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Cultura Celular a Curto PrazoBIO1940 - Citogenética Básica
Dr. Cláudio C. SilvaPUC-Goiás / BIO
Cultura Celular Amostra Heparinizada
Fitohemaglutinina
Meio RPMI
Glutamina
Soro Fetal Bovino
Antibióticos
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Preparação das Lâminas
Colchicina
Hipotônica
Fixador
Limpeza da lâminas
Gotejamento da amostra
Coloração com Giemsa 4%
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Análise Microscópica
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Coleta das Amostras
Protocolo de Cultura Celular
Sangue periférico Heparinizado................... 1,0mL
Meio RPMI....................................................4,5mL
Glutamina.......................................................0,1mL
Soro Fetal Bovino..........................................1,0mL
Fitohemaglutinina..........................................0,1mL
Antibióticos................................................... 0,1mL
• Incubar na estufa 37oC durante 47h;
• Acrescentar 10g/mL (100L) colchicina em cada
cultura;
• Incubar por mais 1h (47h+1h=48h de cultura)
• Ao completar 48h de cultura fazer a colheita;
• Transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga;
• Centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante;
• Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente
aquecida de KCl a 0,075M;
• Colocar na estufa a 37oC por 15 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e
desprezar o sobrenadante;
• Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado;
• Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o
sobrenadante;
• Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes;
• Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a
60oC e aguardar 1 minuto;
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Coloração e Análise das
lâminas
• Mergulhar as lâminas em
Giemsa à 4% durante 10
minutos;
• Enxaguar em água corrente;
• Secar e proceder a análise
microscópica da amostra;
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos;
Microscópio Lâmina Coordenadas Número de cromossomos Observações
Análise Microscópica
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Recomendações da SBG / 2004
Contagem: 15-20 células
Análise: 4-5 células
Cariótipo: 2 células