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Prof. Dra. Adriana Cibele de Mesquita DantasUERGS – Bento Gonçalves
IntroduçãoOs microorganismos sào pequenos demais a
serem vistos a olho nuPara tanto, utiliza-se um microscópioAlguns microorganismos são mais visíveis que
outros, devido ao tamanho ou a características mais facilmente observáveis
Procedimentos de coloraçao na parede celular, membranas e outras estruturas
Unidades de medidasUnidades de microorganismos:
micrometro (µm) = 0,000001mMicro indica dividida por 1 milhão (10-6)Nanômetro (nm) = 0,000000001 (10-9)
Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)
Ao segurar seu microscopio proximo a fonte Ao segurar seu microscopio proximo a fonte de luz, conseguiu observar organismos de luz, conseguiu observar organismos vivos que eram muito pequenos a serem vivos que eram muito pequenos a serem visto a olho nuvisto a olho nu
A amostra foi colocada na exremidade de A amostra foi colocada na exremidade de um ponto ajustavel e visualizada do outro um ponto ajustavel e visualizada do outro lado atraves de uma lente minuscula, lado atraves de uma lente minuscula, quase esférica.quase esférica.
Maior ampliaçao possivel com esse Maior ampliaçao possivel com esse microscopio foi de 300xmicroscopio foi de 300x
Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)
• Inexistência da geração espontâneaInexistência da geração espontânea
• Teoria microbiana das doençasTeoria microbiana das doenças
• Fermentação, decomposição de Fermentação, decomposição de alimentosalimentos
• PasteurizaçãoPasteurização
• Descrição de bactérias associadas às doenças Descrição de bactérias associadas às doenças ((StaphylococcusStaphylococcus, , StreptococcusStreptococcus))
• Vacina anti-rábicaVacina anti-rábica
• Inexistência da geração espontâneaInexistência da geração espontânea
• Teoria microbiana das doençasTeoria microbiana das doenças
• Fermentação, decomposição de Fermentação, decomposição de alimentosalimentos
• PasteurizaçãoPasteurização
• Descrição de bactérias associadas às doenças Descrição de bactérias associadas às doenças ((StaphylococcusStaphylococcus, , StreptococcusStreptococcus))
• Vacina anti-rábicaVacina anti-rábica
Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)
•Estudo do antraz - Postulados de KochEstudo do antraz - Postulados de Koch
•Técnicas para obtenção de culturas purasTécnicas para obtenção de culturas puras
•Placas de PetriPlacas de Petri
•Técnicas de coloraçãoTécnicas de coloração
•Estudos com Estudos com Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis
•Descrição de Descrição de Vibrio cholerae,Vibrio cholerae,
TrypanosomaTrypanosoma
•1905 - Prêmio Nobel de Medicina 1905 - Prêmio Nobel de Medicina
•Estudo do antraz - Postulados de KochEstudo do antraz - Postulados de Koch
•Técnicas para obtenção de culturas purasTécnicas para obtenção de culturas puras
•Placas de PetriPlacas de Petri
•Técnicas de coloraçãoTécnicas de coloração
•Estudos com Estudos com Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis
•Descrição de Descrição de Vibrio cholerae,Vibrio cholerae,
TrypanosomaTrypanosoma
•1905 - Prêmio Nobel de Medicina 1905 - Prêmio Nobel de Medicina
Processamento dos espécimesProcessamento dos espécimesProcessamento dos espécimesProcessamento dos espécimes
• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadequalidade
• Coleta - Sem contaminaçãoColeta - Sem contaminação• Transporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, Identificação• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos
ou Diferenciaisou Diferenciais• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose• Exame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horas• Análise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimento• Análise microscópicaAnálise microscópica• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, molecularessorológicas, moleculares• Análise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos
• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadequalidade
• Coleta - Sem contaminaçãoColeta - Sem contaminação• Transporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, Identificação• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos
ou Diferenciaisou Diferenciais• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose• Exame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horas• Análise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimento• Análise microscópicaAnálise microscópica• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, molecularessorológicas, moleculares• Análise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos
Culturas purasDistribuição uniforme de bactérias é essencial para
visualização das colôniasMétodo mais comum; semeadura por esgotamentoCom alça de inoculação estéril mergulhada na cultura
mista, posteriormente cultivada em meio solidoIsoladas com alça obtém-se culturas puras, contendo
somente um tipo de bactérias.
Obtenção de culturas purasOrigem de uma colonia visivel a partir de um
único esporo, de uma celula vegetativa ou de um grupo de microorganismos em grumos ou cadeias
Apresentam caracteristicas morfologicas diferentes, que permitem diferenciar as colonias
Incubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobiose
Com o contato com oxigênio pode causar morte das bactérias anaeróbicas
Crescimento com meio cultivo especiais denominados meios redutores
Tioglicolato de sódio, combina-se com o oxigênio do meio e elimina da cultura
Quantificar diretamente o crescimento microbianoDeterminar numero de células
No. Cels/ml em meio liquido ou gr em material solido
Determinar a massa total populacionalFormulas matematicas, ex.:70 cels = 10-6 mLX cels = 1 mLUtiliza-se procedimentos de diluições
Contagem em placaTécnica mais utilizada na determinação da
população bacterianaSomente as células viáveis são contadasEsperar 24 horas para células visíveisSomente em culturas puras, de uma única
bactériaA contagem em placas são chamadas Unidades
formadoras de colônias, unidades são os grumos ou cadeias das bactérias
Diluição em série10 mil bactérias / mL1 mL mostrará 10 mil colônias em placa – difícil
de contarTransfere-se 1 mL para um tubo de 9 mL de
caldo de cultura = 1000 bactérias / mLTransfere-se 1 mL = 100 bactérias / mLTransfere-se 1 mL – 10 bactérias
Metodo de pour plateInoculo = 1,0 mL ou 0,1 mL da diluição
bacteriana colocada diretamente na placa de petri
Adiciona-se inoculo em placa sem meio e após o agar, mistura-se suavemente
Crescimento das colônias na superfície como dentro do meio
Espalhamento na placaAdição de inoculo em placa 0,1 mL contendo
meio solidoEspalhamento por uma alçaCrescimento na superfície do meio
Contagem direta no microscópioVolume conhecido de suspensào é delimitada
em uma área definida em um lâmina ‘Petroff-Hausser’
Contadores eletronicos de celulas = contadores Coulter
Análise microscópicaAnálise microscópicaAnálise microscópicaAnálise microscópica
Coloração de GramColoração de GramColoração de GramColoração de Gram
Coloração álcool-ácido resistente
Se liga apenas a bactérias que possuem material céreo em suas paredes .
Identificação do gênero Mycobacterium:M. tuberculosis, M. leprae e linhagens patogênicas de Nocardia.
O corante carbolfucsina é aplicado aum esfregaço fixado e a lâmina é aquecida por vários minutos
A seguir a lâmina es esfriada, secada e lavada com água.
O esfregaço é tratado com o descolorante álcool –ácido (remove o colorante vermelho das bactérias que nâo são álcool-ácido (al-ác) resistêntes.
Os microorganismos al-ác resistêntes retêm a cor vermelha pois a carbolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular que no al-ác.
Coloração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-Nielsen
Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.(presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.
Coloração NegativaColoração Negativa: Permite demonstrar a presencia de cápsula (revestimento gelatinoso). Mistura-se as bactérias com tinta nanquim ou nigrosina para criar um fundo escuro e cora-se as bactérias com coloração simples com safranina.
Coloração de EndósporosColoração de Endósporos (Técnica de Schaeffer-Fulton): Utiliza-se verde malaquita para a coloração primaria.
A safranina utiliza-se como contracorante para corar as poções da cálula que não os endósporos.
Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos.(presença de cápsula), coloração de flagelos.Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos.(presença de cápsula), coloração de flagelos.
Colorante: Nigrosina
Colorante: Carbolfucsina:Aumentar diâmetro dos falgelos.
Difusão em ágar – Difusão em ágar – Método de Kirby & Método de Kirby & BauerBauer
Difusão em ágar – Difusão em ágar – Método de Kirby & Método de Kirby & BauerBauer
Microdiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas Elisa
“ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay)Se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações
enzimáticas.A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa
a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2 ) em H2O mais O2 .Existem vários modelos de testes de ELISA; Forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um
suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno.
Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.
Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H 2 O 2 dissolvida em uma substancia química que dá uma
reação colorida quando H 2 O 2 é desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma
coloração (variável dependendo do substrato).
Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que apresença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno.
Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
Fosfatase alcalinaPeroxidase
B-galactosidase
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
DIRETO OU SANDUÍCHE
INDIRETO PLACA UTILIZADA
ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche
Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
ELISA Competitivo
Afinidade = Forças de atração e de repulsão
Ab
Ag
Alta afinidade
Ab
Ag
Baixa Afinidade
AFINIDADE DE INTERAÇÃO• Força da interação entre um único epitopoantigênico e um único sítio de combinação com
o antígeno
[Ag] + [Ac ] [Ag-Ac]
KA= [Ag-Ac] ([Ag] + [Ac])
KA
KA= Constante intrínseca de associação
Reatividade Cruzada
• Quando os antígenos são estruturalmenterelacionados podendo ocorrer a reatividade de um anticorpo com outro epitopo antigênico.
Anti-A Ab
Ag A
Anti-A Ab
Ag B
Epitopo compartilhado
Anti-A Ab
Ag C
Epitopo similar
Reações Cruzadas
FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES ANTÍGENO/ANTICORPOANTÍGENO/ANTICORPO
Atua em moléculas não polares facilitando a aproximação, os choques moleculares e as ligações.
Moléculas que apresentam grupos laterais iônicos de cargas opostas que se atraem fortalecendo a interação Ag-Ac.
Forças fracas que ocorrem devido à proximidade física entre as moléculas.
A mais fraca das ligações. Ocorrem entre o núcleo de um átomo e a nuvem de elétrons de outro formando dipolos que se atraem.
Avidez• São as forças totais de interação entre um
antígeno com o anticorpo
Keq = 104
Afinidade
106
Avidez
1010
Avidez
RESPOSTA DE ANTICORPOS EspecificidadeEspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. QuantidadeQuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. IsotipoIsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. AfinidadeAfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez:Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
INTERAÇÕES Reações reversíveisReações reversíveis.
Ligações não covalentes:Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas
MÉTODOS
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blotting
MÉTODOS
PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - ImunoeletroforeseAGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de CoombsIMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.
Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃOInteração entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalenteAg precisa ser bi ou polivalenteA reação pode ser afetada pelo n° de sítios de
ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA
PRECIPITADPRECIPITADOO
É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe
abaixo:
Zona de excesso de anticorpo
Zona de equivalência
Zona de excesso de antígeno
+ - -+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado
Quantidade de antígeno adicionado
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
Imunodifusão Dupla:
• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:
Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
Ac
Ag Ag
Ac
Ag Ag
46
Ac
Ag Ag
Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:
Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.
O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Poços onde são colocados padrões e amostras a
serem dosados Agarose contendo anticorposanti-IgG humana
Halo de precipitação IgG – anti-IgG
Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.
Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
48
+ -
Ag
Ag
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna
canaleta
2- Anti-soro na canaleta
canaleta
3- Difusão e precipitação
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃOAc + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa
aglutinação (semi-quantitativo)Pó-zona: excesso de AcPotencial Zeta: alguns Ag podem apresentar
carga elétrica (repulsão)Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
50
2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
51
3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
52
5) Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
negativo positivo
AGLUTINAÇÃO DIRETA
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.
• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.
• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.Aglutinação
Positiva
Negativa
Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
55
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
+Soro anti - hCGUrina
São incubados e colocados numa placa
Adicionam-sePartículas
revestidas com hCG
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
Microscópio de fluorescência com epiluminação
luz UV atinge o ma- terial examinado
fluorescência emitida chega ao observador
TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
IFA direta:Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas
fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a
Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade
(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IMAGENS
CITOMETRIA DE FLUXO Ferramenta que detecta e quantifica células individuais
passando em uma corrente através de um feixe de Laser.Separa as células por fluorescência ativada.Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo
diferente.É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕESTipo de linfócitos;Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares;HIV
RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:
I125: emite raios gama H3: raios beta
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
Metodologias que utilizam reagentes não marcados:
•Precipitação
•Aglutinação
•Hemólise (Fixação de Complemento)
Metodologias que utilizam reagentes marcados
•Radioimunoensaios
•ELISA
•Imunofluorescência
•Western Blotting
•Citometria de Fluxo
Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável.
Excesso de antígeno: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis.
Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no sobrenadante.
Pró-Zona
Imunodifusão radial (Mancini)
InterpretaçãoDiâmetro do anel é
proporcional à concentração do Ag
QuantitativoNíveis de Ig
• Método– Anticorpo no gel– Antígeno no poço
Ag Concentração
Dia
mete
r2
AgAgAgAg
Ac no gel
Imunoeletroforese/Precipitação• Método
– Antígenos são separados por eletroforese
• Interpretação– Arco de precipitina representa a interação Ag-AC
Ag-+
Ag
Ab
Ag
Ab
– Anticorpo é colocado num corte no ágar
Imunoeletroforese/Precipitação
WESTERN BLOTTINGEletroforese de
proteínas.Identifica
antígenos ou anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING
CaracterizaçCaracterização sorológicaão sorológica
Atividades Atividades desempenhadasdesempenhadaspelo Microbiologista pelo Microbiologista ClClínicoínico
Atividades Atividades desempenhadasdesempenhadaspelo Microbiologista pelo Microbiologista ClClínicoínico
Processamento dos espProcessamento dos espécimesécimesProcessamento dos espProcessamento dos espécimesécimes
AdequaçAdequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeão da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeColeta - Sem contaminaçColeta - Sem contaminaçãoãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoInoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou
DiferenciaisDiferenciaisIsolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseExame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horasAnálise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimentoAnálise microscópicaAnálise microscópicaCaracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, molecularessorológicas, molecularesAnálise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos
AdequaçAdequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeão da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeColeta - Sem contaminaçColeta - Sem contaminaçãoãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoInoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou
DiferenciaisDiferenciaisIsolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseExame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horasAnálise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimentoAnálise microscópicaAnálise microscópicaCaracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, molecularessorológicas, molecularesAnálise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos
Semeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamento
Meios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciais
IncubaçIncubação em condições de anaerobioseão em condições de anaerobioseIncubaçIncubação em condições de anaerobioseão em condições de anaerobiose
AnAnálise macroscópica do crescimentoálise macroscópica do crescimentoAnAnálise macroscópica do crescimentoálise macroscópica do crescimento
AnAnálise microscópicaálise microscópicaAnAnálise microscópicaálise microscópica
ColoraçColoração de Gramão de GramColoraçColoração de Gramão de Gram
ColoraçColoração de Ziehl-Nielsenão de Ziehl-NielsenColoraçColoração de Ziehl-Nielsenão de Ziehl-Nielsen
Outras tOutras técnicas de coloraçãoécnicas de coloraçãoOutras tOutras técnicas de coloraçãoécnicas de coloração
CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica
CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica
DifusDifusão em ágar - ão em ágar - Kirby & BauerKirby & BauerDifusDifusão em ágar - ão em ágar - Kirby & BauerKirby & Bauer
MacrodiluiçMacrodiluiçõesõesMacrodiluiçMacrodiluiçõesões
MicrodiluiçMicrodiluiçõesõesMicrodiluiçMicrodiluiçõesões
ELISAELISAELISAELISA
Western blotWestern blotWestern blotWestern blot
AnAnálises molecularesálises molecularesAnAnálises molecularesálises molecularesPCRPCRPCRPCR
GeometricGeometric AmplificationAmplification
GeometricGeometric AmplificationAmplification
22002200
22112211
22222222
22nn22nn
11stst cycle cycle11stst cycle cycle
22ndnd cycle cycle22ndnd cycle cycle
nnthth cycle cyclennthth cycle cycle
ELISAELISA
Western blotWestern blotWestern blotWestern blot
Análises molecularesAnálises molecularesAnálises molecularesAnálises molecularesPCRPCRPCRPCR
GeometricGeometric AmplificationAmplification
GeometricGeometric AmplificationAmplification
22002200
22112211
22222222
22nn22nn
11stst cycle cycle11stst cycle cycle
22ndnd cycle cycle22ndnd cycle cycle
nnthth cycle cyclennthth cycle cycle
Enxergando os microrganismos:Microscópio
Ampliação: jogo de lentes, campo magnético
Resolução: depende do comprimento de onda utilizado para enxergar
Há dois tipos:Óptico:
Fase, campo escuro, fluorescênciaJogo de lentes (20-2000x)Luz visível (300-700nm)
Eletrônico:Transmissão, varreduraCampo magnético (até 40000x)Feixe de elétrons
Figura microscópio
Figura resolução
www.bmb.psu.edu/courses/ micro107/microscopy/
Esterilização de meios e equipamentos
Escolha entre esterilizar (morte de microrganismos vegetativos e esporos)
UV Vapor úmido (mínimo 20 minutos – 120 °C ) Vapor seco (acima de 150 °C ) O aumento da temperatura e do tempo aumenta a perda de nutrientes
(vitaminas) Melhor aumentar a temperatura e diminuir o tempo (UHT)
Pasteurização (morte de patogênicos) 62 °C em 30 minutos, resfriamento brando
Tindalização (70-100 °C ) 1 h, após 24 h repete Desinfecção (desinfetantes, antissépticos) Agentes quimioterápicos (Sulfa, Cloranfenicol, antibióticos) Filtro de lã de vidro