Curs 5 Elemente de Genetica

Tudor Savopol - Elemente de genetic

ELEMENTE DE GENETIC MOLECULARInformaia genetic a unei celule este stocat i utilizat cu ajutorul unui sistem biochimic complex n care elementele principale sunt acizii nucleici. n procesele biochimice implicate n transmiterea informaiei de la celula mam la celulele fiice precum i n exprimarea diferitelor proteine n interiorul unei celule sunt de asemenea implicate nite siteme enzimatice complexe care, pe de o parte asigur transmiterea exact a informaiei genetice, minimiznd probabilitatea apariiei unor accidente (mutaii), iar pe de alt parte asigur exprimarea proteinelor specifice celulei n cantitatea necesar i la momentul necesar desfurrii proceselor vitale. Cunoaterea acestor mecanisme complexe a permis stabilirea unor tehnologii prin care informaia genetic poate fi utilizat att n scopuri cognitive ct i terapeutice. n cele ce urmeaz vom descrie pe scurt principiile fundamentale care stau la baza transmiterii i utilizrii de ctre celule a informaiei genetice precum i cteva tehnici utilizate n scopul manipulrii acestei informaii.

1 Structura acizilor nucleiciAcizii nucleici (acidul deoxiribonucleic - ADN i acidul ribonucleic - ARN) sunt constituii din trei clase de substane: baze azotate, zaharuri i acid fosforic. Vom descrie pe rnd structura acestor molecule precum i modul lor de participare la construcia macromoleculelor de ADN i ARN. 1.1 Bazele azotate Bazele azotate care sunt utilizate pentru construcia moleculelor de ADN i ARN sunt de dou tipuri, ambele fiind derivatele (din punct de vedere structural) a dou molecule organice simple: purina i pirimidina (Fig. 1).NNH2

7

8

5 4

6 3N

O N

N H

9

1 2

NN N

NH

N

N

N

purin adeninN3

N

NH2

guaninO O

4

NH2

2 1N

5 6O

N

HN

HN

N

O

N

O

N

pirimidin citozin uracil timinFig. 1. Structurile purinei, pirimidinei i a bazelor azotate derivate de la acestea. Au fos reprezentate cu valen liber punctele de conexiune cu moleculele de zaharide.

Este de remarcat faptul c cele dou clase de baze azotate se deosebesc una de cealalt prin dimensiunea moleculei; vom vedea c acest fapt joac un rol foarte important n stabilirea structurii macromoleculare a acizilor nucleici. 1


Un alt fapt care trebuie reinut este acela c uracilul este prezent numai n ADN iar timina numai n ARN. La formarea ADN i ARN, bazele azotate se cupleaz cu moleculele de zaharide prin intermediul unor poziii specifice: bazele purinice se conecteaz prin intermediul atomului de azot nr. 9, iar cele pirimidinice prin intermediul azotului nr. 1. O proprietate important a bazelor azotate este caracterul lor hidrofob, datorat n special prezenei nucleelor aromatice. Aceast proprietate contribuie esenial la formarea structurii tridimensionale a acizilor nucleici unde, dup cum vom vedea, bazele azotate se situeaz spre interiorul hidrofob al moleculei. 1.2 Zaharurile Exista dou zaharuri utilizate n construcia acizilor nucleici: riboza (care intr n compoziia ARN) i deoxiriboza (care intr n compoziia ADN), ambele din familia pentozelor (zaharide cu 5 atomi de carbon n molecul) Aa cum se poate vedea n Fig. 2, deosebirea dintre cele dou molecule const n faptul c riboza are n poziia 2 o grupare hidroxil n timp ce deoxiriboza posed naceeai poziie un atom de hidrogen (deosebirile sunt marcate prin culoarea roie n Fig. 2). O proprietate important a acestor molecule este polaritatea lor i caracterul puternic hidrofil, ceea ce conduce la orientarea lor spre exteriorul macromoleculei ADN (sau ARN).HO

5' 4'H H OH

OH O H

HO

5' 4'H H OH

OH O H

1'H

1'H

3'

2'

3'

2'

OH

H

riboza

deoxiriboza

Fig. 2. Structurile ribozei i deoxiribozei. Numerotarea atomilor de carbon de face utiliznd indicele prim pentru a o deosebi de numerotarea utilizat la bazele azotate.

Prin urmare molecula de riboz are mai multe posibiliti de a forma puni eterice prin condensare cu alte molecule. Ambele molecule se afl n configuraia , ceea ce inseamn c gruparea hidroxil glicozidic (poziia 1) se afl de aceeai parte a planului ciclului cu gruparea -CH 2OH din poziia 4. Moleculele de zaharide se cupleaz la cele de baze azotate prin intermediul gruprii hidroxil din poziia 1, formnd o nucleozid (adenozin, guanozin etc). Se poate observa c baza azotat este orientat n plan perpendicular pe planul general al ciclului zaharidei (Fig.3).NH2 N

N

N HO

N

5' 4'H H OH

O H

1'H

3'

2'

H

Fig. 3. Structura adenozinei. Se observ aezarea moleculei de baz azotat n plan perpendicular pe cel al zaharidei.

2


Se poate observa c o nucleozid construit cu ajutorul deoxiribozei posed dou grupri hidroxil libere. n cazul unei nucleozide construite cu ajutorul unei riboze exist o grupare hidroxil liber suplimentar, n poziia 2. 1.3 Gruprile fosfat i formarea nucleotidelor Gruprile fosfat se leag la moleculele de zaharide prin intermediul gruprii hidroxil din poziia 5 a acestora din urm. Dac zaharida respectiv era deja cuplat la o baz azotat, atunci structura care rezult se numete nucleotid (Fig. 4). Nucleotidele constituie unitatile (monomerii) din care sunt alctuite macromoleculele de ADN i ARN.NH2 N

N

2O

O P O H O

N

N

5'H

O H H H

3'OH

Fig. 4. Exemplu de nucleotid format din adenin, deoxiriboz i o grupare fosfat, denumit deoxiadenilat monofosfat sau, prescurtat, dAMP.

Nucleotidele conin ntotdeauna o singur grupare fostat. Exist posibilitatea ca la restul de zahar s se lege mai multe grupri fosfat (pn la 3 grupri), dar compuii rezultai n acest fel nu particip la formarea acizilor nucleici; ei constituie o alt clas de substane de mare interes biologic, de tipul 5-ATP (acid adenozintriphosphoric, ATP, avnd n poziia 5 legate 3 grupri fosfat), 3-GMP (acid guanozinmonophosphoric cu o grupare fosfat legat n poziia 3) etc, implicai n stocarea (i transferul) energiei la nivel celular precum i n anumite procese de semnalizare. Prin prezena gruprii fosfat, nucleotidele sunt ncrcate electric negativ. Din acest motiv ele se comport repulsiv fa de ionii negativi, cum ar fi ionii hidroxil, ceea ce face ca lanul polimeric s fie foarte rezistent la hidroliz (fapt important pentru conservarea informaiei genetice). Convenia de denumire prescurtat, cu o liter, a nucelotidelor este foarte simpl: se folosete iniiala care denot baza azotat a unei nucletide, fr s se mai specifice dac nucleotida conine riboz sau deoxiriboz. Acest lucru nu creeaz ambiguiti deoarece acele lanuri polimerice n care exist timin aparin obligatoriu unui lan ADN, deci sonin deoxiriboz, n timp ce secvenele care conin uracil, vor conine obligatoriu riboz (aparin unui lan ARN). 1.4 Formarea lanului polinucleotidic Nucelotidele pot condensa ntre ele prin intermediul gruprii hidroxil din poziia 3 i al gruprii fosfat (din poziia 5). Rezult astfel lanuri care conin la un capt o grupare fosfat (ntr-o poziie 5) iar la cellalt capt o grupare hidroxil (ntr-o poziie 3). Prin convenie, o secven de nucelotide se citete ntotdeauna de la captul 5 la captul 3. n Fig. 5 se poate vedea un exemplu de astfel de secven

3


AH2N N H2N

CO

GH N NH2 N

N N N

N

N N N O

H O

H H

O H

H

H H O H

H

H H

5'O P -O OO

H H O P

O H OO

O P O

O

3'H O

O-

Fig. 5. Exemplu de lan polinucleotidic: secvena ACG

n exemplul de mai sus a fost schiat structura unei secvene de trei nucleotide. Secvena din Fig. 5 se citete n aceast ordine: ACG. Este de remarcat faptul c aceast secven difer de secvena invers, GCA. 1.5 Structura dublei elici Lanurile polinucleotidice formate aa cum am descris mai sus au un caracter amfifilic datorat prezenei unor grupri hidrofobe (bazele azotate) i unor grupri hidrofile (zaharurile i gruprile fosfat). Stabilizarea acestor structuri se realizeaz prin mperecherea, cu ajutorul legturilor de hidrogen, a dou astfel de lanuri ntr-o structur bifilar, rsucit ca o spiral, i care poart numele de elice . Elicea este astfel structurat nct bazele azotate se afl spre interiorul elicii, iar gruprile polare (zaharuruile i fosfaii) se afl spre exterior, expuse mediului apos. Dac analizm structura perechilor de baze azotate (Fig. 6) constatm c, datorit geometriei acestora, nu sunt posibile dect dou tipuri de mperecheri: A-T i G-C.H

H N N H O CH3N O H

N

N N

N

H

N N

N N

N

H

N N

O

N H

H

O

adenin timin

guanin citozin

Fig. 6. Structura perechilor de baze azotate din molecula ADN (modelul Watson-Crick). Legturile de hidrogen sunt desenate n verde.

Dup cum se poate observa fiecare pereche de baze este format dintr-o baz purinic i una pirimidinc, cele dou structuri obinute fiind aproape identice. n Fig. 7 cele dou structuri au fost desenate suprapus, perechea AT fiind reprezentat n rou, iar perechea GC n albastru. Se poate observa marea similitudine a celor dou structuri, ceea ce explic acest mod de mperechere. O mperechere de tipul AG sau TC nu ar fi posibili din motive sterice (prima ar fi prea voluminoas iar a doua prea mic), iar o mperechere de tipul AC sau GT, dei favorabil din punct de vedere steric, nu ar putea satisface legturile de hidrogen ntre cei doi parteneri.

4

Tudor Savopol - Elemente de geneticH H N N O N HH N O CH3

N N N N

N N

H

H

N N N N

N H

H

O O

Fig. 7. Reprezentare suprapus a celor dou perechi AT (reprezentat n rou) i GC (albastru).

n Fig. 8a este reprezentat o elice vzut lateral, iar n Fig. 8b o elice vzut din lungul axei principale. Sunt de remarcat cteva proprieti importante: bazele azotate se afl aezate ntr-un plan practic perpendicular pe axul principal al elicei; diferena de nivel dintre planurile a dou baze azotate adiacente este de 3,4 ; rsucire complet se realizeaz cu aproximativ 10 perechi de baze, ceea ce nseamn c pasul elicei a este de 34 . diametrul unei elici este de 20 . O proprietate foarte important a acestei molecule const n faptul c prin nclzire structura de elice dubl se pierde, prin ruperea legturilor de hidrogen dintre perechile de baze azotate. Acest proces de denaturare este reversibil, adic atunci cnd sistemul este rcit, molecula redobndete n mod spontan structura iniial.

a

b

Fig. 8. Elicea . Conveniile de culoare sunt: A = rou, G = verde, C = purpuriu, T = albastru, zaharidele i gruprile fosfat = gri.

Mai trebuie menionat faptul c pot exista i alte structuri ale ADN i ARN, dintre care una are o deosebit importan n ingineria genetic: structura circular (termenul de circular se refer la continuitatea lanului i nu la forma geometric real a moleculei). Acest tip de structur se mai numete i plasmid.

2 Replicarea ADNCopierea moleculei de ADN n timpul diviziunii celulare este un proces necesar transmiterii informaiei genetice de la celula mam la celulele fiice. Procesul este cunoscut sub denumirea de replicare i este asistat de peste 20 de enzime specifice, dintre care una are o importan deosebit i se numete ADN-polimeraza. 5


n timpul acestui proces ADN-polimeraza se muleaz la captul 3 al unei molecule ADN denaturat, unde se gsesc totui cteva nucelotide legate deja pe catena parental. Aceast secven scurt iniial, necesar nceperii procesului de replicare se numete primer. Un primer are ntotdeauna o grupare OH liber n poziia 3. Primul pas al replicrii const n prelungirea primer-ului cu nc o nucleotid. Noile nucleotide ce urmeaz a fi incorporate n noua caten ADN se afl n mediul nconjurtor sub form trifosfatat (dATP, dGTP, TTP, dCTP). Procesul este catalizat de ADN-polimeraz i const n urmtoarele etape: noua nucleotid se ataeaz prin legturi de hidrogen la catena ADN parental formnd o pereche Watson-Crick; gruparea OH 3 liber a primer-ului atac nucleofil prima grupare fosfat a noii nucleotide; celelalte dou grupri fosfat sunt eliberate sub form de pirofosfat i sunt apoi hidrolizate (cu ajutorul altei enzime, pirofosfataza, la fosfat anorganic). ntregul proces este ilustrat n detaliu n Fig. 9.primerO

3` T AO

primer TO

3` A

ADN parental

H

O O

3'

O O

3'

2O P O O O P O

O

-O P O

O

P O

O

GO

C

O

G

C

H

O

H

O

5`

Fig. 9. Mecanismul schematic al replicrii ADN (modificat dup Stryer)

Apoi ADN-polimeraza migreaz cu o poziie mai departe spre captul 5 al catenei parentale i procesul se repet pn la terminarea lanului. Modul cum interacioneaz polimeraza cu lanul ADN este ilustrat, ntr-o reprezentare tridimensional, n Fig. 10, unde se poate observa facptul c molecula ADN este denaturat n zona n care interacioneaz cu polimeraza, iar dup ce procesul prelungirii noii catene a avut loc, molecula ADN este renaturat.

Fig. 10. Sinteza ADN prin cataliza ADN-polimerazei

ADN-polimeraza celulelor procariote poate aciona de asemenea i ca exonucleaz (n sensul 3 5), adic poate hidroliza legturile diesterice care formeaz ADN. Aceast proprietate este important n procesul de reparare a eventualelor greeli care apar n timpul replicrii, fcnd posibil nlturarea nucleotidelor care nu s-au mperecheat corect (probabilitatea de apariie a unei greeli este de 10-8/perechea de baze). 6

ADN parental5`

O


3 TranscripiaMecanismul prin care informaia genetic stocat de molecula ADN este utilizat pentru obinerea unor molecule proteice funcionale depinde de tipul celulei. n cazul celulelor procariote (care nu au nucleu) informaia este utilizat direct printr-un mecanism pe care il vom descrie mai trziu. n cazul celulelor eucariote, materialul genetic (ADN) este ncapsulat n nucleu. Pentru ca informaia s ajung la nivelul ribozomului, acolo unde se sintetizeaz proteinele, este necesar ca aceasta s fie transmis ctre aceast destinaie prin intermediul unor molecule specifice. Acesta este rolul moleculelor de ARN mesager (ARNm), iar procesul prin care se formeaz o molecul de ARN, avnd ca model un fragment de ADN, se numete transcripie. Deosebirea dintre replicare i transcripie const n aceea c sunt multiplicate numai acele zone ale ADN care codific o protein. Aceste zone se numesc gene. Interesant de remarcat este faptul c la organismele superioare o gen nu este un ir continuu de nucelotide. Ea este ntrerupt din loc n loc de zone care nu codific nimic. Zonele din ADN care codific proteine se numesc exoni, iar cele care nu codificp se numesc introni. n afar de ARN mesager exist i alte tipuri de ARN, al cror rol va fi discutat ulterior (ARN de transfer, ARN ribozomal). Toate aceste molecule sunt sintetizate cu ajutorul ARN polimerazei. Pentru ca procesul de transcropie s poat avea loc este necesar s existe urmtoarele elemente: molecul model de ADN (template); precursorii necesari construciei ARN (cele patru nucelotide ATP, GTP, UTP, CTP); un ion metalic bivalent, de cele mia multe ori Mg2+ sau Mn2+. Molecula de ARN mesager care se obine n urma transcripiei are o secven practic identic cu cea a ADN-ului model, doar c n locul timinei este folosit uracilul. ntrebarea este cum tie ARN polimeraza unde ncepe i unde se termin o gen o gen, astfel nct s transcripioneze strict acea secev de nucelotide care codific o protein? 3.1 Site-urile promoter Punctul de mcepere a procesului de transcripie este indicat n mod diferit la celulele procariote i eucariote, dar n ambele cazuri exist o secven comun, numit secven consens, situat n amonte fa de zona ce urmeaz a fi transcriionat. Aceast secven conine irul de nucleotide TATAAT (la procariote) i TATAAA la eucariote (numit i cutie TATA sau cutie Hogness). Aceste secveme sunt centrate n poziiile 35 n cazul procariotelor (Fig. 11a) i 25 n cazul eucatiotelor (Fig. 11b).-35 -10 TATAAT ncepe transcriptia + 1

a

ADN

TTGACA

-75

-25 TATAAA

+ 1

b

ADN

GGNCAATCT

ncepe transcriptia

Fig. 11. Schema site-urilor promoter la procariote (a) i eucariote (b)

Dup ce ARN-polimeraza a identificat site-ul promoter, ncepe sinteza noii molecule ARN. Polimeraza se deplaseaz de la captul 3 spre captul 5 al moleculei ADN model, pn la ntlnirea unui semnal terminator.

7


Spre deosebire de procesul de replicare, n cazul transcripiei, noua molecul format nu rmne ataata la molecula model. Imediat dup deplasarea polimerazei spre o nou poziie, coada ARN-ului proaspt format se detaeaz de molecula ADN model. 3.2 Site-urile terminator Semnalul terminator nu este reprezentat neaprat de o secven bine definit a moleculei ADN ci de o anumit sctructur pe care o capt ARN-ul nou format, i care difer destul de mult de la un organism la altul. n cazul E. coli aceast structur const ntr-un ir de nucelotide care duc la formarea unor perechi Watson-Crick, determinnd molecula ARN s capete o structur de elice dubl (ceea ce nu este tipic pentru ARN). Aceast structur este cunoscut sub numele de base-paired hairpin (Fig. 12). Dac aceast structur este urmat de o zon foarte bogat n uracil, molecula ARN se desprinde de ARN-polimeraz i procesul transcrierii nceteaz.C U U G A C C G C C 5 C C C A G C U G G C G G G 3 A U U U U OH C G

Fig. 12. Structura base-paired hairpin a ARN care d semnalul de terminare a transcripiei

n cazul eucariotelor, procesul este mai puin cunoscut. n orice caz desprinderea ARN de ARN-polimeraz se realizeaz cu ajutorul unei alte enzime (enzima rho). Tot n cazul eucariotelor mai trebuie menionat faptul c exist i nite modificri posttranscripionale ale ARN. Comparnd procesele de replicare i transcripie, i mai ales proprietile celor dou polimeraze implicate, constatm c mecanismele care stau la baza lor sunt foarte asemntoare. Trebuiesc totui menionate dou diferene importante: procesul de transcripie nu necesit existena primer-ilor; ARN-polimeraza nu are niciodat rol de exonucleaz;

4 TranslaiaInformaia genetic, dup ce a fost transmis de la ADN la ARN mesager (transcripia) urmeaz a fi utilizat pentru sinteza proteinelor codificate de gene. Acest proces are loc la nivelul unei formaiuni celulare numit ribozom, i se numete translaie. Ribozomul este un complex constnd din molecule de ARN i mai mult de 50 de proteine, cu ajutorul crora se efectueaz traducerea secvenei de nucleotide a ARN n secven de aminoacizi a proteinelor. 4.1 Codul genetic Relaia dintre secvena de nucleotide ARN i cea de aminoacizi a proteinelor se numete cod genetic. Codul genetic este practic universal (adic se aplic la aproape toate organismele). 8


Analiznd codul genetic descris de tabelul de mai jos constatm cteva proprieti care merit a fi comentate. Codul genetic Prima poziie (captul 5) Poziia a II-a Poziia a III-a (captul 3)

U C A G U Phe Ser Tyr Cys C Phe Ser Tyr Cys U A Leu Ser Stop Stop G Leu Ser Stop Trp Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Un set de 3 nucelotide codific un anumit aminoacid i se numete codon. Exist 64 codoni pentru cei 20 aminoacizi folosii pentru construcia unei proteine. Se spune despre codul genetic c este degenerat. Cteva observaii: 1. numai triptofanul i metionina sunt codificate de cte un singur codon; 2. exist 3 codoni care nu codific nici un aminoacid, avnd doar semnificaia unui mesaj de oprire (codoni Stop) n procesul translaiei; 3. codonii care codific acelai aminoacid au (cu excepia a doi codoni pentru Leu) primele dou nucleotide identice, diferenele aprnd numai la cea de-a treia nucleotid Cea mai surprinztoare constatare este gradul mare de degenerare a codului genetic. Explicaia pentru acest lucru rezid n nevoia de fidelitate a procesului de translaie. Dac nu ar exista degenerarea, ar nsemna ca 20 de codoni sa codifice cte un aminoacid. Restul de 44 de codoni ar duce la terminarea translaiei. Probabilitatea unei mutaii accidentale care s duc la terminarea procesului ar fi n felul acesta foarte mare, i s-ar obine foarte multe proteine nefuncionale. n schimb, utiliznd sistemul degenrat, chiar dac pot s apar anumite mutaii, este foarte probabil ca acestea s afecteze foarte puin funcia proteinei. 4.2 Secvene strat i stop n ARN mesager Exact ca i n cazul transcripiei, pentru ca procesul de translaie s nceap i s se termine exact acolo unde ncepe i se termin secvena codificatoare, este necesar existena unor semnale de start i stop. i aici apar nite mici diferene ntre celulele procariote i eucariote, dar, n ambele cazuri, secvena start este o triplet AUG care codific (vezi codul genetic) pentru metionin. n cazul procariotelor acest mesaj intervine de obicei dup o zon bogat n purin, iar la eucariote dup o zon ce a suferit anumite modificri post-transcripionale (inserarea unei structuri Cap n apropierea captului 5). 9


Odat identificat secvena start AUG, este stabilit cadrul de citire (reading frame) i nu mai exist riscul unei defazri. 4.3 ARN de transfer Dup ce ARN mesager a fost transportat la ribozom, procesul translaie poate ncepe. n acest scop, aminoacizii sunt transportai, fiecare, de cte un ARN specific, n secvena cruia exist un set de 3 nucleotide complementare setului care codeaz aminoacidul respectiv (adic un anticodon). Acetia sunt ARN de transfer. ARN de transfer sunt molecule relativ mici (cam 80 nucleotide) i fixeaz la captul 3, prin esterificare, aminoacidul specific. Structura unui ARN de transfer este prezentat n Fig. 13.

Fig. 13. Structura general a unei molecule ARN de transfer

5 Tehnici genetice5.1 Determinarea secvenei ADN Moleculele dublu helicale de ADN pot fi rupte n fragmente mai mici cu ajutorul unor enzime cunoscute (din motive istorice) sub numele de endonucleaze, sau enzime de restricie. Aceste enzime taie polimerul ADN n puncte specifice, n funcie de secvena local a acestuia. O proprietate comun a enzimelor de restricie este aceea c atac ADN n aa numitele zone cu secvene palindromice (palindrom = cuvnd sau propoziie care sunt identice indiferent de sensul de citire; de exemplu, cuvntul radar, sau expresia madam, Im Adam). Se poate observa c o secven palindromic are ntotdeauna un centru de simetrie. Enzimele de restricie atac i ele simetric fa de acest centru de simterie. n tabelul de mai jos sunt enumerate cteva dintre cele mai des folosite enzime de restricie, secvenele specifice pe care le atac (reprezentate prin sgei roii) precum i axa de simetrie a secvenei palindromice. Astfel, dac un ADN cu secvena necunoscut este supus clivrii cu o endonucleaz dat, va rezulta un amestec de fragmente pentru care, de aceast dat cunoatem secvena cel puin a unui capt (cel atacat de endonucleaza folosit). Vom vedea c acest lucru este esenial pentru determinarea secvenei ntregului lan ADN. Folosind, pe rnd, diferite endonucleaze, se pot obine fragmente din ce in ce mai mici i din ce n ce mai bine caracterizate din punctzul de vedere al secvenei. Separarea i analiza acestor fragmente se face prin tehnici cromatografice specifice, pe care le vom descrie ulterior.

10


Enzimele de restricie Enzima EcoRI secvena pe care o atac (cu linie puctat este artat axa de simetrie) 5 GA TT A C 3 3 CTT AG 5 A 5 GG T C 3 A C 3 CCT G A G 5 5 CC GG 3 3 G GCC 5 5 CT GCA G 3 3 GA G C 5 C T

BamI

HaeIII

PstI

De exemplu, EcoRI produce ntotdeauna (Fig. 14) un capt liber 3 cu secvena TTAA i unul complementar, 5 cu secvena (evident!) AATT:5` G A A T T C C T T A A G EcoRI 5` G C T T A A A A T T C G

Fig. 14. Aciunea EcoRI

Alte enzime de restricie nu produc capete asimetrice (de exemplu PstI). Pasul urmtor n determinarea secvenei const n stabilirea scvenei fragmentelor obinute n urma aciunii enzimelor de restricie. Tehnica pe care o vom descrie mai jos poate fi aplicat, n principiu, chiar i unei molecule ntregi de ADN, dar interpretarea ar fi cu mult mai complicat. Metoda folosit se numete metoda dideoxi a lui Sanger dup numele celui care a utilizat-o pentru prima dat ((Frederick Sanger) i dup numele unor reactivi pe care i folosete. Procedura const n urmtoarele: moleculele ADN sunt denaturate; n mediul de reacie se adaog cantiti suficiente din cele 4 nucleotide (sub forma trifosfat); se adaog de asemenea, n cantiti mici, n 4 probe separate, 4 derivai ai celor 4 nucelotide care au lips gruparea OH din poziiile 2 i 3 (2,3-dideoxiderivai, Fig. 15), i care sunt marcai fluorescent cu 4 fluorofori diferii; aceti derivai se adaug n se adaog ADN polimeraza i se las ca sistemul s se replice spontan.

Fig. 15. Structura unui analog 2,3-dideoxi

11


n cursul procesului de replicare, noile molecule de ADN vor crete pe modelul ADN parental, pn cnd, ntmpltor, va fi cuplat o dideoxinucleotid. Acesteia lipsindu-i gruparea OH din poziia 3 numai permite contionuarea reaciei de polimerizare. Prin urmare, se vor obine foarte multe fragmente de ADN care se termin toate cu aceeai nucleotid. Prin electroforez se poate deduce lungimea fiecrui fragment i deci poziiile unde se gsete nucletida respectiv de-a lungul catenei. Dac de exemplu s-a folosit pentru dideoxiATP (ddATP) un colorant cu fluorescen albastr, pentru ddTTP, fluorescen verde, pentru ddGTP galben i pentru ddCTP roie, rezultatul cromatogramelor va arta n felul prezentat n Fig. 16.A - A - A - - - - - - - - - - - A A A

T G - C C - - - C - - - - - C C - - - - - - - G - G - - - - - G - G - G - - T - - T - T T T - - T - T - T - - - -

C A T A G C T G T T T C C T G T G T G A A A

Fig. 16. Decelarea prin fluorecen a fragmentelor de oligonucleotide obinute prin metoda dideoxi. nlimea curbelor reprezint intensitatea fluorescenei.

Tehnologia contemporan a permis automatizarea complet a metodei i a redus foarte mult cantitatea de ADN necesar secvenierii. 5.2 Amplificarea materialului genetic (tehnica PCR) De obicei, cantitatea de material genetic ce se poate obine dintr-o prob biologic este prea mic pentru a permite analiza i manipularea acesteia. Din acest motiv a fost necesar punerea la punct a unei tehnici care s permit amplificarea materialului genetic in vitro. Aceasta este tehnica PCR (de la Polymerase Chain Reaction). Metoda a fost pus la punct n 1984 de ctre Kary Mullis, i a fost recompensat cu premiul Nobel. Stabilirea acestei tehnologiia fost posibil numai dup descoperirea unei polimeraze capabil s acioneze la temperaturi destul de ridicate (72 0C!), provenind de la o bacterie termofil, Thermus aquaticus (de unde i nmele enzimei, Taq polimeraz). Procedura const n introducerea n tubul de reacie urmtoarele substane: ADN care se dorete a fi amplificat; anumit cantitate (exces) de primeri (oligonucleotide care au de obicei 20 - 30 baze), cu o secvena astfel aleas nct s se hibridizeze pe molecula ADN iniial flancnd zona pe care dorim s o amplificm; exces din cele 4 nucleotide (trifosfat) Taq polimeraza Dup omogenizarea amestecului, se parcurg urmtoarele etape: 1. degenerarea ADN prin nclzirea probei la 95 0C, de obicei pentru o durat de15 s;

12


2. hibridizarea primer-ilor prin rcirea brusc a amestecului la 54 0C; n acest fel primer-i se cupleaz la capetele 3 ale celor dou lanuri complementare ale ADN iniial; ADN-ul nu se renatureaz tocmai din cauza primer-ilor care se afl n mare exces; 3. sinteza noului ADN este iniiat prin nclzirea amestecului de reacie la temperatura de lucru a Taq polimerazei (72 0C); tot ADN existent va fi replicat, conform celor descrise, n direcia 5 3; prelungirea catenei va depi zona de interes, i se va termina acolo unde se temin molecula ADN iniial (replici prea lungi) ale ADN iniial; Aceste 3 etape sunt repetate ciclic. La sfaritul celui de-al doilea ciclu, se vor obine, pe lng replici prea lungi i un set de replici corecte, care corespund strict zonei pe care dorim s o amplificm. Deoarece numrul acestora crete geometric cu nurul de cicluri, la sfritul procesului vom avea dor urme de ADN prea lung, i o catitate predominant de ADN avnd lungimea corect (vezi Fig. 17).NCEPE AL DOILEA CICLU secvena int exces primeri nclzire rcire

primeri polimerizare polimerizare

lanuri scurte

Fig. 17. Principiul tehnicii PCR

Dup 20 de cicluri se obine o amplificare de un milion de ori a cantitii iniiale, iar dup 30 de cicluri de un miliard de ori. Procedura este complet automatizat i dureaz n ansamblu cteva ore. Trebuiesc menionate cteva caracteristici importante ale acestei tehnici: 1. Nu este necesar cunoaterea ntregii secvene a ADN iniial, ci doar a dou fragmente care flancheaz zona pe care dorim s o amplificm; 2. ADN-ul de amplificat poate fi foarte mare comparativ cu primerii; 3. nu este necesar ca primerii s fie perfect potrivii secvenei flancurilor, ei se vor ataa suficient de puternic pentru a iniia polimerizarea; 4. PCR este foarte sensibil: se poate detecta i amplifica o singur molecul ADN!

13


5.3 Clonarea genelor Procesul de biosintez a enzimelor se afl sub controlul strict al sistemului celular, astfel nct ele sunt produse n cantitatea i la momentul n care prezena lor este necesar. Enzimele implicate n metabolismul obnuit al celulei sunt fabricate n cantiti mari, n timp ce alte enzime sunt produse doar n cantiti foarte mici, fcnd ca izolarea i purificarea acestora n vederea studierii lor s fie foarte anevoioas. Noua tehnologie a clonrii genelor permite obinerea unor cantiti rezonabile de proteine. Strategia este urmtoarea: ADN-ul genomic este tiat n mai multe fragmente (cu enzime de restricie), dintre care unele vor conine gena de interes. Aceste fragmente se insereaz ntr-un vector, care de obicei este o molecul ADN dublu helical i circular, numit plasmid, care are proprietatea c se replic spontan dac este inserat ntr-o gazd (host), cum ar fi E. coli. Dac plasmidul poate fi rupt cu aceeai enzim de restricie care s-a folosit i pentru ADN-ul de studiat, atunci fragmentul de ADN poate fi inserat i lipit n plasmid cu ajutorul unor enzime numite ligaze. Cel mai des utilizat vector este plasmidul numit pBR322 i derivai ai acestuia. Plasmidul conine gene de rezisten la ampicilin i tetraciclin, permind astfel selectarea culturilor care conin plasmidul. 5.4 Mutaii punctuale i ingineria genetic Exist mai multe tehnici prin care se pot fabrica# gene noi, care s exprime proteine avnd unul sau muli aminoacizi modificai. Cele mai des utilizate sunt: tergerile (deletions), inseriile i substituiile. tergerile. Un plasmid poate fi tiat n dou locuri cu o enzim de restricie, i ligat din nou, formnd un cerc mai mic. Prin aceast procedur se elimin ns fragmente mari. Dac se taie plasmidul ntr-un simgur loc, capetele obinute pot fi scurtate controlat cu alt enzim de restricie, apoi aplsmidul se supune ligrii. Noului plasmid i va lipsi un fragment scurt. Substituiile duc la obinerea unei singure mutaii. De exemplu s presupunem c vrem s nlocuim o anumit serin cu o cistein. Aceast mutaie se poate face numai dac: a) posedm plasmidul care conine gena proteinei respective i b) cunoatem secvena de baze din zona unde vrem s operm mutaia. Dac de exemplu serina respectiv este codat de tripleta TCT, vom schimba C cu G i vom obine cisteina (care este codat de TGT). Acest tip de mutaie se mai numete i mutaie punctual pentru c se nlocuiete o singur nucleotid. Procedura const n prepararea pe cale artificial a unei oligonucleotide primer complementar cu regiunea de interes, dar care conine TGT n loc de TCT. Plasmidul este apoi denaturat, se ataeaz primer-ul (care se va lega suficient de puternic, deoarece o nepotrivire de o baz azotat nucompromite legarea) i se iniiaz replicarea plasmidului prin PCR. Inseriile const n tierea unui plasmid n dou locuri, ndeprtarea unuia dintre fragmente, purificarea fragmentului de interes i inseria unui nou fragment (de obicei sintetic, cu secvena determinat i capete coezive, numit caset), urmat de ligarea plasmidului (Fig. 18).

14


1

2

plasmidul original se taie n punctele 1 i 2 se purific fragmentul mare

se adaug noua caset, se purific

plasmid cu gen nou

Fig. 18. Principiul mutagenezei prin inserie

15

Documents

Curs 5 Elemente de Genetica