Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Guilherme Hideki Yoshizane Costa
ESTUDO DA AÇÃO DE POLIÂNIONS SOBRE A ATIVIDADE DAS ENZIMAS
COLESTEROL ESTERASE E COLESTEROL OXIDASE, UTILIZANDO
LIPOPROTEÍNAS PLASMÁTICAS COMO SUBSTRATOS
BELO HORIZONTE
2015
Guilherme Hideki Yoshizane Costa
ESTUDO DA AÇÃO DE POLIÂNIONS SOBRE A ATIVIDADE DAS ENZIMAS
COLESTEROL ESTERASE E COLESTEROL OXIDASE, UTILIZANDO
LIPOPROTEÍNAS PLASMÁTICAS COMO SUBSTRATOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia da
Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para obtenção do Título de Mestre
em Bioquímica e Imunologia
Orientador: Dr. Jader dos Santos Cruz
Belo Horizonte
2015
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Aos meus pais e irmão, pelo amor e por me proporcionar todos os meios e caminhos
para eu alcançar meus sonhos.
À Rebeca, por todo amor, carinho e compreensão.
Ao Paulo Alexandre Alves de Almeida Neves, por todo companheirismo, empenho e
dedicação ao trabalho.
À Dra. Lara Carvalho Godoi, por todo apoio e compreensão durante o
desenvolvimento do mestrado.
Ao Jamil e Jaqueline, por todo companheirismo e auxílio na execução dos
experimentos.
Aos Colegas do Laboratório de Enzimologia e Físico-química de Proteínas e do
Laboratório de Sinalização Celular e Biotecnologia, pelo auxílio durante o
desenvolvimento das atividades técnicas.
Aos colegas de trabalho do Centro de Desenvolvimento, Inovação, Ciência e
Tecnologia, pelo companheirismo.
Ao Centro de Desenvolvimento, Inovação Ciência e Tecnologia e à Labtest
Diagnóstica S.A., pela oportunidade única e financiamento dos meus estudos.
Ao Dr. Leonides Rezende Junior, por todo apoio, ensinamentos e persistência em
nossos planos.
Ao Professor Dr. Marcelo Matos Santoro in memoriam, por ter me aceitado como
aluno e ser um grande exemplo de pesquisador.
If you want always to be right, you need
always to be prepared to change your mind.
C.G.P. Grey
RESUMO
Sugiuchi et al. (1995) desenvolveram um método direto para a determinação de
colesterol proveniente da lipoproteína de alta densidade (HDL), sem a necessidade de
procedimentos pré-analíticos. O teste consiste na formação de complexos solúveis das
apoB100-lipoproteínas com o poliânion α-ciclodextrina sulfato, o que reduz a ação das
enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase sobre lipoproteínas de baixa densidade
(LDL), muito baixa densidade (VLDL) e quilomicra. A inibição total da catálise enzimática
sobre as apoB100-lipoproteínas é alcançado após a ligação covalente de moléculas de
polietilenoglicol às superfícies das enzimas. Após essa ligação, somente as partículas de HDL
ficam disponíveis para ação da colesterol esterase e colesterol oxidase. O presente trabalho
verificou a capacidade de inibição da reação catalisada pelas enzimas colesterol esterase e
colesterol oxidase pelos poliânions: ácido fosfotúngstico, sacarose octassulfato, sulfato de
condroitina e α-ciclodextrina sulfato. Foram determinados parâmetros cinéticos para a enzima
colesterol esterase nativa e após adição de polietilinoglicol à sua superfície utilizando
calorimetria de titulação isotérmica. Os resultados evidenciaram que o ácido fosfotúngstico é
capaz de inibir satisfatoriamente a ação das enzimas sobre as apoB100-lipoproteínas. Os
valores da constante de Michaelis-Menten (Km) para colesterol esterase nativa utilizando
HDL e LDL foram de 4,26 μM de linoleato de colesterila e 13,14 μM de linoleato de
colesterila, respectivamente. Após a adição do polietilenoglicol à enzima o Km da enzima
utilizando HDL como substrato foi alterado para 21,6 μM de linoleato de colesterila. Os
resultados desse estudo fornecem o embasamento para o desenvolvimento de um reagente
para a determinação de colesterol HDL.
Palavras-chave: Colesterol, Lipoproteína, HDL, Poliânion, Peguilação, Calorimetria,
Colesterol esterase, Colesterol Oxidase.
ABSTRACT
Sugiuchi et al. (1995) developed a direct method to determine cholesterol from high
density lipoprotein, with no need for pre-analytical procedures. The assay consists of the
formation apoB100-lipoproteins' soluble complexes with α-cyclodextrin sulfate polyanion,
which reduces the action of the enzymes cholesterol esterase and cholesterol oxidase over low
density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and chylomicra. Total
inhibition of the enzymatic catalysis over apoB100-lipoproteins is achieved after the covalent
bonding of polyethyleneglycol on the enzymes’ surfaces. Only the HDL's particles are
available for the catalysis of cholesterol esterase and cholesterol oxidase. This study verified
the inhibition of the reactions catalyzed by cholesterol esterase and cholesterol oxidase by the
polyanions: phosphotungstic acid, sucrose octasulfate, chondroitin sulfate and α- cyclodextrin
sulfated. Kinetics parameters for the native enzyme cholesterol esterase and after the bonding
with polyethyleneglycol were also determinate. The results showed that phosphotungstic acid
is able to inhibit satisfactorily the enzymes' action over apoB100-lipoproteins. The Km's
values for native cholesterol esterase with HDL and LDL were 4,26 µM of cholesteryl
linoleate and 13,14 µM of cholesteryl linoleate, respectively. After the bound of
polyethyleneglycol on the cholesterol esterase surface the enzime’s Km for HDL was altered
to 21,6 µM of cholesteryl linoleate. The results of this study provide the knowledge to
develop a reagent used to determine HDL cholesterol.
Key words: Cholesterol, lipoprotein, HDL, Polyanion, PEGylation,Ccalorimetry; Cholesterol
esterase, Cholesterol oxidase.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Principais classes de lipoproteínas. Classificação de acordo com sua densidade
hidratada. Fonte: JONAS, 2008. ......................................................................... 19
FIGURA 2 – Sítios E e F da Apo B100 de ligação à heparina................................................. 23
FIGURA 3 - Mecanismo genérico de hidrólise por lipases...................................................... 24
FIGURA 4 – Etapas reacionais catalisadas pela enzima colesterol oxidase e estrutura do
substrato colesterol. ............................................................................................. 25
FIGURA 5 – Sítio ativo ChOx de Streptomyces ...................................................................... 26
FIGURA 6 – Canal de oxigênio para saída de peróxido de hidrogênio. .................................. 26
FIGURA 7 – Estrutura do polietilenoglicol (PEG). ................................................................. 27
FIGURA 8 – Concentração plasmática de PEG-L-asparaginase versus L-asparaginase em
camundongo. ....................................................................................................... 28
FIGURA 9 – Estabilidade térmica, 55 ºC – Lipase de Pseudomonas fluorescens nativa e
peguilada. ............................................................................................................ 29
FIGURA 10 – Ação de cloreto de magnésio (MgCl2) na reatividade relativa de colesterol em
várias frações de lipoproteínas em presença de colesterol esterase peguilada,
colesterol oxidase peguilada e α-ciclodextrina sulfatada. ................................... 30
FIGURA 11 – Estrutura do monometoxipolietilenoglicol (mPEG). ........................................ 31
FIGURA 12 – 1ª geração de PEG funcionalizado. ................................................................... 32
FIGURA 13 – PEGs tiol reativos. ............................................................................................ 33
FIGURA 14 – Peguilação reversível. ....................................................................................... 33
FIGURA 15 – Métodos enzimáticos para determinação de glicose e colesterol total. ............ 35
FIGURA 16 – Microscopia eletrônica da ação de agregação do poliânion sintético sobre HDL
e VLDL. .............................................................................................................. 38
FIGURA 17 – Métodos homogêneos para determinação de cHDL. ........................................ 39
FIGURA 18 – Esquema básico de um microcalorímetro. ........................................................ 41
FIGURA 19 – Termograma de reações químicas. ................................................................... 41
FIGURA 20 – Termograma de determinação de ΔHapp. .......................................................... 44
FIGURA 21 – Determinação de Km para β-glucosidade. ......................................................... 45
FIGURA 22 – Curva de saturação enzimática. ........................................................................ 46
FIGURA 23 - Sulfato de Condroitina A ................................................................................... 52
FIGURA 24 - α-ciclodextrina sulfato ....................................................................................... 53
FIGURA 25 - Sacarose Octassulfato FIGURA 26 - Dextran Sulfato ...... 53
FIGURA 27 – Aspecto da amostra após ultracentrifugação do soro. ...................................... 64
FIGURA 28 – Cinéticas enzimáticas das classes de lipoproteína. ........................................... 66
FIGURA 29 – Curva dose efeito para sulfato de condroitina. ................................................. 67
FIGURA 30 - Curva dose efeito para ácido fosfotúngstico. .................................................... 68
FIGURA 31 – Curva dose efeito para sacarose octassulfato.................................................... 68
FIGURA 33 – Curva dose efeito para α-ciclodextrina sulfato. ................................................ 70
FIGURA 34 – Curva dose efeito para α-ciclodextrina sulfato associada à dextran sulfato 0,5%
p/v. ....................................................................................................................... 70
FIGURA 35 – Cinética de reação das enzimas nativas sem poliânions em analisador
automático Labmax 240. ..................................................................................... 73
FIGURA 36 – Cinética de reação das lipoproteínas normalizadas para ABS inicial = 0,000. 74
FIGURA 37 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa, sem poliânioins
............................................................................................................................. 75
FIGURA 38 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa,
sem poliânions ..................................................................................................... 75
FIGURA 39 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa, sem poliânion
............................................................................................................................. 76
FIGURA 40 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa,
sem poliânions ..................................................................................................... 76
FIGURA 41 – Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa + 0,75 mmol·L-
1 de ácido fosfotúngstico. .................................................................................... 77
FIGURA 42 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa +
0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. ............................................................... 77
FIGURA 43 – Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. ...................................................................... 78
FIGURA 44 - Cinéticas de reação normalizadas das lipoproteínas utilizando enzimas
peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. ......... 78
FIGURA 45 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato ......................................................................................... 79
FIGURA 46 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa +
0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. .................................................................. 79
FIGURA 47 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. ........................................................................................ 80
FIGURA 48 - Cinéticas de reação normalizadas das lipoproteínas utilizando enzimas
peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. ............ 80
FIGURA 49 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa, sem poliânion. ..................................... 82
FIGURA 50 – Normalização das cinéticas de reação do reagente enzimático-colorimétrico
com 10 vezes a concentração de enzimas mPEG 5 kDa, sem poliânion. ........... 83
FIGURA 51 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa, sem poliânion. ................................... 83
FIGURA 53 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de ácido
fosfotúngstico. ..................................................................................................... 85
FIGURA 54 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com
10 vezes a concentração de enzimas mPEG 5 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de
ácido fosfotúngtico. ............................................................................................. 85
FIGURA 55 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de ácido
fosfotúngstico. ..................................................................................................... 86
FIGURA 56 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com
10 vezes a concentração de enzimas mPEG 10 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. ....................................................................................... 86
FIGURA 57 - Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato 87
FIGURA 58 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com
10 a concentração de enzimas mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina
sulfato. ................................................................................................................. 87
FIGURA 59 - Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato
............................................................................................................................. 88
FIGURA 60 – Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico com 10
vezes a concentração de enzimas mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina
sulfato. ................................................................................................................. 88
FIGURA 61 – Termograma da reação de CE com substrato HDL. ......................................... 92
FIGURA 62 – Titulação isotérmica da hidrólise de HDL por CE. .......................................... 93
FIGURA 63 – Cinética enzimática – CE substrato HDL. ........................................................ 93
FIGURA 65 – Termograma da reação de CE com substrato LDL. ......................................... 95
FIGURA 66 – Titulação isotérmica da hidrólise de LDL por CE. ........................................... 95
FIGURA 68 – Linearização de Lineweaver-Burk para CE + HDL. ........................................ 96
FIGURA 69 - Termograma da reação de CE-PEG 10 kDa com substrato HDL. .................... 98
FIGURA 70 – Titulação isotérmica da hidrólise de HDL por CE-PEG – 10 kDa. .................. 98
FIGURA 71 – Cinética enzimática – CE substrato HDL. ........................................................ 99
FIGURA 72 – Linearização de Lineweaver-Burk para CE-PEG 10 kDa + HDL. ................... 99
FIGURA 73 – Termograma da reação de CE-PEG 10 kDa com substrato LDL. .................. 100
FIGURA 74 – Separação de lipoproteínas por gradiente descontínuo de densidade. ............ 101
FIGURA 75 – Esquema da interação entre CE e lipoproteína. .............................................. 111
FIGURA 76 - Valores de ΔGapp, ΔHapp e -TΔSapp para reações catalisadas por CE. .............. 115
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição lipídica das classes de lipoproteínas .................................................. 20
Tabela 2 – Principais funções das apolipoproteínas ................................................................. 21
Tabela 3 – Principais apolipoproteínas humanas. .................................................................... 21
Tabela 4 – Teste ELISA para titulação de anticorpo de camundongo imunizado com proteína
nativa e peguilada .................................................................................................. 28
Tabela 5 – 1ª geração: Métodos de precipitação de LDL e VLDL por poliânion e cátion
bivalente ................................................................................................................. 37
Tabela 6 - Protocolo de ultracentrifugação............................................................................... 49
Tabela 7 – Composição do reagente enzimático colorimétrico. ............................................... 51
Tabela 8 – Procedimento para realização dos testes espectrofotométricos. ............................. 52
Tabela 9 - Poliânions ................................................................................................................ 54
Tabela 10 – Massa de mPEG-NHS 5 kDa e 10 kDa acionado à CE e ChOX. ......................... 56
Tabela 11 – Procedimento para determinação do grau de conjugação com mPEG-NHS ........ 58
Tabela 12 - Parâmetros constantes utilizados no microcalorímetro para determinação de ΔHapp
............................................................................................................................... 59
Tabela 13 - Protocolos e parâmetros variáveis utilizados no microcalorímetro para
determinação de ΔHapp ........................................................................................... 60
Tabela 14 - Parâmetros constantes utilizados no microcalorímetro para determinação de Km 62
Tabela 15 - Protocolos e parâmetros variáveis utilizados no microcalorímetro para
determinação de Km ............................................................................................... 62
Tabela 16 – Caracterização química e proteica das lipoproteínas ............................................ 65
Tabela 17 – Atividade residual dos poliânions sobre as atividades residuais das enzimas CE
eChOx utilizando as lipoproteínas LDL, HDL e VLDL como substrato .............. 71
Tabela 18 – Teste de ninidrina para determinação do grau de conjugação com mPEG-NHS . 72
Tabela 19 – Teste t-Student para comparativo das cinéticas enzimáticas. ............................... 89
Tabela 20 – Atividade residual das reações catalisadas pelas enzimas peguiladas .................. 90
Tabela 22 – Parâmetros enzimáticos para colesterol esterase ................................................ 100
Tabela 23 – Determinação de ΔGapp para as reações de hidrólise realizadas por CE ............ 115
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1 - 𝛥𝐸 = 𝑄 + 𝑊
Equação 2 - 𝑊 = − 𝑃𝛥𝑉
Equação 3 - 𝛥𝐸 = 𝑄 − 𝑃𝛥𝑉
Equação 4 - 𝑄 = 𝛥𝐸 − 𝑃𝛥𝑉
Equação 5 - 𝑄 = 𝛥𝐻 = 𝛥𝐸 − 𝑃𝛥𝑉
Equação 6 - 𝛥𝐻 = 𝑄 = 𝛥𝐸
Equação 7 - 𝛥𝐻𝑎𝑝𝑝 =
1
𝑆 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 × 𝑉
𝑑𝑄(𝑡)
𝑑𝑡
𝑡=∞
𝑡=0
𝑑𝑡
Equação 8 - 𝑣 =𝑑 𝑃
𝑑𝑡=
1
𝑉 ∙ ∆𝐻app
∙𝑑𝑞
𝑑𝑡
Equação 9 - 𝐾𝑐𝑎𝑡 =𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐸0
Equação 10 - 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑚𝑀 = 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑀 − 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑙𝑖𝑣𝑟𝑒 (𝑚𝑀)
Equação 11 - 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (%) =𝐴𝐵𝑆 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑎çã𝑜 𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛ç𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑙𝑖â𝑛𝑖𝑜𝑛
𝐴𝐵𝑆 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑎çã𝑜 𝑠𝑒𝑚 𝑝𝑜𝑙𝑖â𝑛𝑖𝑜𝑛× 100
Equação 12 - 𝑔𝑟𝑎𝑢 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑔𝑎çã𝑜 (%) = 1 − 𝐴𝐵𝑆 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑃𝑒𝑔𝑢𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎 − 𝐴𝐵𝑆 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑁𝐻𝑆
𝐴𝐵𝑆 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑁𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 − 𝐴𝐵𝑆 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 á𝑔𝑢𝑎 × 100
Equação 13 - 1
𝑣=
𝐾𝑚
𝑉max [𝑆]+
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
Equação 14 - 𝐾𝑚 =𝑘−1 + 𝑘2
𝑘1
Equação 15 - ∆𝐺 = 𝑅𝑇𝐿𝑛𝐾𝑑
Equação 16 - 𝐾𝑑 = 𝐸 𝑆
𝐸𝑆
Equação 17 - 𝐾𝑚 = 𝐸 𝑆
𝐸𝑆
Equação 18 - 𝐾𝑑 =𝐾−1
𝐾1
Equação 19 - ∆𝐺𝑎𝑝𝑝 = ∆𝐻𝑎𝑝𝑝 − 𝑇∆𝑆𝑎𝑝𝑝
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CE Colesterol esterase
c-HDL Colesterol HDL
ChOx Colesterol oxidase
CM Quilomicra
DAC Doença arterial coronariana
DP Potência diferencial (Differencial Power)
EMSE N-etil-N-(3-metil fenil)-N'-succinil etilenodiamina
FAD Flavina adenina nucleotídeo
HDL Lipoproteína de alta densidade (High density lipoprotein)
ITC Calorimetria de titulação isotérmica (Isothermal titration calorimetry)
KBr Brometo de potássio
kDa Quilodalton
LCAT Lecitina acil transferase
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein)
MgCl2 Cloreto de magnésio
mPEG Monometoxipolietilenoglicol
mPEG-NHS Monometoxipolietilenoglicol succinimidil carbonato
NaCl Cloreto de sódio
PEG Polietilenoglicol
SUS Sistema Único de Saúde
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade (Very low density lipoprotein)
G Energia livre (energia de Gibbs)
H Entalpia
S Entropia
T Temperatura termodinâmica
R Constante dos gases ideais = 1,987 cal·K−1·
mol−1
ΔGapp Variação da energia livre aparente
ΔHapp Variação da entalpia aparente
ΔSapp Variação da entropia aparente
Km Constante de Michaelis-Menten
Vmax Velocidade máxima da reação enzimática
kcat Número de renovação
[E] Concentração da enzima
[S] Concentração do substrato
[P] Concentração do produto
k1 Constante cinética de formação complexo enzima substrato
k-1 Constante cinética de dissociação do complexo enzima substrato
k2 Constante catalítica
Sumário
1 Introdução....................................................................................................................................... 17
2 Revisão da literatura ...................................................................................................................... 19
2.1 Lipoproteínas: estrutura, composição, função e interação com glicosaminoglicanos ........... 19
2.1.1 Principais classes de lipoproteínas ................................................................................ 19
2.1.2 Conteúdo lipídico .......................................................................................................... 20
2.1.3 Conteúdo proteico ......................................................................................................... 20
2.1.4 Interação de lipoproteínas com glicosaminoglicanos .................................................... 22
2.2 Enzimas envolvidas na determinação de colesterol HDL ..................................................... 23
2.2.1 Colesterol esterase: mecanismo de reação .................................................................... 23
2.2.2 Colesterol oxidase: mecanismo de reação e sítio ativo ................................................. 24
2.2.3 Reação catalisada pela colesterol oxidase ..................................................................... 24
2.3 Modificação química: conjugação com polietilienoglicol .................................................... 27
2.3.1 Aplicações biomédicas .................................................................................................. 27
2.3.2 Aplicações biotecnológicas ........................................................................................... 29
2.3.3 Química da peguilação. ................................................................................................. 30
2.4 Determinação de colesterol HDL .......................................................................................... 34
2.4.1 Determinação de colesterol total ................................................................................... 34
2.4.2 Evolução dos métodos para determinação de cHDL ..................................................... 36
2.5 Calorimetria de Titulação Isotérmica .................................................................................... 40
2.5.1 Microcalorímetro de titulação isotérmica ...................................................................... 40
2.5.2 Termodinâmica básica de calorimetria de titulação isotérmica..................................... 42
2.5.3 Determinação de parâmetros cinéticos enzimáticos utilizando ITC ............................. 43
3 Objetivos ......................................................................................................................................... 47
3.1 Objetivos Gerais .................................................................................................................... 47
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................ 47
4 Materiais e métodos ....................................................................................................................... 48
4.1 Separação de lipoproteínas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de densidade 48
4.1.1 Materiais ........................................................................................................................ 48
4.1.2 Procedimento experimental ........................................................................................... 49
4.2 Determinação do conteúdo químico e proteico das lipoproteínas ......................................... 50
4.2.1 Materiais ........................................................................................................................ 50
4.2.2 Procedimento experimental ........................................................................................... 50
4.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânion ...................................................... 51
4.3.1 Reagente enzimático-colorimétrico ............................................................................... 51
4.3.2 Seleção de poliânions .................................................................................................... 52
4.4 Materiais ................................................................................................................................ 54
4.4.1 Procedimento experimental ........................................................................................... 54
4.5 Conjugação com monometoxipolietilenoglicol succinimidil carbonato ............................... 55
4.5.1 Materiais ........................................................................................................................ 55
4.5.2 Procedimento experimental ........................................................................................... 56
4.6 Determinação de variação de entalpia aparente de reação – ITC .......................................... 59
4.6.1 Materiais ........................................................................................................................ 59
4.6.2 Procedimento experimental ........................................................................................... 59
4.7 Determinação da constante de Michaelis-Menten ................................................................. 61
4.7.1 Materiais ........................................................................................................................ 61
4.7.2 Procedimento experimental ........................................................................................... 61
5 Resultados ....................................................................................................................................... 64
5.1 Separação de lipoproteínas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de densidade 64
5.2 Determinação do conteúdo químico e proteico das lipoproteínas ......................................... 65
5.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânion ...................................................... 66
5.3.1 Cinéticas de reação das classes de lipoproteínas ........................................................... 66
5.3.2 Seleção de poliânions .................................................................................................... 67
5.4 Conjugação com monometoxipolietilenoglicol succinimidil carbonato ............................... 72
5.5 Ensaios para determinação da atividade residual das enzimas peguiladas associadas a 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico ........................................................................................ 73
5.5.1 Reagente enzimático-colorimétrico contendo 10 vezes a concentração de enzimas ..... 82
5.5.2 ............................................................................................................................................... 89
5.6 Determinação da variação de entalpia aparente de reação e constante de Michaelis-Menten.
............................................................................................................................................. 92
5.6.1 Enzimas nativas – substrato lipoproteínas. .................................................................... 92
5.6.2 Colesterol esterase peguilada – substrato lipoproteínas. ............................................... 97
6 Discussão ....................................................................................................................................... 101
6.1 Separação de lipoproteínas e determinação de suas características químicas e proteicas. .. 101
6.2 Peguilação das enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase ........................................ 103
6.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânions ................................................... 105
6.3.1 Ensaios de determinação da atividade residual para enzimas peguiladas associadas a
0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. ...................................................................................... 107
6.4 Determinação de variação da entalpia aparente de reação e constante de Michaelis-Menten.
........................................................................................................................................... 110
6.4.1 Determinação de ΔHapp ................................................................................................ 110
6.4.2 Determinação de Km .................................................................................................... 111
6.5 A reação é entalpica ou entropicamente dirigida? ............................................................... 113
7 Conclusão ...................................................................................................................................... 117
8 Perspectivas .................................................................................................................................. 118
Referências ......................................................................................................................................... 119
Apêndice 1 .......................................................................................................................................... 125
Apêndice 2 .......................................................................................................................................... 126
17
1 INTRODUÇÃO
Desde 1977 sabe-se que indivíduos com níveis elevados de colesterol ligado às
lipoproteínas de alta densidade (colesterol HDL - cHDL) apresentam menor prevalência de
doenças arteriais coronarianas (DAC) (CASTELLI et al., 1977). Atualmente, a determinação
do cHDL é um parâmetro clínico comumente solicitado por médicos para avaliação de risco
de doenças correlacionadas ao sistema cardiovascular. No ano de 2013, somente o Sistema
Único de Saúde (SUS), realizou 18.671.654 testes para determinação de cHDL, com um gasto
de R$ 64.947.809,27. Esse valor corresponde a 8,5% de todo o recurso destinado à realização
de exames laboratoriais, dentro do grupo de bioquímica. (BRASIL, 2014).
Para determinação de cHDL é necessário que o sistema analítico seja capaz de detectar
somente o colesterol ligado às lipoproteínas de alta densidade. Já foram descritos vários
métodos para a determinação de cHDL e os artifícios para inibir a participação das
lipoproteínas de baixa densidade, muito baixa densidade e quilomicra na reação de
determinação do colesterol plasmático são diferentes. Os artifícios contemplam: separação por
ultracentrifugação, precipitação de ApoB-lipoproteínas, complexação de ApoB-lipoproteínas
por anticorpos anti-ApoB, modificação das enzimas envolvidas na reação para diminuir a
interação com as ApoB-lipoproteínas, dentre outros (WARNICK et al., 2001).
Sugiuchi et al. (1995) desenvolveram um reagente para a determinação de colesterol
HDL que utiliza a α-ciclodextrina sulfatada e a modificação química das enzimas colesterol
esterase e colesterol oxidase, por meio de adição de moléculas de polietilenoglicol; visando
reduzir suas afinidades pelas ApoB-lipoproteínas. A vantagem do seu método é a capacidade
de ser utilizado por analisadores automáticos, sem a necessidade de realizar qualquer pré-
tratamento da amostra geralmente laborioso, que incluem pipetagem manual ou centrifugação.
Sugiuchi et. al. (1995) demonstram que α-ciclodextrina sulfatada auxilia na redução
da interação das enzimas com ApoB-lipoproteinas e que as constantes de Michaelis-Menten,
(Km), das enzimasmodificadas quimicamente não diferem dos Km das enzimas nativas, quando
utilizado o linoleato de colesterol e colesterol livre como substratos. Embora o autor não tenha
evidenciado alteração dos Km das enzimas modificadas, os substratos utilizados não
correspondem à complexidade de uma lipoproteína.
18
INTRODUÇÃO
Se for considerado que a modificação química é realizada para diminuir a interação
das enzimas com ApoB-lipoproteínas, seria possível imaginar que houvesse alteração nos Km
das enzimas modificadas, quando consideradas as lipoproteínas como substrato. Seria
interessante então, avaliar outros poliânions que exercem a mesma função, já que α-
ciclodextrina sulfatada tem um custo elevado.
O presente trabalho teve como intuito o estudo de outros poliânions como agentes
redutores da interação ApoB-lipoproteínas/enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase e
determinação dos Km’s para as enzimas nativas e alteradas quimicamente utilizando
lipoproteínas humanas como substrato.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Lipoproteínas: estrutura, composição, função e interação com glicosaminoglicanos
Lipoproteínas são complexos solúveis de proteínas (apolipoproteínas) e lipídeos que
têm como função o transporte de lípides pela circulação sanguínea (JONAS, 2008).
2.1.1 Principais classes de lipoproteínas
Apesar de apresentarem diferenças estruturais (composição de apolipoproteínas), de
interagirem com diferentes receptores e participarem de diferentes vias metabólicas, a
classificação mais usual das lipoproteínas é com base na sua densidade hidratada. Sendo
denominadas, em ordem crescente de densidade hidratada (FIGURA 1): Quilomicra (em
inglês: Chylomicra, CM); Lipoproteína de muito baixa densidade (em inglês: Very Low
Density Lipoprotein, VLDL); Lipoproteína de baixa densidade (em inglês: Low Density
Lipoprotein, LDL) e Lipoproteína de alta densidade (em inglês: High Density Lipoprotein,
HDL) (JONAS, 2008).
FIGURA 1 - Principais classes de lipoproteínas. Classificação de acordo com sua
densidade hidratada. Fonte: JONAS, 2008.
20
REVISÃO DA LITERATURA
As funções principais das lipoproteínas são determinadas pelas apolipoproteínas e o
conteúdo de lipídeos. Os quilomicra são sintetizados no intestino para transporte de
triglicerídeos, provenientes da dieta, para vários tecidos. O VLDL é sintetizado no fígado para
exportar triglicerídeos endógenos, enquanto, o LDL é originado pela transformação
metabólica do VLDL na circulação. O LDL tem como função o transporte de éster de
colesterol para tecidos periféricos e fígado. O HDL é sintetizado no fígado, intestino ou é
originado de transformações metabólicas de outras lipoproteínas na circulação, assim como,
lipídeos de origem celular nas membranas celulares. A função principal do HDL é remover o
excesso de colesterol das células e transportá-lo para o fígado e tecidos esteroidogênicos.
(JONAS, 2008).
2.1.2 Conteúdo lipídico
O revestimento externo de todas as lipoproteínas é composto por uma monocamada
de fosfolípides, apolipoproteínas e colesterol livre. O seu conteúdo interno é constituído de
triglicerídeos, colesterol esterificado e colesterol livre. A quantidade total de lípides na
constituição da lipoproteína é inversamente proporcional à sua densidade (Tabela 1).
Tabela 1 – Composição lipídica das classes de lipoproteínas
CM VLDL LDL HDL
Densidade (g/mL) < 0,94 0,94-1,006 1,006-1,063 1,063-1,210
Lípides totais (% m/m) 98-99 90-92 75-80 40-48
Ésteres de ácido graxo (% m/m) 81-89 50-58 7-11 6-7
Éster de Colesterol (% m/m) 2-4 15-23 47-51 24-45
Colesterol livre (% m/m) 1-3 4-9 10-12 6-8
Fosfolipides (% m/m) 7-9 19-21 28-30 42-51
A maioria dos ésteres de ácido graxo são triacilgliceróis (96%), somente uma pequena quantidade é composta
por diacil e monoacilgliceróis. Fonte: Adaptado de SKIPSKI, 1967.
2.1.3 Conteúdo proteico
As apolipoproteínas apresentam diferentes funções nas lipoproteínas: auxiliam na
manutenção da estrutura micelar, solubilização de lipídeos na circulação, reconhecimento por
receptores de lipoproteínas e modulação enzimática (Tabela 2) (BOLANOS-GARCIA e
MIGUEL, 2003). As apolipoproteínas podem ser divididas em dois grandes grupos: o
21
REVISÃO DA LITERATURA
primeiro é composto por apolipoproteínas circulantes, pequenas proteínas solúveis que podem
ser transferidas entre lipoproteínas, designadas apoA1, apoA2, apoA4, apoC1, apoC2, apoC3
e apoE; o segundo grupo é composto pelas apolipoproteínas não circulantes, proteínas que
não podem ser transferidas de uma lipoproteína para outra, chamadas apoB48 e apoB100. A
sua distribuição nas lipoproteínas não é homogênea, sendo que algumas apolipoproteínas só
estão presentes em algumas classes de lipoproteínas (Tabela 3).
Tabela 2 – Principais funções das apolipoproteínas
Apolipoproteína Principal(is) função(ões)
Circulantes
ApoA1 Ativador de Lecitina aciltransferase (LCAT)
ApoA2 Manutenção da estrutura de HDL e controle no transporte reverso de
colesterol.
ApoC1, C2, C3 Regulação das enzimas envolvidas no metabolismo de lipoproteínas.
ApoE Clearance de VLDL e quilomicron, captura de lipoproteínas pelo fígado e
sítios periféricos.
Não Circulantes
ApoB100 Manutenção da estrutura de VLDL e LDL; ligante do receptor de LDL.
ApoB48 Manutenção da estrutura de quilomícron.
Fonte: BOLAÑOS-GARCIA e MIGUEL, 2003.
Tabela 3 – Principais apolipoproteínas humanas.
Apolipoproteína Peso molecular
(Da)
Classe de
lipoproteína a
Concentração
plasmática (mg/dL)
ApoA1 28.100 HDL, CM 130
ApoA2 17.400 HDL 40
ApoA4 44.500 CM 15
Apo(a) 3-8 x 105
Lp (a) 0,1–40
ApoB100 512.000 LDL, VLDL 100
ApoB48 b
242.000 CM
ApoC1 6.600 VLDL, CM, HDL 3
ApoC2 9.000 VLDL, CM, HDL 12
ApoC3 9.000 VLDL, CM, HDL 12
ApoDc
22.000 HDL 12
ApoE 34.200 VLDL, CM, HDL 7 a Em negrito são destacadas as principais lipoproteínas que contêm a apolipoproteína.
bApo B48 corresponde a 48% da sequência n-terminal da Apo B100. Ambas são glicoproteínas presentes em
diferentes quantidades dependendo do estado de alimentação e das concentrações dos quilomicra. c Apo D pertence à família da lipocalina, mas seu papel no metabolismo não é conhecido.
Fonte: Adaptado de JONAS, 2008.
22
REVISÃO DA LITERATURA
2.1.4 Interação de lipoproteínas com glicosaminoglicanos
As apolipoproteínas ApoB100 e ApoE apresentam características únicas dentre as
demais, tendo a capacidade de se ligar ao receptor de LDL e a uma variedade de
glicosaminoglicanos.
Lindahl e Hook (1978) definem glicosaminoglicanos como polissacarídeos
encontrados em tecidos animais, que usualmente estão covalentemente ligados à proteína. Sua
cadeia central de carboidratos é composta por unidades alternadas de ácido urônico (ácido L-
idurônico e/ou ácido D-glucurônico) e hexosamina. Esses polissacarídeos são distinguidos
pela composição de seus monômeros, pela posição e configuração das ligações glicosídicas e
pela localização e quantidade dos grupos sulfatos substituintes. Sete tipos são comumente
reconhecidos, dos quais seis são estruturalmente relacionados por serem sulfatados (somente
hialuronato não é sulfatado).
Apesar de não ser claro o motivo fisiológico pelo qual as lipoproteínas ligam-se aos
glicosaminoglicanos, sugere-se que essa ligação ocorra porque a lipase lipoprotéica liga-se ao
tecido endotelial por proteoglicanos (proteínas ligadas a glicosaminoglicanos) e a interação
das apolipoproteínas com glicosaminoglicanos favoreça a ancoragem da lipoproteína na
parede do vaso sanguíneo facilitando a ação da lipase. A interação das apolipoproteínas
ApoB100 e ApoE com glicosaminoglicanos dos vasos sanguíneos pode estar relacionada com
a patogênese de doenças cardiovasculares. Modificações químicas nos resíduos de
aminoácidos das apolipoproteínas ApoE e ApoB100 demonstraram que resíduos de lisina e
arginina estão envolvidos nas interações com o receptor de LDL e glicosaminoglicanos.
Existem seis sítios de ligação à heparina sódica na ApoB100, sendo que os sítios com maior
afinidade, E e F (FIGURA 2) são os que apresentam maior concentração de aminoácidos
básicos, o que justifica sua maior afinidade (WEISGRABER e RALL, 1987).
23
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 2 – Sítios E e F da Apo B100 de ligação à heparina. Os sítios de ligação da heparina possuem elevada concentração de resíduos de aminoácidos básicos. Fonte:
WEISGRABER e RALL, 1987
2.1.4.1 Interação de lipoproteínas com heparina na presença de cátions bivalentes
Uma das principais maneiras para isolar as lipoproteínas LDL e VLDL do soro é a
utilização da combinação de glicosaminoglicanos e cátions bivalentes. Essa associação leva à
formação de complexos insolúveis que podem ser isolados por centrifugação convencional. O
processo de separação apresenta especificidade e rendimento adequados, sem promover
alteração na lipoproteína ou necessidade de utilização de ultracentrifugação (BURSTEIN et
al., 1970). Srinivasan et al. (1975) estudaram a seletividade da interação entre as
lipoproteínas HDL, LDL e VLDL na presença de heparina e Ca++
, Mg++
e Mn++
. O estudo
demonstrou que os cátions cálcio e magnésio levam à formação de complexos insolúveis com
LDL e VLDL, diferentes do cátion manganês que promove a precipitação de HDL, LDL e
VLDL na presença de heparina. Esse fenômeno da interação seletiva das moléculas de LDL e
VLDL na presença de Mg++
e glicosaminoglicanos foi utilizado por Sugiuchi et al. (1995)
para promover as reações seletivas entre o colesterol HDL e as enzimas colesterol esterase e
colesterol oxidase peguiladas, na presença de α-ciclodextrina sulfatada e Mg++
.
2.2 Enzimas envolvidas na determinação de colesterol HDL
2.2.1 Colesterol esterase: mecanismo de reação
Colesterol esterase (CE) é nome antigo dado à enzima carboxil éster lipase. Essa
enzima é uma lipase não específica capaz de hidrolisar ésteres de colesterol, tri,-di- e
24
REVISÃO DA LITERATURA
monoacilglicerol, fosfolípides, lisofosfolípedes e ceramidas (HU e HOWLES, 2002). A CE é
utilizada em vários métodos para a determinação de colesterol por meio da hidrólise de
ésteres de colesterol (ARRANZ et al., 1994).
A atividade hidrolítica da CE (FIGURA 3) é conferida pela tríade catalítica
constituída pelos resíduos de aminoácidos Ser-His-Asp, semelhante a outras lipases. O
resíduo de serina é responsável pelo ataque nucleofílico à carboxila do éster. A histidina
auxilia na formação do estado intermediário tetraédrico e promove a remoção do próton da
serina, aumentando o seu caráter nucleofílico. O aspartato interage com o resíduo de histidina
aumentando o pKa da base, o que aumenta a força de interação do resíduo de histidina com o
próton da serina. Dessa maneira o resíduo de serina se torna mais nucleofílico (HUI;
HOWLES, 2002).
FIGURA 3 - Mecanismo genérico de hidrólise por lipases. No primeiro momento é mostrado a ação do resíduo de aspartato sobre o resido de histidina, o que acarreta no
aumento do pKa da base. Em seguida, ocorre o captura do próton do resíduo de serina, seguido pelo ataque
nucleofílico à carbonila do éster, denominado intermediário tetraédrico. Por fim, ocorre liberação do álcool que
compunha o éster. Fonte: Adaptado de CYGLER e SCHRAG, 2007
2.2.2 Colesterol oxidase: mecanismo de reação e sítio ativo
Colesterol oxidases (ChOx) são flavoproteínas que catalisam o primeiro passo da
degradação do colesterol. Essas enzimas contêm uma única molécula de flavina-adenina
dinucleótido (FAD) aderido à sua estrutura como coenzima para realização de reações redox.
ChOx é uma ferramenta biotecnológica de grande utilidade, utilizada em reagentes para a
determinação de concentração de colesterol sérico e potencial uso como larvicida e inseticida
(VEIRLINK e GHISLA, 2009).
2.2.3 Reação catalisada pela colesterol oxidase
ChOx catalisa três conversões químicas (FIGURA 4). A primeira conversão é a de
desidrogenação do álcool na posição 3 do anel esteroide. Os dois prótons, um proveniente do
25
REVISÃO DA LITERATURA
álcool e outro da ligação C-H, juntamente com um par de elétrons, são transferidos para o
cofator FAD promovendo sua redução. No segundo passo catalítico, o FAD reduzido
transfere o par de prótons e elétrons recebidos para uma molécula de oxigênio (O2)
produzindo peróxido de hidrogênio. Finalmente, o esteroide oxidado passa por um processo
de isomerização da dupla ligação do anel esteroide.
FIGURA 4 – Etapas reacionais catalisadas pela enzima colesterol oxidase e estrutura do
substrato colesterol. 1ª etapa: oxidação do colesterol; 2ª etapa: transferência do par de elétrons para molécula de O2; 3ª etapa:
isomerização da dupla ligação. Fonte: VEIRLINK e GHISLA, 2009
2.2.3.1 Sítio ativo da colesterol oxidase
O sítio ativo da enzima (FIGURA 5) possui um profundo bolsão hidrofóbico capaz
de acomodar o anel esteroide. O sítio de ligação é selado do ambiente externo por meio de
alças, que devem se reorientar para permitir a entrada do substrato esteroide no bolsão
hidrofóbico (YUE et al., 1999). A entrada de oxigênio e saída de peróxido de hidrogênio do
sitio ativo da enzima ocorre por um canal de oxigênio que se estende do exterior da enzima
até o bolsão hidrofóbico (FIGURA 6) (CHEN et al., 2008).
26
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 5 – Sítio ativo ChOx de Streptomyces Molécula de colesterol em roxo, localizada dentro do bolsão hidrofóbico. Fonte: VEIRLINK e GHISLA, 2009
FIGURA 6 – Canal de oxigênio para saída de peróxido de hidrogênio. Canal de oxigênio estendendo-se do exterior da enzima até o bolsão hidrofóbico, molécula de oxigênio pode ser
visualizada no interior do canal. Fonte: CHEN et al., 2008.
27
REVISÃO DA LITERATURA
2.3 Modificação química: conjugação com polietilienoglicol
Proteínas conjugadas com polietilenoglicol (PEG) (FIGURA 7) pertencem a uma
diferente classe de biocompostos que não são considerados proteínas ou outros polímeros
orgânicos, mas um híbrido dos dois (BAILON e BERTHOLD, 1998). A conjugação de
proteínas com polietilenoglicol teve início na década de 70 com o pesquisador Frank F. Davis
que estudava mecanismos de redução da imunogenicidade de proteínas por meio de
conjugação de carboidratos com sua estrutura. Entretanto, durante seus estudos as
características físico-químicas e toxicológicas do PEG se apresentaram mais adequadas para
conjugação proteica do que os carboidratos. O PEG apresenta solubilidade em vários
solventes orgânicos, mas precipita-se com adição de outro solvente, o que favorece a
funcionalização e recuperação do PEG funcionalizado. O polímero é solúvel em soluções
aquosas, sua estrutura é flexível, não ramificada e pode apresentar um único grupo terminal
hidroxil para funcionalização e ligação às proteínas. O PEG apresenta baixa toxicidade, o que
o torna um bom material para uso in vivo (DAVIS, 2002).
FIGURA 7 – Estrutura do polietilenoglicol (PEG).
2.3.1 Aplicações biomédicas
A conjugação de PEG, chamada de peguilação, a proteínas de interesse médico
promove melhorias em suas propriedades farmacocinéticas e toxicológicas. O processo de
peguilação promove aumento no tempo de meia-vida da proteína in vivo, o que se deve à
redução da suscetibilidade à degradação enzimática e diminuição da filtração renal, causado
pelo aumento do tamanho aparente da proteína (FIGURA 8). A imunogenicidade das
proteínas também é reduzida porque eventuais epítopos são peguilados (Tabela 4). A
toxicidade da proteína peguilada é menor quando comparado com a proteína nativa
(FUERTGES e ABUCHOWSKI, 1990).
28
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 8 – Concentração plasmática de PEG-L-asparaginase versus L-asparaginase
em camundongo. A conjugação da aparaginase com PEG promoveu aumento no tempo de circulação plasmática quando
comparado com a enzima na forma nativa. Fonte: FUERTGES e ABUCHOWSKI, 1990
Tabela 4 – Teste ELISA para titulação de anticorpo de camundongo imunizado com
proteína nativa e peguilada
Antisoro contra Via de
administração
IgG + IgM
+ IgA IgG IgM
superóxido dismutase Intraperitoneal 1:156.250 1:156.250 1:12.500
PEG - superóxido dismutase Intraperitoneal 1:320 1:50 1:20
PEG - superóxido dismutase Intramuscular 1:640 1:100 1:40
A proteína nativa e a PEG superóxido dismutase foram administradas na dose de 0,1
mg/semana , durante 12 semanas. Fonte: FUERTGES e ABUCHOWSKI, 1990
O principal tratamento para infecções causadas pelo vírus da hepatite C é realizado
com interferon-α2b peguilado. Os estudos clínicos demonstraram que a molécula apresenta
tempo de meia vida muito superior quando se comparado à forma não peguilada (GLUE et
al., 2000).
29
REVISÃO DA LITERATURA
2.3.2 Aplicações biotecnológicas
O processo de peguilação promove alterações nas características físico-químicas das
proteínas. Dentre as alterações, há aumento da solubilidade das proteínas em solventes
orgânicos (benzeno, tolueno e haletos de alquila) devido à modificação de sua superfície após
a adição do PEG, que é uma molécula anfifílica. Em consequência ao aumento da
solubilidade em solventes orgânicos, novas possibilidades de utilização das enzimas são
criadas (INADA et al., 1995):
Hidrólise reversa em meio orgânico;
Aumento de catálise de substratos hidrofóbicos;
Síntese estereoespecífica em meio hidrofóbico;
Síntese de compostos instáveis em meios aquosos;
Aumento de termoestabilidade em meios aquosos e hidrofóbicos.
O aumento da estabilidade térmica é de grande interesse comercial, já que proteínas
mais estáveis podem resultar em processos industriais mais robustos e medicamentos com
maior estabilidade. Hiroto et al. (1992) avaliaram a estabilidade térmica de lipase peguilada e
nativa de Pseudomonas fluorescens, em meio orgânico e concluíram que a modificação
estrutural da esterase promoveu aumento da estabilidade térmica para a enzima (FIGURA 9).
FIGURA 9 – Estabilidade térmica, 55 ºC – Lipase de Pseudomonas fluorescens nativa e
peguilada. Curva A – atividade lipase peguilada; Curva B – atividade da síntese de éster em benzeno da lipase peguilada;
Curva C – atividade da lipase nativa. Fonte: HIROTO et al., 1992
30
REVISÃO DA LITERATURA
Outra aplicação para proteínas peguiladas foi desenvolvida por Sugiuchi et. al.
(1995) que criou um método para determinação direta de colesterol HDL. As enzimas
colesterol esterase e colesterol oxidase, após serem modificadas pela adição de PEG 6
quilodalton (kDa), interagem com a fração HDL das lipoproteínas e, parcialmente, com LDL,
VLDL ou quilomícron. A inibição completa da interação com LDL e VLDL e quilomícron foi
alcançada na presença de cátion magnésio e α-ciclodextrina sulfatada (FIGURA 10).
FIGURA 10 – Ação de cloreto de magnésio (MgCl2) na reatividade relativa de colesterol
em várias frações de lipoproteínas em presença de colesterol esterase
peguilada, colesterol oxidase peguilada e α-ciclodextrina sulfatada. O aumento na concentração de cátions magnésio promoveu aumento na inibição da reação catalisada por CE
peguilada e ChOx peguilada somente sobre as ApoB-lipoproteínas. A inibição máxima foi alcançada com 2 mM
de Mg++
. ○, HDL; ●, LDL; Δ, VLDL e ▲quilomicron. FONTE: SUGIUCHI et al., 1995
2.3.3 Química da peguilação.
Para realizar o acoplamento de polietilenoglicol a uma molécula (e.g. peptídeos,
polissacarídeos, polinucleotídeos e pequenas moléculas orgânicas) é necessário modificar o
PEG, adicionando um grupo funcional em uma ou ambas as hidroxilas terminais do polímero.
O grupo funcional é escolhido de acordo com o grupo reativo da molécula que será ligada ao
polímero. Para as proteínas, os aminoácidos mais usuais para realização do acoplamento são:
lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina.
Grupos amino-terminal e ácido carboxílico-terminal também podem ser acoplados ao PEG.
Entretanto, a rota mais comum de conjugação tem sido por meio dos grupamentos amina
presente em resíduos de lisina e N-terminal de proteínas.
31
REVISÃO DA LITERATURA
Apesar de ambas as hidroxilas do PEG poderem ser funcionalizadas, prefere-se a
utilização do monometoxipolietilenoglicol (mPEG) (FIGURA 11) para peguilação de
proteínas, o que evita a formação de crosslink entre as moléculas (ROBERTS et al., 2002).
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
FIGURA 11 – Estrutura do monometoxipolietilenoglicol (mPEG).
2.3.3.1 1ª Geração de PEG funcionalizados
As moléculas de PEG utilizadas para acoplamento em proteínas podem ser divididas
em duas gerações. As moléculas da primeira geração são menos seletivas e apresentam baixo
grau de pureza. Com a segunda geração de PEGs funcionalizados foi obtido maior
seletividade para a conjugação e a criação de acoplamentos reversíveis.
A primeira geração de PEGs funcionalizados liga-se às proteínas por meio de
formação de carbamatos. Os grupamentos amina da proteína realizam um ataque nucleofílico
à carbonila do PEG funcionalizado, formando um carbamato e liberando o grupo abandonador
(FIGURA 12). Apesar da reação de acoplamento se proceder principalmente com aminas
primárias, provenientes de resíduos lisinas e N-terminal, reações colaterais com resíduos de
histidina e tirosina também podem ocorrer (ROBERTS et al., 2002).
32
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 12 – 1ª geração de PEG funcionalizado.
1, PEG diclorotriazina; 2, PEG tresilato; 3a, PEG succinimidil carbonato; 3b, PEG benzotriazol carbonato; 3c,
PEG p-nitrofenil carbonato; 3d, PEG triclorofenil carbonato; 4, PEG carbonilimidazol e 5, PEG succinimidil
succinato. FONTE: ROBERTS et al., 2002
2.3.3.2 2ª Geração de PEGs funcionalizados
A segunda geração de PEGs funcionalizados apresenta modificações em sua
estrutura que promoveram melhorias no grau de pureza, redução de reações colaterais,
aumento de seletividade e reversão da ligação covalente. Um exemplo são as alterações que
permitiram realizar peguilação em resíduos de cisteína (FIGURA 13).
33
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 13 – PEGs tiol reativos. 1, PEG maleimida; 2, PEG vinilsulfona; 3, PEG iodoacetamida; 4, PEG ortopiridil dissulfeto. Fonte: ROBERTS
et al., 2002.
O avanço da tecnologia da peguilação permitiu a criação de produtos de conjugação
passíveis de hidrólise enzimática, tornando-a reversível (FIGURA. 14). O processo de
peguilação aumenta o tempo de meia vida das proteínas, entretanto sua atividade é reduzida
devido à introdução de PEG em regiões de relevância para atividade da proteína (ROBERTS
et al., 2002). Esse problema foi solucionado por pesquisadores da empresa ENZON
Pharmaceuticals (2002) que utilizaram o processo de peguilação reversível na molécula de
interferon, o que permitiu o aumento do tempo de meia vida, acarretado pelo aumento do peso
aparente, e manteve a potência do fármaco, já que o PEG adicionado era gradativamente
hidrolisado liberando o interferon íntegro (KOZLOWSKI e HARRIS, 2002).
FIGURA 14 – Peguilação reversível. Após a hidrólise enzimática, a molécula peguilada é liberada sem resquícios da conjugação. Fonte:: ROBERTS
et al., 2002.
34
REVISÃO DA LITERATURA
2.4 Determinação de colesterol HDL
Atualmente já é bem aceito que níveis elevados de cHDL atuam como fator de
proteção para DAC (WARNICK et al., 2001). Entretanto, até a década de 1970 não havia
grande interesse dos pesquisadores em estudar a potencial relação entre cHDL e DAC. Como
o HDL é responsável pelo transporte de uma pequena fração do colesterol circulante,
acreditava-se que essa lipoproteína não tivesse grande participação em processos patológicos;
o que de certa maneira é curioso, porque Berr et. al. (1951) relataram que indivíduos
saudáveis apresentam níveis de cHDL mais elevados que pacientes com DAC (CASTELLI et
al., 1977). A mudança no papel do cHDL em relação a DAC ocorreu quando Castelli et al.
(1977) apresentaram os resultados do primeiro grande estudo que evidenciou a relação inversa
entre os níveis de cHDL e prevalência de DAC.
Com os resultados do estudo de Castelli et. al. (1977), aumentou-se o interesse na
determinação de cHDL, o que resultou em elevação da demanda pela realização de exames
clínicos laboratoriais para a determinação de cHDL e investimentos em novos métodos para
quantificar cHDL (WARNICK et al., 2001).
Estudos recentes, como o realizado por Huang et. al. (2014), evidenciaram a
participação da lipoproteína HDL na formação de ateroma e concluíram que a determinação
da atividade de transporte de colesterol pela lipoproteína HDL é mais relevante do que seu
conteúdo em colesterol. A quantificação de cHDL ainda é importante na avaliação de risco
cardíaco, tendo em vista que é um parâmetro que consegue ser mensurado com facilidade em
laboratórios de análises clínicas e que os achados realizados por Castelli et. al. (1977) ainda se
aplicam à maioria das pessoas.
2.4.1 Determinação de colesterol total
Até a proposição da determinação de colesterol sérico utilizando enzimas, feita por
Allain et al l(1974); todos os métodos para determinação de colesterol baseavam-se na reação
da molécula de colesterol com um ácido forte concentrado, que atua como agente oxidante,
levando a formação de colestapilienos, que são compostos corados (ARRANZ et al., 1994).
Um exemplo é o método desenvolvido por Pearson (1953), no qual se reage colesterol com
ácido p-toluenosulfônico, na presença de ácido acético e ácido sulfúrico, levando à formação
de produto corado cuja intensidade é proporcional à concentração de colesterol. Entretanto,
por se tratar de uma reação de oxidação por um ácido forte, ocorrem reações colaterais com
35
REVISÃO DA LITERATURA
moléculas semelhantes ao colesterol, o que leva à superestimação da colesterolemia
(ARRANZ et al., 1994).
Atualmemte, o método comumente empregado para a determinação de colesterol
sérico é o desenvolvido por Allain et. al. (1974), que consiste na utilização das enzimas
colesterol esterase e colesterol oxidase, na presença de surfactante não iônico. O sistema
utiliza o surfactante não iônico para realizar abertura das lipoproteínas e exposição dos ésteres
de colesterol e colesteróis livres. A enzima colesterol esterase catalisa a hidrólise do éster de
colesterol e em seguida, a enzima colesterol oxidase promove a oxidação do colesterol livre e
colesterol proveniente da hidrólise do éster levando à formação de colesterona e peróxido de
hidrogênio. O peróxido de hidrogênio formado reage com fenol e 4-aminoantipirina, sob ação
catalisadora da peroxidase, por meio de uma reação de acoplamento formando uma
antipirilquinonimina vermelha, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de
colesterol. O sistema de quantificação de colesterol descrito acima é uma modificação do
sistema para determinação de glicose desenvolvido por Trinder (1969).
O método criado por Trinder (1969) utiliza a enzima glicose oxidase para conversão
da glicose em ácido glucônico e liberação de peróxido de hidrogênio. (FIGURA 15).
Atualmente, as empresas produtoras de reagentes destinados a análises clínicas denominam os
sistemas para determinação de concentração de substratos que utilizam o conjunto de enzimas
oxidase/peroxidase como método Trinder - enzimático colorimétrico.
a)
glicose + O2 glicose oxidase
ácido glucônico + H2O2
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol peroxidase
antipirilquinonimina + 4 H2O
b) éster de colesterol + H2O
colesterol esterase colesterol + ácido graxo
colesterol + O2 colesterol oxidase
colesterona + H2O2
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol peroxidase
antipirilquinonimina + 4 H2O
FIGURA 15 – Métodos enzimáticos para determinação de glicose e colesterol total. a) método desenvolvido por Trinder (1969) para determinação de glicose; b) método desenvolvido por Allain et.
al. (1974) para determinação de colesterol total.
36
REVISÃO DA LITERATURA
2.4.2 Evolução dos métodos para determinação de cHDL
A determinação de cHDL teve sua grande expansão após a constatação da
prevalência de DAC em pacientes com níveis reduzidos de cHDL, realizada por Castelli et al
(1977). Os primeiros métodos para a determinação de cHDL eram demorados, com várias
etapas e demandavam a utilização de ultracentrífugas. Novos métodos foram introduzidos, ao
ponto que hoje, podemos dividi-los em três gerações: 1ª geração: métodos de precipitação; 2ª
geração: métodos de precipitação automatizados; 3ª geração: ensaios homogêneos. Todas
essas três gerações citadas têm em comum o fato de utilizarem, em algum momento do
processo, o método para determinação de colesterol desenvolvido por Allain et. al. (1974)
(WARNICK et al., 2001).
2.4.2.1 Determinação de cHDL por ultracentrifugação
A separação de lipoproteínas por ultracentrifugação é o método de referência para a
determinação de cHDL. Como a ultracentrifugação permite a separação da lipoproteína do
soro, é possível determinar o conteúdo de colesterol correspondente a cada classe de
lipoproteína. O método baseia-se na diferença da densidade hidratada entre as lipoproteínas.
Apesar das lipoproteínas apresentarem densidades hidratadas distintas, esses valores são
muito próximos (quilomícron 0,94 g/mL; VLDL 0,94-1,006 mg/mL; LDL 1,006-1,063 g/mL
e HDL 1,063-1,210 mg/mL) o que impede a utilização de centrífugas comuns para realizar a
separação. O método utiliza brometo de potássio ou brometo de sódio para ajustar a densidade
do soro para 1,063 mg/mL e em seguida é realizada a ultracentrifugação. As partículas de
HDL formam uma faixa na porção inferior do tubo de centrífuga. A fração de HDL é
recolhida, seguido por um processo de diálise para a remoção de sal e determinação da
concentração de cHDL pelo método de Allain et al(1977) (WARNICK et al., 2001).
Esse método não é utilizado com frequência para a determinação de cHDL porque
consome muito tempo, é laborioso e requer utilização de ultracentrífuga. Além disso, a
elevada concentração de sal utilizada para correção de densidade do soro pode promover
alteração na estrutura das lipoproteínas. Esse método é mais utilizado para a separação de
lipoproteínas do plasma do que a determinação de concentração de colesterol nas
lipoproteínas.
37
REVISÃO DA LITERATURA
2.4.2.2 Determinação de cHDL – métodos de 1ª geração
Os métodos de 1ª geração (Tabela 5) baseiam-se na capacidade das lipoproteínas
VLDL e LDL de se ligarem a poliânions (glicosaminoglicanos, polímeros sulfatados,
heteropoliácidos) os quais na presença de cátions bivalentes formam complexos insolúveis,
que podem ser removidos por simples centrifugação, deixando somente a lipoproteína HDL
solúvel no sobrenadante. A determinação da concentração de colesterol no sobrenadante é
realizada pelo método de Allain et. al. (1974).
Tabela 5 – 1ª geração: Métodos de precipitação de LDL e VLDL por poliânion e cátion
bivalente
Poliânion/cátion Desenvolvido por
Heparina – Mn++
HAINLINE et al., 1952 e WARNICK;
ALBERS, 1978.
Dextran sulfato – Mg++
FINLEY et al., 1978 e WARNICK,
BENDERSON, ALBERS, 1982.
Ácido fosfotúngstico – Mg++
LOPES-VIRELLA, 1977.
Fonte: Adaptado WARNICK; NAUCK; RIFAI, 2001.
Os métodos de precipitação são simples e requerem poucos equipamentos, o que
permitiu aos laboratórios de análises clínicas determinar a concentração de cHDL. Entretanto,
o teste nesse formato ainda necessita passar por um processo de centrifugação, o que impede a
total automação do processo e limita a quantidade de testes que podem ser realizados pelos
laboratórios. Outro problema comum a esse método está relacionado à pacientes com valores
elevados de trigliceridemia. Como os triglicérides são transportados principalmente por
VLDL, essas lipoproteínas tornam-se mais abundantes no plasma e menos densas devidos à
maior participação de lípides em sua constituição. Essa elevação na quantidade de VLDL,
juntamente com a diminuição de sua densidade, dificulta a sua precipitação, levando à
superestimação dos valores de cHDL (WARNICK, ALBERS, 1978).
2.4.2.3 Determinação de cHDL – métodos de 2ª geração
A 2ª geração de métodos para a determinação de cHDL foi desenvolvida para
agilizar o tempo gasto na centrifugação da amostra. O método desenvolvido pela empresa
Cortlandt Manor, NY, avaliado pelos pesquisadores Harris, Galpchian e Rifai (1996), utiliza
dextran sulfato ligado a partículas magnéticas para facilitar a remoção das apoB-lipoproteínas
38
REVISÃO DA LITERATURA
do meio reacional. Vários outros métodos foram criados, desde sistemas que utilizam frascos
que continham a quantidade calculada de agentes precipitante e podem ser inseridos nos
analisadores automáticos, até fitas reativas impregnadas com reagente. A grande dificuldade
da aceitação desses métodos deve-se à necessidade de aquisição de equipamentos específicos
para a realização dos ensaios (WARNICK et al., 2001).
2.4.2.4 Determinação de cHDL – métodos de 3ª geração
Os reagentes da 3ª geração são denominados homogêneos e têm como principal
característica a capacidade de serem completamente automatizáveis. O termo homogêneo é
baseado na convenção prévia utilizada na química clínica que descreve um imunoensaio que
requer somente uma etapa. Os métodos homogêneos para a determinação de cHDL não
requerem pré-tratamento ou separação, eliminando processos como pipetagem manual e
centrifugação (WARNICK et al., 2001)
Os reagentes homogêneos utilizam diferentes técnicas para a segregação das apoB-
lipoproteínas. Kakuyama, Kimura e Hashiguchi (1994) utilizaram anticorpos anti-ApoB para
formar complexos com quilomícron, VLDL, LDL e bloquear a ação das enzimas colesterol
esterase e colesterol oxidase. Outro método desenvolvido pela empresa Daiichi, Inc. utiliza
um poliânion sintético que agrega as apoB-lipoproteínas. Em seguida, um surfactante atua
somente sobre as partículas de HDL, expondo seu conteúdo para ação das enzimas colesterol
esterase e colesterol oxidase. A ação de agregação do poliânion sintético foi avaliado em
microscopia eletrônica de transmissão, que comprovou a sua ação somente sobre as apoB-
lipoproteínas (FIGURA 16) ( KONDO et al., 1999).
FIGURA 16 – Microscopia eletrônica da ação de agregação do poliânion sintético sobre HDL e VLDL. Em 4a, o poliânion não consegue agregar partículas de HDL; 4b, o poliânion agrega partículas de VLDL. Fonte:
KONDO et al., 1999.
39
REVISÃO DA LITERATURA
Sugiuchi et al., (1995) demonstraram que α-ciclodextrina sulfatada associada a
cátions magnésio era capaz de proteger as lipoproteínas LDL, VLDL e quilimícrons da ação
das enzimas envolvidas no teste. Maior seletividade foi alcançada com a ligação covalente de
PEG nas enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase. Outros métodos foram
desenvolvidos na década de 90 e comercializados por diferentes empresas (FIGURA 17).
FIGURA 17 – Métodos homogêneos para determinação de cHDL. Fonte: WARNICK et al., 2001
40
REVISÃO DA LITERATURA
2.5 Calorimetria de Titulação Isotérmica
Técnica que mensura diretamente a mudança de entalpia em interações
biomoleculares à temperatura constante; essa é a definição simplificada de Calorimetria de
Titulação Isotérmica (em inglês: Isothermal Titration Calorimetry – ITC) (LADBURY e
DOYLE, 2004).
Interações ligante-receptor, enzima-substrato, proteína-proteína, fármaco-receptor,
inibidor-enzima, são algumas dentre as inúmeras possibilidades de interações que podem ser
avaliadas pela ITC. (FREIRE et al., 1990).
2.5.1 Microcalorímetro de titulação isotérmica
O microcalorímetro de titulação isotérmica (FIGURA 18) é o instrumento que torna
possível a mensuração da diferença de calor resultante das interações químicas. O
equipamento é composto por um sistema diferencial de células dentro de uma manta
termostatizada. As células são divididas em referência e de reação. A célula de referência é
preenchida com água ou tampão, enquanto a célula de reação recebe a macromolécula ou
ligante de interesse. O injetor realiza a adição da amostra na célula de reação o que leva às
trocas de calor. Essas trocas originam-se da diluição do ligante, diluição da macromolécula
além dos calores envolvidos na reação. O microcalorímetro faz a mensuração da diferença de
potência elétrica necessária para que a temperatura da célula de reação seja igual à
temperatura da célula referência. Essa medida é denominada potência diferencial (Differential
Power-DP). Todo esse sistema é envolvido por um escudo adiabático, mantido em
temperatura constante, que tem como função isolar o sistema do ambiente (LADBURY e
DOYLE, 2004).
O DP é convertido em µcal/s. Todo esse processo é acompanhado por um
termograma - µcal/s versus tempo. Quando ocorrem reações endotérmicas o microcalorímetro
fornece calor à célula de reação para que as condições isotérmicas sejam mantidas, essa ação
é demonstrada no termograma como uma deflexão positiva. Por outro lado, em reações
exotérmicas o equipamento fornece menos calor à célula de reação, o que é representado no
termograma como deflexão negativa. (FIGURA 19) (TODD e GOMEZ, 2011).
41
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 18 – Esquema básico de um microcalorímetro. Fonte: MARTINEZ et al., 2013
FIGURA 19 – Termograma de reações químicas. Deflexões negativas correspondem a reações exotérmicas e deflexões positivas correspondem a reações
endotérmicas. Fonte: LADBURY e DOYLE, 2004, p.44
42
REVISÃO DA LITERATURA
2.5.2 Termodinâmica básica de calorimetria de titulação isotérmica
Basicamente, a calorimetria de titulação isotérmica utiliza-se da lei de conservação
de energia para embasar a metodologia.
Energia não pode ser criada ou destruída, ela modifica-se e surge em
forma de energia mecânica, energia térmica, energia eletroestática e
outras. (PRIVALOV, 2012)
Energia não pode ser medida diretamente, mas podemos quantifica-la pelas
mudanças na sua forma de sua manifestação como calor (Q) e trabalho (W) (Equação 1)
𝛥𝐸 = 𝑄 + 𝑊 (1)
Em reações químicas, principalmente as que envolvem proteínas e modificações de
estrutura proteica, o trabalho mecânico realizado está associado com as modificações de
volume a pressão constante (Equação 2):
𝑊 = − 𝑃𝛥𝑉 (2)
Fazendo a substituição da equação 2 na equação 1 temos (Equação 3):
𝛥𝐸 = 𝑄 − 𝑃𝛥𝑉 (3)
Rearranjando a equação 3, temos (Equação 4):
𝑄 = 𝛥𝐸 − 𝑃𝛥𝑉 (4)
A variação da entalpia pode ser definida como a variação do conteúdo de calor de um
sistema e é representada pelo símbolo ΔH (Equação 5):
𝑄 = 𝛥𝐻 = 𝛥𝐸 − 𝑃𝛥𝑉 (5)
Como todas as reações que ocorrem no microcalorímetro não promovem variações
consideráveis no volume e são realizadas a pressão constante, praticamente não há realização
de trabalho e toda troca de energia resultante deve-se ao fluxo de calor. Sendo assim podemos
assumir (Equação 6):
𝛥𝐻 = 𝑄 = 𝛥𝐸 (6)
43
REVISÃO DA LITERATURA
2.5.3 Determinação de parâmetros cinéticos enzimáticos utilizando ITC
Williams e Toone (1993), Ladbury e Doyle (2004) e Todd e Gomez (2011) citam
como principal vantagem da utilização da ITC para determinação de parâmetros cinéticos
enzimáticos, a possibilidade de uso do substrato enzimático sem a necessidade de qualquer
alteração em sua estrutura química. Métodos espectrofotométricos necessitam que os
substratos consumidos ou produtos formados durante a reação enzimática absorvam luz
dentro do espectro do ultravioleta e região do visível. Frequentemente isso não é possível,
sendo necessária a utilização de substratos quimicamente modificados ou reações acopladas o
que pode interferir na determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos. A necessidade de
modificação química se estende a outras técnicas como fluorimetria, marcação radioativa e
outros (LADBURY e DOYLE, 2004, p.19).
2.5.3.1 Determinação da entalpia aparente de reações catalisadas por enzimas
A determinação da entalpia aparente (ΔHapp) (Equação 7) é realizada a partir de uma
única injeção do substrato enzimático, permitindo que o substrato seja completamente
consumido. O calor total liberado pela reação é proporcional à concentração molar do
substrato. O calor total da reação é determinado pela integração da área do calor envolvido na
reação (FIGURA 20) (TODD; GOMEZ, 2011)
44
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 20 – Termograma de determinação de ΔHapp. Termograma da reação de hidrólise de 700 nmol de ureia por urease. Após a injeção do substrato permite-se que
ele seja todo consumido. Após a integração da área do pico determinou-se a ΔHapp da reação = -10,4 kcal/mol.
As setas indicam o momento da adição do substrato. Fonte: Adaptado – TODD e GOMEZ, 2011
𝛥𝐻𝑎𝑝𝑝 =1
𝑆 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 × 𝑉
𝑑𝑄(𝑡)
𝑑𝑡
𝑡=∞
𝑡=0
𝑑𝑡
(7)
Determinação de ΔHapp . [S], concentração do substrato; V volume de solução na célula de reação; Q, calor; t,
tempo. O calor total produzido pela catálise do substrato, 𝑑𝑄(𝑡)
𝑑𝑡
𝑡=∞
𝑡=0 𝑑𝑡, dividido pela quantidade do substrato na
célula de reação no microcalorímetro, 1
𝑆 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ×𝑉 resulta no ΔHapp da reação avaliada.
2.5.3.2 Determinação de constante de Michaelis-Menten, velocidade máxima e constante
catalítica
Em um ensaio com injeções contínuas, sem permitir que o substrato seja todo
consumido, é possível determinar a taxa reacional (mol/L·s) de formação de produto por
concentração de substrato no meio. A partir desses dados é possível determinar constante de
Michaelis-Menten (Km), velocidade máxima (Vmax) e constante catalítica (kcat) (TODD e
GOMEZ, 2011).
45
REVISÃO DA LITERATURA
Henzler et. al. (2008) determinaram os parâmetros cinéticos para β-glucosidase
imobilizada. Para a determinação de Km foi realizado ensaio com múltiplas injeções do
substrato (FIGURA 21). A velocidade máxima da reação foi alcançada quando se formou um
platô no termograma e a adição de mais substrato não promoveu aumento do DP.
FIGURA 21 – Determinação de Km para β-glucosidade. Múltiplas injeções de substrato à célula de reação contendo a enzima. No canto superior direito, termograma da
determinação de ΔHapp. Fonte: HENZLER et al., 2008
De posse do ΔHapp da reação é possível determinar a taxa reacional de formação de
produto para cada injeção de substrato. Em que v é a taxa de formação do produto em
mol/L·s-1
(Equação. 8).
𝑣 =𝑑 𝑃
𝑑𝑡=
1
𝑉 ∙ ∆𝐻app
∙𝑑𝑞
𝑑𝑡
(8)
De posse desses dados é possível plotar uma curva de saturação enzimática, contendo
a taxa de formação de produto versus concentração de substrato. Como o intervalo das
injeções do substrato são curtas o suficiente para não permitir o consumo completo do
substrato, ocorre acúmulo do substrato o que permite a enzima alcançar velocidade máxima
(FIGURA 22) (TODD e GOMEZ, 2011).
46
REVISÃO DA LITERATURA
FIGURA 22 – Curva de saturação enzimática.
Velocidade inicial da reação dividido pela concentração de enzima versus concentração do substrato. FONTE:
HENZLER et al., 2008
Km e Vmax podem ser obtidos por linearização dos dados obtidos no gráfico de
saturação enzimática ou por utilização de regressão não linear (WILLIAMS e TOONE, 1993).
kcat é determinado pela equação, em que [E0], é a concentração total de enzima no
experimento (Equação. 9):
𝑘𝑐𝑎𝑡 =𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐸0
(9)
47
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos Gerais
Definir o poliânion com maior capacidade de reduzir a interação das enzimas
colesterol esterase peguilada e colesterol oxidase peguilada com as ApoB-
lipoproteínas.
Determinar Km para enzimas colesterol esterase, colesterol oxidase, colesterol esterase
peguilada e colesterol oxidase peguilada utilizando HDL, LDL e VLDL como
substrato, pelo método de microcalorimetria de titulação isotérmica.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar os poliânions: α-ciclodextrina sulfatada, ácido fosfotúngstico, dextran sulfato,
sulfato de condroitina e sacarose octasulfato e definir qual destes promove a maior
inibição relativa da atividade enzimática de CE e ChOx sobre as lipoproteínas LDL e
VLDL, utilizando o reagente proposto por Sugiuchi et al. (1955).
Determinar por espectrofotometria, a inibição relativa da atividade enzimática de CE e
ChOx conjugadas com PEG e associadas com o poliânion que promoveu maior
inibição da atividade para LDL e VLDL.
Determinar por ITC a entalpia aparente de reação para a reação catalisada por CE e
ChOx, nativas e peguilada, utilizando HDL, LDL e VLDL como substrato.
Determinar por ITC o Km para CE e ChOx, nativas e peguilada, utilizando HDL, LDL
e VLDL como substratos.
48
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Separação de lipoproteínas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de
densidade
O método de separação de lipoproteínas por ultracentrifugação em gradiente
descontínuo de densidade desenvolvido por Chung et al. (1980) permite a separação de HDL,
LDL e VLDL do soro em um único ensaio. O método consiste em criar um gradiente
descontínuo de densidade com intervalo entre 1,006 e 1,3 g·dL-1
utilizando cloreto de sódio e
cloreto de bário. O soro tem a sua densidade ajustada para 1,3 g·dL-1
por meio da adição de
cloreto de bário. Uma segunda solução de cloreto de sódio 0,9% p/v com densidade de 1,006
g·dL-1
é adicionada sobre o soro com densidade ajustada formando um sistema bifásico.
Durante a ultracentrifugação, o gradiente de densidade descontínuo é formado. As
lipoproteínas são separadas em três faixas, sendo HDL, com densidade hidratada de 1,063-
1,21 g·dL-1
, (faixa situada mais próxima ao fundo do tubo); LDL densidade hidratada 1,019 -
1,063 g·dL-1
, (faixa situada no meio do tubo) e VLDL densidade hidratada de 0,095 - 1,006
g·dL-1
(banda é situada na porção superior do tubo) (CHUNG et al., 1980).
4.1.1 Materiais
a) Ultracentrífuga Sorval® - Ultra Pro 80
b) Rotor de ângulo fixo, capacidade 10 tubos 10,0 mL - Sorval ®
c) Tubo de ultracentrífuga de policarbonato, capacidade 7 mL
d) Cloreto de Bário Padrão Analítico (KBr) – Synth ®
e) Cloreto de Sódio Padrão Analítico (NaCl) – Synth ®
f) Seringa 1,0 mL
g) Soro Humano
h) Membrana para diálise 12-14 kDa – Sigma Aldrich Co. LLC
i) Tampão Fosfato 10 mM pH 7,0+ NaCl 0,9% p/v
j) Microtubo 0,5 mL
49
MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.2 Procedimento experimental
4.1.2.1 Ajuste de densidade do soro humano
1. Preparar pool de soro humano a partir da junção de soros coletados de dez doadores
saudáveis em jejum de 12 horas.
2. Adicionar 0,3 g de brometo de potássio (KBr) para cada mililitro de pool de soro para
ajustar a densidade do soro para 1,3 g•dL-1
.
3. Transferir 3,0 mL de pool de soro com densidade ajustada para um tubo de
ultracentrifugação com capacidade para 10 mL.
4. Adicionar, vagarosamente, 7,0 mL de solução NaCl 0,9% p/v sobre o pool de soro
humano.
4.1.2.2 Ultracentrifugação em rotor de ângulo fixo
Transferir os tubos cuidadosamente para o rotor evitando que o pool de soro misture-
se com a solução de NaCl 0,9%.
Tabela 6 - Protocolo de ultracentrifugação
Velocidade 65.000 rpm
Duração 2,0 horas
Tempo de parada 0,5 hora
Temperatura 10 ºC
Após a finalização da ultracentrifugação, coletar as três bandas de lipoproteínas
separadamente, com auxílio de seringa.
Observação: Utilizar uma seringa por faixa de lipoproteína.
4.1.2.3 Diálise e armazenamento
1. Transferir as lipoproteínas para membranas de diálise 12-14 kDa.
2. Realizar a diálise por 24 horas entre 2-8 ºC em 4,0 L tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH
7,0 + 0,9 p/v NaCl. Trocar o tampão a cada 8 horas.
3. Aliquotar as lipoproteínas em criotubos devidamente identificados e armazenar a -
80ºC.
50
MATERIAIS E MÉTODOS
4.2 Determinação do conteúdo químico e proteico das lipoproteínas
As classes das lipoproteínas foram avaliadas quanto ao seu conteúdo de colesterol
total, colesterol livre, colesterol esterificado, Apolipoproteína A1 e Apolipoproteína B100.
Para determinação de colesterol e triglicérides foram utilizados reagentes enzimático-
colorimétricos descritos no item 4.2.1. Para determinação do colesterol livre o reagente
utilizado para determinação total de colesterol foi produzido sem a enzima colesterol esterase,
assim, somente o colesterol livre participa na reação de Trinder (CARR, 1993). O colesterol
esterificado (quantificado como linoleato de colesterila) é determinado pela diferença entre
colesterol total e colesterol livre. Para a quantificação das Apolipoproteínas A1 e B100 foram
utilizados testes imunoturbidimétricos, referenciados no item 4.2.1.
4.2.1 Materiais
a) Triglicérides Liquiform, Ref. 84 – Labtest Diagnóstica SA
b) Colesterol Liquiform, Ref.139 – Labtest Diagnóstica SA
c) Reagente para determinação de colesterol livre
d) Apo A1Turbiquest, Ref. 381 – Labtest Diagnóstica SA
e) Apo B Turbquest, Ref. 382– Labtest Diagnóstica SA
f) Analisador automático – Labmax 240 – Labtest Diagnóstica SA
4.2.2 Procedimento experimental
1. Utilizar os reagentes conforme indicação do fabricante e em conjunto com as amostras
controles.
2. Realizar testes em triplicata utilizando o analisador automático Labmax 240 – Labtest
Diagnóstica.
3. Determinar concentração de colesterol esterificado calculando a diferença entre a
concentração de colesterol total e a concentração de colesterol livre (Equação 10).
𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑚𝑀 = 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑀 − 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑙𝑖𝑣𝑟𝑒 (𝑚𝑀)
(10)
51
MATERIAIS E MÉTODOS
4.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânion
4.3.1 Reagente enzimático-colorimétrico
O estudo de atividade enzimática para CE e ChOx foi realizado com uma modificação
do reagente desenvolvido por Sugiuchi et al. (1995). As diferenças encontram-se na ausência
de poliânion e a troca do agente cromógeno N-etil-N-(3-metil fenil)-N'-succinil etilenodiamina
(EMSE) por fenol (Tabela 7). O poliânion α-ciclodextrina sulfatada e dextran sulfato foram
removidos para possibilitar a adição de outros poliânions.
O reagente é constituído por duas soluções, denominadas PARTE 1 e PARTE 2
(Tabela 7). Na PARTE 1 foi adicionado o poliânion e na PARTE 2 foram adicionadas as
enzimas. Essa divisão permite que a amostra interaja primeiro com os poliânions e em
seguida, somente após a adição da PARTE 2, ocorra a interação com as enzimas.
4.3.1.1 Materiais
a) Reagente enzimático-colorimétrico.
Tabela 7 – Composição do reagente enzimático colorimétrico.
PARTE 1 PARTE 2
Tampão ácido 3-(N-morfolino)
propanosulfônico pH 7,0 - 30
mmol·L-1
(Research Organics Inc.)
Tampão ácido 3-(N-morfolino)
propanosulfônico pH 7,0 - 30 m
mol·L-1
(Research Organics Inc.)
Fenol - 22 mmol·L-1
(Synth ®) 4-Aminoantipirina - 2,4 m mol·L-1
(Sorachim Co)
Cloreto de Magnésio - 2,0 mmol·L-1
(Sigma-Aldrich Co.LLC)
Colesterol Oxidase - 5 kU/L (Roche
Ltd)2
Poliânion1 Colesterol Esterase - 1 kU/L (Roche
Ltd)2
Peroxidase - 30 kU/L (Roche Ltd)
1 Os poliânions e suas respectivas concentrações utilizadas estão descritos no item 3.3.3.
2 As especificações do fornecedor para colesterol esterase e colesterol oxidase estão nos Apêndices 1 e 2.
b) Espectrofotômetro: Biochrom ® Libra S22 UV/VIS.
c) Banho termostatizado
52
MATERIAIS E MÉTODOS
4.3.1.2 Procedimento experimental
Tabela 8 – Procedimento para realização dos testes espectrofotométricos.
Procedimento:
1º passo- Pipetar 1,0 mL de reagente - PARTE 1 + 0,02 mL de amostra e
homogeneizar.
2º passo- Aquecer a mistura por 5 minutos a 37 ºC em banho-maria.
3º passo- Adicionar 0,25 mL de reagente PARTE 2 à mistura, homogeneizar e
transferir para espectrofotômetro.
4º passo- Mensurar o incremento da absorbância em 505 nm. Acompanhar cinética
de reação por 10 minutos.
4.3.2 Seleção de poliânions
Sulfato de condroitina (FIGURA 23) consiste de uma mistura de polímeros, sulfato
de condroitina A, que possui um grupo sulfato ligado ao carbono 4 da N-acetilgalactosamina ,
e sulfato de condroitina C, que possui um grupo sulfato ligado ao carbono 6 da N-
acetilgalactosamina (LINDAHL e HOOK, 1978).
FIGURA 23 - Sulfato de Condroitina A
Ácido fosfotúngstico é um composto inorgânico da classe dos heteropoliácidos com
formula molecular H3PW12O40.
53
MATERIAIS E MÉTODOS
Heteropoliácidos constituem uma classe especial dos polioxometalatos. Normalmente
um ânion central (fosfato, silicato, ou borato) encontra-se no centro de um poliedro, cujas
arestas são compostas por óxidos de metais de transição (JOSÉ e PRADO, 2005).
α-ciclodextrina sulfato (FIGURA 24) é um oligossacarídeo cíclico composto por seis
unidades de D-glucopiranose, na qual parte de seus grupos hidroxila está substituída por
grupos sulfato (SUGIUCHI et al, 1995).
Figura 24 - α-ciclodextrina sulfato
Sacarose octassulfato (fórmula molecular: C12H14Na8O35S8) é um dissacarídeo
formado pela ligação glicosídica entre uma glicose e uma frutose, que possui todos os grupos
hidroxilas substituídos por grupos sulfato (FIGURA 25). A molécula apresenta 8 grupos
sulfato cada um com uma carga negativa. Dextran sulfato (FIGURA 26) é um polímero
composto por unidades de glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas. As hidroxilas são
substituídas por grupos sulfato. Ambas as substancias apresentam várias cargas negativas em
sua estrutura, o que caracterizam essas moléculas como poliânions com capacidade de
interação com resíduos de lisina e arginina de LDL e VLDL (MAHLEY, 1984).
FIGURA 25 - Sacarose Octassulfato FIGURA 26 - Dextran Sulfato
54
MATERIAIS E MÉTODOS
4.4 Materiais
a) Poliânions
Tabela 9 - Poliânions
Poliânion - Fornecedor Massa Molar/Unidade de
massa
Sulfato de Condroitina – Carbosynth Ltd Não aplicável
Ácido Fosfotúngstico P.A.- Synth 2880,2 g/mol
α-Ciclodextrina Sulfato - sal sódico hidratado – Sigma
Aldrich Co. LLC
10373 g/mol
Sacarose Octassulfato de sódio – Carbosynth Ltd 1158,7 g/mol
Dextran Sulfato – Sigma Aldrich Co. LLC 500 kDa
b) Reagente enzimático-colorimétrico – item 4.3.1.
c) Espectrofotômetro: Biochrom ® Libra S22 UV/VIS
d) Analisador automático Labmax 240 – Labtest Diagnóstica SA.
e) Banho-maria termostatizado
4.4.1 Procedimento experimental
1. Adicionar à PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico diferentes quantidades do
poliânion que será avaliado.
a) Sulfato de condroitina: 0,00%; 0,05%; 0,10%; 0,25% e 0,50% p/v
b) Ácido fosfotúgstico: 0,00; 0,75; 1,50; 2,25 e 7,50 mmol·L-1
c) Sacarose octassulfato: 0; 1; 2; 4 e 6 mmol·L-1
d) Sacarose octassulfato + dextran sulfato 500 kDa [0,05% p/v]: 0; 1 e 6 mmol·L-1
e) α-ciclodextrina sulfato: 0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mmol·L-1
f) α-ciclodextrina sulfato + dextran sulfato 500 kDa [0,05% p/v]: 0,00; 0,75; 1,50; 2,25 e
7,50 mmol·L-1
2. Medir o pH do reagente 1, corrigir para pH 7,0 a 25 ºC com solução de hidróxido de sódio
10 mol·L-1
, se necessário.
3. Ensaiar as lipoproteínas separadas do pool de soro utilizando o protocolo de utilização do
Reagente enzimático colorimétrico.
4. Determinar a atividade residual causada pela inibição da reação devido à presença do
poliânion em relação à reação sem poliânions, de acordo com procedimento 4.3.1.2.
55
MATERIAIS E MÉTODOS
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (%) =𝐴𝐵𝑆 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑎çã𝑜 𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛ç𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑙𝑖â𝑛𝑖𝑜𝑛
𝐴𝐵𝑆 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑎çã𝑜 𝑠𝑒𝑚 𝑝𝑜𝑙𝑖â𝑛𝑖𝑜𝑛× 100
(11)
5. Definir qual poliânion e em qual concentração ocorreu a maior inibição da reação das
enzimas CE e ChOx com as frações contendo LDL e VLDL.
6. Após realizar a peguilação das enzimas CE e ChOx (item 4.5), repetir ensaio com enzimas
CE e ChOx peguiladas com o poliânion definido no item 5 e determinar a atividade
residual. Utilizar analisador automático.
a. Protocolo analisador automático: Labmax 240
1. Comprimento de onda: 505 nm
2. Volume de reagente 1: 200 μL
3. Volume de reagente 2: 50 μL
4. Volume de amostra: 4 μL
5. Ciclos de leitura: Main 53-54 / Sub: 33-34
6. Tipo de calibração: Fator
7. Fator: 10000
4.5 Conjugação com monometoxipolietilenoglicol succinimidil carbonato
A conjugação com polietilenoglicol deve ser realizada em meio aquoso alcalino
tamponado (pH 8,5) para aumentar o número de resíduos de lisina e arginina desprotonados.
O agente tamponante não deve possuir aminas primárias ou secundárias que possam competir
com os resíduos de aminoácidos na reação de conjugação com monometoxipolietilenoglicol
succinimidil carbonato (mPEG-NHS). O mPEG-NHS, em meio aquoso, apresenta um tempo
de meia vida curto o que impede o seu armazenamento em solução aquosa. A adição do
mPEG funcionalizado deve ser realizada diretamente sobre a solução alcalina contendo as
proteínas de interesse (dados do fornecedor NANOCS®)
4.5.1 Materiais
a) mPEG-NHS 5 kDa – NANOCS Inc
b) mPEG-NHS 10 kDa – NANOCS Inc
c) Tampão HEPES 100 mM – pH 8,5, pH corrigido com solução hidróxido de sódio
10M.
d) Colesterol esterase - 134,9 U/mg de pó liofilizado - Roche Ltd
56
MATERIAIS E MÉTODOS
e) Colesterol Oxidase - 16.1 U/mg de pó liofilizado - Roche Ltd
f) Microtubo de poliestireno com tampa – Sarstedt AG & Co
4.5.2 Procedimento experimental
1. Adicionar 4050U da enzima colesterol esterase em 3,0 mL tampão HEPES 100
mmol·L-1
- pH 8,5 e homogeneizar até completa solubilização. Aliquotar a solução em
três microtubos, contendo volumes iguais da solução e identificar. Denominar tubos 1,
2 e 3.
2. Solubilizar 1200 U da enzima colesterol oxidase em 3,0 mL tampão HEPES 100
mmol·L-1
– pH 8,5. Aliquotar a solução em três microtubos, contendo volumes iguais
da solução e identificar. Denominar tubos 1, 2 e 3.
3. Adicionar, sob agitação constante, mPEG NHS 5 kDa e 10 kDa às soluções de
enzimas CE e ChOx conforme indicado na Tabela 10.
Tabela 10 – Massa de mPEG-NHS 5 kDa e 10 kDa acionado à CE e ChOX.
Microtubo com solução de enzimas PEG succinimidil carbonato
mPEG-NHS 5 kDa mPEG-NHS 10 kDa
Microtubo 1 – Sol. CE 83,3 mg (16,7 µmol) -
Microtubo 2 – Sol CE - 166,6 mg (16,7 µmol)
Microtubo 1 – Sol. ChOx 8,3 mg (1,7 µmol) -
Microtubo 2 – Sol. ChOx - 16,6 mg (1,7 µmol)
4. Após a adição do PEG-NHS, manter os microtubos sob agitação constante durante 30
minutos.
4.5.2.1 Determinação do grau de conjugação com mPEG-NHS
A ninidrina reage com aminas primárias formando um composto corado que absorve
luz em 570 nm. Como o mPEG-NHS liga-se principalmente aos resíduos de lisina, arginina e
grupos n-terminais, as aminas primárias que reagem com o mPEG-NHS não ficam
disponíveis para reagir com a ninidrina. A determinação da quantidade de aminas primárias
disponíveis antes e após a conjugação permite quantificar o grau de conjugação com mPEG-
NHS.
57
MATERIAIS E MÉTODOS
Para o branco da reação foi elaborado uma solução de N-hidroxisuccinimida, para
simular a N-hidroxisuccinimida liberada no meio após a conjugação com mPEG-NHS.
4.5.2.2 Materiais
a) Ninhydrin Reagent Cod. N7285 - Sigma-Aldrich Co. LLC
b) Solução de N-hidroxisuccinimida 16,7 mM – Sigma-Aldrich Co. LLC
c) Etanol P.A. – Synth ®
d) Espectrofotômetro: Biochrom ® Libra S22 UV/VIS
e) Solução de enzimas TUBO 3 - CE e TUBO 3 - ChOx elaboradas no item 4.3.2.
f) Solução de enzimas peguiladas 4.5.2
a. CE-PEG 5 kDa
b. ChOx-PEG 5 KDa
c. CE-PEG 10 kDa
d. ChOx-PEG 10 KDa
4.5.2.3 Procedimento experimental
O protocolo para determinação do grau de conjugação das enzimas encontra-se detalhado na
Tabela 11.
58
Tabela 11 – Procedimento para determinação do grau de conjugação com mPEG-NHS
Amostras
Água
Branco
Branco
(NHS 16,7 mmol·L-
1)
Branco
(NHS 1,7 mmol·L-1)
CE-PEG
5 kDa
(TUBO 1)
ChOx-PEG
5 kDa
(TUBO 1)
CE-PEG
10 kDa
(TUBO 2)
ChOx-PEG
10 kDa
(TUBO 2)
CE
(TUBO 3 –
Enzima
nativa)
ChOx
(TUBO 3
Enzima
nativa)
Amostra 100 µL 100 µL 10 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
Reagente
Ninidrina 2% 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Água 300 µL 300 µL 390 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL
Aquecer a 100 ºC por 10 minutos.
Etanol 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL 900 µL
Realizar medição de absorbância no espectrofotômetro, 570 nm.
Cálculo de grau de conjugação
𝑔𝑟𝑎𝑢 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑔𝑎çã𝑜 (%) = 1 − 𝐴𝐵𝑆 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑃𝑒𝑔𝑢𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎 − 𝐴𝐵𝑆 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑁𝐻𝑆
𝐴𝐵𝑆 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑁𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 − 𝐴𝐵𝑆 𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 á𝑔𝑢𝑎 × 100
(12)
59
MATERIAIS E MÉTODOS
4.6 Determinação de variação de entalpia aparente de reação – ITC
4.6.1 Materiais
a) Microcalorímetro MicroCalTM
VP-ITC
b) Desgaseificador a vácuo – MicroCalTM
TermoVac
c) Lipoproteínas HDL, LDL e VLDL separadas do pool de soro
d) Tampão Fosfato Monobásico Sódio 10 mmol·L-1
, ajustado para pH 7,0 com solução
de Hidróxido de Sódio 10 M + NaCl 0,9% p/v (tampão fosfato salina)
e) Solução de CE - 20 kU/L em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0+ NaCl 0,9% p/v
f) Solução de ChOx - 20 kU/L (nominal) em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl
0,9% p/v
g) Solução de CE-PEG – 10 kDa - 20 kU/L em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 +
NaCl 0,9% p/v
h) Solução de ChOx-PEG 10 kDa (nominal) - 20 kU/L em tampão fosfato 10 mM pH 7,0
+ NaCl 0,9% p/v
i) Softwear OriginPro©
8.0 - OriginLab
4.6.2 Procedimento experimental
1. Desgaseificar as amostras e soluções de enzimas durante 5 minutos a 25 ºC
utilizando o MicroCalTM
TermoVac.
2. Executar o esquema para a realização dos experimentos descritos nas Tabelas 12 e
13.
Tabela 12 - Parâmetros constantes utilizados no microcalorímetro para determinação de
ΔHapp
Parâmetros constantes para determinação de ΔHapp
Parâmetros experimentais
# totais injeções 2
Temperatura da célula 37 ºC
Reference Power (µcal/s) 30
Intervalo inicial (seg.) 120
Velocidade de agitação 310
Parâmetros de injeção
1# Injeção/Intervalo 1 µL/150s
60
Tabela 13 - Protocolos e parâmetros variáveis utilizados no microcalorímetro para determinação de ΔHapp
Protocolos e parâmetros variáveis utilizados no microcalorímetro para determinação de ΔHapp
Colesterol Esterase
Colesterol Esterase - PEG Colesterol Oxidase Colesterol Oxidase - PEG
Injetor Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Célula de amostra Ensaio:
Solução de CE 20kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Ensaio:
Solução de CE-PEG 20kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Ensaio:
Solução de ChOx 20kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Ensaio:
Solução de ChOx-PEG 20kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Volume 2# injeção HDL: 10 µL
LDL: 40 µL
VLDL: 40 µL
HDL: 10 µL
LDL: 40 µL
VLDL: 40 µL
HDL: 10 µL
LDL: 40 µL
VLDL: 40 µL
HDL: 10 µL
LDL: 40 µL
VLDL: 40 µL
Duração da reação 1200 s 1200 s 1200 s 1200 s
61
MATERIAIS E MÉTODOS
3. Integrar as deflexões do termograma ocasionadas pela catálise das reações de
hidrólise de lipídeos, oxidação do colesterol livre e brancos de reação. Utilizar
OriginPro 8.0.
4. Deduzir a quantidade de calor referente ao branco de reação das reações catalisadas
pelas enzimas.
5. Normalizar os resultados para kcal/mol de linoleato de colesterila, utilizando
Equação. 7.
6. Realizar os experimentos em duplicata.
4.7 Determinação da constante de Michaelis-Menten
Durante a execução dos testes para determinação de entalpia aparente, não foi possível
determinar a entalpia de reação para a enzima ChOx e interações de VLDL com CE. Como
consequência a determinações de Km foram realizadas somente para CE utilizando HDL e
LDL provenientes do pool de soro como substratos.
4.7.1 Materiais
a) Microcalorímetro MicroCalTM
VP-ITC
b) Desgaseificador a vácuo – MicroCalTM
TermoVac
c) Lipoproteínas HDL, LDL provenientes do pool de soro
d) Tampão Fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v (tampão fosfato salina)
j) Solução de CE - 20 kU/L em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v
k) Solução de CE-PEG - 10 kDa - 20 kU/L (nominal) em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v
l) Softwear OriginPro©
8.0 - OriginLab
e) Softwear GraphPad©
Prism 5.03 – GraphPad software, Inc.
4.7.2 Procedimento experimental
1. Desgaseificar as amostras e soluções de enzimas durante 5 minutos a 25 ºC
utilizando o MicroCalTM
TermoVac.
2. Executar o esquema para a realização dos experimentos descritos nas Tabelas 14 e
15.
62
MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 14 - Parâmetros constantes utilizados no microcalorímetro para determinação de
Km
Parâmetros constantes para determinação de Km
Parâmetros
experimentais
# totais injeções 21
Temperatura da célula 37 ºC
Reference Power (µcal/s) 30
Intervalo inicial (seg.) 120
Velocidade de agitação 310
Parâmetros de injeção
1# Injeção/Intervalo 1 µL/150 s
Tabela 15 - Protocolos e parâmetros variáveis utilizados no microcalorímetro para
determinação de Km
Colesterol Esterase Colesterol Esterase - PEG
Injetor Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Ensaio:
Lipoproteína de interesse
Branco de reação:
Lipoproteína de interesse
Célula de amostra Ensaio:
Solução de CE 20 kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Ensaio:
Solução de CE-PEG 20 kU/L
Branco de reação:
Tampão fosfato salina
Volume das demais
injeções
HDL: 5 µL
LDL: 5 µL
HDL: 5 µL
LDL: 5 µL
Intervalo entre cada
injeção
60 s 60 s
3. Integrar as deflexões do termograma ocasionadas pela catálise das reações de hidrólise
de lipídeos, oxidação do colesterol livre e brancos de reação. Utilizar OriginPro©
8.0.
4. Deduzir a quantidade de calor referente ao branco de reação das reações catalisadas
pelas enzimas.
5. Determinar a velocidade de reação em µmol/L·min, normalizando os resultados pela
concentração de linoleato de colesterila na célula de amostra.
63
MATERIAIS E MÉTODOS
6. Construir gráfico de cinética enzimática para as reações de CE e CE-PEG, utilizando a
Equação 8 para cálculo de taxa de catálise do substrato
.
𝑣 =𝑑 𝑃
𝑑𝑡=
1
𝑉 ∙ ∆𝐻app
∙𝑑𝑞
𝑑𝑡
(8)
7. Determinar Km por meio de linearização (Equação 13) dos dados do gráfico de
cinética enzimática, utilizando a equação de Lineweaver- Burk. Utilizar GraphPad©
Prism para aplicar fator de pesos estáticos 1/x2 para as curvas de regressão.
1
𝑣=
𝐾𝑚
𝑉max [𝑆]+
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
(13)
64
5 RESULTADOS
5.1 Separação de lipoproteínas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de
densidade
Após a finalização da ultracentrifugação observou-se a formação de três faixas
distintas (FIGURA 27). Apesar de pouco visível, a faixa de VLDL foi separada
satisfatoriamente, como foi comprovado posteriormente pelos testes químicos e proteicos.
As lipoproteínas apresentaram o seguinte aspecto visual após a diálise:
a) HDL: Solução límpida e de coloração amarela.
b) LDL: Solução límpida e de coloração laranja.
c) VLDL: Suspensão levemente opaca e coloração branca.
O aspecto turvo da solução de VLDL não impede sua utilização. Amostras de soro de
pacientes que apresentam dislipidemia ocasionada por elevação da concentração de VLDL
apresentam o mesmo aspecto (TIETZ, 2008).
FIGURA 27 – Aspecto da amostra após ultracentrifugação do soro. As faixas formadas por HDL (parte inferior do tubo) e LDL (parte mediana do tubo) são mais visíveis. A faixa
composta por VLDL, apesar de pouco visível, está localiza na porção superior do tubo, próximo à rosca do
frasco. As classes de lipoproteínas foram separadas por ultracentrifugação em gradiente descontinuo de
densidade. Densidade do soro foi ajustada para 1,3g/mL com adição de KBr. Para criação do gradiente de
densidade foi utilizado um sistema bifásico entre o soro com densidade ajustada e solução de cloreto de sódio
0,9% p/v.
65
RESULTADOS
5.2 Determinação do conteúdo químico e proteico das lipoproteínas
A Tabela 16 apresenta os resultados obtidos para a determinação do conteúdo
químico e proteico das lipoproteínas. A concentração de colesterol nas classes de
lipoproteínas é expressa como: colesterol total, colesterol livre (colesterol não esterificado
com ácido graxo) e éster de colesterol (quantificado como linoleato de colesterila).
Tabela 16 – Caracterização química e proteica das lipoproteínas
Parâmetro Faixa Inferior
(HDL)
Faixa mediana
(LDL)
Faixa Superior
(VLDL)
Colesterol Total 79 mg/dL (2,05 mM) 183 mg/dL (4,76 mM) 32 mg/dL (0,83 mM)
Colesterol livre 14 mg/dL (0,36 mM) 46 mg/dL (1,20 mM) 15 mg/dL (0,39 mM)
Éster de colesterol* 110 mg/dL (1,69 mM) 231 mg/dL (3,56 mM) 29 mg/dL (0,44 mM)
Triglicérides 17 mg/dL (0,19 mM) 21 mg/dL (0,24 mM) 124 mg/dL (1,40 mM)
ApoA1 183 mg/dL (65,1 µM) 3,3 mg/dL (1,2 µM) 0,0 mg/dL (0,0 µM)
ApoB100 1,6 mg/dL (0,03 µM) 113 mg/dL (2,2 µM) 12 mg/dL (0,22 µM)
A Separação das lipoproteínas foi realizada utilizando ultracentrifugação de gradiente descontínuo de densidade.
Densidade do plasma ajustado com KBr.
Concentração de colesterol esterificado foi determinada pela diferença entre colesterol livre e colesterol total.
*Éster de colesterol foi calculado como linoleato de colesterila, MM= 649,08 g/mol
66
RESULTADOS
5.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânion
5.3.1 Cinéticas de reação das classes de lipoproteínas
As cinéticas enzimáticas da FIGURA 28 foram determinadas utilizando o reagente
enzimático colorimétrico sem poliânions em sua composição. O gráfico corresponde à reação
catalisada pelas enzimas CE e ChOx nativas após a adição da PARTE 2 do reagente, o que
corresponde à solução com as enzimas.
FIGURA 28 – Cinéticas enzimáticas das classes de lipoproteína. , Teste realizado utilizando o espectrofotômetro Biochrom – Libra S22. Ensaios realizados a 37 ºC, λ= 505 nm.
Além das concentrações distintas de colesterol total entre as classes de lipoproteínas,
as cinéticas de reação também são distintas. HDL apresenta uma cinética de reação com um
incremento de absorbância mais linear. A cinética de reação do LDL possui uma lag phase,
seguido por um crescimento constante da reação. A reação do VLDL praticamente alcança
ponto final com 150 segundos de reação.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 100 200 300 400 500 600
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das lipoproteínas (deduzidas do branco)
HDL
LDL
VLDL
67
RESULTADOS
5.3.2 Seleção de poliânions
a) Curva dose efeito para sulfato de condroitina
A FIGURA 29 demonstra diferentes concentrações de sulfato de condroitina que
foram adicionadas ao reagente enzimático colorimétrico e estas foram posteriormente
avaliadas quanto à atividade residual em relação ao reagente sem poliânions,
FIGURA 29 – Curva dose efeito para sulfato de condroitina. 100% da atividade corresponde ao ΔABS(600segundos – 0 segundos) do ensaio realizado com as enzimas CE e ChOx
nativas sem a presença de poliânions. As amostras de lipoproteínas foram adicionadas à PARTE 1 do reagente
enzimático-colorimétrico, aquecido a 37 ºC, e foram incubados por 5 minutos a 37 ºC. Adicionou-se a PARTE 2
do reagente à mistura. O incremento da absorbância foi acompanhado a 505 nm, durante 10 minutos utilizando o
espectrofotômetro Libra S22-Biochrom.
b) Curva dose efeito para ácido fosfotúngstico
A FIGURA 30 apresenta a atividade residual das lipoproteínas LDL, VLDL e HDL,
quando submetidas à ação da ChOx e CE, na presença de diferentes concentrações de ácido
fosfotúngstico
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,00% 0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50%
Ati
vid
ad
e re
sid
ua
l (%
)
% p/v - sulfato de condroitina
Sulfato de Condroitina
VLDL
LDL
HDL
68
RESULTADOS
FIGURA 30 - Curva dose efeito para ácido fosfotúngstico. Concentrações avaliadas de ácido fosfotúngstico presentes na PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico.
Procedimento aplicado ao experimento foi o mesmo realizado no experimento representado pela FIGURA 29.
c) Curva dose efeito para Sacarose Octassulfato
‘ A FIGURA 31 apresenta o efeito das diferentes concentrações de sacarose
octassulfato sobre a ação das enzimas CE e ChOx sobre as diferentes classes de
lipoproteínas.
FIGURA 31 – Curva dose efeito para sacarose octassulfato. Concentrações avaliadas de sacarose octasulfato presentes na PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico.
Procedimento aplicado ao experimento foi o mesmo realizado no experimento representado pela FIGURA 29..
0%20%40%60%80%
100%120%140%160%180%200%
0,0 0,8 1,5 2,3 3,0 3,8 4,5 5,3 6,0 6,8
Ati
vid
ad
e re
sid
ua
l (%
)
mmol·L-1- Ácido Fosfotúngstico
Ácido Fosfotúngstico
VLDL
LDL
HDL
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 1 2 3 4 5 6
Ati
vid
ad
e re
sid
ua
l (
%)
mmol·L-1 - Sacarose Octasulfato
Sacarose Octasulfato
VLDL
LDL
HDL
69
RESULTADOS
d) Curva dose efeito para Sacarose Octassulfato + Dextran Sulfato 0,5 % p/v
A FIGURA 32 demonstra ação da associação de diferente concentrações de sacarose
octassulfato mais dextran sulfato, com concentração constante de 0,5% p/v, sobre a atividade
das enzimas CE e ChOx utilizando HDL, LDL e VLDL como substrato.
FIGURA 32 – Curva dose efeito para sacarose octassulfato + dextran sulfato 0,05% p/v. Concentrações avaliadas de sacarose octasulfato, associada a 0,05% de dextran sulfato, presentes na PARTE 1
do reagente enzimático-colorimétrico. Procedimento aplicado ao experimento foi o mesmo realizado no
experimento representado pela figura 29.
e) Curva dose efeito para α-ciclodextrina sulfato
Também foram avaliadas diferentes concentrações do poliânion α-ciclodextrina sulfato
(FIGURA 33) como potencial inibidor da catálise das enzimas CE e ChOX sobre as
lipoproteínas. Em complemento a esse ensaio, foi avaliado a associação de α-ciclodextrina
sulfato com 0,5% p/v de dextran sulfato (FIGURA 34).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
180%
200%
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Ati
vid
ad
e re
sid
ua
l (
%)
mmol·L-1 - Sacarose Octasulfato + 0,05% Dextran sulfato
Sacarose Octasulfato + dextran sulfato 0,05% p/V
VLDL
LDL
HDL
70
RESULTADOS
FIGURA 33 – Curva dose efeito para α-ciclodextrina sulfato. Concentrações avaliadas de α-ciclodextrina sulfato presentes na PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico.
Procedimento aplicado ao experimento foi o mesmo realizado no experimento representado pela figura 29.
f) Curva de dose efeitoα-ciclodextrina sulfato + dextran sulfato 0,05% p/v
FIGURA 34 – Curva dose efeito para α-ciclodextrina sulfato associada à dextran sulfato
0,5% p/v. Concentrações avaliadas de α-ciclodextrina sulfato, associada a 0,05% p/v de dextran sulfato, presentes na
PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico. Procedimento aplicado ao experimento foi o mesmo realizado
no experimento representado pela FIGURA 29.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 1 2 3 4
ati
vid
ad
e re
sid
ua
l (
%)
mmol·L-1- Ciclodextrina Sulfatada
α-ciclodextrina sulfato
VLDL
LDL
HDL
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
180%
200%
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0Rea
tiv
ida
de
rela
tiv
a d
e co
lest
ero
l (%
)
mM - αCiclodextrina + 0,05% Dextran sulfato
HDL - α Ciclodextrina + 0,05% dextran Sulfato
VLDL
LDL
HDL
71
RESULTADOS
Tendo em vista que a adição do poliânion ao reagente enzimático-colorimétrico tem
como objetivo a inibição da ação das enzimas CE e ChOx sobre as lipoproteínas LDL e
VLDL. A Tabela 17 resume de cada gráfico de dose efeito dos diferentes poliânions qual foi
a concentração verificada que obteve o menor valor de atividade residual para cada classe de
lipoproteína.
Tabela 17 – Atividade residual dos poliânions sobre as atividades residuais das enzimas
CE eChOx utilizando as lipoproteínas LDL, HDL e VLDL como substrato
ApoB100 ApoA1
Poliânion LDL VLDL HDL
Sulfato de condroitina 81% a 0,25% p/v 88% a 0,5% p/v 46% a 0,25% p/v
Ácido fosfotúngstico 35% a 7,5 mM 52% a 0,75 mM 58% a 2,25 mM
Sacarose octassulfato 91% a 2 mM 82% a 4 mM 81% a 4 mM
Sacarose octassulfato + dextran sulfato 88% a 1 mM 100% a 0 mM 80% a 1 mM
α-ciclodextrina sulfato 85% a 1 mM 68% a 1 mM 54% a 2 mM
α-ciclodextrina sulfato + dextran sulfato 82% a 4 mM 90% a 4 mM 59% a 0,5 mM
O ácido fosfotúngstico promoveu a maior inibição da reação catalisada por CE e ChOx
em comparação aos demais poliânions avaliados para os substratos LDL e VLDL. Foram
alcançadas atividades residuais de 35% e 52% para LDL e VLDL, respectivamente. Mesmo
na primeira concentração do ácido avaliado, 0,75 mmol·L-1
, a atividade residual do LDL caiu
para 69%, valor inferior ao de qualquer outro poliânion avaliado.
O ácido fosfotúngstico permitiu a obtenção de uma atividade residual de 58% para o
HDL na concentração de 2,25 mmol·L-1
, promoveu um incremento da atividade da reação em
77% a 0,75 mmol·L-1
e em nenhum momento incrementou as atividades das reações de LDL e
VLDL. Se considerado a concentração de 0,75 mmol·L-1
para ácido fosfotúngstico as
atividades residuais foram: 69% para LDL, 52% para VLDL e 177% para HDL, o que o
define como poliânion com maior capacidade de inibição da reação catalisada por CE e ChOx
sobre LDL e VLDL.
72
RESULTADOS
5.4 Conjugação com monometoxipolietilenoglicol succinimidil carbonato
Os resultados dos percentuais de conjugação das enzimas colestesol esterase e
colesterol oxidase estão demonstrados na Tabela 18. Os resultados estão expressos em
absorbância em 570 nm para o ensaio colorimétrico com ninidrina.
Tabela 18 – Teste de ninidrina para determinação do grau de conjugação com mPEG-
NHS
Absorbâncias das amostras – λ 570 nm
Colesterol esterase Grau de peguilação
CE nativa CE PEG-5 kDa CE PEG-10 kDa CE PEG-5 kDa CE PEG-10 kDa
0,943 0,526 0,556 44,2% 41,0%
Colesterol oxidase
ChOx nativa ChOx PEG-5 kDa ChOx PEG-10 kDa ChOx PEG-5 kDa ChOx PEG-10 kDa
0,736 0,660 0,665 10,3% 9,7%
As absorbâncias das amostras foram deduzidas dos brancos reacionais.
Grau de peguilação pode ser entendido como porcentagem de potenciais grupos amino que foram conjugados
com mPEG.
O grau de peguilação alcançado foi semelhante entre os dois polímeros de mPEG-
NHS selecionados. O mPEG NHS 10 kDa apresentou menor grau de conjugação.
Durante o aquecimento das enzimas a 100 ºC, para a realização do teste de ninidrina a
enzima ChOx nativa precipitou, o que não foi percebido com a enzima peguilada.
73
RESULTADOS
5.5 Ensaios para determinação da atividade residual das enzimas peguiladas
associadas a 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico
Após a conjugação das enzimas com mPEG-NHS foi elaborado novo reagente
enzimático-colorimétrico contendo as enzimas peguiladas e o ácido fosfotúngstico 0,75
mmol/L-1
. O desempenho do novo reagente foi verificado utilizando as lipoproteínas como
amostra e comparado aos reagentes contendo: a) as enzimas peguiladas sem o poliânion, b)
enzimas peguiladas + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato associado à dextran sulfato 0,05%
p/v e c) enzimas nativas sem poliânion (FIGURA 35). Os ensaios foram realizados no
analisador automático Labmax 240 – Labtest Diagnóstica SA, o que possibilitou a
visualização da interação entre a PARTE 1 dos reagentes com a amostra.
FIGURA 35 – Cinética de reação das enzimas nativas sem poliânions em analisador
automático Labmax 240. A PARTE 1 do reagente enzimático colorimétrico é adicionada à cubeta de reação, aquecida a 37 ºC, aos 75
segundos. Após 90 segundos a amostra é adicionada. A adição da PARTE 2 ocorre aos 300 segundos após
adição da amostra. Os tempos de adição dos reagentes, tempo de reação e temperatura são fixos. O equipamento
realiza medição da absorbância em 505 nm a cada 15 segundos de reação. As absorbâncias das amostras foram
deduzidas do branco de reação, que consiste da absorbância do reagente mais amostra que não contenha o
substrato das enzimas (no ensaio em questão foi utilizado água deionizada) em 505 nm,. O mesmo protocolo foi
aplicado a todos os demais experimentos realizados utilizando o analisador automático.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas das reações utilizando enzimas nativas sem poliânion
Enzimas nativas - VLDL
Enzimas nativas - LDL
Enzimas nativas - HDL
74
RESULTADOS
A normalização das cinéticas (FIGURA 36), considerando a absorbância inicial igual
a 0,000, permite visualizar com uma maior escala gráfica, em comparação à utilizada na
FIGURA 35, a reação catalisada pelas enzimas nativas. Os dados apresentados no gráfico
foram obtidos após a adição da PARTE 2 do reagente enzimático-colorimétrico.
FIGURA 36 – Cinética de reação das lipoproteínas normalizadas para ABS inicial =
0,000. Cinéticas das enzimas CE e ChOx após normalização para ABS= 0,000, A normalização das cinéticas
proporciona melhor vizulaização do perfil cinético de cada reação.
A conjugação das enzimas com mPEG NHS 5 kDa promoveu redução de sua
atividade catalítica, independente do substrato analisado, como está indicado na FIGURA 37
As reações das enzimas peguiladas com as lipoproteínas apresentam cinética de reação
distinta das enzimas nativas e uma redução do ΔABS (800 segundos – 465 segundos).
-0,020
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas nativas normalizadas para ABS
inicial = 0,000
Enzimas nativas - VLDL
Enzimas nativas - LDL
Enzimas nativas - HDL
75
RESULTADOS
FIGURA 37 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa, sem
poliânioins As cinéticas obtidas com o reagente enzimático-colorimétrico que contém enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa
foram avaliadas utilizando o analisador automático Labmax 240, conforme descrito na FIGURA 35. A
peguilação reduziu a atividade catalítica das enzimas CE e ChOx.
As cinéticas de reação da FIGURA 37 foram normalizadas para ABS 0,000 e
apresentadas na FIGURA 38. A cinética de reação com HDL ainda apresenta crescimento
linear na absorbância, entretanto a taxa de crescimento é inferior quando comparado com as
enzimas nativas. Para o LDL ocorre uma deflexão na cinética da reação, seguido por um
aumento da absorbância. Praticamente, não há alteração na absorbância para o VLDL.
Entretanto, todas essas alterações ocorrem com uma pequena variação no ΔABS (800 segundos –
465 segundos), não superior a 20 miliunidades de absorbância.
.
FIGURA 38 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5
kDa, sem poliânions Cinéticas de reação normalizadas referentes à FIGURA 37.
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
,, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa, sem
poliânions
Enzima PEG 5 kDa -
VLDL
Enzima PEG 5 kDa -LDL
Enzima PEG 5 kDa -HDL
-0,0200
-0,0150
-0,0100
-0,0050
0,0000
0,0050
0,0100
450 550 650 750
Ab
sorb
ãn
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5
kDa, sem poliânions, normalizadas para ABSi = 0,000
Enzima PEG 5 kDa -
VLDL
Enzima PEG 5 kDa -LDL
Enzima PEG 5 kDa -HDL
76
RESULTADOS
Os mesmo fenômenos observados com as enzimas peguiladas com mPEG NHS 5 kDa são
observados nas enzimas conjugadas com mPEG 10 kDa (FIGURAS 39 e 40).
FIGURA 39 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa, sem
poliânion As cinéticas de reação com de mPEG 10 kDa não diferem das cinéticas com mPEG 5kDa.
FIGURA 40 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 10
kDa, sem poliânions As cinéticas de reação da FIGURA 39 foram normalizadas para ABS 0,000.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa, sem
poliânion
Enzima PEG 10 kDa -VLDL
Enzima PEG 10 kDa -LDL
Enzima PEG 10 kDa -HDL
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sob
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa, sem
poliânions, normalizadas para ABSi = 0,000
Enzima PEG 10 kDa -VLDL
Enzima PEG 10 kDa -LDL
Enzima PEG 10 kDa -HDL
77
RESULTADOS
A mesma avaliação das cinéticas enzimáticas foi aplicada ao reagente enzimático-
colorimétrico com 0,75 mmol·L-1
(FIGURAS 41 e 42). A adição de 0,75 mmol·L-1
de ácido
fosfotúngstico à PARTE 1 do reagente enzimático-colorimétrico inibiu a formação da
deflexão negativa na reação com LDL, porém não provocou alterações nas cinéticas de reação
para HDL e VLDL.
FIGURA 41 – Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa + 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. As cinéticas enzimáticas obtidas com o reagente enzimático-colorimétrico que contém enzimas peguiladas com
mPEG 5 kDa + 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico foram avaliadas utilizando o analisador automático
Labmax 240.
FIGURA 42 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5
kDa + 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. As cinéticas de reação da FIGURA 41 foram normalizadas para ABS 0,000..
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa +
0,75 mmol·L-1 de ác. fosfotúngstico
Enzimas PEG 5 kDa - VLDL
Enzimas PEG 5 kDa - LDL
Enzimas PEG 5 kDa - HDL
-0,030
-0,025
-0,020
-0,015
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com
mPEG 5 kDa + 0,75 mmol·L-1 de ác. fosfotúngstico, ABSi = 0,000
Enzima PEG 5 kDa -VLDL
Enzima PEG 5 kDa -LDL
Enzima PEG 5 kDa -HDL
78
RESULTADOS
As mesma alterações presentes nas cinéticas de reação das enzimas peguiladas com
mPEG-NHS 5 kDa na presença de 0,75 mM de ácido fosfotúngstico aplicam-se as enzimas
modificadas com mPEG NHS 10 kDa na presença do poliânion (FIGURAS 43 e 44).
FIGURA 43 – Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. As cinéticas enzimáticas do reagente enzimático-colorimetro elaborado com enzimas peguiladas com mPEG 10
kDa e 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico foram avaliadas utilizando o analisador automático Labmax 240
FIGURA 44 - Cinéticas de reação normalizadas das lipoproteínas utilizando enzimas
peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico. As cinéticas de reação da FIGURA 43 foram normalizadas para ABS 0,000.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa +
0,75 mmol·L-1 de ác. fosfotúngstico
Enzima PEG 10 kDa -VLDL
Enzima PEG 10 kDa -LDL
Enzima PEG 10 kDa -HDL
-0,0250
-0,0200
-0,0150
-0,0100
-0,0050
0,0000
0,0050
0,0100
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas enzimas peguiladas com mPEG 10
kDa + 0,75 mmol·L-1 de ác. fosfotúngstico, ABSi = 0,000
Enzima PEG 10 kDa -HDL
Enzima PEG 10 kDa -LDL
Enzima PEG 10 kDa -VLDL
79
RESULTADOS
A adição de 0,5 mmol·L-1
de α-ciclodextria sulfato ao reagente enzimático-
colorimétrico com enzimas peguiladas não afetou significativamente as cinéticas de reação
enzimáticas, idependente do peso molecular de mPEG utilizado na peguilação (FIGURAS
45, 46, 47 e 48), quando comparado às cinéticas de reação das enzimas peguiladas na
ausência de poliânion.
FIGURA 45 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa + 0,5
mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato As cinéticas enzimáticas do reagente enzimático-colorimetro elaborado com enzimas peguiladas com mPEG 5
kDa e 0,5 mmol·L-1
de α-ciclodextrina sulfato foram avaliadas utilizando o analisador automático Labmax 240.
FIGURA 46 - Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com mPEG 5
kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. A utilização de α-ciclodextrina sulfato não acarretou em diferenças no perfil da cinética da reação das
lipoproteínas em comparação às cinéticas enzimas peguiladas na ausência de poliânions.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 5 kDa + 0,5
mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
-0,025
-0,020
-0,015
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas das enzimas peguiladas com
mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato, ABSi = 0,000
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
80
RESULTADOS
FIGURA 47 - Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5
mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. A associação de 0,5 mmol·L
-1 de α-ciclodextrina sulfato com enzimas peguiladas com mPEG-NHS 10 kDa não
promoveu alterações significativas nas cinéticas de reação das lipoproteínas em comparação
Figura 48 - Cinéticas de reação normalizadas das lipoproteínas utilizando enzimas
peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina sulfato. Cinéticas de reação da FIGURA 47 são apresentadas normalizadas para ABS = 0,000.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação das enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5
mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 10 kDa - VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
-0,010-0,008-0,006-0,004-0,0020,0000,0020,0040,0060,0080,010
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ânci
a, 5
05
nm
Tempo de reação (segundos)
Cinéticas de reação normalizadas das lipoproteínas utilizando
enzimas peguiladas com mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1 α-
ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 10 kDa - VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
81
RESULTADOS
A peguilação das enzimas promoveu uma redução no ΔABS(800 segundos – 465 segundos),
quando comparada com a forma nativa das enzimas. As cinéticas de reação com HDL, mesmo
após a peguilação, apresentam crescimento da absorbância e cinética de reação semelhante às
enzimas nativas, independente da molécula de mPEG-NHS utilizada ou se a reação é
realizada na presença ou ausência de ácido fosfotúngstico ou α ciclodextrina.
As cinéticas de reação das enzimas com as lipoproteínas LDL e VLDL tiveram as
mudanças mais drásticas. Após a peguilação, praticamente não há incremento da absorbância
e a presença de ácido fosfotúngstico removeu a deflexão na cinética de reação para o substrato
LDL.
82
RESULTADOS
5.5.1 Reagente enzimático-colorimétrico contendo 10 vezes a concentração de enzimas
Com a redução do ΔABS(800 segundos – 450 segundos) observado nos reagentes contendo as
enzimas peguiladas em comparação com o que contém as enzima nativas, um segundo
reagente foi elaborado com dez vezes mais a concentração nominal de enzimas peguiladas, no
intuito de aumentar a sensibilidade do sistema. O reagente é composto por 10 kU/L de CE-
PEG e 50 kU/L de ChOx-PEG. As cinéticas de reação das lipoproteínas utilizando o reagente
com maior concentração de enzimas peguiladas foi avaliado sem a associação com poliânions
e na presença de ácido fosfotúngstico e α-ciclodextrina sulfato associada ao dextran sulfato
0,05% p/v.
O aumento na concentração nominal das enzimas em 10 vezes acarretou em aumento no
ΔABS(800 segundos – 465 segundos) para HDL e LDL, sem causar grandes modificações na cinética de
reação com VLDL (FIGURA 49). O aumento na concentração das enzimas não manteve a
seletividade encontrada nos estudos anteriores. As reações que tem LDL como substrato
apresentam incremento da absorbância (FIGURA 50). Assim como nos ensaios anteriores, as
cinéticas de reação com o mPEG 10 kDa não se diferem das cinéticas enzimáticas com as
enzimas peguiladas com polímero de 5 kDa (FIGURAS 51 e 52).
FIGURA 49 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa, sem poliânion. O reagente enzimático-colorimétrico foi elaborado com uma concentração nominal de enzimas 10 vezes superior
ao testado anteriormente. Concentrações finais de CE-PEG 10 kU/L e ChOx 50 kU/L. As cinéticas de reação
foram avaliadas utilizando o analisador automático Labmax 240.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 5 kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L, sem
poliâniôn
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
83
RESULTADOS
.
FIGURA 50 – Normalização das cinéticas de reação do reagente enzimático-
colorimétrico com 10 vezes a concentração de enzimas mPEG 5 kDa, sem
poliânion. Cinéticas de reação da FIGURA 49 são apresentadas normalizadas para ABS = 0,000.
FIGURA 51 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa, sem poliânion. Cinéticas de reação enzimáticas foram determinadas utilizando o reagente enzimático-colorimétrico com 10
vezes a concentração nominal de enzimas peguiladas. Testes foram realizados utilizando Labmax 240.
-0,020
-0,010
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
osr
ob
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 5 kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L, sem
poliânion
Enzima PEG 10 kDa - VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico CE- PEG 10
kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 10 kDa 50 KU/L, sem poliânion
Enzima PEG 10 kDa -
VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
84
RESULTADOS
FIGURA 52 – Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico com
10 vezes a concentração de enzimas mPEG 10 kDa, sem poliânion. As cinéticas de reação são semelhantes às obtidas com as enzimas conjugadas com mPEG-NHS 5 kDa.
A presença do poliânion ácido fosfotúngstico na reação com LDL inibiu o crescimento
da absorbância após a adição da PARTE 2 do reagente enzimático-colorimétrico. A partir dos
650 segundos a reação alcança um platô na absorbância. A reação com HDL e VLDL não
apresentam diferença na cinética de reação quando comparada ao mesmo reagente sem o
poliânion (FIGURAS 53 e 54).
-0,020
-0,010
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
osr
ob
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 10 kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 10 kDa 50 KU/L, sem
poliânion
Enzima PEG 10 kDa -
VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
85
RESULTADOS
FIGURA 53 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de ácido
fosfotúngstico. Cinéticas de reação do reagente enzimático-colorimétrico com CE-5kDa 10 KU/L e ChOx-10kDa 50 KU/L
associado a 0,75 mmol·L-1
Com a normalização das cinéticas de reação (FIGURA 54) fica mais evidente a
formação do platô na reação aos 600 segundos de reação com LDL como substrato. A adição
do poliânion foi eficaz na inibição do incremento da absorbância.
FIGURA 54 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico
com 10 vezes a concentração de enzimas mPEG 5 kDa, associado a 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngtico.
0,000
0,100
0,200
0,300
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico CE- PEG 5
kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L+ 0,75 mmol·L-1 ác.
fosfotúngstico
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
-0,200
-0,150
-0,100
-0,050
0,000
0,050
0,100
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 50
5 n
m
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 5 kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L+ 0,75
mmol·L-1 ác. fosfotúngstico
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
86
RESULTADOS
A adição de ácido fosfotúngstico ao reagente enzimático colorimétrico contendo
enzimas peguiladas com mPEG-NHS 10 kDa (FIGURAS 55 e 56), teve a mesma ação as
lipoproteínas quando comparado ao reagente contendo enzimas peguiladas com mPEG-NHS
5 kDa associado ao ácido fosfotungstico.
FIGURA 55 – Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa, associado a 0,75 mmol·L-1
de
ácido fosfotúngstico.
FIGURA 56 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico
com 10 vezes a concentração de enzimas mPEG 10 kDa, associado a 0,75
mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico CE- PEG 10
kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 10kDa 50 KU/L+ 0,75 mmol·L-1 ác.
fosfotúngstico
Enzima PEG 10 kDa -
VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
-0,200
-0,150
-0,100
-0,050
0,000
0,050
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
osr
ob
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente
enzimático-colorimétrico CE- PEG 10 kDa 10 KU/L e ChOx-PEG
10kDa 50 KU/L+ 0,75 mmol·L-1 ác. fosfotúngstico
Enzima PEG 10 kDa
- VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
87
RESULTADOS
A α-ciclodextrina sulfato, utilizada na concentração de 0,5 mmol·L-1
e associada ao
dextran sulfato não foi capaz de inibir o incremento da absorbância na reação com a LDL,
como obtido para ácido fosfotúngstico, independente da massa molecular do polietilenoglicol
utilizado para a peguilação das enzimas (FIGURAS 57, 58 59 e 60).
FIGURA 57 - Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina
sulfato
FIGURA 58 – Normalização das cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico
com 10 a concentração de enzimas mPEG 5 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-
ciclodextrina sulfato.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico CE- PEG
5kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L
+ 0,5 mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
-0,020
0,000
0,020
0,040
0,060
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sob
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 5kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L
+ 0,5 mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 5 kDa - VLDL
Enzima PEG 5 kDa - LDL
Enzima PEG 5 kDa - HDL
88
RESULTADOS
FIGURA 59 - Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico com 10 vezes a
concentração de enzimas mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-ciclodextrina
sulfato A associação de 0,5 mM de α-ciclodextrina sulfato ao reagente contendo enzimas peguiladas com mPEG-NHS
10 kDa não impediu a elevação da absorbância na reação com a LDL.
FIGURA 60 – Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico com
10 vezes a concentração de enzimas mPEG 10 kDa + 0,5 mmol·L-1
α-
ciclodextrina sulfato.
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 200 400 600 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação reagente enzimático-colorimétrico CE- PEG
5kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L
+ 0,5 mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 10 kDa - VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
-0,020
-0,010
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ân
cia
, 5
05
nm
Tempo de reação (s)
Cinéticas de reação normalizadas reagente enzimático-colorimétrico
CE- PEG 5kDa 10 KU/L e ChOx-PEG 5kDa 50 KU/L
+ 0,5 mmol·L-1 α-ciclodextrina sulfato
Enzima PEG 10 kDa -
VLDL
Enzima PEG 10 kDa - LDL
Enzima PEG 10 kDa - HDL
89
RESULTADOS
O aumento de dez vezes na concentração nominal das enzimas peguiladas promoveu
o aumento do ΔABS(800 segundos – 465 segundos) da reação com as lipoproteínas HDL e LDL.
Entretanto, o aumento da concentração das enzimas promoveu queda de especificidade do
sistema, evidenciado pelo incremento de absorbância da reação com LDL. Com a adição do
ácido fosfotúngstico ao reagente, a reação com LDL não apresentou mais incremento de
absorbância após a adição da PARTE 2 do reagente. A reação das demais lipoproteínas não
foi afetada. A adição de 0,5 mM de α-ciclodextrina evidenciou ser incapaz de evitar a
elevação da absorbância após a adição da PARTE 2 do reagente.
Apesar das cinéticas de reação do reagente com maior concentração de enzimas
serem visualmente semelhante às reações com enzimas nativas, elas são estatisticamente
distintas (Tabela 19). Após a adição do ácido fosfotúngstico a cinética de reação utilizando
LDL como substrato deixa de apresentar correlação com o reagente elaborado com enzimas
nativas.
Todas as comparações apresentaram | t valor | maior que t crítico. A hipótese nula é
descartada. A adição do poliânion altera as cinéticas de reação das lipoproteínas. Há elevada
correlação entre as cinéticas de reação, mesmo após a modificação enzimática e adição do
poliânion. Exceto para a cinética de reação do LDL na presença de ácido fosfotúngstico.
Tabela 19 – Teste t-Student para comparativo das cinéticas enzimáticas.
Teste de t-Student, comparativo das cinéticas de reação entre as enzimas nativas e
enzimas peguiladas na presença e ausência de ácido fosfotúngstico.
Teste t bicaudal para dados emparelhados
H0:µd =0 – adição do poliânion e a modificação enzimática não promoveu alteração das cinéticas de reação
H1:µd≠ 0 – adição do poliânion e a modificação enzimática promoveu alteração das cinéticas de reação
5.5.2
n amostral – 11 intervalos de medição de absorbância (650-800 segundos de reação)
t crítico 3,17 – para n = 11 e p (0,01)
Se | t valor | > rejeita-se hipótese nula.
Ácido fosfotúngstico + Enzimas PEG Enzimas PEG
HDL LDL HDL LDL
t valor 31,24 116,93 27,48 -5,88
Correlação de
Pearson (r) 0,999 -0,775 1,000 1,000
Os cálculos estatísticos foram realizados com MS-Excel 2010 - Microsoft
90
Tabela 20 – Atividade residual das reações catalisadas pelas enzimas peguiladas
Lipoproteínas
Reagente enzimático-colorimétrico HDL
ΔABS (800s – 650s) / ativ.
residual
LDL
ΔABS (800s – 650s) / ativ.
residual
VLDL
ΔABS (800s – 465s) / ativ.
residual
Enzimas nativas e sem poliânion 0,0259 / 100% 0,0362 / 100% 0,0248/100%
Enzimas 5 kDa mPEG 0,0018 / 7,0% 0,0052 / 14,3% -0,0038/ -17,0%
Enzimas 10 kDa mPEG 0,0014 / 5,5% 0,0042 / 11,7% -0,0030/ -13,4%
Enzimas 5 kDa mPEG + ac. Fosfotúngstico 0,75 mmol·L-1 0,0012 / 4,6% -0,0001 / -0,2% -0,0039 / -17,8%
Enzimas 10 kDa mPEG + ac. Fosfotúngstico 0,75 mmol·L-1 0,0005 / 1,9% 0,0019 / 5,2% -0,0055 / -24,6%
Enzimas 5 kDa mPEG + α-ciclodextrina sulfato 0,5 mmol·L-1 0,0013 / 5,1% 0,0004 / 1,1% - 0,0070 / -28,1%
Enzimas 10 kDa mPEG + α-ciclodextrina sulfato 0,5 mmol·L-1 0,0017 / 6,6% -0,0004 / 1,1% -0,00643 / -25,9%
10x [ ] Enzimas 5 kDa mPEG 0,0161 / 62,4% 0,02385 / 65,9% -0,0179 / 72,4%
10x [ ] Enzimas 10 kDa mPEG 0,0155 / 60,0% 0,0145/ 40,1% -0,0120 / -48,5%
10x [ ] Enzimas 5 kDa mPEG + ac. Fosfotúngstico 0,75 mmol·L-1 0,0176 / 68,0% 0,0051 / 14,0% - 0,0146 / -58,9%
10x [ ] Enzimas 10 kDa mPEG + ac. Fosfotúngstico 0,75 mmol·L-1 0,0167 /64,63% -0,0001 / -0,3% -0,0122 / -49,2%
10x [ ] Enzimas 5 kDa mPEG + α-ciclodextrina sulfato 0,5 mmol·L-1 0,0147 / 56,8 % 0,0239 / 65,9% -0,0206 / -83,1
10x [ ] Enzimas 10 kDa mPEG + α-ciclodextrina sulfato 0,5 mmol·L-1 0,0123 / 47,5% 0,0229 / 63,1% -0,0199 / -80.2
1- Para o cálculo de atividade residual, o ΔABS para o reagente enzimático-colorimétrico com enzimas nativas e sem poliânion foi considerado como 100%.
2- Para a medição de ΔABS para as cinéticas de reação com HDL e LDL utiliza-se o intervalo entre 650 a 800 segundos para determinar a variação de absorbância em
platôs formados em algumas das cinéticas de reação.
3- Utiliza-se o intervalo entre 465 a 800 segundos para determinação ΔABS para as reações com VLDL devido à característica de ponto final da cinética de reação da
lipoproteína. Intervalos de tempo menores resultariam em valores de ΔABS próximos de 0.
91
RESULTADOS
O reagente contendo a associação de 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico mais 10
kU/L de CE e 50 kU/L de ChOx, conjugadas com mPEG-NHS 10 kDa apresentou a
capacidade de inibir a ação das enzimas sobre as ApoB-lipoproteínas e maior sensibilidade
para detecção no produto corado pelo espectrofotômetro avaliadas. Combinação semelhante à
citada acima, empregando enzimas conjugadas com mPEG-NHS 5kDa, também foi eficaz
para a inibição da reação das lipoproteínas LDL e VLDL. Entretanto, há um pequeno
incremento na absorbância para a reação que utiliza o LDL como substrato, indicando que a
associação 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico mais 10 kU/L de CE e 50 kU/L de ChOx-
conjugadas com mPEG-NHS 10 seja a mais eficaz para a inibição das reações com LDL e
VLDL.
92
RESULTADOS
5.6 Determinação da variação de entalpia aparente de reação e constante de
Michaelis-Menten.
5.6.1 Enzimas nativas – substrato lipoproteínas.
Foram avaliados diferentes parâmetros nos ensaios realizados no microcalorímetro,
variando-se concentração de enzima, substrato, volume de injeção e tempo de reação até a
definição do protocolo mais adequado para o cálculo de ΔHapp de reação e de Km das enzimas
nativas. Entretanto, todos os protocolos avaliados para a enzima colesterol oxidase não
forneceram resultados satisfatórios para determinação de ΔHapp ou Km utilizando as
lipoproteínas como substrato. As deflexões resultantes da catálise pela ChOx não retornavam
à linha base e apresentavam DP baixo, com termograma pouco diferente do branco reacional.
A hidrólise da amostra de VLDL por CE não liberou calor suficiente para discriminar
a reação de hidrólise do branco reacional, o que impossibilitou a determinação de ΔHapp e Km
para a catálise desse substrato.
. A FIGURA 61 apresenta o termograma da reação de hidrólise do HDL pela CE, que
libera para o meio 2,44 kcal/mol de linoleato de colesterila.
FIGURA 61 – Termograma da reação de CE com substrato HDL. Ensaio realizado com injeção única de 10 µL de amostra. Ensaio realizado em tampão fosfato 10 mmol·L
-1 pH
7,0 + NaCl 0,9% p/v, 37 ºC, Área corrigida da deflexão é de -41,3 µcal
-0,50
-0,40
-0,30
-0,20
-0,10
0,00
0,10
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
μca
l/s
Tempo de reação (min)
Termograma da reação de CE com substrato HDL
Reação
Branco
93
RESULTADOS
Posterior à determinação da entalpia de reação para a hidrólise de HDL pela CE, foi realizado
a titulação isotérmica da reação enzimática (FIGURA 62). A cinética enzimática (FIGURA
63) é obtida por transformação matemática dos dados provenientes da titulação da hidrólise de
HDL. A determinação da velocidade de reação é calculada pela equação 𝑣 =𝑑 𝑃
𝑑𝑡=
1
𝑉∙∆𝐻app∙
𝑑𝑞
𝑑𝑡
FIGURA 62 – Titulação isotérmica da hidrólise de HDL por CE. Injeções consecutivas, intervaladas a cada 1 minuto de 5,0µL/min de amostra de HDL com concentração de
linoleato de colesterila 1,69 mmol·L-1
. Ensaio realizado em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9%
p/v, 37 ºC. Deflexões na curva são causadas pela hidrólise de lipídeos presentes na lipoproteína.
Cinética enzimática - CE substrato HDL
0 10 20 30 40 500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
µM - linoleato de colesterila
µm
ol/
L/m
in
FIGURA 63 – Cinética enzimática – CE substrato HDL.
-0,50
-0,40
-0,30
-0,20
-0,10
0,00
0,10
0,20
0 5 10 15 20 25
µca
l/s
Tempo (min)
Titulação isotérmica da hidrólise de HDL por CE
Reação
Branco
94
RESULTADOS
Como a determinação do Km foi realizada utilizando a linearização de Lineweaver-
Burk é necessário aplicar regressão dos mínimos quadrados aos dados para definir a
inclinação e intercepto da curva. A regressão dos mínimos quadrados leva em consideração os
valores absolutos dos pontos da curva e como consequência os menores valores com maiores
inversos têm maior impacto para determinação da inclinação da curva. A exatidão dos
resultados na região mais próxima do intercepto da curva é comprometida. Para minimizar o
impacto dos pontos de maiores inversos, utilizam-se pesos estatísticos na regressão linear
(JAIN, 2010).
Os inversos da velocidade de reação e a concentração de substrato foram utilizados
para a linearização dos resultados da cinética de reação das de hidrólise do HDL pela CE
(FIGURA 64).
.
FIGURA 64 – Linearização de Lineweaver-Burk para CE + HDL. Correlação linear ajustada por peso estatístico de cada ponto. Fator de peso utilizado 1/x
2. Regressão realizada
em GraphPad Prism 5.03.
A ΔHapp,(FIGURA 65) , titulação isotérmica de hidrólise do substrato (FIGURA 66),
cinética enzimática (FIGURA 67) e determinação de valor de Km também foram (FIGURA
68) também foram determinados para CE nativa utilizando LDL como substrato, por meio de
ITC.
95
RESULTADOS
FIGURA 65 – Termograma da reação de CE com substrato LDL. Ensaio realizado com injeção única de 40 µL de amostra em tampão fosfato 10 mmol·L
-1 pH 7,0 + NaCl 0,9%
p/v, 37 ºC. Área corrigida da deflexão é de -278,7 µcal. A reação de hidrólise do LDL pela CE libera para o meio
-1,96 kcal/mol de linoleato de colesterila.
FIGURA 66 – Titulação isotérmica da hidrólise de LDL por CE. Ensaio realizado em tampão fosfato 10 mmol·L
-1 pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v, 37 ºC, com injeção de 5,0µL/min de
amostra de LDL com concentração de linoleato de colesterila 3,56 mmol·L-1
. Deflexões na curva são causadas
pela hidrólise de lipídeos presentes na lipoproteína.
-0,7
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0 5 10 15 20
μca
l/s
Tempo (min)
Termograma da reação de CE com substrato LDL
Branco
Reação
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
µca
l/s
Tempo (min)
Titulação isotérmica da hidrólise de LDL por CE
Reação
Branco
96
RESULTADOS
Cinética enzimática - CE substrato LDL
0 20 40 60 80 1000.0
0.5
1.0
1.5
µM - linoleato de colesterila
µm
ol/
L/m
in
FIGURA 67 – Cinética enzimática – CE substrato LDL. A cinética enzimática é obtida por transformação matemática dos dados provenientes da titulação da hidrólise de
LDL (fig.66).
Linearização de Lineweaver-Burk CE + LDL
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15
0.5
1.0
1.5
2.0
Km = 13,14 µM
Vmax = 1,26 µmol/L/min
y = 10,42x + 0,7928
r = 0,967
1/µM linoleato de colesterila
1/(
µm
ol/L
/min
)
FIGURA 68 – Linearização de Lineweaver-Burk para CE + HDL. Correlação linear ajustada por peso estatístico de cada ponto. Fator de peso utilizado 1/x
2. Regressão realizada
em GraphPad Prism 5.03.
97
RESULTADOS
O resumo dos resultados é apresentado na Tabela 21.
Tabela 21 – Parâmetros enzimáticos para colesterol esterase nativa
Parâmetro Substrato
HDL LDL
ΔHapp -2,44 kcal/mol de linoleato de
colesterila
-1,96 kcal/mol de linoleato de
colesterila
Km 4,26 µmol·L-1
13,14 µmol·L-1
Parâmetros definidos em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v a 37 ºC.
5.6.2 Colesterol esterase peguilada – substrato lipoproteínas.
Os mesmos passos operacionais no microcalorímetro para determinação de ΔHapp e
Km nas enzimas nativas foram realizados para CE-PEG- 10 kDa. Um menor número de
ensaios foram realizados com ChOx-PEG e VLDL como substrato, mas os resultados foram
insatisfatórios, assim como os outros obtidos anteriormente.
Durante a tentativa de determinação do Km para CE-PEG 10 kDa com LDL como
substrato, as injeções de amostra resultavam em deflexões de mesma magnitude. Mesmo
variando-se concentração da enzima ou amostra a alturas das deflexões eram as mesmas.
Dessa maneira não é possível observar um aumento na velocidade da reação, o que impediu a
determinação do Km. Porém, foi possível determinar a ΔHapp da reação de hidrólise para CE-
PEG utilizando LDL como substrato (FIGURA 73).
Para a CE-PEG utilizado HDL como substrato a determinação dos parâmetros
cinéticos foram obtidos satisfatoriamente. Os resultados estão demonstrados nas FIGURAS
69, 70, 71 e 72.
98
RESULTADOS
.
FIGURA 69 - Termograma da reação de CE-PEG 10 kDa com substrato HDL. Ensaio realizado com injeção única de 10 µL de amostra. Ensaio realizado em tampão fosfato 10 mmol·L
-1 pH
7,0 + NaCl 0,9% p/v. 37 ºC. Área corrigida da deflexão é de -48,5 µcal. A reação de hidrólise do HDL pela CE-
PEG 10 kDa libera para o meio -2.87 kcal/mol de linoleato de colesterila.
FIGURA 70 – Titulação isotérmica da hidrólise de HDL por CE-PEG – 10 kDa. Injeção de 5,0µL/min de amostra de HDL com concentração de linoleato de colesterila 1,69 mmol·L
-1. Ensaio
realizado em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v, 37 ºC. Deflexões na curva são causadas pela
hidrólise de lipídeos presentes na lipoproteína.
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0 2 4 6 8 10
μca
l/s
Tempo (min)
Termograma da reação de CE-PEG 10 KDa com substrato HDL
Branco
Reação
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0 2 4 6 8 10
µca
l/s
Tempo (min)
Titulação isotérmica da hidrólise de HDL - por CE-PEG - 10kDa
Reação
Branco
99
RESULTADOS
Cinética enzimática - CE-PEG 10 kDa substrato HDL
0 10 20 30 400.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
µM - linoleato de colesterila
µm
ol/
L/m
in
FIGURA 71 – Cinética enzimática – CE substrato HDL. Cinética enzimática é obtida por transformação matemática dos dados provenientes da titulação da hidrólise de
HDL pela enzima CE-PEG 10 kDa (fig.70).
Linearização de Lineweaver-Burke CE-PEG 10 kDa + HDL
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0Km = 21,62 µM
Vmax = 1,42 µmol/l/min
y = 15,28x + 0,71
r = 0,907
1/µM - linoleato de colesterila
1/(
µm
ol/
L/m
in)
FIGURA 72 – Linearização de Lineweaver-Burk para CE-PEG 10 kDa + HDL. Correlação linear ajustada por peso estatístico de cada ponto. Fator de peso utilizado 1/x
2. Regressão realizada
em GraphPad Prism 5.03.
100
RESULTADOS
FIGURA 73 – Termograma da reação de CE-PEG 10 kDa com substrato LDL. Área corrigida da deflexão negativa é de -304,3 µcal. Ensaio realizado em tampão fosfato 10 mmol·L
-1 pH 7,0 +
NaCl 0,9% p/v. 37 ºC. A reação de interação do LDL pela CE-PEG – 10 kDa libera para o meio -2,14 kcal/mol
de linoleato de colesterila.
Todos os resultados obtidos utilizando ITC para a determinação dos parâmetros cinéticos das
enzimas CE nativa e após a peguilação estão resumidos na Tabela 22.
Tabela 22 – Parâmetros enzimáticos para colesterol esterase
Substrato
Parâmetro enzimático HDL LDL
CE nativa
ΔHapp -2,44 kcal/mol de linoleato de
colesterila
-1,96 kcal/mol de linoleato de
colesterila
Km 4,26 µmol·L-1
13,14 µmol·L-1
CE – PEG 10 kDa
ΔHapp -2,87 kcal/mol de linoleato de
colesterila
-2,14 kcal/mol de linoleato de
colesterila
Km 21,62 µmol·L-1
Não determinado
Parâmetros definidos em tampão fosfato 10 mmol·L-1
pH 7,0 + NaCl 0,9% p/v a 37 ºC.
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
0 5 10 15 20
μca
l/s
Tempo (min)
Termograma da interação de CE-PEG com substrato LDL
Branco
Reação
101
6 DISCUSSÃO
6.1 Separação de lipoproteínas e determinação de suas características químicas e
proteicas.
A separação das lipoproteínas ocorreu de maneira satisfatória. O aspecto de
distribuição das faixas das lipoproteínas (FIGURA 74) ficou semelhante ao encontrado por
Chung et al. (1980). Como os pacientes estavam em jejum de 12 horas, as amostras de soro
são ausentes de partículas de quilomicra, assegurando que a faixa superior de lipoproteínas é
composta exclusivamente de VLDL.
FIGURA 74 – Separação de lipoproteínas por gradiente descontínuo de densidade. Tubo de ultracentrífuga utilizado na separação das lipoproteínas, comparado com o obtido por Chung et. al.
(1980). Plasma humano (1); VLDL Humano (2); LDL Humano (3); HDL Humano (4); HDL Humano (5),
Mistura de VLDL, LDL e HDL (6). Fonte: CHUNG et al., (1980)
A confirmação da separação foi realizada por testes imunoturbidimétricos. Como
esperado, a faixa inferior, local com densidade mais elevada no tubo, continha a maior
concentração de ApoA1, proteína de principal presença no HDL. As duas faixas superiores,
situadas em região com menor densidade no tubo, continham duas faixas de lipoproteínas
com elevada concentração de ApoB100. Sendo a faixa intermediária corresponde ao LDL e a
superior ao VLDL.
As pequenas quantidades de Apo B100 na faixa que corresponde ao HDL e ApoA1
na de LDL podem ter sido causadas pela utilização de seringas para a remoção das
lipoproteínas do tubo de centrifugação. Apesar de ter sido utilizado diferentes seringas para
remoção de cada faixa de lipoproteína é difícil delimitar o início e o fim de cada faixa.
102
DISCUSSÃO
Outro motivo provável deve-se ao fato das lipoproteínas estarem distribuídas em um
intervalo de densidade hidratada que possui fim e início comuns, resultando em um valor de
densidade no qual seja possível encontrar partículas de HDL e LDL. O reagente
imunoturbidimétrico também pode ter contribuído para a detecção de pequenas concentrações
do contaminante. Como o reagente utilizado para o ensaio foi desenvolvido para
determinações de apolipoproteínas em soro humano e não em frações do soro, sua
sensibilidade analítica é ajustada para concentrações de lipoproteínas mais próximas da
normalidade. Logo, quando se utiliza o reagente para quantificação de ApoB100 na amostra
de HDL, as absorbâncias resultantes do ensaio estão próximas do limite de detecção do
ensaio, região na qual a imprecisão do ensaio é maior, o que pode acarretar resultados com
maior variação em torno do valor real da amostra. O mesmo se aplica para a detecção de
ApoA1 nas partículas de LDL.
A separação de LDL e VLDL foi confirmada também pelos testes químicos. A
fração correspondente ao LDL teve a maior concentração de colesterol total, diferente da
fração VLDL, que continha grande quantidade de triglicérides e baixa concentração de
colesterol total. A distribuição de colesterol e triglicérides, como foi encontrada nas frações
das lipoproteínas, se deve ao papel fisiológico de cada uma. A LDL que possui maior
concentração de colesterol total é a principal lipoproteína responsável pelo transporte de
colesterol do fígado para os tecidos, já a VLDL tem como principal função o transporte de
triglicérides (JONAS, 2008). As partículas de HDL e LDL apresentaram 82% e 75% de
relação de colesterol esterificado por colesterol total, respectivamente. A maior porção de
colesterol esterificado demonstra que a maior quantidade de colesterol transportado por essas
lipoproteínas está no cerne na micela, o que corresponde ao demonstrado por Skipski (1967).
Mesmo com a possível contaminação cruzada entre as frações de lipoproteínas, o
método desenvolvido por Chung et al. (1980) permite a separação das três classes de
lipoproteínas com um grau de pureza adequado em um único ensaio, o que reduz o volume de
amostra e trabalho necessário, caso fosse separado uma classe de lipoproteína por ensaio.
Como a separação é rápida e seguida de diálise, mesmo a elevada concentração de sal não
alterou significativamente as apolipoproteínas, já que elas foram reconhecidas pelos
anticorpos dos reagentes imunoturbidimétricos e apresentavam concentrações séricas dentro
do relatado por Jonas (2008).
103
DISCUSSÃO
6.2 Peguilação das enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase
É curioso que em nenhum momento Sugiuchi et al. (1995) tenham abordado o
mecanismo pelo qual a peguilação das enzimas CE e ChOx reduzem a interação com LDL e
VLDL. Nem mesmo outros pesquisadores como Warnick et al. (2001), que escreveram uma
revisão sobre determinação de c-HDL, tentaram criar hipóteses ou investigar o mecanismo da
inibição. Ambos apresentam somente os resultados obtidos com a peguilação. Sugiuchi et al.
(1995) relatam a importância da conjugação com mPEG de alto peso molecular para dificultar
a penetração das moléculas do polímero no interior das enzimas e eventual peguilação de
regiões no sitio ativo, o que reduziria drasticamente a atividade da enzima.
Sugiuchi et al. (1995) realizaram a conjugação das proteínas com mPEG-NHS 6
kDa. Durante a prospecção por matérias primas não foi encontrado uma molécula de mPEG
com essa massa molar, foram selecionadas então duas molécula de mPEG, com massa molar
de 5 kDa e 10 kDa. Os ensaios seriam realizados com ambas as moléculas.
O processo de conjugação com mPEG-NHS é relativamente simples e prático, não
sendo necessárias condições especiais para a realização do processo. Entretanto, o carbamato
no mPEG-NHS tem baixa estabilidade e precisa ser adicionado no estado sólido ao tampão
alcalino contendo as enzimas (ROBERTS et al., 2002; NANOCS, 2014). Caso houvesse a
possibilidade de se utilizar uma solução de mPEG-NHS, o processo de peguilação poderia ser
melhor controlado, resultando em conjugações mais uniformes, já que poderia ser mantida
uma relação constante da solução de amostra que entraria em contato com a solução de
mPEG-NHS.
O reagente de ninidrina atendeu as nossas necessidades para a determinação do grau
de conjugação das enzimas, entretanto a reação com ninidrina é mais utilizada para a
determinação de concentração de aminoácidos. Como há necessidade de aquecimento para
realizar o ensaio, algumas proteínas podem desnaturar o que não ocorreria com um
aminoácido. Os ensaios realizados com a enzima colesterol oxidase nativa resultaram na
formação de um coágulo que pode ter acarretado em redução da disponibilidade dos grupos
amino para reagir com a ninidrina. Como consequência o teste pode ter subestimado a
quantidade total de aminas disponíveis para a conjugação com mPEG- NHS. Porém, a
solução de enzima colesterol oxidase que passou pelo processo de conjugação com mPEG não
104
DISCUSSÃO
levou à formação de coágulos após o aquecimento, o que corrobora os resultado obtidos por
Hiroto et al. (1992) de que a peguilação aumenta a estabilidade térmica das proteínas.
O grau de peguilação atingido foi satisfatório, com valores próximos dos obtidos por
Sugiuchi et al. (1995). Os autores relataram em seu trabalho um grau de peguilação de 45,0%
para a CE e 41,7% para ChOx, sendo que os grupos amino foram determinados com
trinitrobenzeno sulfato. No presente trabalho foram encontrados graus de peguilação de
44,2% e 41,0% para mPEG-NHS de 5 kDa e 10 KDa para CE, respectivamente. A ChOx foi
peguilada em graus de peguilação inferiores aos encontrados por Sugiuchi et al (1995), mas o
resultado pode ter sido falseado devido à coagulação da enzima nativa durante a determinação
de grupos amino. As enzimas peguiladas com molécula de mPEG NHS de 10 kDa têm menor
grau de peguilação quando comparadas com mPEG-NHS 5 kDa. Isso ocorreu provavelmente
por que a molécula com maior cadeia não consegue penetrar tão profundamente quanto o
polímero de cadeia menor e uma menor quantidade de resíduos aminados estão disponíveis
para realizar a conjugação.
Como consequência da peguilação houve perda considerável da capacidade catalítica
das enzimas e os valores de atividade enzimática fornecidos pelo fabricante não puderam ser
considerados. Para contornar esse problema foi considerada uma atividade nominal referente
às soluções de enzimas nativas que foram utilizadas para peguilação. Para manter essa relação
de atividade com as enzimas nativas foi determinado que a purificação das enzimas
peguiladas não fosse realizada. Após a definição de que as enzimas peguiladas não fossem
purificadas foi verificado se N-hidroxissuccinamida e mPEG, não conjugado com as
proteínas, poderiam interferir de alguma maneira nas reações enzimáticas. Testes realizados
com as enzimas nativas adicionando-se concentrações de 5% de PEG 8 kDa e 50 mmol·L-1
de
N-hidroxissuccinamida à PARTE 2 do reagente enzimático-colorimétrico não afetaram o
sistema. As concentrações de mPEG e N-hidroxissuccinamida resultante da conjugação das
enzimas são muito inferiores às concentrações que foram avaliadas.
105
DISCUSSÃO
6.3 Estudo enzimático colorimétrico e seleção de poliânions
Todos os testes espectrofotométricos foram realizados com uma variação do reagente
proposto por Sugiuchi et al. (1995). O reagente foi modificado de tal modo que diferentes
poliânions pudessem ser avaliados como possíveis inibidores da reação de CE e ChOx com as
apoB100-lipoproteínas. A troca do cromógeno não afeta o sistema, pois a participação do
cromógeno ocorre na reação acoplada à peroxidase e não é critico para catálise das reações
por CE e ChOx. A quinoneimina formada com o fenol apresenta um coeficiente de
absortividade molar inferior ao formado com EMSE (FOSSATI e PRENCIPE; 1978), o que
afeta a sensibilidade do reagente, entretanto, as absorbâncias oriundas dos testes foram
suficientes para realização dos ensaios e avaliação dos dados. A alteração do cromógeno
ocorreu devido ao seu elevado custo de aquisição.
Warnick et al. (2001) e Kondo et al. (1999) relatam a ação dos poliânions em
conjunto com os cátions bivalentes como os responsáveis pela formação de grandes
complexos solúveis de LDL e VLDL de difícil acesso ao centro ativo das enzimas. Assim,
somente o HDL fica disponível para ser hidrolisado e oxidado pelas CE e ChOx,
respectivamente. Os poliânions foram selecionados de acordo com trabalhos de pesquisadores
que desenvolveram métodos para determinação de c-HDL ou estudaram a sua interação com
as lipoproteínas.
Como representante dos glicosaminoglicanos a intenção era de se avaliar a heparina
sódica, entretanto a obtenção da matéria prima mostrou-se uma tarefa hercúlea, com inúmeras
restrições de aquisição pela Agência Nacional de Saúde (ANVISA). Diante de tal dificuldade,
foi selecionado o sulfato de condroitina, que não é um glicosaminoglicano descrito para a
realização de testes de determinação de c-HDL (WARNICK et al., 2001; ARRANZ et al.,
1994), porém sua interação com apoB100-lipoproteinas é bem caracterizada por Olsson et al.
(2001).
Com exceção da sacarose octassulfato, foram encontrados trabalhos que
relacionavam os poliânions avaliados interagindo com as lipoproteínas que contêm apoB100.
A seleção da sacarose octassulfato está relacionada à proximidade de sua estrutura com a α-
ciclodextrina sulfato. Ambas são moléculas com grande número de substituinte sulfato,
elevada carga negativa em pH 7,0 e derivadas da modificação de um carboidrato. Como
maioria dos poliânions utilizados é aplicada em métodos de precipitação, a concentração dos
106
DISCUSSÃO
poliânions utilizada foi reduzida em relação aos métodos de precipitação para evitar a
formação de turvação no meio reacional.
Os resultados demonstraram que todos os poliânions inibem parcialmente e de
maneira não seletiva a interação das enzimas do sistema com as lipoproteínas. As variações
nas concentrações dos poliânions não apresentam linearidade na relação inibição versus
concentração de poliânion, mas como se trata de interação de cargas entre três íons (Mg++
,
poliânions e resíduos de aminoácidos positivos na ApoB100) essa relação linear, ou até
mesmo uma resposta em formato de sino, não seria de se esperar.
Os resultados de inibição utilizando α-ciclodextrina sulfato foram inferiores aos
esperados. A avaliação de qual concentração de α-ciclodextrina sulfato seria necessária para
total inibição da catálise de LDL e VLDL realizada por Sugiuchi et al. (1995) foi realizada
com CE-PEG, ChOx nativa. Os pesquisadores definiram que 2,0 mmol·L-1
do poliânion,
associado a 0,5 g/L de dextran sulfato, eram suficientes para total inibição, sem afetar a
interação das enzimas com HDL.
Apesar da avaliação do potencial de inibição neste trabalho ter sido realizado com
enzimas nativas, a α-ciclodextrina afetou negativamente a catálise das enzimas utilizando o
HDL como substrato, o que não era esperado. Mesmo a associação do poliânion com dextran
sulfato não foi capaz de realizar inibições superiores às encontradas com ácido fosfotúngstico.
Dentre todos os poliânions avaliados o ácido fosfotúngstico, na concentração de 0,75
mmol·L-1
, foi o único que apresentou seletividade em inibir somente a reação com LDL e
VLDL, sendo assim, foi selecionado para avaliação de seu potencial inibitório com as
enzimas peguiladas. Durante a realização dos testes verificou-se um incremento na velocidade
de reação com HDL na presença de 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico, o que não era
esperado. Lopes-Virella (1977) criador do método de precipitação com ácido fosfotúngstico
não cita qualquer incremento de velocidade na reação durante a determinação de c-HDL. Mas
é importante ressaltar que a mensuração da absorbância para os testes de determinação de c-
HDL, pelo método de precipitação, é realizada após o substrato ter sido completamente
consumido, dificultando a verificação de qualquer incremento na velocidade de reação. Não
foram encontrados relatos na literatura sobre essa relação. Mais estudos seriam necessários
para verificar o mecanismo desse fenômeno. Concentrações superiores a 1,5 mmol·L-1
de
ácido fosfotúngstico promoviam turvação do sistema quando se utilizava LDL ou VLDL
como amostra, devido à formação de complexos insolúveis com as lipoproteínas.
107
DISCUSSÃO
6.3.1 Ensaios de determinação da atividade residual para enzimas peguiladas associadas
a 0,75 mmol·L-1
de ácido fosfotúngstico.
A conjugação das enzimas com mPEG-NHS promoveu uma redução média de suas
atividades em quase 10 vezes, possivelmente devido à ligação de moléculas de mPEG na
proximidade ou dentro do sítio catalítico das enzimas. Sugiuchi et al. (1995) evidenciaram
uma atividade residual de 28,8% para colesterol esterase após peguilação, utilizando linoleato
de colesterila como substrato para a enzima. Dados sobre colesterol oxidase não foram
apresentados por Sugiuchi et al. (1995).
Após a peguilação, o ΔABS(800-650 segundos) das reações tiveram uma redução drástica,
quando utilizada a mesma concentração nominal de 1,0 kU/L de CE-PEG e 5,0kU/L ChOx-
PEG, o que tornou difícil a afirmação de que a conjugação com mPEG-NHS foi suficiente
para inibir a reação com LDL e VLDL. Como a redução média (considerando as reações com
HDL e LDL) no ΔABS(800-650 segundos) foi de aproximadamente 10 vezes, as concentrações
nominais das enzimas foram ajustadas para 10 kU/L de CE-PEG e 50 kU/L de ChOx-PEG.
Com o aumento das concentrações das enzimas houve incremento da sensibilidade do método
o que permitiu melhor visualização das reações.
As reações que ocorreram com o VLDL apresentaram uma redução na absorbância
após a adição da PARTE 2 do reagente enzimático-colorimétrico, resultando em ΔABS(800-650
segundos) com valores negativos. Para esse tipo de ensaio um ΔABS negativo não tem
significado, entretanto a queda na absorbância pode ser causada pela dissociação de
complexos formados por VLDL após a adição da PARTE 2. Como a amostra de VLDL é
ligeiramente turva, a formação de complexos é mais evidente. Independente da composição
do reagente utilizado, a inibição do VLDL ocorreu de maneira satisfatória.
Diferente do VLDL, para a inibição da reação com LDL a presença do poliânion é
essencial. A presença do ácido fosfotúngstico promoveu a formação de um platô na
absorbância após a adição da PARTE 2, o que pode ser entendido como supressão total das
reações. A formação do platô não foi evidenciado na reação realizada somente com as
enzimas peguiladas. O aumento da cadeia do mPEG, parece influenciar a capacidade de
inibição. O mPEG-NHS 10 kDa inibiu a reação de maneira mais eficiente que o mPEG-NHS
5 kDa, na presença de ácido fosfotúngstico. Esses resultados estão de acordo com os achados
de Sugiuchi et al. (1995), de que a inibição da reação com LDL só foi alcançada após a adição
de poliânions no meio reacional.
108
DISCUSSÃO
O aumento da concentração nominal das enzimas conseguimos recuperar a
sensibilidade do ensaio quando utilizado HDL como substrato. A cinética de reação continuou
com característica linear. A peguilação das enzimas ou o poliânion têm pouco impacto na
cinética de reação do HDL, sendo que a perda de sensibilidade do sistema é facilmente
corrigida pelo incremento da concentração das enzimas.
O teste t de Student aplicado às cinéticas de reação dos reagentes evidenciou que a
modificação das enzimas e a adição do ácido fosfotúngstico causam modificações nas
cinéticas enzimáticas em comparação às enzimas nativas. Parte desse resultado também se
deve ao modelo estatístico utilizado para análise. O teste t de Student para dados pareados
considera o valor da média dos dados para realizar comparação. Como as curvas apresentam
médias de absorbância distintas era de se esperar que o teste considerasse as diferença entre as
médias estatisticamente relevantes. Mas o teste estatístico apresenta validade, já que
demonstra que as modificações realizadas nas enzimas e associações com o poliânion
produzem respostas distintas das enzimas nativas.
Mas os dados estatísticos mais relevantes são obtidos com a correlação de Pearson.
As cinéticas de reação do reagente contendo as enzimas peguiladas, sem poliânion,
apresentam correlações elevadas com o controle, mesmo para a reação com LDL como
substrato. Tal fato indica que um incremento de absorbância na reação do LDL realizado com
o reagente elaborado com enzimas nativas é acompanhado por crescimento de absorbância no
reagente com enzimas peguiladas. Entretanto, essa correlação elevada para a reação com LDL
não existe para o reagente com ácido fosfotúngstico. Se associarmos os resultados do teste t
de Student com a correlação de Pearson temos que a reação do LDL com o reagente com
ácido fosfotúngstico é diferente e não correlacionável com o controle. Embora a reação do
reagente contendo ácido fosfotúngstico com a LDL seja distinta do controle, a reação com
HDL já apresenta elevada correlação.
Esses resultados demonstram que a associação das enzimas colesterol esterase e
colesterol oxidase conjugadas com mPEG 10 kDa associadas a 0,75 mmol·L-1
de ácido
fosfotúngstico é capaz de inibir as reação com LDL e VLDL, sem afetar drasticamente a
reação das mesmas enzimas com HDL.
Não foi possível replicar os resultados obtidos por Sugiuchi et al. (1995) apesar de
terem sido utilizados os mesmos poliânion e enzimas peguiladas. A única diferença foi a
109
DISCUSSÃO
massa molar dos mPEGs utilizados nos presentes trabalhos (5 kDa e 10 kDa) contrastando
com o mPEG 6 kDa utilizado no trabalho original.
110
DISCUSSÃO
6.4 Determinação de variação da entalpia aparente de reação e constante de
Michaelis-Menten.
A grande vantagem da utilização da microcalorimetria de titulação isotérmica para
esse trabalho é a possibilidade de se verificar a formação de produto da reação da enzima
colesterol esterase sem a necessidade de reações acopladas, que seriam necessárias caso fosse
utilizado um espectrofotômetro. Assim, todos os dados informados pelo equipamento são
resultantes da interação enzima substrato, diminuindo a possibilidade de interferência pela
adição de mais substâncias ao meio. (FREIRE et al., 1990).
Como mencionado previamente em Resultados, não foi possível obter sinais do
microcalorímetro adequados para o cálculo de parâmetros cinéticos para colesterol oxidase e
VLDL hidrolisado por colesterol esterase. O calor liberado por essas reações era pouco
distinto do branco e as reações catalisadas pela ChOx não retornavam à linha de base. Vários
protocolos foram avaliados, mas todos sem sucesso.
6.4.1 Determinação de ΔHapp
Para determinação da ΔH de hidrólise de lipídeos pela CE é necessário contabilizar a
contribuição da troca de calor proveniente das diferentes interações que ocorrem no sistema,
que são descritas como: a interação substrato-enzima, calor de diluição da lipoproteína, calor
de diluição da solução de enzimas e calor de ionização do tampão (TODD e GOMEZ, 2011).
O calor de diluição da lipoproteína foi determinado pela realização do branco da reação com a
solubilização das lipoproteínas em tampão. Os calores provenientes da diluição da solução de
enzimas e ionização de tampão foramminimizados pela utilização do mesmo tampão fosfato
empregado na diálise das lipoproteínas e solubilização das enzimas. O tampão fosfato
apresenta entalpia de ionização igual a 0,22 kcal/mol, insignificante quando comparado ao
calor liberado pela reação de hidrólise de lipídeos (GOLDBERG et al., 2002). No entanto, o
calor da interação enzima-substrato não pode ser calculado, já que a hidrólise do substrato
procede à interação e acabam sendo contabilizados juntos. Por esses motivos a utilização do
termo ΔHapp é mais adequada para a situação.
Seria interessante que o cálculo de ΔHapp e Km fossem realizados por mol de
lipoproteína, mas realizar esse cálculo para todas as classes de lipoproteínas não é simples.
Para LDL existe a relação de uma cópia de ApoB100 para cada partícula de lipoproteína, logo
um mol de ApoB100 corresponde a um mol de LDL. Entretanto, para o HDL pode existir
111
DISCUSSÃO
mais de uma cópia de ApoA1 por partícula e isso impede uma extrapolação semelhante como
ocorre com o LDL (BOLANOS-GARCIA e MIGUEL, 2003). Como não foi possível
determinar a molaridade de HDL, os resultados foram normalizados pelo conteúdo de éster de
colesterol de cada uma das lipoproteínas. O éster de colesterol é calculado como massa de
linoleato de colesterila, molécula usualmente utilizada para testes de atividade da CE
(ROCHE, 2009). Mesmo a normalização dos resultados por linoleato de colesterila não estaria
completamente correto, já que a CE realiza a hidrólise de uma variedade de substratos nas
lipoproteínas (HUI e HOWLES, 2002). Após fazer essas considerações foram determinados
ΔHapp e Km para CE utilizando os substratos HDL e LDL, os resultados de entalpia foram
expressos com kcal·mol-1
de linoleato de colesterila e a constante de Michaelis-Menten foi
calculada como µmol·L-1
de linoleato de colesterila.
A reação de hidrólise dos lipídios nas lipoproteínas pela CE é exotérmica, com valores
de ΔHapp de -2,44 kcal·mol-1
para HDL e -1,96 kcal·mol-1
para LDL. A diferença pode estar
associada à diferença de composição e proporção lipídica de cada lipoproteína e sua interação
com a enzima. Após a peguilação, os valores de ΔHapp modificaram para -2,87 kcal·mol-1
para
HDL e -2,14 kcal·mol-1
para LDL. Mesmo após a modificação os valores são próximos da
enzima nativa, em parte porque o substrato e a reação catalisada são as mesmas. A diferença
dos valores entre as enzimas nativas e enzimas peguiladas estaria relacionada com provável
mudança na interação entre CE PEG e as lipoproteínas que, devido às limitações do ensaio,
são contabilizados como calor de reação.
6.4.2 Determinação de Km
A interação enzima lipoproteínas pode ser representada esquematicamente como
(FIGURA 75)
Lipoproteína + CE
k1
k-1
Complexo
Lipoproteína CE
k2 ácido graxo + colesterol + glicerol + CE
FIGURA 75 – Esquema da interação entre CE e lipoproteína.
k1 – constante cinética de formação do complexo enzima-substrato; k-1 – constante cinética de dissociação do
complexo enzima-substrato; k2 – constante catalítica. Não foram considerados no esquema moléculas de água
envolvidas na hidrólise, demais lipídeos presentes na lipoproteína ou estequiometria da reação.
112
DISCUSSÃO
O Km para a CE nativa difere de acordo com a lipoproteína utilizada. Mesmo a reação
catalisada pela CE sendo indiferente para ambas as lipoproteínas avaliadas, as diferenças
estruturais entre HDL e LDL impactam na maneira como a enzima interage com a
lipoproteína. Isso é plausível, já que as constantes k1 e k-1 que são envolvidas na interação
enzima substrato são componentes de Km (Equação 14). Seria possível que o conteúdo
proteico do invólucro externo ou o tamanho das lipoproteínas seja fator impeditivo para a
formação do complexo enzima-substrato o que justificaria o maior Km com LDL em relação
ao HDL.
𝐾𝑚 =𝑘−1 + 𝑘2
𝑘1
(14)
O termograma da titulação de hidrólise do HDL pela enzima CE-PEG não apresenta o
formato usual de uma titulação para determinação de Km, mas adições consecutivas do
substrato promoveram a formação de deflexões de diferentes alturas, até o momento em que
atingiram um platô. O tratamento dos dados da titulação permitiu determinar a cinética da
enzima com HDL e cálculo do Km para a enzima peguilada. As deflexões com LDL
apresentavam todas a mesma magnitude. Menores concentrações do substrato foram
avaliadas, mas não diferiam do branco de reação. Esses fatores impediram que a determinação
de Km para CE-PEG com LDL fosse realizada.
Sugiuchi et al. (1995) não verificaram modificação do Km das enzimas CE e ChOx
após a peguilação. Os autores utilizaram como substrato para a reação o linoleato de
colesterila. Apesar dessa molécula ser substrato da enzima CE, ela não representa a
complexidade de uma lipoproteína. No presente trabalho o Km da enzima peguilada foi
determinado com HDL, um substrato mais complexo que linoleato de colesterila e mais
próximo da realidade para qual a enzima será utilizada. O Km observado para a enzima
peguilada é 5,1 vezes maior que o da enzima nativa, o que evidencia que a modificação
enzimática afeta a interação entre enzima e substrato. Se utilizarmos o resultado obtido por
Sugiuchi et al. (1995) e os obtidos neste trabalho é possível propor uma hipótese para o
mecanismo pelo qual a peguilação reduz a interação entre enzima e substrato.
A hipótese seria de que as moléculas de mPEG adicionadas à superfície das enzimas
criem um emaranhado de ramificações de polímero que dificulta a aproximação da
113
DISCUSSÃO
lipoproteína com o sítio ativo da enzima, o que minimizaria a formação do complexo enzima-
substrato, diminuindo o valor de k1, denominador da equação para determinação de Km..
Como LDL e VLDL formam grande complexos solúveis na presença do poliânion e cátion
bivalente, juntamente com as ramificações de mPEG, as suas interações com as enzimas
seriam extremamente desfavorecidas. Uma vez atingido o sitio ativo da enzima os lipídeos
seriam hidrolisados normalmente, mantendo-se o valor de k2. Uma redução de k1 e mantendo-
se k2 resultaria em aumento do Km.
6.5 A reação é entalpica ou entropicamente dirigida?
Uma das maneiras para a determinação da energia livre (ΔG) de uma interação seria
definir a constante de dissociação no equilíbrio (Kd) e aplica-la na Equação 15.
∆𝐺 = 𝑅𝑇𝐿𝑛𝐾𝑑
(15)
Em que R seria a constante dos gases ideais e T a temperatura em graus Kelvin. Mas
só com os dados que foram obtidos, ΔHapp e Km,não seria possível determinar Kd.
Cohlberg (1979) aborda a utilização de Km como constante aparente de dissociação e a
proximidade dos valores de Km e Kd, dado as devidas ressalvas. Kd é determinado no
equilíbrio e considera a reversibilidade da ligação entre enzima e substrato e pode ser como
descrito na Equação 16.
𝐾𝑑 = 𝐸 𝑆
𝐸𝑆 no equilíbrio
(16)
Km pode ser definido (Equação 17) como constante de dissociação aparente se
considerando o modelo de estado estacionário, no qual o fornecimento de substrato para o
meio se iguala a quantidade de produto liberado. Dessa maneira a relação [E][S]/[ES] também
é mantida constante. Mas o estado estacionário se difere do equilíbrio por que novos
substratos são adicionados ao meio já que ocorre sua conversão em produto, diferente do
equilíbrio em que os substratos envolvidos na ligação e dissociação da enzima são os
mesmos.
114
DISCUSSÃO
𝐾𝑚 = 𝐸 𝑆
𝐸𝑆 no estado estacionário
(17)
Apesar das semelhanças para cálculo das constantes de dissociação e Michaelis-
Menten, a Kd (Equação 18) não considera a constante catalítica da enzima como o Km. Já Km
sempre apresentará valores maiores que Kd, nessa aproximação com apenas um complexo
formado. Entretanto, esses valores podem se aproximar quando a capacidade catalítica da
enzima é baixa resultando em um k2 de baixo valor. O contrário também é valido, enzimas
com alta capacidade catalítica apresentam k2 elevado, o que distancia Km de Kd.
𝐾𝑑 =𝑘−1
𝑘1
(18)
Considerando todas essas ressalvas pode-se assumir que Km ≅ Kd e realizar um
exercício para determinar se a reação de hidrólise dos lipídeos nas lipoproteínas entálpica ou
entropicamente dirigida.
A entropia aparente da reação pode ser determinada pela Equação 19.
∆𝐺𝑎𝑝𝑝 = ∆𝐻𝑎𝑝𝑝 − 𝑇∆𝑆𝑎𝑝𝑝
(19)
115
DISCUSSÃO
Após a determinação dos valores de ΔGapp, ΔHapp e -TΔSapp (Tabela 23), temos que a
reação é exergônica, exotérmica e com aumento da entropia do sistema. Tanto a entalpia
quanto a entropia favorecem a espontaneidade da reação. O ganho de entropia exerce maior
participação em ΔGapp (FIGURA 76).
Tabela 23 – Determinação de ΔGapp para as reações de hidrólise realizadas por CE
Enzima – Lipoproteína
CE – HDL CE – LDL
ΔHapp -2,44 kcal/mol -1,96 kcal/mol
ΔSapp 1,72 x 10-2
kcal/mol 1,68 x 10-2
kcal/mol
-T ΔSapp -5,33 kcal/mol -5,21 kcal/mol
ΔGapp -7,77 kcal/mol -7,17 kcal/mol
R= 1,987 cal·K-1
·mol-1
T= 310,15 K
FIGURA 76 - Valores de ΔGapp, ΔHapp e -TΔSapp para reações catalisadas por CE.
ΔHapp e -TΔSapp contribuem para a espontaneidade da reação. Maior contribuição para ΔGapp é proveniente do
aumento da entalpia.
Uma possível explicação para a maior participação da entropia no direcionamento da
reação pode ser o ganho de graus de liberdade que ocorre com a abertura da micela e
liberação de produtos de reação da hidrólise dos ésteres de colesterol e triglicérides. Mesmo
-9,0-8,0-7,0-6,0-5,0-4,0-3,0-2,0-1,00,0
CE-LDL
CE-HDL
kcal/mol
ΔGapp, ΔHapp e -TΔSapp para reações catalisadas por CE.
ΔGapp
-TΔSapp
ΔHapp
116
DISCUSSÃO
com a formação de ligações de hidrogênio com os produtos da hidrólise que reduz o grau de
liberdade das moléculas de água, a desorganização do interior hidrofóbico da lipoproteína e
liberação de mais substâncias para o meio compensa a perda de entropia ocasionada pela
formação de novas ligações de hidrogênio.
Apesar das varias considerações para se definir que a entropia tem maior participação
na espontaneidade da reação, o exercício é válido para entendimento das reações que ocorrem
decorrentes da hidrólise das lipoproteínas pela colesterol esterase.
117
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos com esse estudo permitiu verificar que o poliânion ácido
fosfotúngstico, além da α-ciclodextrina sulfato, também inibem seletivamente a ação das
enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase sobre a lipoproteína LDL e VLDL, em um
sistema homogêneo para a determinação de colestro – HDL. A concentração de 0,75 mM do
ácido fosfotúngtico se mostra a mais eficaz, no sistema avaliado, para a inibição das enzimas
sobre LDL e VLDL.
Assim como, foi verificado que a alteração química da enzima colesterol esterase,
por meio de ligação covalente de polietilenoglicol, a sua superfície promove alteração na sua
interação com HDL e LDL, que pôde ser indentificado pela alteração do Km para esses
substratos.
118
8 PERSPECTIVAS
Seria de grande valia verificar se outras hidrolases e lipases comercialmente
disponíveis se comportam de maneira semelhante à enzima colesterol esterase peguilada na
presença das apoB100 lipoproteínas.
Um segundo ponto importante seria a purificação das enzimas peguiladas e estudar
como a alteração da sua estrutura com a conjugação com monometoxipolietilenoglicol altera
sua estabilidade térmica.
Os resultados obtidos poderão servir de base para o desenvolvimento futuro de um
sistema para a determinação direta de cHDL.
119
REFERÊNCIAS
ALLAIN, C. C. et al. Enzymatic determination of total serum cholesterol. Washington,
USA, Clin Chem, v. 20, n. 4, p. 470-475, 1974.
ARRANZ, M.; ESTEBAN, M.; PALACIOS, M. Métodos recomendados para la
determinación de la concetración de colesterol en suero o plasma y en otros especímenes
biológicos. Quím Clín, v.13, n.7, p. 496-503, 1994.
BAILON, P.; BERTHOLD, W. Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical
proteins. Pharmaceut Sci Tech Today, v. 1, n. 8, p. 352-356, 1998.
BARR, D. P.; RUSS, E. M.; EDER, H. A. Protein-lipid relationships in human plasma: II. In
atherosclerosis and related conditions. New York, USA, Am J Med, v. 11, n. 4, p. 480-493,
1951.
BOLANOS-GARCIA, V. M.; MIGUEL, R. N. On the structure and function of
apolipoproteins: more than a family of lipid-binding proteins. Oxfrod , UK, Prog Biophys
Mol Biol, v. 83, n. 1, p. 47-68, 2003.
BRASIL. Ministério da Saúde. DATASUS Tecnologia da Informação a Serviço do SUS.
Base de dados nacional referente ao período de jan. 2013 até dez. 2013. Brasília, DF, 2013.
Disponível em: <http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/deftohtm. exe?sia/cnv/qauf.def>. Acesso em:
14/02/15
BURSTEIN, M. S. H. R. et al. Rapid method for the isolation of lipoproteins from human
serum by precipitation with polyanions. Bethesda, USA, J lipid Res, v. 11, n. 6, p. 583-595,
1970.
CARR, Timothy P.; ANDRESEN, Catharine J.; RUDEL, Lawrence L. Enzymatic
determination of triglyceride, free cholesterol, and total cholesterol in tissue lipid extracts.
Clinical biochemistry, v. 26, n. 1, p. 39-42, 1993.
120
CASTELLI, W. P. et al. HDL cholesterol and other lipids in coronary heart disease. The
cooperative lipoprotein phenotyping study. Circul, v. 55, n. 5, p. 767-772, 1977.
CHEN, L. et al. The Binding and Release of Oxygen and Hydrogen Peroxide Are Directed by
a Hydrophobic Tunnel in Cholesterol Oxidase†. Washington, USA, Biochem, v. 47, n. 19, p.
5368-5377, 2008.
CHUNG, Byung H. et al. Preparative and quantitative isolation of plasma lipoproteins: rapid,
single discontinuous density gradient ultracentrifugation in a vertical rotor. Journal of lipid
research, v. 21, n. 3, p. 284-291, 1980.
COHLBERG, Jeffrey A. Km as an apparent dissociation constant. Journal of Chemical
Education, v. 56, n. 8, p. 512, 1979.
CYGLER, M.; SCHRAG, J. D. Structure as basis for understanding interfacial properties of
lipases. New York, USA, Methods Enzymol Lipases. v. 284, p. 3-27, 1997.
DAVIS, F. F. The origin of pegnology. Adv Drug Deliv Rev, v. 54, n. 4, p. 457-458, 2002.
FINLEY, P. R. et al. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in
its enzymic measurement. Washington, USA, Clin Chem, v. 24, n. 6, p. 931-933, 1978.
FOSSATI, P.; PRENCIPE, L. [Emerson-Trinder reaction: study of various chromogens and
analyses of the principle interferences (author's transl)].Quaderni Sclavo di diagnostica
clinica e di laboratorio, v. 14, n. 2, p. 164-177, 1978.
FREIRE, E.; MAYORGA, O. L.; STRAUME, M.. Isothermal titration
calorimetry. Washington, USA, Anal Chem, v. 62, n. 18, p. 950A-959A, 1990.
FUERTGES, F.; ABUCHOWSKI, A. The clinical efficacy of poly (ethylene glycol)-modified
proteins. Amsterdam, NL, J Control Release, v. 11, n. 1, p. 139-148, 1990.
121
GLUE, P. et al. Pegylated interferon-α2b: Pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and
preliminary efficacy data*. Hoboken, USA, Clin Pharmacol Ther, v. 68, n. 5, p. 556-567,
2000.
GOLDBERG, Robert N.; KISHORE, Nand; LENNEN, Rebecca M. Thermodynamic
quantities for the ionization reactions of buffers. Journal of physical and chemical
reference data, v. 31, n. 2, p. 231-370, 2002.
HAINLINE, A. et al. (Ed.). Manual of laboratory operations: lipid and lipoprotein
analysis. 2nd ed. Bethesda, MD: National Heart, Lung and Blood Institute, Lipid Research
Clinics Program, 1982.
HARRIS, N. E. I. L.; GALPCHIAN, V.; RIFAI, N. Three routine methods for measuring
high-density lipoprotein cholesterol compared with the Reference Method. Washington,
USA, Clin Chem, v. 42, n. 5, p. 738-743, 1996.
HENZLER, K.; HAUPT, B.; BALLAUFF, M. Enzymatic activity of immobilized enzyme
determined by isothermal titration calorimetry. Orlando, USA, Anal Biochem, v. 378, n. 2, p.
184-189, 2008.
HIROTO, M. et al. Chemical modification of lipase with a comb-shaped synthetic copolymer
of polyoxyethylene allyl methyl diether and maleic anhydride. Dordrecht, NL, Biotechnol
Lett, v. 14, n. 7, p. 559-564, 1992.
HUANG, Y. et al. An abundant dysfunctional apolipoprotein A1 in human atheroma. New
York, USA, Nature Med, v. 20, n. 2, p. 193-203, 2014.
HUI, D. Y.; HOWLES, P. N. Carboxyl ester lipase structure-function relationship and
physiological role in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Bethesda, USA, J Lipid
Res, v. 43, n. 12, p. 2017-2030, 2002.
JAIN, Ram B. Comparison of three weighting schemes in weighted regression analysis for
use in a chemistry laboratory. Clinica Chimica Acta, v. 411, n. 3, p. 270-279, 2010.
122
JONAS, A. Lipoprotein structure. New Compreh Biochem, v. 36, p. 485-506, 2008.
JOSÉ, N. M.; PRADO, L. A. S. Almeida. Hybrid organic-inorganic materials: preparation and
some applications. Quimica Nova, v. 28, n. 2, p. 281-288, 2005.
KAKUYAMA, T.; KIMURA, S.; HASHIGUCHI, Y. Fully automated determination of HDL-
cholesterol from human serum with Hitachi 911. Washington, USA, Clin Chem, v. 40, p.
1104, 1994.
KONDO, A. et al. Dynamic reaction in a homogeneous HDL-cholesterol assay visualized by
electron microscopy. . Washington, USA, Clin Chem, v. 45, n. 11, p. 1974-1980, 1999.
KOZLOWSKI, A.; HARRIS, J. M. Improvements in protein PEGylation: pegylated
interferons for treatment of hepatitis C. Amsterdam, NL, J Control Release, v. 72, n. 1, p.
217-224, 2001.
LADBURY, J. E.; DOYLE, M. L. (Ed.). Biocalorimetry 2: applications of calorimetry in
the biological sciences. Chichester, UK, John Wiley & Sons, 2004.
LINDAHL, U.; HOOK, M. Glycosaminoglycans and their binding to biological
macromolecules. Palo Alto, USA, Ann Rev Biochem, v. 47, n. 1, p. 385-417, 1978.
LOPES-VIRELLA, M. F. et al. Cholesterol determination in high-density lipoproteins
separated by three different methods. Washington, USA, Clin Chem, v. 23, n. 5, p. 882-884,
1977.
MAHLEY, R. W. et al. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function. Journal
of lipid research, v. 25, n. 12, p. 1277-1294, 1984.
MARTINEZ, J. C. et al. Isothermal titration calorimetry: thermodynamic analysis of the
binding thermograms of molecular recognition events by using equilibrium models. INTECH
Open Access Publisher, 2013.
123
OLSSON, Urban; ÖSTERGREN-LUNDÉN, Gunnel; MOSES, Jonatan. Glycosaminoglycan-
lipoprotein interaction. Glycoconjugate journal, v. 18, n. 10, p. 789-797, 2001.
PEARSON, S.; STERN, S.; MCGAVACK, T. H. Rapid, Accurate Method for Determination
of Total Chlolesterol in Serum. Washington, USA,Anal Chem, v. 25, n. 5, p. 813-814, 1953.
ROBERTS, M. J.; BENTLEY, M. D.; HARRIS, J. M. Chemistry for peptide and protein
PEGylation. Amsterdam, NL, Adv Drug Deliv Rev, v. 54, n. 4, p. 459-476, 2002.
SKIPSKI, V. P. et al. Lipid composition of human serum lipoproteins. London, UK, Biochem
J, v. 104, p. 340-352, 1967.
SRINIVASAN, S. R.; RADHAKRISHNAMURTHY, B; BERENSON, Gerald S. Studies on
the interaction of heparin with serum lipoproteins in the presence of Ca 2+, Mg 2+, and Mn
2+. New York, USA, Arch Biochem Biophys, v. 170, p. 334-340, 1975.
SUGIUCHI, H et al. Direct measurement of high-density lipoprotein cholesterol in serum
with polyethylene glycol-modified enzymes and sulfated alpha-cyclodextrin. Washington,
USA, Clin Chem, v. 41, n. 5, p. 717-723, 1995.
TIETZ, N. W.; BURTIS, C. A.; ASHWOOD, E. R. Fundamentos de Química
Clínica. Guanabara Koogan SA, Rio de Janeiro–RJ, 6ª Edição, 2008.
TODD, M. J.; GOMEZ, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for
enzyme activity? Orlando, USA, Anal Biochem, v. 296, n. 2, p. 179-187, 2001.
TRINDER, P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative
oxygen acceptor. London, UK, Ann Clin Biochem, n. 6, 1969.
VRIELINK, A.; GHISLA, S. Cholesterol oxidase: biochemistry and structural features.
Oxford, UK, Febs J, v. 276, n. 23, p. 6826-6843, 2009.
124
WARNICK, G. R.; ALBERS, J. J. A comprehensive evaluation of the heparin-manganese
precipitation procedure for estimating high density lipoprotein cholesterol. Bethesda, USA, J
Lipid Res, v. 19, n. 1, p. 65-76, 1978.
WARNICK, G. R.; ALBERS, J. J. Heparin--Mn2+ quantitation of high-density-lipoprotein
cholesterol: an ultrafiltration procedure for lipemic samples. Washington, USA, Clin Chem,
v. 24, n. 6, p. 900-904, 1978.
WARNICK, G. R.; BENDERSON, J.; ALBERS, J. J. Dextran sulfate-Mg2+ precipitation
procedure for quantitation of high-density-lipoprotein cholesterol. Washington, USA, Clin
Chem, v. 28, n. 6, p. 1379-1388, 1982.
WARNICK, G. R.; NAUCK, M.; RIFAI, N. Evolution of methods for measurement of HDL-
cholesterol: from ultracentrifugation to homogeneous assays. Washington, USA, Clin Chem,
v. 47, n. 9, p. 1579-1596, 2001.
WILLIAMS, B. A.; TOONE, E. J. Calorimetric evaluation of enzyme kinetic
parameters. Columbus, USA, J Org Chem, v. 58, n. 13, p. 3507-3510, 1993.
YUE, Q. K. et al. Crystal structure determination of cholesterol oxidase from Streptomyces
and structural characterization of key active site mutants. Washington, USA, Biochem, v. 38,
n. 14, p. 4277-4286, 1999.
125
APÊNDICE 1
ESPECIFICAÇÕES PARA ENZIMA COLESTEROL ESTERASE - ROCHE
Cholesterol Esterase from Pseudomonas species, lyophilizate cod. 11 520 857 103
Nomenclature: Sterol-ester acylhydrolase
Molecular weight: ~129 kD
Isoelectric point: 4.5
Michaelis constant (Phosphate buffer, pH 7.5): Cholesterol oleate: 7 x 10-5
mol/l
Inhibitors: Heavy metals such as Cu2+
, Ag+, Zn
2+
Activators: Detergents
pH optimum: 6.0-8.0; (maximum at pH 7.6)
Temperature dependence: Not possible to determine under assay conditions due to turbidity
of Thesit at temperatures above +27°C.
pH stability: 6.0-6.5
Thermal stability: Below +20°C
Specificity: Cholesterol esterase is an enzyme of lipid metabolism and gives complete
cleavage of all serum cholesterol esters.
Remark: This Cholesterol esterase is especially suited for liquid stable applications with
extended shelf life requirements.
Appearance: Brownish lyophilizate
Solubility: Clear, brown solution in water (c=50 mg/ml)
pH value (c=50 mg/ml in water): 7.0-8.0
Activity (+25°C, cholesterol oleate): ≥100 U/mg lyophilizate
Specific Activity: ≥100 U/mg protein
Protein (Biuret): No limit
Contaminants (expressed as percentage of Cholesterol Esterase activity):
Stability: At +2 to +8°C within specification range for 12 months.
ATPase: ≤0.005
Catalase: ≤1.00
Glycerokinase: ≤0.001
Glucose oxidase: ≤0.001
Hexokinase: ≤0.005
"NADH oxidase": ≤0.001
Uricase: ≤0.005
126
APÊNDICE 2
ESPECIFICAÇÕES PARA ENZIMA COLESTEROL OXIDASE - ROCHE
Cholesterol Oxidase from Brevibacterium sp., expressed in E.coli, lyophilizate cod. 11479709103
Nomenclature: Cholesterol:oxygen oxidoreductase
Molecular weight: 60 kD (native and SDS)
Isoelectric point: ~5.0
Michaelis constant (Phosphate buffer, 0.5 mol/l, pH 7.5; +25°C): Cholesterol: 1 x 10-4
mol/l
Inhibitors: Hg2+
, ZnCl2, SDS
Activators: Non ionic detergents
pH optimum: 5.5-8.0
pH stability: 5.0-10.0
Thermal stability: Up to +55°C
Storage and Stability: No decrease in activity over 6 weeks at +35°C
Specificity:
Appearance: Yellow lyophilizate
Solubility: Clear, yellowish solution in water (c=10 mg/ml)
pH value: 6.0-7.0
Protein (Biuret): 0.1-0.3 mg/mg lyophilizate
Activity (+25°C, cholesterol): 10-20 U/mg lyophilizate
Contaminants (expressed as percentage of Cholesterol Oxidase activity):
Catalase: ≤6.0
Glucose oxidase: ≤0.01
"NADH oxidase": ≤0.01
Uricase: ≤0.01
Stability: At -15 to -25°C within specification range for 12 months. Store dry. Protect from
light.
cholesterol 100%
pregnenolon 52%
stigmasterol 17%
dehydroandrosterone 0.5%
androsterone 0%
estradiol 0%
cholate 0%