ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ - phavi.umcs.plphavi.umcs.pl/at/attachments/2016/0223/151342-skrypt-iii-rok-mikro.pdf · Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016 7 Materiały

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016

1

UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ

WYDZIAŁ BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII

ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ

ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

dla studentów III roku mikrobiologii

LUBLIN 2016

Wersja 1.2


2

Spis treści:

1. Izolacja jąder komórkowych i histonów

2. Analiza składu białkowego chromatyny

3. Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus

4. Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą

ze Staphylococcus aureus

5. Izolacja DNA z nabłonka jamy ustnej

6. Amplifikacja i analiza elektroforetyczna sekwencji minisatelitarnej z uzyskanego DNA

7. Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej

drożdży Saccharomyces cerevisiae

8. Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży

9. Analiza otrzymanych białek metodą SDS/PAGE i immunoblotingu

10. Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym

na przykładzie inwertazy

11. Identyfikacja białek w komórkach ssaczych metodą immunocytochemiczną.


3

Izolacja jąder komórkowych i histonów

U organizmów eukariotycznych, większość DNA znajduje się w wyspecjalizowanych

organellach – jądrach komórkowych. DNA jądrowy występuje w postaci kompleksu

nukleoproteinowego, zwanego chromatyną. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny

jest nukleosom. W skład nukleosomu wchodzi tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle),

cząsteczka histonu H1 i fragment DNA o długości ok. 190-220 pz. Cząstkę rdzeniową tworzy

kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (po dwie cząsteczki

histonów H2A, H2B, H3 i H4). Wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 140-

150 pz. Pozostałą część stanowi łącznikowy DNA (ang. linker DNA) o długości 50-70 pz

z którym oddziałuje pojedyncza cząsteczka histonu H1. Znanych jest wiele wariantów

sekwencyjnych histonu H1, występujących w określonych tkankach lub etapach rozwoju

danego organizmu. Na przykład w jądrzastych erytrocytach ptaków zamiast histonu H1

występuje histon H5.

Histony mogą podlegać szeregu modyfikacjom potranslacyjnym, np. acetylacji,

metylacji, fosforylacji czy ubikwitynacji. Modyfikacje te mają istotne znaczenie w regulacji

stopnia upakowania DNA i jego dostępności dla replikacji i transkrypcji np. acetylacja reszt

lizyny na N-końcu łańcucha polipeptydowego histonów rdzeniowych zmniejsza ich

powinowactwo do DNA, co powoduje rozluźnienie struktury chromatyny i zwiększenie

poziomu ekspresji genów. Warto zauważyć, że wpływ modyfikacji potranslacyjnych

histonów na stopień kondensacji chromatyny i ekspresję genów nie zależy tylko od rodzaju

modyfikacji ale także od miejsca wystąpienia takiej modyfikacji na białku histonowym,

np. metylacja reszty lizyny w pozycji 9 łańcucha polipeptydowego histonu H3 powoduje

zwiększenie stopnia upakowania chromatyny i wyciszenie ekspresji genów zaś metylacja

reszty lizyny w pozycji 4 wpływa na rozluźnienie struktury chromatyny. Wysunięto więc

hipotezę „kodu histonowego”, która zakłada, że istnieją pewne określone wzory modyfikacji

histonów odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych procesów w komórce.

Materiał badawczy do ćwiczeń to linia komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub

linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy HeLa. Komórki hodowane są

na płytkach Petriego (10x14cm) odpowiednio w płynie hodowlanym DMEM

i RPMI, w temperaturze 370C i w atmosferze 5% CO2. Celem ćwiczenia jest otrzymanie

preparatów zawierających wszystkie białka jądrowe oraz izolacja histonów z jąder komórek

linii NIH 3T3 lub HeLa. Histony oczyszcza się z jąder komórkowych wykorzystując zdolność

http://pl.wikipedia.org/wiki/Histony

http://pl.wikipedia.org/wiki/Lizyna

http://pl.wikipedia.org/wiki/Lizyna


4

tych białek do rozpuszczania się w kwasach nieorganicznych, np. 0,25M HCl lub 0,2M

H2SO4.

Materiały i odczynniki

1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości

komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)

2. Bufor PBS

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4, pH 7,5

3. Bufor do izolacji jąder:

200 mM Tris-HCl, pH 7,5

100 mM NaCl

250 mM sacharoza

1 mM EDTA

0,5% Triton X-100

4. Bufor próbkowy do elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym

SDS-PAGE (4x stężony)

5. 0,25 M HCl

6. Aceton (oziębiony)

7. Zdrapywacz do komórek

8. Homogenizator szklano-teflonowy o pojemności 2 ml

9. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml oraz końcówki do pipet.

Przed przystąpieniem do wykonania ćwiczenia przygotować blok grzejny o temp. 950C

oraz schłodzić wirówkę do temp. 40C


5

Wykonanie ćwiczenia

Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać

w temp. +40C

Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa

1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść

na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.

2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego buforu PBS.

3. Po ściągnięciu pipetą buforu PBS zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą

specjalnego zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich

płytek 3 ml oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.

4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,

a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować

20 min. w lodzie.

5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego

i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji

można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).

6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml

i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

7. Supernatant (zawierający białka cytoplazmatyczne) przenieść do nowej probówki

Eppendorfa, oznaczyć w nim stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku

do ćwiczeń), a następnie przygotować próbki do elektroforezy SDS-PAGE

zawierające po 15 μg i 30 μg białka (przepis w załączniku do ćwiczeń). Gotowe

próbki do analizy metodą SDS-PAGE przechowywać w temp. -200C do kolejnych

ćwiczeń.

8. Do osadu jąder dodać 1 ml buforu PBS, kilkukrotnie przepipetować zawartość

probówki w celu jej dokładnego wymieszania i odwirować przy 2000 rpm przez 10

min.

9. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder

dodać 1 ml buforu PBS i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).


6

Izolacja białek jądrowych

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować

przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

2. Supernatant odrzucić a osad jąder zawiesić w 60 μl buforu próbkowego

do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).

3. Próbki dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 950C przez 5 min.

W wyniku uwolnienia DNA z jąder zawiesina przyjmuje galaretowatą konsystencję.

4. Po inkubacji próbki odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 5 min. Supernatant

zawierający białka jądrowe przenieść do nowej probówki Eppendorfa i zamrozić.

Izolacja histonów z użyciem 0,25 M HCl

1. Do probówki Eppendorfa o poj. 1,5 ml przenieść 500 μl zawiesiny jąder i wirować

przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

2. Supernatant odrzucić, a do osadu jąder dodać 50 μl 0,25 M HCl i dokładnie

wymieszać.

3. Próbkę pozostawić w temp. pokojowej na 25 min. (ekstrakcja histonów),

a następnie odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

4. Supernatant zawierający histony przenieść do nowej probówki Eppendorfa o poj.

1,5 ml.

5. Do osadu dodać ponownie 50 μl 0,25 M HCl, dokładnie wymieszać i pozostawić

na 25 min. w temp. pokojowej (ponowna ekstrakcja w celu zwiększenia wydajności).

6. Próbkę odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

7. Uzyskane supernatanty, zawierające histony, połączyć.

8. Wytrącać histony z supernatantu przez dodanie 8 objętości (0,8 ml) oziębionego

acetonu. Całość pozostawić do kolejnych ćwiczeń (minimum na 24 godziny)

w temp. -20OC.

Analiza składu białkowego chromatyny

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek jądrowych techniką elektroforezy

jednokierunkowej w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących SDS-PAGE

(metoda Laemmli’ego).


7



2. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń)

3. Preparaty białek jądrowych, cytoplazmatycznych i histonów otrzymane w poprzednim

ćwiczeniu




1. rzygotować 13,8 % żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach

denaturujących według przepisu zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń.

2. Próbki z wytrąconymi histonami odwirować przy prędkości 10000 rpm przez 15 min.

w 40C w celu otrzymania osadu białek histonowych. Następnie osad przemyć 1 ml

oziębionego acetonu i wysuszyć na powietrzu. Osad białek histonowych zawiesić

w 30 μl buforu próbkowego do elektroforezy SDS-PAGE (1x stężony).

3. Próbki zawierające wszystkie białka jądrowe, wyizolowane histony, białka

cytoplazmatyczne oraz wzorce białkowe zawieszone w buforze próbkowym do

elektroforezy SDS-PAGE ogrzewać przez 3 min. w temp. 90

0C. Bezpośrednio po

ogrzaniu nanosić na żel po 30 μl przygotowanych próbek. Rozdział prowadzić pod

napięciem 150V, tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Po

rozdziale białka wybarwić błękitem Coomassie (patrz załącznik do ćwiczeń).

Interpretacja wyników

1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.

2. Określić masy cząsteczkowe białek histonowych.


8

Trawienie DNA chromatyny nukleazą ze Staphylococcus aureus

Nukleaza ze Staphylococcus aureus (MN-aza, nukleaza mikrokokowa) jest

stosunkowo niespecyficzną endonukleazą, gdyż tnie zarówno jedno- jak i dwuniciowe kwasy

nukleinowe, chociaż bardziej aktywna jest wobec substratów jednoniciowych. Cięcie DNA

lub RNA następuje preferencyjnie w regionach bogatych w AT lub AU. Zmieszana

z chromatyną MN-aza tnie fragmenty DNA, które nie są chronione przez związanie

z białkami. Dlatego też w wyniku działania MN-azy na chromatynę otrzymuje się szereg

fragmentów odpowiadających mono- i oligonukleosomom. Enzym ten wykazuje swoją

aktywność w obecności jonów Ca2+

. Reakcję trawienia chromatyny przez MN-azę można

zahamować stosując odpowiednie stężenie EGTA lub EDTA, które działają jako chelatory

jonów dwuwartościowych.

Ćwiczenie ma na celu otrzymanie mieszaniny oligonukleosomów w wyniku trawienia

chromatyny jąder fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa przez niespecyficzną

endonukleazę ze Staphylococcus aureus.


1. Hodowla komórkowa fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa o gęstości

komórek ok. 90% (trzy płytki Petriego na jeden zespół studentów)

2. Bufor PBS

3. Bufor do izolacji jąder

4. Zdrapywacz do komórek

5. Homogenizator szklano-teflonowy o poj. 2 ml

6. Bufor do cięcia MN-azą:


5 mM CaCl2

7. Roztwór MN-azy w H2O (300 U/µl). Bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć

MN-azę 240-krotnie (1 µl roztworu MN-azy dodać do 239 µl H2O). Uzyskuje się

końcowe stężenie 1,25 U/µl

8. 100 mM EDTA

9. 10% SDS

10. Pronaza E – roztwór w H2O o stężeniu 25 mg/ml


9

11. Fenol, pH 7,5- 8,0

12. Chloroform

13. 5 M NaCl

14. 96% etanol (oziębiony)





Uwaga! Jeśli nie zaznaczono inaczej, poniższe czynności należy wykonywać

w temp. +40C

Otrzymywanie jąder z fibroblastów mysich NIH 3T3 lub komórek HeLa

1. Trzy płytki Petriego z komórkami fibroblastów mysich o gęstości ok. 90% przenieść

na lód i ściągnąć pipetą płyn hodowlany.

2. Przepłukać komórki na każdej płytce 5 ml oziębionego PBS.

3. Po usunięciu PBSu, zeskrobać komórki fibroblastów z płytek za pomocą specjalnego

zdrapywacza do komórek. Zawiesinę komórek spłukać ze wszystkich płytek 3 ml

oziębionego PBS i przenieść do dwóch probówek Eppendorfa o poj. 2 ml.

4. Komórki odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 5 min. Supernatant odrzucić,

a osad z obu probówek zawiesić łącznie w 2 ml buforu do izolacji jąder i inkubować

20 min. w lodzie.

5. Przenieść zawiesinę komórek do homogenizatora szklano-teflonowego

i dezintegrować wykonując 40 ruchów teflonowym tłoczkiem (stopień dezintegracji

można zweryfikować przy użyciu mikroskopu świetlnego).

6. Uzyskany dezintegrat komórek przenieść do probówki Eppendorfa o poj. 2 ml

i odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

7. Po odwirowaniu usunąć z probówki supernatant przy pomocy pipety, a do osadu jąder

dodać 1 ml buforu do cięcia MN-azą i dokładnie wymieszać ( za pomocą pipety).


10

Trawienie DNA chromatyny MN-azą

Uwaga! Wszystkie czynności należy wykonywać z zachowaniem warunków

jałowych. Pracę z fenolem wykonywać w rękawicach ochronnych

1. Zawiesinę jąder komórkowych odwirować przy prędkości 2000 rpm przez 10 min.

Supernatant odrzucić, a osad jąder zawiesić ponownie w 1 ml buforu do cięcia

MN-azą

2. Dodać 5 µl przygotowanego roztworu MN-azy (6,25u) i wymieszać dokładnie

zawartość probówki.

3. Bezpośrednio po dodaniu enzymu przenieść 300 µl mieszaniny do nowej probówki

Eppendorfa o poj. 1,5 zawierającej 30 µl oziębionego 100 mM EDTA (czas

trawienia 0).

4. Pozostałą część mieszaniny inkubować w temp. 37oC. Po upływie 5 i 10 min. (licząc

od czasu 0) inkubacji, przenosić po 300 µl mieszaniny do nowych probówek

Eppendorfa zawierających po 30 µl oziębionego 100 mM EDTA.

5. Do tak otrzymanych próbek dodać po 5 µl 10% SDS i 3 µl roztworu pronazy.

6. Inkubować próbki przez 30 min. w temp. 37oC (trawienie białek jądrowych). Reakcję

zatrzymać przez dodanie 34 µl 10% SDS.

7. Do każdej probówki dodać po 400 µl fenolu i wytrząsać całość przez 10 min.

(ekstrakcja DNA) po czym odwirować przez 5 min. (jeśli nie zaznaczono inaczej

wszystkie wirowania wykonywać przy 10000 rpm w 40C) w celu rozdzielenia faz.

8. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa, dodać po 400 l

chloroformu i wytrząsać przez 5 min. (usuwanie resztek fenolu), a potem odwirować

przez 5 min.

9. Górne fazy wodne przenieść do nowych probówek Eppendorfa i dodać po 6 l 5M

NaCl oraz 800 l oziębionego 96% etanolu. Próbki pozostawić w temp. -20oC, w celu

precypitacji DNA, do kolejnych ćwiczeń.


11

Elektroforetyczna analiza DNA po trawieniu nukleazą

ze Staphylococcus aureus

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy otrzymanych na poprzednich ćwiczeniach

preparatów DNA techniką elektroforezy w żelu agarozowym.


1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do

ćwiczeń)

2. Preparaty DNA otrzymane w trakcie poprzednich ćwiczeń.


1. Wytrącony na poprzednich ćwiczeniach DNA odwirować przy prędkości 10000 rpm

przez 15 min. w 40C. Uzyskany osad DNA przemyć 1 ml oziębionego 70% etanolu,

po czym odwirować przy 10000 rpm przez 5 min. i wysuszyć na powietrzu.

2. Osad DNA rozpuścić w 20 l buforu próbkowego do elektroforezy DNA.

3. Przygotować 80 ml 1% roztworu agarozy w buforze TAE według przepisu

zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń

4. Na żel agarozowy nanieść otrzymane próbki DNA. Rozdział fragmentów DNA

prowadzić przy napięciu 100V dopóki czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu.

Po zakończonej elektroforezie obserwować rozdzielone fragmenty DNA pod lampą

UV. Obrazem trawienia powinna być „drabinka” prążków, które odpowiadają

fragmentom DNA stanowiącym wielokrotność około 200 par zasad.


1. Porównać obraz elektroforetyczny DNA przed i po trawieniu MN-azą.

2. Określić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku działania MN-azy.


12

Analiza zmienności osobniczej DNA w obrębie sekwencji

minisatelitarnej

Minisatelity to fragmenty DNA składające się z szeregu powtórzeń krótkiej sekwencji

o długości kilkudziesięciu nukleotydów. Ilość powtórzeń tej sekwencji jest zmienna

osobniczo, wobec czego może być wykorzystywana jako marker zmienności genetycznej.

Różnice między allelami bada się z wykorzystaniem w reakcji PCR starterów

komplementarnych do sekwencji flankujących region minisatelity. Produkty amplifikacji są

następnie nanoszone na żel agarozowy lub, jeśli chcemy precyzyjnie mierzyć długość

produktu, poliakrylamidowy i analizowane pod kątem długości. Są to markery kodominujące,

co oznacza, że dla heterozygoty w danym locus zobaczymy oba allele. Podczas ćwiczenia

zostanie przeanalizowany marker D1S80, którego sekwencja o długości 16 pz może być

powtórzona od 14 do 42 razy (najczęściej w populacji występującym allelem jest 24

powtórzeń). Ponadto, marker ten jest heterozygotyczny w 79%.

Celem ćwiczenia jest określenie profilu genetycznego charakterystycznego dla DNA

każdej osoby. W tym celu z komórek śluzówki policzka zostanie wyizolowane DNA

z wykorzystaniem specjalnego firmowego zestawu. Zestaw ten wyposażony jest

w kolumienki z membraną krzemionkową, wobec której kwasy nukleinowe wykazują

wysokie powinowactwo. Zastosowanie tej technologii pozwala na wygodne przepłukiwanie

membrany w celu usunięcia zanieczyszczeń, dzięki czemu uzyskane preparaty DNA

charakteryzują się wysoką czystością. Wyekstrahowane DNA wykorzystuje się następnie

w reakcji PCR, podczas której amplifikacji podlega tzw. fragment minisatelitarny.


1. Zestaw do izolacji genomowego DNA z wymazów ( np. Genomic Micro AX Swab

Gravity Plus)

2. Startery reakcji PCR

3. Polimeraza Taq 0,5U/l

4. Bufor dla polimerazy Taq z siarczanem amonu (firmowy)

5. 2 mM mieszanina deoksynukleotydów (dNTP)

6. 25 mM MgCl2 (firmowy)

7. Jałowa dejonizowana woda


13

8. Odczynniki i zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych (patrz załącznik do

ćwiczeń)

9. Cienkościenne probówki do reakcji PCR o poj. 0,2 ml


Izolacja DNA z nabłonka jamy ustnej

1. Do probówki o poj. 2 ml typu eppendorf dodać 700 µl buforu lizującego L.

2. Otworzyć opakowanie i wyjąć wymazówkę z probówki ochronnej.

Uwaga! Koniec wymazówki nie może dotknąć żadnej przypadkowej powierzchni

ani innej osoby poza osobą, od której pobierany jest wymaz.

3. Pobrać wymaz przy użyciu wymazówki dołączonej do zestawu. W tym celu pocierać

końcem wymazówki obie strony wewnętrznej części policzka przez 5 min.

Następnie szczoteczkę z pobraną próbką umieścić w probówce z buforem L, stosując

wyrzutnik wymazówki lub odciąć część patyczka wymazowego z pobraną próbką za

pomocą nożyczek (szczoteczka wymazówki z pobraną próbką powinna być

całkowicie zanurzona w buforze lizującym L).

4. Do próbki dodać 20 µl Proteinazy K i wymieszać przez worteksowanie. Następnie

próbkę inkubować 10 min. w temp. 50˚C z ciągłym mieszaniem bądź mieszać próbkę

podczas inkubacji przez worteksowanie co 2 min.

5. Podczas inkubacji umieścić kolumnę Micro AXD w probówce odbieralnikowej

i wstawić ją do statywu.

6. Nanieść na kolumnę 500 µl roztworu równoważącego K1. Odczekać aż do

całkowitego przejścia buforu przez kolumnę.

7. Po inkubacji w temp. 50˚C, próbkę wymieszać przez worteksowanie przez 2 min.

8. Krótko odwirować próbkę w celu osadzenia całości materiału na dnie probówki.

9. Nanieść próbkę na kolumnę Micro AXD. Poczekać aż roztwór przejdzie przez

kolumnę.

10. Dodać na kolumnę Micro AXD 600 µl pierwszego roztworu płuczącego W1.

Poczekać aż roztwór przejdzie przez kolumnę.

11. Dodać na kolumnę Micro AXD 500 µl drugiego roztworu płuczącego W2. Poczekać

aż roztwór przejdzie przez kolumnę.

12. Dodać do kolumny Micro AXD 60 µl roztworu elucyjnego E i poczekać 5 min.


14

13. W tym czasie przygotować probówkę o poj. 1,5 ml typu eppendorf i dodać na jej dno

5 µl buforu zobojętniającego N.

14. Przenieść kolumnę Micro AXD do przygotowanej probówki.

15. Dodać na kolumnę 60 µl roztworu elucyjnego E. Odczekać aż roztwór całkowicie

wypłynie do probówki. Następnie krótko zwirować próbkę.

16. Kolumnę Micro AXD usunąć a DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać

w lodówce do czasu dalszych analiz.

17. Sprawdzić wydajność izolacji oraz czystość preparatu DNA wykorzystując

spektrofotometr NanoDrop 2000c.

Amplifikacja i analiza elektroforetyczna sekwencji minisatelitarnej

z uzyskanego DNA

1. W probówkach do reakcji PCR o poj. 0,2 ml, przygotować 10 µl mieszaniny

reakcyjnej o następującym składzie:

Woda 4,3 µl

Bufor Taq z siarcz. am. 1 µl

dNTP (2mM) 1 µl

MgCl2 (25 mM) 0,4 µl

Starter F (20mM) 0,5 µl

Starter R (20mM) 0,5 µl

Polimeraza Taq 0,3 µl

DNA 2 µl

2. Przygotowaną mieszaninę reakcyjną wstawić do termocyklera i ustawić podany

program reakcji:

95°C – 2 min.

95°C - 15s

67°C - 30s x30

72°C - 30s

72°C – 2 min.

3. Po zakończeniu reakcji PCR, do probówki dodać 5 l buforu do elektroforezy DNA

i przeprowadzić rozdział elektroforetyczny powstałych produktów reakcji oraz

komercyjnego wzorca DNA w 1% żelu agarozowym (według przepisu

zamieszczonego w załączniku do ćwiczeń), ważne, aby przy wylewaniu żelu użyć

grzebyków o cienkich ząbkach – zwiększa to rozdzielczość rozdziału.

Interpretacja wyników - Przeanalizować zmienność genetyczną w grupie.


15

Otrzymywanie rybosomów i frakcji cytoplazmatycznej drożdży

Saccharomyces cerevisiae

Frakcjonowanie komórek to metoda rozdzielania struktur subkomórkowych

polegająca na wstępnej dezintegracji oraz poddaniu homogenatu wirowaniu różnicowemu

(kilkukrotnemu wirowaniu ze stopniowo wzrastającą siłą odśrodkową) albo wirowaniu

w gradiencie sacharozy czy chlorku cezu (poszczególne struktury subkomórkowe osadzają się

w roztworze o różnej gęstości).

Celem ćwiczenia jest izolacja mikrosomów i frakcji cytoplazmatycznej oraz

oczyszczenie rybosomów z drożdży S. cerevisiae techniką wirowania różnicowego.

Mikrosomy są pęcherzykami, powstającymi z samozasklepiających się fragmentów gładkiego

lub szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W celu uwolnienia rybosomów od błon

retikulum endoplazmatycznego stosuje się bufor z dodatkem 1% niejonowego detergentu

jakim jest Triton X-100. Tak traktowane rybosomy (tzw. rybosomy surowe) zawierają

zasocjowane z nimi białka cytoplazmatyczne, które można usunąć z powierzchni rybosomów

za pomocą zbuforowanych roztworów o wysokim stężeniu soli.


1. Osad zamrożonych komórek drożdży S. cerevisiae

2. Piasek do dezintegracji

3. 2 M Tris

4. 10% roztwór Tritonu X-100 w buforze A

5. Bufor A (do dezintegracji)


80 mM KCl

12,5 mM MgCl2

0,5 mM EDTA

1 mM PMSF

6 mM β- MET


16

6. Bufor B (do zawieszania rybosomów)

50% glicerol


80 mM KCl

10 mM MgCl2

0,5 mM EDTA

5 mM DTT

7. Bufor A z dodatkiem 0,5 M KCl

8. 30% sacharoza w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl

9. Stały siarczan amonu

10. Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)

50 mM Tris – HCl, pH 7,5

0,5 mM EDTA

6 mM β- MET

0,5 mM PMSF

11. Odczynnik Bradford


Uwaga! Poniższe czynności należy wykonywać w temp. 40C

Dezintegracja komórek drożdży i otrzymywanie ekstraktu bezkomórkowego

1. Osad zamrożonych komórek drożdżowych zważyć.

2. Komórki drożdżowe dezintegrować, ucierając je z piaskiem w moździerzu

porcelanowym przez około 15 min. Piasek dodawać stopniowo w ilości wagowej

3 -krotnie większej od masy komórek. Podczas dezintegracji utrzymywać wartość pH

w zakresie 7,2 – 7,5 poprzez dodawanie 2 M Trisu (niebuforowanego).

3. Uzyskany dezintegrat drożdży zawiesić w buforze A i wirować przy 3000 rpm przez

5 min. celem osadzenia piasku i resztek komórek.

4. Uzyskany supernatant wirować przy 30000 x g w ciągu 15 min. aby osadzić struktury

subkomórkowe (mitochondria, jądra, ściany komórkowe).

5. Tak otrzymany ekstrakt komórkowy (tzw. frakcja S30) podzielić na dwie części. Do

jednej części, przy stałym mieszaniu, dodać 10% Tritonu X-100 tak, aby jego


17

końcowe stężenie wynosiło 1%, po czym ekstrakt mieszać jeszcze przez 10 min.

Drugą część ekstraktu przechowywać w tym czasie w temp. 40C.

6. Obie części wirować przy 400000 x g przez 30 min. W wyniku wirowania otrzymuje

się frakcję cytoplazmatyczną, tzw. frakcję S100 i frakcję mikrosomalną

(z części nietraktowanej Tritonem X-100) oraz rybosomy surowe (z części

traktowanej Tritonem X-100).

7. Osady stanowiące frakcję mikrosomalną oraz rybosomy surowe zawiesić w buforze B

(za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego) i przechowywać do kolejnych

ćwiczeń w temp. –200 C.

8. W supernatancie stanowiącym frakcję cytoplazmatyczną oznaczyć białko metodą

Bradford. a następnie przygotować dwie próbki do elektroforezy SDS/PAGE

zawierające po 25 μg białka. Gotowe próbki białkowe przechowywać do kolejnych

ćwiczeń w temp. –200 C.

Oczyszczanie rybosomów

1. Osad rybosomów surowych zawiesić w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl i mieszać

w homogenizatorze szklanym przez 15 min. po czym osadzić przez wirowanie przy

100000 x g przez 1,5 godz. Czynność tę wykonać dwukrotnie.

2. Uzyskany preparat rybosomów ponownie zawiesić w buforze A z 0,5 M KCl

i wirować przez 1cm warstwę zbuforowanego roztworu sacharozy (30% sacharoza

w buforze A z dodatkiem 0,5 M KCl) przy 100000 x g przez 3 godz. Po osadzeniu,

rybosomy zawiesić w buforze B, oznaczyć ich stężenie (przepis – patrz załącznik do

ćwiczeń) i przechowywać do kolejnych ćwiczeń w temp. –200 C.


18

Izolacja kwaśnych białek rybosomowych z drożdży

Większość białek rybosomowych stanowią małe białka o charakterze zasadowym,

których punkt izoelektryczny oscyluje w pobliżu pH 8,5 lub wyższym. Duża podjednostka

rybosomów zawiera jednak grupę powierzchniowych białek kwaśnych, tworzących

charakterystyczną strukturę zwaną „kciukiem”, który oddziałuje z czynnikami translacyjnymi

podczas syntezy białka. U bakterii kwaśne białka rybosomowe tworzą pentameryczny lub

heptameryczny kompleks, złożony, odpowiednio, z dwóch lub trzech dimerów białka L12

oraz pojedynczej cząsteczki białka L10. U Escherichia coli białko L12 nazywane jest L7/L12.

Różnica między L7 i L12 polega na potranslacyjnej acetylacji na N-końcu polipeptydu L7.

Białko L7/L12 E. coli złożone ze 120 aminokwasów i posiada masę cząsteczkową 12,2 kDa.

Eukariotyczne białka kwaśne noszą nazwę białek P, ze względu na ich fosforylacyjną

modyfikację. Białka te podzielono na dwie grupy. Jedną z nich stanowią dwa małe białka P1

i P2 o masie 11 kDa i pI równym 3,0-3,5, będące funkcjonalnymi odpowiednikami

bakteryjnego białka L12. U niższych eukariontów takich jak drożdże stwierdzono obecność

czterech białek P1/P2. Kwaśne białka drożdży S. cerevisiae nazwano P1A, P1B, P2A i P2B.

Ponadto u roślin zidentyfikowano dodatkowo białko P3. Drugą grupę białek P stanowi

pojedyncze białko P0 o masie ok. 34 kDa, będące odpowiednikiem bakteryjnego białka L10.

Na rybosomie białka P tworzą pentameryczny kompleks P0-(P1-P2)2, który wiąże się,

poprzez N-końcowy fragment białka P0, do wysoce konserwatywnego regionu 25S/28S

rRNA, zwanego centrum GTPazowym. U S. cerevisiae białka z grupy P1/P2 tworzą

preferencyjnie dwa heterodimery P1A-P2B i P1B-P2A w których N-końcowe fragmenty

białek są odpowiedzialne za dimeryzację i interakcje z białkiem P0, zaś karboksylowe końce

są wolne i oddziałują z czynnikami translacyjnymi takimi jak EF-2.

Białka z grupy P1/P2 nie są niezbędne dla aktywności translacyjnej rybosomu,

natomiast białko P0 jest stabilnym białkiem rdzenia rybosomowego i jest konieczne dla jego

funkcjonowania. Delecja genu dla P0 prowadzi do śmierci komórki. Wszystkie białka P

charakteryzują się niezwykle konserwatywną C-końcową domeną, zawierającą resztę seryny

ulegającą fosforylacyjnej modyfikacji oraz stanowiącą antygen, przeciwko któremu

skierowane są przeciwciała u ludzi cierpiących na niektóre choroby autoimmunologiczne

(układowy toczeń trzewny) i infekcyjne (choroba serca Chagasa, leiszmanioza).

W odróżnieniu od pozostałych składników rybosomu kwaśne białka rybosomowe,

zarówno bakteryjne jak i eukariotyczne, występują w postaci wolnej w cytoplazmie.


19

U organizmów eukariotycznych, w przeciwieństwie do bakterii, odbywa się ponadto wymiana

tych białek między rybosomem a pulą cytoplazmatyczną.


1. Oczyszczone rybosomy drożdżowe o stężeniu 20 mg/ml

2. Bufor do ekstrakcji kwaśnych białek rybosomowych


40 mM MgCl2

6 mM β- MET

1 M NH4Cl



5. 25 mM Tris-HCl, pH 7,5

6. Odczynnik Bradford


1. Kwaśne białka rybosomowe ekstrahować z 2 mg rybosomów oczyszczonych

S. cerevisiae o stężeniu 20 mg/ml. Do zawiesiny rybosomów (1 objętość) dodać

1 objętość buforu do ekstrakcji białek kwaśnych i pozostawić na 5 min. w lodzie.

2. Dodać 1 objętość 96% etanolu (oziębionego) i pozostawić na 10 min. w lodzie.

3. Powtórzyć punkt 2.

4. Odwirować przy 10000 rpm przez 15 min. w celu osadzenia cząstek rdzeniowych

rybosomów ( tj. rybosomów zawierających białka, które nie zostały wyekstrahowane).

5. Supernatant zawierający kwaśne białka rybosomowe przenieść do nowej probówki

Eppendorfa, dodać trzykrotną objętość oziębionego acetonu (w celu wytrącenia białek

z supernatantu) i pozostawić w temp. –200 C przez co najmniej 24 godz.

6. Wytrącone białka osadzić drogą wirowania przy 10000 rpm przez 15 min., po czym

supernatant odrzucić, a osad kwaśnych białek rybosomowych wysuszyć na powietrzu

i zawiesić w 50 µl 25 mM Trisu – HCl, pH 7,5.

7. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis w załączniku do ćwiczeń)


20

Analiza otrzymanych białek metodą SDS/PAGE

i immunoblotingu

Technika immunoblotingu, zwana inaczej techniką western blot, składa się z kilku

etapów. Pierwszym etapem jest rozdzielenie mieszaniny białek w żelu poliakrylamidowym.

Następnie białka przenoszone są na membranę (w naszym przypadku jest to transfer pół-

suchy), która niespecyficznie wiąże wszystkie białka. Ostatnim etapem jest detekcja białek

przy udziale przeciwciał.

Po rozdziale elektroforetycznym w obecności SDS białka są zdenaturowane

i wszystkie posiadają ładunek ujemny proporcjonalny do ich masy. Transfer odbywa się

zatem w kierunku elektrody dodatniej. Wyróżniamy dwa typy transferu: transfer mokry

i półsuchy.

Transfer

Aby przeprowadzić transfer białek na membranę, należy przygotować „kanapkę”

złożoną z żelu, membrany i bibuły Whatman. W przypadku transferu mokrego, „kanapka”

ułożona jest pionowo pomiędzy dwiema elektrodami, a całość umieszczana jest w aparacie

wypełnionym buforem. Transfer mokry stosuje się zwłaszcza w przypadku białek dużych

(>100 kDa), hydrofoowych lub trudno rozpuszczalnych ze względu na możliwość

prowadzenia go nawet przez 24 godziny, bez ryzyka wyparowania buforu. Należy wówczas

zapewnić chłodzenie, aby utrzymać temperaturę w granicach 10 – 30°C. Transfer mokry

przeprowadza się przy stałym napięciu prądu, zwykle 20 – 30 V.

W przypadku transferu półsuchego „kanapka” ułożona jest poziomo między

elektrodami. Żel i membrana umieszczone są pomiędzy bibułami Whatman nasączonymi

buforem. Transfer ten prowadzi się przy stałym natężeniu prądu, wynoszącym zwykle 0,8 –

1,5 mA/cm2 membrany.

Transfer białek z żelu można przeprowadzić na membrany nitrocelulozowe lub

membrany z polifluorku winylidenu (PVDF). Wielkość porów w obu typach membranach

waha się od 0,1 μm do 0,45 μm. Membrany nitrocelulozowe są tańsze, wiążą 80-200 μg

białka na cm2. Membrany te od razu nasącza się buforem do transferu, bez uprzedniego

zanurzania ich w metanolu. Membrany PVDF wiążą 150-200 μg białka na cm2 i mają dużo

większą wytrzymałość mechaniczną niż membrany nitrocelulozowe. Należy pamiętać

o wcześniejszym zanurzeniu ich w metanolu i dopiero później w buforze do transferu.


21

Blokowanie membran

Po transferze wolne miejsca wiązania białek na membranie są blokowane, aby

zapobiec niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciał do membrany. Do blokowania membran

używa się odtłuszczonego mleka lub albuminy z surowicy bydlęcej.

Wiązanie przeciwciał

Badane białka identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał

pierwszorzędowych (swoistych dla badanych białek), lub niewyznakowanych przeciwciał

pierwszorzędowych i wyznakowanych przeciwciał drugorzędowych (specyficznych dla

pierwszorzędowych). Następnie przeprowadza się detekcję przeciwciał związanych

z badanymi białkami, której sposób zależy od rodzaju znacznika, jaki dołączony jest do

przeciwciał.

Detekcja

Najczęściej dołączanymi do przeciwciał znacznikami są enzymy: alkaliczna fosfataza

i peroksydaza chrzanowa. Wizualizacja tych znaczników może być przeprowadzona

kolorymetrycznie (w miejscu związania przeciwciał do białka na membranie powstaje barwny

produkt) lub chemiluminescencyjnie (enzym przeprowadza reakcję z wytworzeniem światła,

odczytu ilości emitowanego światła można dokonać na dwa sposoby, stosując urządzenie do

detekcji chemiluminescencji lub za pomocą kliszy fotograficznej).

Ćwiczenie ma na celu dokonanie analizy białek rybosomowych

i cytoplazmatycznych techniką SDS-PAGE i immunoblotingu. Przeprowadzimy identyfikację

immunologiczną białek P drożdży. W tym celu wykorzystamy niewyznakowane przeciwciała

pierwszorzędowe rozpoznające drożdżowe, białka P i przeciwciała drugorzędowe sprzężone

z alkaliczną fosfatazą.


1. Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń).

2. Preparaty mikrosomów, rybosomów surowych, rybosomów oczyszczonych, frakcji

cytoplazmatycznej oraz białek P otrzymane na poprzednich ćwiczeniach.

3. Membrana PVDF.


22

4. Metanol

5. Bibuła Whatman 3 MM.

6. Bufor Novablot.

7. Czerwień Ponceau.

8. PBS

9. Roztwór blokujący (10 % roztwór mleka odtłuszczonego w PBS).

10. Aparat do pół-suchego transferu białek.

11. Przeciwciała pierwszorzędowe (poliklonalna surowica skierowana przeciwko

drożdżowym białkom P)

12. Drugorzędowe przeciwciała sprzężone z alkaliczną fosfatazą

13. Bufor PBS

14. Bufor PBS-T (PBS z 0,1 % Tween 20)

15. Bufor AP

16. NBT (18 mg NBT rozpuścić w 1400 µl DMF i 600 µl wody). Przechowywać w -20oC.

17. BCiP (8 mg BCiP rozpuścić w 2 ml DMF). Przechowywać w -20oC.

18. Probówki Falcona o pojemności 15 ml i 50 ml.

19. Pęsety.

20. Rękawiczki nitrylowe.


1. Przygotować dwa 12 % żele poliakrylamidowe do elektroforezy białek w warunkach

denaturujących według przepisu w załączniku do ćwiczeń.

2. Oznaczyć stężenie mikrosomów, rybosomów surowych i oczyszczonych (przepis –

patrz załącznik do ćwiczeń)

3. Przygotować po dwie próbki białkowe do elektroforezy SDS/PAGE zawierające:

a) 25 μg mikrosomów, b) 25 μg rybosomów surowych, c) 25 μg rybosomów

oczyszczonych, d) 25 μg białek frakcji cytoplazmatycznej, e) 5μg białek P, e) wzorce

białkowe, według przepisu w załączniku do ćwiczeń.

4. Próbki białkowe zawieszone w buforze próbkowym SDS/PAGE nanieść na żele

poliakrylamidowe. Rozdział prowadzić pod napięciem 150V tak długo, aż barwnik

przesunie się do końca żelu separującego. Po rozdziale, jeden żel poliakrylamidowy

wybarwić błękitem Coomassie, (przepis w załączniku do ćwiczeń).

5. Drugi żel poliakrylamidowy przepłukać buforem Novablot a następnie przeprowadzić

transfer białek z żelu na membranę PVDF (wcześniej nawilżoną metanolem


23

a następnie buforem Novablot), umieszczoną pomiędzy dwiema potrójnymi

warstwami bibuły Whatman 3 MM nawilżonej buforem Novablot. Całość umieścić

w aparacie do elektrotransferu pomiędzy grafitowymi elektrodami. Transfer białka

prowadzić w kierunku anody przy natężeniu prądu 280 mA przez jedną godzinę.

6. Po zakończeniu transferu, membranę PVDF inkubować z 0,02% roztworem czerwieni

Ponceau (celem wybarwienia markerów białkowych). Po zaznaczeniu ołówkiem

pozycji markerów białkowych, odpłukać barwnik za pomocą buforu PBS. Następnie

inkubować membranę w roztworze blokującym, w temp. 4oC, do kolejnych ćwiczeń.

7. Wylać roztwór blokujący i dodać do membrany 20 ml przeciwciał

pierwszorzędowych rozcieńczonych 1:1000, w buforze PBS i pozostawić przez

40 min. na kołysce w temp. pokojowej.

8. Odpłukać przeciwciała roztworem PBST: 4 razy przez 1 min.

9. Na płytkę z membraną wlać 20 ml przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych

1:10000 w 20 ml PBST i pozostawić na kołysce w temperaturze pokojowej na

40 min. (w czasie inkubacji przygotować barwniki do detekcji).

10. Odpłukać przeciwciała roztworem PBST: 4 razy przez 1 min.

11. Przepłukać membranę buforem AP: 2 razy przez 1 min.

12. Przeprowadzić detekcję białek na membranie. W tym celu do probówki Falcona

dodać 10,5 ml buforu AP a następnie dodać jednocześnie dwa przygotowane

wcześniej barwniki (NBT i BCiP) . Wymieszać zawartość probówki Falcona i wylać

całość na płytkę z membraną. Pozostawić na kołysce do pojawienia się prążków.

Reakcje barwienia przerwać poprzez płukanie membrany wodą dejonizowaną, po

czym membranę wysuszyć na powietrzu.


1. Porównać skład białkowy preparatów poddawanych elektroforezie.

2. Określić masy cząsteczkowe białek P.

3. Określić w jakich frakcjach komórkowych występują białka P drożdży.


24

Badanie aktywności enzymatycznej w żelu poliakrylamidowym

na przykładzie inwertazy

Badanie aktywności enzymów w żelu poliakrylamidowym jest często skuteczną

metodą identyfikacji enzymów w nieoczyszczonych preparatach białkowych. Badanie

aktywności enzymatycznej można przeprowadzać zarówno po rozdziale białek w żelu

poliakrylamidowym w warunkach denaturujących jak i po elektroforezie w warunkach

natywnych. Wybór metody zależy w dużej mierze od wrażliwości badanego enzymu na

obecność SDS. W przypadku niektórych białek, które nie zachowują aktywności

enzymatycznej w obecności SDS, można przeprowadzić ich renaturację poprzez usunięcie

SDS (np. płucząc żel w roztworze 2,5% tritonu X-100). Jednakże nie ma jednej

uniwersalnej, efektywnej metody renaturacji enzymów, toteż aktywność enzymatyczną

niektórych białek bada się po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach natywnych.

Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.26) katalizuje hydrolizę sacharozy będącej

disacharydem złożonym z cząsteczki α-D-glukozy i cząsteczki β-D-fruktozy połączonych

wiązaniem α1-β2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiązania powstaje równomolarna

mieszanina cząsteczek glukozy i fruktozy. Inwertaza jest syntetyzowana przez wiele

szczepów drożdży i bakterii. Ilość enzymu produkowana przez mikroorganizm waha się

znacznie w zależności od gatunku, szczepu, czy dostępnego źródła węgla. Drożdże

Saccharomyces cerevisiae wytwarzają zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkową

inwertazę. Zewnątrzkomórkowa inwertaza występuje w formie wysoce glikozylowanego

homodimeru wydzielanego do przestrzeni periplazmatycznej. Wewnątrzkomórkowa

inwertaza również tworzy homodimer ale nie ulega glikozylacji. Inwertaza jest

powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym do produkcji fruktozy czy

w biosensorach do stałego monitorowania poziomu sacharozy.

Celem ćwiczenia jest identyfikacja aktywności enzymatycznej inwertazy z drożdży

S. cerevisiae po rozdziale w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.


1. 20-godzinna hodowla drożdży S cerevisiae, szczep W303 (50 ml na zespół studentów)

2. (NH4)SO4 cz. d. a. w postaci stałej

3. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0

4. 10 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu


25

5. 10 mM bufor fosforanowy pH 5,8

6. 0,1 M r-r sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8 (przygotować

bezpośrednio przed użyciem)

7. Chlorek tetrazolu w postaci stałej (chronić przed światłem!!!)

8. 1M NaOH

9. Inwertaza - preparat handlowy (1 mg/ml w 10 mM buforze fosforanowym pH 5,8) –

przygotować w dniu poprzedzającym ćwiczenia, przechowywać w temp. 40C.

10. Celulozowe „węże” do dializy

11. Papierki wskaźnikowe pH 5,4 – 7,0

12. 10% roztwór kwasu octowego

13. Odczynniki i zestaw do elektroforezy białek SDS/PAGE


Wysalanie i dializa białek z płynu pohodowlanego

1. Po ok. 20 godzinach hodowli, gdy OD600 równa się ok. 9-10 (faza stacjonarna)

odwirować komórki przy 3000 rpm przez 10 min.

2. Płyn pohodowlany zlać do cylindra (źródło inwertazy) a osad komórek odrzucić.

3. Zmierzyć objętość płynu pohodowlanego, przelać go do zlewki i pozostawić w lodzie

na mieszadle magnetycznym.

4. Białka wytrącać stałym siarczanem amonu przy wysyceniu 0-90% (tabela

frakcjonowania siarczanem amonu – załącznik do ćwiczeń). Siarczan amonu dodawać

stopniowo mieszając przez 1 godz. w temp. 40 C. Następnie zawiesinę odwirować

przy 10000 rpm przez 20 min.

5. Osad wytrąconych białek rozpuścić w 200-300 µl 10 mM buforu fosforanowego, pH

7,0 i poddać dializie (przepis – załącznik do ćwiczeń) wobec 10 mM buforu

fosforanowego, pH 7,0 z dodatkiem 30% glicerolu. Po zakończeniu dializy roztwór

białek przechowywać w temp. –200 C.


26

Oznaczanie aktywności inwertazy w żelu

1. Oznaczyć stężenie białka metodą Bradford (przepis – załącznik do ćwiczeń).

2. Przygotować 10% żel poliakrylamidowy do elektroforezy białek w warunkach

denaturujących (SDS/PAGE) według przepisu w załączniku do ćwiczeń.

3. Przygotować trzy próbki zawierające: 100 µg, 150µg i 200 µg białka w objętości 30 µl

i dodać do nich po 10 µl buforu próbkowego do elektroforezy białek w warunkach

denaturujących (bezpośrednio przed naniesieniem na żel). Jako wzorzec przygotować

dwie próbki zawierające 10 µg i 20µg inwertazy handlowej w objętości 30 µl i dodać

do nich po 10 µl buforu próbkowego. Dokładnie wymieszać (uwaga! nie ogrzewać

próbek w temperaturze 900C) i nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym.

4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 150 V tak długo, aż barwnik

przesunie się do końca żelu separującego.

5. Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść do małego pojemnika, przepłukać 30 ml

wody destylowanej, a następnie 30 ml 10 mM buforu fosforanowego pH 5,8.

6. Następnie żel zalać 30 ml 0,1 M roztworu sacharozy w 10 mM buforze fosforanowym

pH 5,8 i inkubować w łaźni wodnej w temp. 450C przez 45 min. Uwaga! Podczas

inkubacji należy kontrolować, za pomocą papierków wskaźnikowych, pH r-ru

(pH r-ru wzrasta, zwłaszcza w ciągu pierwszych 15 min. inkubacji). W przypadku

zmiany pH, zlać roztwór sacharozy i zalać żel kolejną porcją.

7. Po zakończeniu inkubacji, zlać roztwór sacharozy, a żel przepłukać trzy razy wodą

destylowaną.

8. Ok. 10 min przed zakończeniem inkubacji przygotować wrzącą łaźnię wodną.

Naważyć 50 mg chlorku tetrazolu i rozpuścić w 50 ml 1M NaOH.

9. Gdy roztwór chlorku tetrazolu zaczyna zmieniać barwę (z bezbarwnej na różową),

wlać barwnik do naczynia z żelem i umieścić we wrzącej łaźni wodnej.

10. Żel barwić do pojawienia się czerwonych prążków białkowych.

11. Reakcję przerwać przez przeniesienie żelu do roztworu 10 % kwasu octowego.


27

Identyfikacja białek w komórkach ssaczych metodą

immunocytochemiczną

Immunocytochemia (ICC, ang. immunocytochemistry) jest laboratoryjną techniką

mikroskopową powszechnie wykorzystywaną w badaniach podstawowych takich dziedzin

nauki jak np. biologia komórki czy biologia molekularna. Jednocześnie stanowi ona również

potężne narzędzie diagnostyczne stosowane szeroko w medycynie.

Zasada metody ICC polega na wykrywaniu in situ w komórce, tkance

(immunohistochemia, IHC) konkretnych antygenów (najczęściej są to białka, ale również

kwasy nukleinowe i polisacharydy) oraz definiowaniu ich subkomórkowej lokalizacji w

oparciu o zastosowanie przeciwciał specyficznie rozpoznających charakterystyczne dla

danego antygenu regiony określane jako epitopy. Wysoka specyficzność wiązania antygenu

przez przeciwciało jest determinowana unikalną strukturą epitopów danego antygenu

rozpoznawaną przez konkretne przeciwciało na zasadzie dopasowania przestrzennego.

Wizualizacja powstałych w komórce immunokompleksów (kompleksy przeciwciało-antygen)

jest możliwa dzięki znacznikom przyłączonym do przeciwciał. Generalnie wyróżnia się trzy

grupy znaczników:

1) enzymy (immunocytochemia właściwa), które przekształcają rozpuszczalny w

wodzie substrat w barwny i nierozpuszczalny w wodzie produkt np. peroksydaza chrzanowa

(HRP) czy alkaliczna fosfataza (AP) (Rys. 1),

Rys. 1 Analiza IHC chromograniny A pokazująca rekcję pozytywną w materiale pobranym z trzustki

(prawy panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-chromogranina A (lewy panel).

IHC pośrednia z wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-chromogranina A i

przeciwciał drugorzędowych wyznakowanych HRP (Fot. Thermo Scientific. Pierce Antibody Products).


28

2) fluorofory (immunocytofluorescencja IF) charakteryzujące się emisją światła o

innej długości fali niż światło wykorzystane do jego wzbudzenia np. FITC, barwniki z

rodziny Alexa Fluor, czy znaczniki nowej generacji tj. kropki kwantowe QDs (ang. qantum

dots) (Rys. 2) oraz

Rys. 2 Analiza ICC/IF białka HER2 pokazująca rekcję pozytywną w komórkach linii SK-BR-3 (prawy

panel) oraz reakcję negatywną w kontroli bez użycia przeciwciał anty-HER2 (lewy panel). ICC/IF pośrednia z

wykorzystaniem pierwszorzędowych monoklonalnych przeciwciał anty-HER2 i przeciwciał drugorzędowych

wyznakowanych fluoroforem DyLight 488. Jądra komórkowe wyznakowano barwnikiem DAPI. (Fot. Thermo

Scientific. Pierce Antibody Products).

3) białka zawierające metale ciężkie np. ferrytyna czy też same cząsteczki metali

ciężkich tj. np. koloidalne złoto w przypadku analiz ultrastrukturalnych w mikroskopii

elektronowej.

Detekcję antygenu w analizowanym materiale przeprowadza się stosując obserwacje

mikroskopowe w określonym typie mikroskopu (świetlny, fluorescencyjny, konfokalny,

elektronowy), co warunkowane jest rodzajem znacznika przyłączonego do przeciwciała

specyficznie wiążącego badany antygen.

Wśród metod immunocytochemicznych wyróżnia się metody bezpośrednie i

pośrednie. Immunocytochemia bezpośrednia polega na detekcji analizowanego antygenu w

komórce za pomocą wyznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego specyficznie

wykrywającego dany antygen. Ze względu na zwiększoną czułość częściej stosuje się jednak

nieco bardziej skomplikowaną i czasochłonną immunocytochemię pośrednią. W tym

przepadku przeciwciało pierwszorzędowe skierowane przeciwko analizowanemu antygenowi

jest niewyznakowane i dopiero zastosowanie wyznakowanego przeciwciała drugorzędowego

specyficznie rozpoznającego przeciwciało pierwszorzędowe umożliwia wizualizację reakcji

(schemat poniżej).


29

Ze względu na szeroki wachlarz możliwości jakie stwarzają metody immunocyto- i

histochemiczne z powodzeniem stosuje się je w medycznych laboratoriach naukowych jak

również w diagnostyce klinicznej. Wykorzystuje się je m.in. do potwierdzenia infekcji

wirusowych (np. CMV, HBV, HCV), diagnostyki wrodzonych chorób genetycznych (tj. np.

dystrofie mięśniowe, choroby mitochondrialne) i chorób metabolicznych (np. miażdżyca).

Immunocytochemia odgrywa również bardzo ważną rolę w diagnostyce nowotworów.

Analizując obecność lub poziom ekspresji markerów nowotworowych możliwe jest wstępne

określenie typu nowotworu (np. antygen CA 125 - rak jajnika, PSA - rak gruczołu

krokowego, CEA - rak jelita grubego, ale również żołądka, płuc, S-100 – czerniak, ale i

diagnostyka nowotworów pochodzenia nerwowego) i różnicowanie nowotworów (np.

antygen LCA w różnicowaniu raków i chłoniaków w nowotworach płuc), zdefiniowanie czy

nowotwór jest złośliwy czy łagodny (np. ekspresja E-kadheryny, kalretyniny), określenie

stadium rozwoju nowotworu, identyfikacja typu komórek w przerzutach i odnalezienie źródła

przerzutowania czyli nowotworu pierwotnego (identyfikacja białek filamentów pośrednich FP

tj. np. cytokeratyna, wimentyna, nestyna), jak również przewidywanie odpowiedzi na

zastosowaną terapię czyli identyfikacja markerów predykcyjnych (np. lek trastuzumab, nazwa

handlowa: Herceptin, jest skuteczny w leczeniu raka piersi z przerzutami jedynie przy

nadekspresji białka HER2) jak również markerów prognostycznych. IHC wykorzystuje się

również przy opracowywaniu leków do testowania ich skuteczności poprzez wykrywanie

aktywności lub zmian w poziomie ekspresji molekularnego celu leku w chorobowo

zmienionej komórce.

Jakkolwiek pojęcie immunohistochemia jest często stosowane zamienne z

immunocytochemią warto zdawać sobie sprawę z istniejących między nimi różnic. Zasada

obu metod jest taka sama natomiast różnice dotyczą pochodzenia i histologiczno-


30

cytologicznej charakterystyki analizowanej próbki (w przypadku ICH mamy do czynienia z

materiałem biopsyjnym, pobraną od pacjenta tkanką, natomiast ICC umożliwia analizę

komórek pochodzących z płynów ustrojowych lub laboratoryjnych hodowli komórkowych)

oraz odpowiedniego przygotowania próbek przed zastosowaniem przeciwciał.

Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z techniką immunocytochemii

pośredniej oraz z metodami różnicowego barwienia fluorescencyjnego składników komórek.


1. Hodowla komórek nowotworowych i prawidłowych na szkiełkach nakrywkowych w

oddzielnych małych szalkach Petriego 35 x 10 mm, o gęstości komórek ok. 80% (dwie

szalki z komórkami jednego typu na zespół studentów)

2. Bufor PBS:

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4, pH 7,5

3. 36,5-38% formaldehyd

4. Utrwalacz: 4% formaldehyd (przygotowywany na świeżo w buforze PBS)

5. Odczynnik do permeabilizacji: aceton schłodzony do temp. - 20° C

6. Bufor blokujący I:

2% BSA w buforze PBS

7. Bufor blokujący II:

6% BSA w buforze PBS

8. Surowica rozpoznająca ludzkie białko uL10

9. Roztwór króliczych przeciwciał pierwszorzędowych rozpoznających ludzkie białko

uL10, rozcieńczenie: 1:50 (przygotowywane na świeżo z surowicy w buforze

blokującym I)

10. Roztwór przeciwciał drugorzędowych skoniugowanych z fluoroforem Alexa fluor

488, rozpoznających przeciwciała pierwszorzędowe, stężenie 1 µg/ml w buforze

blokującym II

11. Barwnik fluorescencyjny Hoechst 33342, stężenie 2 µg/ml w H2O

12. Woda MiliQ


31

13. Roztwór do zatapiania komórek: komercyjny (Fluka), przed użyciem konieczne

ogrzanie w termobloku lub 20 % glicerol w H2O

14. Jałowe probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 i 2 ml i jałowe końcówki do pipet.

15. Jałowe probówki typu Falcon o poj. 15 ml

16. Pęsety

17. Małe szalki Petriego (35 x 10 mm) do hodowli komórkowych

18. Komory wilgotne (duże szalki Petriego 100 x 15 mm wyłożone bibułą filtracyjną

nasączoną w wodzie destylowanej)

19. Szkiełka podstawowe do obserwacji mikroskopowych

20. Termoblok


Wszystkie etapy wykonywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

Przy pracy z formaldehydem i barwnikiem Hoechst 33342 używać rękawiczek

ochronnych.

1. Usunąć pożywkę znad hodowli i przepłukać komórki 1 ml buforu PBS ogrzanym do

temp. 37° C.

2. Komórki w szalkach utrwalić na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 1 ml 4%

roztworu formaldehydu, inkubować w utrwalaczu 10 min.

3. Po usunięciu 4% formaldehydu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.

4. Usunąć bufor PBS i permeabilizować komórki przez 10 min. w 1 ml acetonu

schłodzonym do temp. -20° C (plastikowe szalki ulegną zmętnieniu).

5. Po usunięciu acetonu komórki przepłukać 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.

6. Szkiełka nakrywkowe z utrwalonymi i spermeabilizowanymi komórkami przenieść za

pomocą pęsety do nowych szalek Petriego.

7. Szalki z komórkami na szkiełkach umieścić w komorach wilgotnych.

8. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych

(anty uL10) i inkubować prze 30 min. w zamkniętych komorach wilgotnych (próba

badana). W przypadku preparatów kontrolnych zamiast roztworu przeciwciał

pierwszorzędowych użyć buforu blokującego I (kontrola negatywna).

9. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.


32

10. Na komórki delikatnie nakroplić 50 - 100 µl roztworu przeciwciał drugorzędowych

sprzęgniętych z markerem fluorescencyjnym Alexa fluor 488 i inkubować przez 30

min. w zamkniętych komorach wilgotnych.

11. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać komórki 3 x za pomocą 1 ml buforu PBS.

12. Komórki przepłukać jednokrotnie wodą MiliQ (1 ml) i wybarwić jądra komórkowe

nanosząc na komórki 50-100 µl roztworu barwnika Hoechst 33342, inkubować 2 min.

13. Roztwór barwnika usunąć a komórki przepłukać buforem PBS.

14. Na szkiełko podstawowe nanieść 10 µl roztworu do zatapiania komórek. Na powstałej

kropli umieścić szkiełko nakrywkowe z wybarwionymi komórkami tak, aby strona z

komórkami była zwrócona do roztworu.

15. Przygotowane preparaty oglądać w mikroskopie konfokalnym przy określonej

długości fali:

Alexa-Fluor 488:

światło wzbudzające: niebieskie (max 488 nm), emisja – światło zielone.

Hoechst 33324:

światło wzbudzające: UV (max 352 nm), emisja – światło niebieskie

16. Zdefiniować obszary komórki wyznakowane fluorescencyjnie i porównać profil

intensywności fluorescencji komórek nowotworowych i prawidłowych.


Ocena subkomórkowej lokalizacji analizowanego antygenu na podstawie obserwacji

mikroskopowych fluorescencyjnie wyznakowanych immunokompleksów. Porównanie

intensywności sygnału fluorescencyjnego dla komórek nowotworowych i prawidłowych.

Literatura:

1. Immunocytochemia, Zabel A. Wydawnictwo Naukowe PWN

Documents

ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ - phavi.umcs.plphavi.umcs.pl/at/attachments/2016/0223/151342-skrypt-iii-rok-mikro.pdf · Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2016 7 Materiały