LAPORAN SEMENTARA

PRAKTIKUM TEKNIK BIOPROSES

IDENTITAS PRAKTIKAN

NAMA : Yuliana Stevani

NIM : 03101003016

KELOMPOK : 2

I. NAMA PERCOBAAN : Inokulasi

II. TUJUAN

1. Untuk mengetahui cara pembiakan jamur pada medium padat

2. Dapat menghitung bayaknya jumlah mikroba dengan menggunakan alat

Haemacytometer.

3. Mengetahui perkembangan jamur antara medium tabung reaksi tegak dan

tabung reaksi miring.

III. DASAR TEORI

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana

memperoleh suatu biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara

serta mencegah pencemaran dari luar.Inokulasi dimaksudkan untuk

menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba

yang murni.

Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang

lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.

Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan.

Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak

mikroorganisme.

Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati

dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh

karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang

disebut dengan teknik inokulasi biakan. Identifikasi biakan mikroorganisme

seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi

pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik

aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan

berulangkali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau

padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan

mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka

akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu

pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel. Pertumbuhan mikroorganisme

dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas metabolismenya. Mikroba

aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada bagian

ini kandungan oksigen tinggi.

Selain dalam media cair, mikroorganisme juga memperlihatkan

pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau

lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan

murni sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan

mikroorganisme.

A. Inokulasi Bakteri

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik

penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :

1. Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril

agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam

labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat

dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak

tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.

2. Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan

untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air murni sebanyak 99

ml.

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi.

Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh

lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam

melakukan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan

sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin

kembali, ujung kawat itu disentuhkan ke suatu koloni, mulut tabung tempat

pembiakan dipanasi setelah sumbatnya dibuka. Ujung kawat yang ada sampel

mikroorganisme (inokulum), digesekkan pada medium. Setelah penggesekan

selesai, mulut tabung dipanasi kembali. Kemudian disumbat seperti semula.

B. Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :

1. Metode gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan

waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan

latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang

terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam

cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis

goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh

menjadi koloni.

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk

lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis.

Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium

tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada

lempeng medium pembiakan.

Kesulitan dari metode ini, yaitu proses penggoresan yang cukup lama dan

sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip

metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni

yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan

membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan

dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada

cawan berisi media steril.

Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi

cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut

digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua.

Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat

dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak

jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak

tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan

secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.

Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :

1. Goresan T

2. Goresan Kuadran

3. Goresan Radiand

4. Goresan Sinambung

2. Metode tebar

Pada metode cawan sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah

diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan.

Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar

koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian

diletakkan dalam inkubator (370C) selama 1-2 hari.

Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan

batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata, biakan justru

terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus benar-benar steril,

yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian

dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang masih

panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar,

sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar

api bunsen (±15 cm).

Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang

menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni

lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media,

diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan

permukaan koloni.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk

mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose

steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu

sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam

tabung reaksi.

3. Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar

melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga

pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar

tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak

diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya

kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya

tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media

panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan

uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses

pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar.

Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat

kemudian diletakkan dalam inkubator

4. Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan

ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan

ke dalam media. Metode Tusuk ini termasuk kedalam media agar tegak dan

media cair. (Winarni, 1997).

C. Macam-Macam Media Untuk Inokulasi

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1) Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme.

2) Plate culture: media padat dalam petridish.

3) Slant culture : media padat dalam tabung reaksi.

4) Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya

dengan cara penusukan.

5) Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

6) Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya

dikocok.

D. Perhitungan Mikroba

Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk

organisme bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel

dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga

untuk organisme berfilamen (misalnya kapang). Ada berbagai cara untuk

mengukur jumlah sel antara lain:

1. Hitungan Cawan (Pengenceran)

Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest

steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml

sampel yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu :

a. 1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di

dalam tabung pertama menjadi 10-1.

b. 1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung

kedua menjadi 10-2.

c. Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah.

Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke

dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian

timbul pada tiap-tiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus

memperhitungkan faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika

pertumbuhan koloni terlalu rapat biasanya sulit untuk

dipertanggungjawabkan hasilnya. Juga untuk pertumbuhan yang terlalu

jarang sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan yang ditumbuhi koloni

yang paling tinggi kemurniannya untuk dihitung.

2. Hitungan Mikroskopis Langsung

Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung

(seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung

dengan bantuan mikroskop.

Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada media, tetapi

diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop

terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan. Misalnya

didapatkan jumlah yang terhitung 12 sel, maka perhitungan jumlah sel

adalah:

Jumlah Sel = 12 x 25 x 50 x 103

= 1,5 x 107 sel/ ml

Dimana: 12 = Jumlah sel yang terhitung.

25 = Jumlah kotak pada ruang perhitungan.

50 = Volume tiap-tiap kotak.

103 = Pengenceran sampel.

Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak

memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat

membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang

diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan

menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut

secara enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru.

Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah

sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena

ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi

dengan mewarnai sel sehingga mudah dilihat. Kelemahan lainnya adalah

kadang-kadang sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan

sel-sel individu. Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan

gumpalan sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal, seperti

Dinatrium etilamina tetra asetat dan tween sebanyak 0,1 %.

3. Penggunaan Nefelometer / Turbidometer

Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan,

yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan

kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.

4. Menggunakan Ruang Hitung Haemacytometer

Haemacytometer adalah alat khusus yang digunakan untuk menghitung

mikroorganisme. Pada alat ini terdapat kotak-kotak kecil dengan luas 1 / 400

mm2 dan kedalaman 0,1 mm. Penggunaannya adalah dengan meletakkan kaca

preparat yang di atasnya dan ditutup dengan deck glass. Pengamatan ini

dilakukan dengan menggunakan mikroskop agar dapat mengamati sel-sel

mikroba baik yang kecil maupun yang besar, yang dibatasi oleh kotak-kotak

haemacytometer.

Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan langsung

karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat haemacytometer

dan diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dengan metode ini mempunyai

beberapa keuntungan, yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup atau

pun sudah mati dapat dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila

pengenceran tidak homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam

perhitungan.

Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan

langsung karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat

haemacytometer dan diamati di bawah mikroskop.

Perhitungan dengan metode ini mempunyai beberapa keuntungan,

yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup atau pun sudah mati dapat

dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila pengenceran tidak

homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam perhitungan.

E. Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :

1) Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang

berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan

mudah sekali tumbuh di dalam suatu media.

2) Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum

ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang

relatif banyak (Rohimat, 2002).

F. Fermentasi

Fermentasi merupakan suatu cara pengolahan melalui proses

memanfaatkan penguraian senyawa dari bahan-bahan protein kompleks.

Protein kompleks tersebut terdapat dalam tubuh ikan yang diubah menjadi

senyawasenyawa lebih sederhana dengan bantuan enzim yang berasal dari

tubuh ikan atau mikroorganisme serta berlangsung dalam keadaan yang

terkontrol (Adawyah 2007).

Fermentasi secara teknik dapat didefinisikan sebagai suatu proses

oksidasi anaerobik atau partial anaerobik karbohidrat yang menghasilkan

alkohol serta beberapa asam, namun banyak proses fermentasi yang

menggunakan substrat protein dan lemak (Muchtadi dan Ayustaningwarno

2010).

Fermentasi terbagi menjadi dua, yaitu fermentasi spontan dan tidak

spontan (membutuhkan starter). Fermentasi spontan adalah fermentasi yang

biasa dilakukan menggunakan media penyeleksi, seperti garam, asam

organik, asam mineral, nasi atau pati. Media penyeleksi tersebut akan

menyeleksi bakteri patogen dan menjadi media yang baik bagi tumbuh

kembang bakteri selektif yang membantu jalannya fermentasi.

Fermentasi tidak spontan adalah fermentasi yang dilakukan dengan

penambahan kultur organisme bersama media penyeleksi sehingga proses

fermentasi dapat berlangsung lebih cepat (Rahayu et al. 1992). Hasil

fermentasi diperoleh sebagai akibat metabolisme mikroba-mikroba pada

suatu bahan pangan dalam keadaan anaerob. Mikroba yang melakukan

fermentasi membutuhkan energi yang umumnya diperoleh dari glukosa.

Dalam keadaan aerob, mikroba mengubah glukosa menjadi air, CO2 dan

energi (ATP). Beberapa mikroba hanya dapat melangsungkan metabolisme

dalam keadaan anaerob dan hasilnya adalah substrat yang setengah terurai.

Hasil penguraiannya adalah air, CO2, energi dansejumlah asam organik

lainnya, seperti asam laktat, asam asetat, etanol serta bahan-bahan organik

yang mudah menguap. Perkembangan mikroba-mikroba dalam keadaan

anaerob biasanya dicirikan sebagai proses fermentasi (Muchtadi dan

Ayustaningwarno 2010). Sebagai suatu proses fermentasi memerlukan:

1. Mikroba sebagai inokulum

2. Tempat (wadah) untuk menjamin proses fermentasi berlangsung dengan

optimal.

3. Substrat sebagai tempat tumbuh (medium) dan sumber nutrisi bagi

mikroba.

G. Desain Media Fermentasi

Medium untuk fermentasi biasa disebut substrat. Biasanya pada teknologi

fermentasi digunakan bahan dasar yang mengandung karbon. Oleh karena

itu, kebanyakan berasal dari tumbuhan dan sedikit dari produk hewani.

Sebagai contoh; biji-bijian (grain), susu (milk). Natural raw material berasal

dari hasil pertanian dan hutan. Karbohidrat; gula, pati (tepung), selulosa,

hemiselulosa, dan lignin.

1. Gula, bahan makanan yang mengandung gula mudah dan relatif mudah

didapatkan untuk proses biotek.

2. Pati, jagung, padi, ganum, kentang, dan pohong (kassava) didegradasi

menjadi gula sederhana (monosakarida) dengan hidrolisis sebelum

fermentasi. Pati juga dapat digunakan sebagai bahan bakar non minyak

(etanol).

3. Selulosa

4. Substrat dari limbah industri: Molase (tetes tebu), mengandung 50 % gula

5. sebagai substrat untuk produksi antibiotik, asam organik. Whey (air

dadih), Damen dan ampas tahu, bahkan urine hewan ternak.

Berdasarkan bentuknya substrat dapat dibedakan menjadi:

1. Substrat cair (air anggur)

2. Substrat semi cair (yoghurt)

3. Substrat padat digunakan untuk produksi tempe, oncom, kecap, kompos

dsb.

4. Solid substrate fermentation (SSF), melibatkan jamur berfilamen, yeast

atau streptomyces.

H. Inokulum

Tujuan utama pembuatan inokulum untuk fermentasi menggunakan

bakteri ialah menyediakan inokulum yang berada dalam keadaan aktif

sehingga dapat mempersingkat fase adaptasi pada waktu fermentasi.

Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh volume inokulum dan kondisi

fisiologinya. Untuk bakteri pembentuk spora, inokulum juga dipengaruhi

oleh lamanya fase adaptasi. Karena itu, inokulum bakteri sebaiknya

diinokulasikan ke dalam medium fermentasi pada saat sel aktif melakukan

metabolisme. Fase adaptasi dapat dikurangi sampai serendah-rendahnya jika

komposisi medium inokulum yang digunakan sama dengan komposisi

medium fermentasi. Fase adaptasi dalam proses fermentasi untuk

memproduksi enzim yang dihasilkan oleh bakteri juga perlu dikurangi

sampai serendah mungkin.

Inokulum merupakan campuran antara kultur mikroba dan media

pertumbuhannya yang digunakan untuk memfermentasikan suatu produk.

Inokulum yang digunakan harus berada dalam fasa aktif untuk memberikan

fase lag yang pendek. Fase lag dipengaruhi oleh jumlah inokulum dan

kondisi fisiologis mikroba itu sendiri. Jika dalam proses fermentasi diawali

dengan jumlah inokulum yang terlalu minim, pertumbuhan akan lambat dan

kecepatan pembentukan produk tidak memuaskan.

Komposisi kultur media, konsentrasi biomassa, dan konsentrasi metabolit

umumnya akan mengalami perubahan secara konstan sebagai hasil

metabolisme sel. Umumnya konsentrasi inokulum yang dibutuhkan adalah

sebagai berikut:

Bakteri 0,1 – 3 %

Aktinomiset 5 – 10 %

Fungi 5 – 10%

Suspensi spora 1 – 5 x 105/L

Berikut jenis-jenis inokulum :

1. Bakteri : Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp.

Eschericia sp.

2. Jamur : Aspergillus sp. Penicillium sp.

3. Jamur filamentous

4. Kahmir (yeast) : Saccharomyces sp.

Jenis Inokulum Substrat Produk

JamurRhizopus oligoporus Kedelai, Ampas

Kacang

Tempe,

Oncom

Khamir (Yeast) Saccharomyces

cerevisiae

Bahan roti, tetes

tebu

Roti

Saccharomyces

cerevisiae

Bahan dasar

karbohidrat:

Tape

beras,

ketan, ketela

Saccharomyces

cerevisiae

Air anggur, bir,

brem

anggur, bir,

brem

Bakteri

Acetobacter xylinum Air kelapa Nata de

coco

Streptococcus

thermophillus

Lactobacillus

bulgaricus

Air susu Yoghurt

Tabel 1. Berbagai jenis inokulum dan produknya

IV. ALAT DAN BAHAN

a. Alat :

1. Tabung reaksi

2. Cawan Petri

3. Jarum Oase

4. Burner

b. Bahan :

1. Medium yang telah jadi

2. Kultur murni

3. Jarum/kawat

4. Alcohol

V. PROSEDUR PERCOBAAN

Untuk percobaan Inokulasi :

1. Siapkan tabung yang berisi jamur atau bakteri dan tabung medium.

2. Panaskan jarum inokulasi sampai berpijar dan diamkan sebentar.

3. Buka sumbat tabung jamur atau bakteri lewatkan dekat nyala Bunsen.

4. Ambil jamur dengan menggunakan jarum Oase.

5. Buka sumbat tabung medium, mulut tabung dilewatkan ke nyala Bunsen.

6. Masukkan ujung kawat oase tadi yang membawa jamur dengan

menggesekkan pada permukaan medium dari kiri ke kanan dengan arah

dari bawah ke atas medium.

7. Tabung medium kemudian disumbat lagi.

8. Simpan tabung yang telah ditanami jamur tadi + 7 hari.

9. Amati bentuk jamur atau bakteri melalui mikroskop dan jelaskan.