Université de Sherbrooke

>

Développement de nouveaux agents diagnostiques pour le dépistage du cancer par la rnodincation d'axLalogues peptidiques hormonaux.

Par

Jean-François Fournier

Département de Radiobiologie et de Médecine Nucléaire, Faculté de médecine,

Université de Sherbrooke, Sherbmoke, Québec, Canada,

j l H 5N4

Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de

maître ès sciences (M. Sc.)

Le 14 juin de l'année 1996

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Table des matières

Liste des illustrations .................................................................. i

Figures ........................................................................ i

Tabiea wc ...................................................................... ii

................................................ Liste des sigles. abréviations et symbdes iv

............................................................................. Résumé v

I . Infroducb'm ........................................................................ 1

1.1.Lamédecineetlirnagecie~~cale .............................................. 2

1.2. Les hormones ............................................................... 4

.................................................... 1.2.1. La somatostatine 4

1.2.2.LaGHRH ........................................................... 8

1.2.3.LaLHRH .......................................................... 12

.......................................................... 11.1. Produits chimiques 19

......................................................... 11.2. Produits biologiques 19

............................................................... 11.3. Radioactivité 20

11.4- Peptides .................................................................. 20

..................................................................... II .A. La chimie 21

...................................................... IIA.1. lodination du MK-678 21 125 ................................................. llA.2. Synthèse du 1-Hexareline 23 125 ................................................... IIA.3- Synthese du I-Antarelix 24 111 ......................................... Il A.4- Synthèse du [ In-DTPAj-Hexareline 26

............................................... Il A.5- Synthbse du HexarelineB&H 28

llA6- Synthèse du Hexareline-Dextran ............................................. 30 111

11.A.7. Synthèse du In-Antarelix .................................................. 31

. II & La biologie .................................................................... 33 8

11.0.1. Culture ceilulaire ........................................................... 33

11.8.2. Études phamacocinétiques ................................................. 33

11.63 h d e s in vi?u ............................................................ 35

....................................................................... 1I.C.Autres 37

II.C.1. Stockage des fractions purifées par HPLC ..................................... 37

ll.C.2. Stabilité des produits en solution ............................................. 37

III . Résultats ........................................................................ 39

HIA- Etudes chimiques ............................................................. 40

I1IA.1. Purification du MK-678 iodé ................................................ 40

lllA.2. Purification de l't-iexareline i o d ............................................. 41

lllA.3. Purification du I'Antarelù: iodé I'iodogene .................................... 42 I I 1

Ill A.4. Purification de Il[ In-DTPAj-Hexareline ...................................... 44

lllA.5. Purification de I'Hexareline-84H ............................................. 46

Ill A.& Purification de I'Hexareline-Dextran .......................................... 47 11 1

lllA.7. Purification de 1' In-Antareli ............................................... 49

111.8 Études biologiques ............................................................

Ill.B.1. MK-678 iodé .............................................................

lll.B.2. CHexareline iodé .........................................................

11.6.3. L'Antarelix iodé ........................................................... 111 111.8.4. C[ In-DTPAkHexareline ..................................................

Ill B.5. L'Hexareline-58H ........................................................

lIl.B.6. CHexareline-Dextran ......................................................

111 B.7. Liaisons s w q u e s in v& de S Antarelii iodé .................................

............................................................... i1l.G Autres résuilats 74

........................................... III.C.1. Stabilité in viiro de I'Antarelix iodé 74

....................................................................... IV . Discussion

.................................................................... 1V.A- La chimie

.......................................... IVA.1- Chimie de I'iodination des peptides

.................................................... IVA.1 .i ). Le MK-678 iodé

.................................................... IVA.1 .ii ). CHexarelin iodé

..................................................... NA.1 .iii ). CAntarelu: iodé

....................................................... IVA.2- Chimie de chélation

.................................................. IVA.2.i)- CHexarelin-DTPA

.................................................... IVA.2.ii)- CHexarelin-BBH

................................................. IVA.Z.iii)- CHexarelin-Dexban

................................................ IVA.3- Chimie de marquage direct

...................................................... IV.A.3.i)- L'Antarelk-"'ln

...................................................................... IV.& La biologie 85

....................................................... IV.B.1. Pharmacminétique 85

.......................................... IV.B.2. Essais radioimmunologigues (RIA) 87

1~.~.3.6bdesdeliaiçoninvib ................................................... 91

...................................................................... V . Condusion 94

................................................................... VI . Remeraements 95

..................................................................... VI1 . Bibliographie 96

....................................................................... VIII . Annexes 107

............................................................ 1 . Clairances sanguines 107

............................................................... 2 . Feuille de calculs 109

3 . Calcul de l'erreur ............................................................... 110

Liste des illustrations

8

Figure 1 . Schéma de la technique d'imagerie médicale SPECT ................................. 2

Figure 2 . Somatostatine (SS-14) et la p r o ~ o r n a t o ~ n e (SS-28) ................................ 4

Figure 3 . La glande pituitaire antérieure (hypophyse) chez l'humain ............................. 5

Figure 4 . La cascade des réactions activées par l'A ...................................... 6

Figure 5 . Modèles tumoraux ............................................................. 7

Figure 6 . Analogues de SomatDçtaone .................................................... 7

.................................................... Figure 7 . Recepteur hnsmembranaire 8

Figure 8 . La GHRH ................................................................... 9

Figure 9 . Quelques analogues de GHRPs, ainsi que leur effet sur la dose de GH ................. 10

........................................ Figure 10 . C~volution des endorphines a I'Hexareiin 10

..................................................... Figure 1 1 . La gonadohpine (WRH) 13

.................................................................. Figure 12 . CAntareiix 14

Figure 13 . R k t i o n de hode moléculaire dans une solution aqueuse .......................... 21

Figure 14 . Reacüon du MU-678 à l'iode radioactive ......................................... 22

............................................. Figure 1 5 . Réaction de I'Hexarelin B l'iode1 25 23

.............................................. Figure 16 . R6acüon de PAntarelix à l'iode4 25 24

............. Figure 17 . Reaction de I'Hexarelin à radde diethylenefnm'ne pentatacétique (DTPA) 27

Figure 18 . Rbcüons du substrats B&H avec l'iode1 25 ...................................... 29

............................. Figure 19 . La hnçformation du dextran B la f o m liée au peptide 30

.................................... Figure 20 . Marquage directe de I'AntareI'i B l'indium1 11 32

Figure 21 . M6thode elaborée pour les Wdes d'excr6tion chez la souris ........................ 34

............................ Figure 22 . Mbthode d'analyse de chromatographie à couche mince 38

........................................ Figure 23 . HPLC du MK-678 et de ses dérivés iodés 41

figure 24 . HPLC de SHexarelin et de ses Wvés iodeç ...................................... 42 A Figure 25 . HPLC de I'Antarelix iodé ...................................................... 43

Figure 26 . HPLC de I'Hexarelin lié au DTPA ............................................... 44

. Figure 27 Chromatogramme du marquage I'nidium-1 I l du pic 1 élué à 31 minutes ............. 45

. Figure 28 Chromatogramme du marquage a I'Ïndium-111 du pic 2 éiue a 43 m i n a ............. 46

Figure 29 . HPLC de la rbaction de liHexareiin et du W H ..................................... 47

Figure 30 . Séparation sur colonne PD-IO de la réacfion de I'Hexarelin et du Dexlran .............. 48

Figure 31 . HPLC sur colonne C4 deltopa& de I'Antarel'ix marque a l'indium1 11 ................ 49 125

Figure 32 . Biadisbibution du I-MK.678 .................................................. 50 125

Figure 33 . Clakance plasmatique du MK-678 ........................................... 51 12s

Figure 34 . Excrétion du I.MK.678 ....................................................... 52

Figure 35 . L'hérnatmite à la SUL de l'injection du ' *1 -~~-678 ............................... 53 12s . Figure 36 Biodisbibution du CHexareh ................................................. 54

125 . Figure 37 Clairance plasmatique de 1-Hexarelin ......................................... 55 125

. Figure 38 Exa&ion du 1-Hexarelin .................................................... 56

Figure 39 . Variation du niveau de I ' h é m ~ e après incorporation de 1251-~exarelin .............. 57 1 a

Figure 40 . Biodistibvtion du 1-Antareiii ................................................. 57 125

Figure 41 . Clairance plasmatique du 1-Antarelii .......................................... 59 ia

Figure 42 . Excrétion totale du I-Antarelix ................................................ 60 125

Figure 43 . L'hématocrite après injection de I' 1-Antarelix .................................... 60 I l l

Figure 44 . Biodistibution du [ In-DTPA]-Hexarelin ......................................... 61

Figure 45 . Clairance plasmatique du complexe ( " l n ~ ~ ~ ~ ~ - ~ e x a r e l i n ......................... 63 111

Figure 46 . Excrbtion du complexe [ In-DTPAI-Hexarelin .................................... 64

Figure 47 . L'hBrnatocrk apr& injection du dérivé Btiexarelin li6 au DTPA; fraction 1 ............. 64

Figure 48 . RIA des fractions de la rkacüon de I'Hexarelin et du substrats DTPA ................... 66

ir Figure 49 . RIA des fractions de la réaction de I'Hexarelin et du substrats B&H ................... 67

Figure 50 . RIA des fractions de la réaction de IHexarelin et du substrats Dexfran ................. 69

7

$&

Figure 51 . liaison in ~ & 7 de PAntareiix iodé aux cellules EMT-6 à 4 degrés Celsius en suspension . . 70

Figure 52 . Liaison h de PAntareiix iodé aux cellules EMT-6 A 4 degrés Celsius en pétris ...... 70

Figure 53 . Liaison UI vmde I'Antarelix iode aux cenules EMT-6 8 37 degrés Celsius en pétris ..... 71

Figure 54 . Liaison in vm de I'Antarelùc iodé aux cellules EMTô sous différentes conâiions ....... 72 I

Figure 55 . Liaison h mde Phtarelu< iodé aux cellules MCF-7 8 4 de* Celsius en suspension . . 73

Figure 56 . Liaison in Maade PAntareFvc iodé aux cellules MCF-7 à 37 degrés Celsius en pétris ..... 73

Figure 5 ï . Chromatographie sur couche mince P C ) dans le PBS ........................... 74

Tableaux

....................... Tableau 1 . R 6 ç u M numéfiques de la biodistfibution du '251-~~-678 50

....................... Tableau 2 . R6sultats nurnéfiques de la biodiçoibution Hexarelin iodé 54

......................... Tableau 3 . Valeurs numériques de la biodisbibution I'Antareiix iodé 58

............... Tableau 4 . Valeurs numériques de la biodi!&ibution du [ " ' l n - ~ ~ ~ ~ l - ~ e x a r e l i n 62

................................... Tableau 5 . Comparaison des diirents d o s tumoraux 66

..................................................... . TaMeau 6 Clairance sanguine 107

............................................ Tableau 7 . himination sanguine de l'iode 108

iii

a.i.

AMPc

ARN

A T

B&H

BSA

CT

d.i.

DMF

OTPA

ETDA

FSH

GH

GHRH

GnRH

GRlF

Liste des sigles, abréviations et symboles

Après injection

Adénosine monophosphate cydique

Acide ribonud4ique

Adénosine triphosphate

Boiton & Hunter

Bovine serurn alburnin

Computed tomograp hy

Dose injectée

Diméthytbrmamide

Diethyieneûiarnine pentaacetic acid

Eoiylenediarninetetraacetic acîd

Follicule Stimulaüng Homne

Growth H o m n e

Growth HomoneReleasing Homne

GonadotopineReleasing Hormone

Growth HomoneReleasing Fartw (SS)

HBSS HanKs balanced sait solution

HEPES Hydroxyethylpiperazine ethane sulfonic acid

HPLC High Perfomiance üquid Chromabgraphie

IGF-1 Insulin-like Growtti Fador-1

IRM Imagerie par Résonance Magnétique

LH Luteinizing Homne

LHRH Luteinizing HormoneReleasing Hormone

NCS New -bom Calf Serum

PBS Phosphate Bukr Sduüon

RIA Radioimmunoasay

SPECT Single Photon Emission Cornputed Tomography

SS Somatostatine

TEP Tomographie par Emision de Positrons

F A Trifiuoroacetic acid

TLC Thin Layer Chmmabgraphy

TPN Température et Pression Nomaies

Résumé

Différentes hormones peptidïques ont été modiiées afin de développer de nouveaux agents diagnostiques

pour le depistage du cancer. Entre autre, un analogue de la famille des GHRPs, î'Hexareline, a été mdifi8 '

par: lodination directe; par chdation d'un groupement marquaMe A l'iode, le Khydr~xysu~nimidyl p-

hydroxyphénylproprionate (Boiton 8 Hunter); ou par chélation il l'indium grâce a l'acide diethyiénetriamine

pentaacétique (DTPA). De plus un analogue de la LHRH, I'Antareli, a été modM par iodinaüon ou par

liaison &recte à I'indium. Un analogue de la sornatostaüne (SS) le MK-678 a 6îé utilisé comme base

d'apprentissage et comme contr6le. Finalement, I'Hexareline a fait l'objet cfhtudes de liaison au dextran

(Dx); molécule u t W pour le marquage au technétium. Les résultats des divers essais de marquages sont

inwessants avec des rendement de marquage allant de 6% pour I'Hexareline iodé jusqu'8 48% dans le

cas de l'["'ln-DTPAI-Hexardine. Malgré, dans certains cas, de bons rendements chimiques, les résultats

bioiogiques au niveau himoral sont Wdioaes et ne démontrent aucune captation spécifique supérieure A

cdles retrouvées dans les tissus périphériques. Cependant, les .résultats obtenus lors de 1'6tude de

I'Hexarelin-DTPA ont dérnontrb une importante fixation r6naie (près & 20% d.iJg). D'autre part,

I'AnWelix, antagoniste de GnRH, marque 3 l'iodei25, a démontré une forte w o n hypophysaire (185-

400% d.i.\g). Ces analogues peptidiques. dans le contexte de 116tude prhnte, c'est-Mire en

consideration des cellules tumorales utilisées (EMT-6 et MCF-7), sont inapproprk pour le &veloppement

dagents diagnostiques pour le dépistage du cancer. Tamis, si d'auûes types de cellules tumorales

&aient disponibles (des cellules sélectionnées pour leurs récepteurs de GnRH), les résultats pourraient

etre dïirentç. De plus, la fixation renale obtenue lors des etudes phamiacocin~tiques de I'Hexareline li6

au DTPA pourrait faire l'objet d'études plus approfondies.

1. introduction *)!

I La médecine et l'imagerie médicale

Nous sommes ii bpproche du 21e siècle et les sciences médides sont en plein essor. Plusieurs

nouvelles découveîtes ont camWSé la fin du 20e siMe, tek le baiternent du cancer de la moelle

osseuse (Preisk, 1994), la détedon précoce et le traitment du cancer de la pmsîate (Allain et al., 1994,

l'identification de plusieurs gènes responsables de maladies graves, par exemple la fibrose kystique

(Riordan et al, l989), ou de probièmes de santé, comne I'obésiîé (Amer, 1995). En œ qui conceme la

médecine nud&ire, il y a bute la panopiie des novvelies technologies de dagnostique, la IRM (imagefie

par résonance magnbiique), la TEP (bmographie par emisçion de w o n s ) , le CT scan ("X-ray computed

bmography'), l'image& par ultrasons. 15magefïe ppar infmuge, et bien sùr, le SPECT ("single photon

emission computed tomographym) (fig .1).

Rgure 1. Schéma de la technique â'Ïmagerie medcaIe SPECT (Saha, 1992).

Le SPECT exige, contairement au Xiay CT, une source émetbice venant de l'intérieur d'un organisme.

La position de ceüe dernih est inconnue et dol &e retracée a l'aide bun système de détection collimate

dans le but de fournir une direclion aux photons incidents. Cette caméra gamma a la particul& de

fournir des informaüons de &tribution spatio-temporelle connue sous le nom de sanügraphie dynamique.

Cette fom d'imagerie permet aw types de radionudeides utilisés d'exprimer la fonction de l'organe ou du C

L système examine (Ott et al., 1 988).

v Pour que cette dem- technologie dimagerie soit exploitée au maximum, de nomkeux produits

radbphmaceutiques ont vu le jour et de n o a u x le sont quotidiennement Tous ces agents

diagnosüques ont été développés dans un but ulorne, découvrir un moyen de aüer BretXement un site

anormal afin de l'analyser et de l'#miner, si cela se Ruve nécessaire, par les méthodes chinirgides

conventionnelles, ou par des méthdes moins envahissantes tel que le tansport direct de décules

Un grand nombre de chercheurs aspirent a découvrir œ que i'on nomme The Magic Bullet", un moyen

d'atteihdre directement les tissus cancéreux sans pour autant nuire aux tissus sains environnants. C'est le

cas de I'intér& potté sur les peptides porteurs de radio-isotopes.

Paralklernent au mécanisme d'action 'anticorps-anti@nes'. l'utilisation d'un système ligand-récepteur

comme méthode de pour cibler des tissus tumoraux, à l'aide d'hormones ou de séquences peptidiques

porteurs dun radiw'sotope, semble de plus en plus etudié et trbs prometteur. Cette méthode est deja en

pratique en dinique avec l'utilisation de la s ~ m a t o ~ n e (SS), hormone déterminante au processus de

croissance cellulaire (Frohman etal, 1990).

Cette technique m'améne donc introduire mon sujet de maîtrise qui, en fait, est une extension A la

méthode de la SS déja en pratique et qui pourrait s'ajouter aux syst&mes déj8 existants. La somatostatine

est ici utilis& comme base de travail servant de rMrenœ aux &tudes de marquage. Le but de ce travail

est de développer de nouveaux agents peptidiques, racfiomarqués, pour le depistage du cancer. Les effets

physidogiques et métaôoiiques des molécules biologiques utilisées ne sont en aucun temps sous

investigations.

7 Les Hormones *&

Afin d'appuyer le dioix de ces andogues peptidiques homionaux s u tout autre type de séquences

pepfidiques, 1 est knp&aüf de awinaitre les liens et les effets qu'ont ces molécules sur l'organisme. *

Certaines cara&Mques physiques et adogques, par exemple, des structures plus stabies b v h et

des effets anohimwc, vdident davantage le choix de ces peptides. C'est dans l'optique de créer une

bonne fondation au &aval de recherche que les andogues 6tudiés, ainsi que leurs fanilles, sont déaits en

profondeur.

figure 2. Sequence de la SOmafostatine cher les mammifères (-14) et de la prosomatostatine (SS-28) (Hadey, 1992).

Les hormones font partie intégrante de la machine vivante et sont essentielles a son bon fonctionnement

ales sont les messagères qui portent une nouvelle dadon, ou d'inaction, a un endroit bien spécifique du

corps. En 1978, Guillemin et ses coll&ues ont été ies premiers B decouvrir et rapporter la structure de la

çornatostatine (SS), hormone inhibitrice de croissance, aussi connue sous le nom de GRlF (Growth

t Homwne-Releasinplnhibiüng Fador). La SS, maintenant bien connue et bien caractérisée, possede une

L structure circulaire longue de 14 (SS-14) ou de 28 (SS28) acides amines (Bakker et al., 1992; Hadley,

t

.& 1992) (fig. 2). Synthétisée et sécrébée au niveau de l'hypothdmus (fig. 3), d e agit sur la glande pituitaire

antérieure afin d'inhiber la sécrétion de SOmadOfrOpine (hormones de (Bakker ef al, 1992). De

nos jours, nous savons que la SS et ies deiivés peptidiques de la SS sont retrouvés dans d'autres régiuns

du caveau, tels que le gangiïïn de la base @asal ganglia), le cervelet, et les régions limbiques OB elle a #

une implication sur I'expmsbn des h m t k e s , ainsÎ que sur b processus de la mémoire et de

i'apprentissage. On la retrouve aussi ailieurs dans I'wganisme. telies que la voie gastro-intestinale, la

moelle 6pini&e et le pancréas (spéaf~quement dans les cetlules-D des ilotç paméatiques (Bakker. 1992)

où elle inhibe la sécrétion de nombreuses homnes induant le giucagon et l'insuline (Reisine etal, 1990).

F i 3. Schémâ de h glande pituitaire antérieufe @ypqhpe) et de i'hypothalamus chez l'humain (Hadey, 1992).

La SS, par l'entremise de récepteurs transmembranaires, agit de façon à inactiver le mécanisme du

çecond messager (Weckbecker et al, 1993). Ce dernier (fg. 4) est défini par une cascade de r6acüons

cellulaires normalement déâemhée par l'interaction d'une homione dadivation et de son récepteur. Dans

le cas d'une activalMn, I'adenyl cydase se dédendie et, en présence d'ions & magnésium, transfomie

l'adénosine triphosphate (ATP) en 31-5' adénosine monophosphate cydique (AMPc) (Sûyer, 1988).

CAivlPc est la def qui met en branle toute une série de réactions afin de provoquer la sécr6tion de

plusieurs hormones, entre aube, la GH (Growth Hormone) (Reisine et al., 1 990). La GH (çomaWopine)

r est un polypeptide long de 191 acide aminés et ses effets d'origine hypophysaire, sont caractérisés par

k une stimulation de la captation cFaci*des aminés par les cellules touchées et par une stimulation de la

7 production hépatique de IGF-1 (Insulin-fike Growth Factor-1), qui B son tour, cause la des os et *&

des muscles (Damell et al. 1990).

F v 4. Schéma de la cascade des réactions acovées par i'AhtiPc. lkhrnent chToc1o(ogique représenté de A a D.

Les tissus cancéreux sont caractérisés par une croissance cellulaire non contrdée. L'utilisation des

peptides pour le diagnostic eVou pour le traitement de certains cancers est très intéressant dans deux

situations diff6rentes: pour des tumeurs syn#&isant et W4tant des quant&% excessives de ces peptides

(A); et pour des tumeurs qui posedent une grande densité de récepteun s m q u e s pour un peptide

particulier (6) (Reubi, 1993) (fig. 5). Ce dernier est dun autant plus grand intérêt parce que cette

augrnenbüon de la concentration des récepteurs favorise une meilleure cktecüon des tissus tumoraux par

p le marquage radioactif d'une hormone ou d'un de ses analogues. Plusieurs cancers (du sein, de la 4.

A prostate, du panaéas, etc.) sont tr& bien diagnostiqués grâce la somatostaone (SS14. SS28) et

surtout @ce a ses anmues beaucoup plus pefirs et beaucoup plus puissants. Ces analogues sont en

grande quantite et ils sont très v a . On y retrouve, ente aube, le BIM 23014 (Somatulin), le RG16O

(Vapreotide), le MK-678 (Seglebde, non présenté a h figure 6) et bien sOr, i'M& (Sandostatin) #

(Prbvost elal., 1992; Vamum etal, 1994; Schdly ef al., 1988; Reisine etal, 1990; Lambeits elaL, 1990;

Weckbedcer e f d , 1992) (fig.6). Ces dérivés de la SS peuvent être modMs de plusieus façons afin de

convenir aux besoins recMch&, imagerie statique ou dynamique, exaéoon hépatique ou rende (Moreîü

et al., 1991) et même a des fins thérapeutiques (Krenning el al.. 1994a). Leurs caracbkistiques

avantageuses sur la SS natutelie sont 1) une inhibition plus puissante de GH; 2) une demi-vie sanguine

plus longue, causant des e f W inhibiteurs prdongés sur les organes abies; 3) une activité vétifiée apres

injection sous-cutanée; 4) aucun rebond d'hypers&&ion aprb leur adrninisûâtion (Lwibertç et al, 1990).

F m 5. MOdfjle hnmral hypersynttiefi'sant et hypersécrétant (A) et à grande deosite de c8aplsub (8) (Rabi, 1993).

Octrsotlde (SMS 201-895) (Sondo -na)

BIM 23014

R g m 6. Stmcture des différents analogues de somatostatine (Weckbecker etal, 1993).

f Il est dair que finté& porté sur la SS est pn* r tc imnt lié Ee sa cqm%é capaaté agent diagnostique et -Ir

thérapeutique. k n t une homwine r e l i i la croissance dulaire, une quantité impoctante de cancer (du

sein, de la prosta(e, de l'hypophyse, du panaéas, etc.) peuvent êüe d&ctés (Krenning et al, 1994b;

Reubi et al, 199%; Schaily, 1988; Macaulay, 1992). LWrWide est le plus souvent utiIÎ dO ses

pmpM& biologiques et de son sua& dinique (Bakker et ai. 1991). Afin de me fmiiariser au travail en

laboratoirel un andogue de la somaWaüne. le MK-678, a 6té u h l i i pour des ehides ~ ~ u c ü o n aux

techniques de recherche.

2. La GHRH

n n n

1 r - r i r - 1 1

La SS n'est pas la seule gérer la régulation & la croissance cellulaire. Sa compéülrice, la GHRH

(Growth Homone Releasi'ng Homione) ou Çomatdiberine, synthétisée et Secr6tée au niveau de

Ifhypothalarnusl voyage par la Mie hypottiafamo-hpophysaire et gère la çéa6tion @hormone de

croissance au niveau de la glande pituitaire antérieure par un s e m e ligand-réceptew presque identique

à celui de la SS (fig. 4). Son mécanisme d'action implique la stimulation de la transcription de I'ARN

messager (ARNm) et de la sécr&ion de la GH (ilorner et al, 1 %O), par le biais de i'augmentaoon de la

concentration des AMPc lors de l'interaction de la GHRH et de son récepteur (Lewin et al, 1983; Hadley,

1992) (fig. 7). Cependant, la sécrétion de la GH suMent seulement lorsqu'il y a retrait de la sécr6tion v

% hypothalamique de la SS momer etal, 1990). La GHRH est une homione qui contient 44 acides aminés

(fig. 8) et sert principalement à séa&r les GH lorsqu'elles wnt déficientes (Veliçeiebi et al. 1986; Vance, 7

'& 1990).

Fgure 8, Structure secoridaire et &queme des aminés de la GHRH (Hadey, 1992).

D'autre part, un groupe de peptide bien particulier possède des propriétés sembiabies B celles que

possèdent la GHRH. Ces polypeptides sont les endorphines. C'est en 1975 que John Hughes et ses

collègues isolèrent, la méthionineenkephaiine et la leudneenkephaline B partir de 630000 hypothalamus

de porc (Wieland et Bodanszky, 1991; Stryer, 1988). Un an plus tard, Guillemin et ses collégues isoltirent

des peptides plus longs. les endorphines, du lobe intermédiaire de la glande pituitaire (Guillemin, 1978;

Sûyer, 1988). &nt indspensables au syst&ne nerveux, les endorphines sont les neuroregulateurs de la

douleur perçue par l'organisme. Ils agissent au niveau des nodcepteurs (récepteurs opiacés) en tant

qu'hormone analgésique (Olson et al., 1989). Toutefoii, un aspect bien distinct les caractérise. Leur

système baetjon est jumelé paraildement au système endoainien de la GHRH, c'estadire, l'action des

endorphines A leurs récepteun déâenche une sécr6tion d'hormones de croissance parallde à celle &$à

connue de la GHRH (Bowers et ai, 1980).

Plusieurs chercheurs se sont penchés sur la question pour essayer d'optimiser la sécreion de GH par le

biais des noc'cepteurs en y omettant les effets secondaires bien connues, retrouvés lors de l'usage de

produits de la même famille des endorphines; morphine, Hroïne, opium (Katzung, 1995). C'est en 1977

que les premiers peptiâes de la série &s GHRPs (Growth HormoneReleasing Peptides) (Bowers et al,

r 1980) ont 6té découverts; quelques uns sont listés a la figure 9 (gracieuseté BEuropeptide, Argenteuil, \

7 France). II sont bus des deiiveç du perhpeptide Metenkep halines (fig. 1 0) ( R o m et al. 1 977; Bowers 4

et al, 1980), ils sont depouvus 8-vité opiacée, I s n'ont aucune relation A la GHRH dais leur séquence

pepüdique (Maccario et al., 1995; Korbonib et al, 1995) et pourtant iis agissent au nivaau des cdules

hypophysar'res alin d'en acliver la séaétion de GH (Bowers etd, 1991). Ce n'est que arts plus tard

qu'un analogue beaucoup plus efficace (mille fois plus niportant l'hypothdamus et a l'hypophyse, que la '

ûose S.C. GH (nglml) moy. Andogue f SEM (a 20 min.)

300 mgkg 127.0 f 18.6 His-û-Trp-Ala-Trp-D-P he-Lys-NH2 (GHRP-6) 300 mgkg 163.5 f 21.5 His-B2-Me-Trp-Aia-TpD-P he-Lys-NH2

(Hexareli n) 300 mgkg 9.0 t 2.3 His-Ala-PTpaa-2Me-TpD-P he- Lys-NH2 300 mgn<!J 60.8 21.6 His-D-TpAlâ-24e-TpD-Phe-Lys-NH2 300 mgkg 21.6 9.5 Hiç-D-TpA1~2Me-Trp.BPhe-Ai).LysNH2

Fgwe 9. Tableau de quelques analogues de GHRPs, ainsi que leur effet sur la &se de GH (Europeptides, Argenteuil, France).

Figure 10. Cheminement simplifié de I'évduücm des endorphines I ' H d i n .

*t Plusieurs hypothéçes sur le fonâionnement du système GHf?P-GH ont & &mises: une interaction

indépendante des -un de la GHRH, de la SS, et des récepteurs opiacés (Bowers etal, 1980; Anrat

et al, 1995; Maccario et al, 1995; Guillaume et al , 1994; Bowerr, 1991 ; Cheng et al , 1989; Conley et ai,

1995; Arvat et a l , 1994), une fonction antagoniste au système de h SS (Thorner et al, 1990; Guillaume et #

al, 1994; Conley et al, 1995), un effet non seulement B la glande pituitare antérieure. mais aussi A

l'hypothdamus (Thomer et al, 1990; Codd et a/.. 1989; ANat et al, 1995; Conley et al, 1995), une

axessibilii a des sources de GH différentes de celle de la GHRH (Cheng efa l , 1989). ou la sécféüon

d'un f'acteur hypothalamique inconnu capable d'inkragir avec la GHRH (Bowers et al, 1991).

Maigre la quantité importante d'&des faites sur le sujet et les nombreuses hypothèses drfférentes ou

contradictoires, le mécanisme d''action des GHRPs sur la sécr6tion de somatotropine n'est toujours pas

elucide. Neanmoins, plusieurs nouveaux indices semblent diriger les recherches vers des réponses plus

daires Ce qui laisse croire que les GHRPs agissent par un mécanisme distinct de celui de la GHRH, est

1) i'efFet synergique sur la Séa6lion de GH lorsqu'une désensibilisation a l'un des deux types â'homne

est ekcbke au préaiable (Bowers etal , 1991 et 1993); 2) contrairement a la GHRH, les GHRPs sécr&nt

les GH via un mécanisme calaumdépendant et AMPoindépendant (Cheng et a l , 1 Ç89; Lewin ela/., 1983;

ûower et al, 1991; Conley et al, 1995), probabîement gM par le mécanisme de la progine kinase C (Lei

etal , 1994); 3) que l'activité inhibitrice sur la sécr6tion de GH par le fadeur de croissance IGF-1 ne peut

&re prévenu par les GHRPs étant dom& que la concentration de FIGF-1 dans le sérum n'augmente que

seulement plusieurs heures ap& stimulation & la GH, contrairement a la synergie GHRP-GHRH qui elle

est rapide (Bowers ef al. 1991); 4) I'inefficaciîé du Ndoxone (antagoniste opiacé) sur la sécr6tion de GH

par les GHWs (Korbonits etal , 1995).

Cependant, de nouveiles études tendent a démontrer que malgré les preuves appuyant l'acceptation d'un

modèle bacüon Bsünd des GHRPs vis-à-vis la GHRH, les GHRPs emprunteraient maigre tout, du moins

en partie, le mécanisme de la GHRH (Conley et al, 1995). L'expression du @ne Ibs (Dicison ef ai, 1993;

Guillaume et al, 1994), les sites spécifiques de liaison de la GHRP-6 l'hypothalamus (Dickçon et a/,

-L 1993; Codd etal, 1989) et Ipugrnenta(ion de I'activibé neumtique dune populaîbn de neurones arcifwmes

reconnues awmie étant des cellules contenant des GRF (ûowth Homione Releasing Factor) @ i i n et

al., 1993; Guillaume e l al., 1994) sont des indices qui, jusqu'a ce pur, appuient I'hypothese dune

interrelation des GHRPs et de la GHRH, #

Dans la grande famille des GHRPs, un nouvel analogue vient accroître l'intérêt déja très grand sur ces

nouveaux sécrétagogues (hormones activant la &&ion d'autres homiones). CHexareline, anabgue de

la GHRP-6. lui ressemble &rangement par sa structure (fig. 9 et 10) et possède les mêmes

caradéristiques physiologiques et davantages. Elle est deux fois plus efficace dans sa fonction sécrétoire

de GH, elle est chimiquement (Cella et al., 1 995; Anrat et d, 1994) et biologiquement (Cella et a/., 1995)

plus stable in vivoet elle poséde une plus grande endurance aux radiations. que la GHRP-6 (Deghenghi

etal., 1994). L'Hexareline possède une activité superposable B celle de la GHRP-ô avec un effet soutenu

qui se traduit en une puissance accrue waisemMablement due à son caractère plus lipophilique (Cella et

al., 1995; Conley et al., 1995; Deghenghi et al., 1994) et aux avantages chimiques et biologiques ates a-

haut CHexareIine est présentement en essai dinique (Laron et al., 1994; Cella et al., 1995; Arvat et al.,

1 994; Arvat et al., 1 995; Maccario et a/, 1 995) et se trouve eîre un modèle tr6s interessant pour devenir un

agent d7magerie médicale paralMe aux anaiogues de la SS.

3. La LHRH

Par ailleurs, une aufre hormone qui représente une grande partie de ce mémoire, a été &di&; I'Antareli

(un analogue antagoniste de la LHRH; Luteinizing Homne Releasing Homne). La LHRH est une

homione gonadotope de l'hypothalamus indispensable au développement sexuel #un individu. Elle est

I'homne contrdlant la sécr&ion de la LH (Luteinizing Homne) et de FSH (Follicule Stimulating

Homne) au niveau de la glande pi tu i re antérieure, qui leur tour gèrent l'activité hotmonale des

gonades (Davidson et al, 1994; Weinbauer et Nieschlag, 1992). La LH est une homne agissant sur les I

cellules de Leydig responsabies de la syn thh et de la &&ion de la testostérone et du fait de la

d fomiaoon deç spemabmïdes chez l'homme, et sur les développement des cellules luMnes qui

synthétisent et sécrétent la pmgest6rone et I'estrc@ne, chez la femne. La FSH, de son côté, aide au

dévdoppement des spemi~zoÏdes par la sécr6tion &sîrogène chez i'homne et au dévdoppement du

fdlicule et a épanouissement des ovins, chez la femme (Guyton, 1987; Hsueh et al, 1985). La LHRH est

donc indirectment responsable du dévefoppement des mact&üqueç secondgres retrouvées chez

I?ndividu, développement des seins, élargissement des hanches, etc., chez la femme, et de la pilosité, de

la musculature, etc., chez I'homrne. Ceüe pro@& est très intéesante car plusieurs tissus possèdent

des récepkurs pour ce& hormone et peuvent être ciblés si un cancer s'y développe.

C'est au début des années 1970 que Burgus et ses call&gues, ainsi que Matsuo et ses colkgues, ont

séquencé le décapeptide qu'est la LHRH (fig. 11). Une serie d'analogues ont été synth6tisé.s pour mieux

optimiser leurs réponses biologiques ou pour mieux profiter d'un phbnoméne etcou mieux se débarrasser

d'un autre. Plus de 3MW) de ces analogues ont W testés (Weinbauer et Niescf~lag, 1992) et leurs sites

a& identifiés. Les acides amin& les plus importants sont ceux en posiüons 1, 2 et 3 qui possédent

l'activité de sécr&ion homionale et ceux en positions 6 et 10 qui sont responsables de la liaison aux

P récepteurs (Schally et Coy, 1983; Sandow et Kbnig, 1979). D'autres sites acofç t r s impoitants, ceux de

$1 divage endopeptidasique et de sont retrouvés en position 5-6 et 910 de la moiécule (Carone

et al., 1987).

Le bui de ces synthéses massives @andogues est @opti&er et Craqdi(iner certaines réponses

biologiques dédencheeç par l'hormone naturelle. Certains changements specitiques faits à la molécule

naturelie causent dflérentes réponses bidogques lon 6études phamacokgiqueç. P a exemple,

18utilisaüon &cides amines-[) (pius hydrophobes) accentue horWrent I'aclivité des antaçonistes de la

WRH probablement par l'augmentation de la stablii et de la &&am à la degadaoon enzymatique

(Fiouret etaL, 1984; Deghenghi etal.. 1993); la subsatulion speafique en position 6 par un acide mh&D

basique augmnie largement l'activité antiovulatoire (Coy el al., 1982). mais aussi cause un effet

secondaire caractérise par une SécrMon importante d'histamine (Sharoni etal, 1989).

De nouveaux moyens sont &di& pour améliorer I'efbcité du traitement 1 ) soit en faisant une

combinaison de deux traitements, c'est-Mire un agoniste, ou un antagoniste, avec un radiai cytotoxique

(agent chimioth6rapub'que) (Schdly et al, 1990; Szende et al, 1990a; Szende et d, 1990b; Bajusz et d,

1989a), ou 2) par l'utilisation des deux types hormonaux; Sagoni* de la LHRH pour la désensibilisation et

l'analogue de la somatusMine c o r n inhibiteur de aoissance (Schdl y et al., 1 9%; Schall y et Redding ,

1987; Szende etal., 1989). Ou tout simplement en remplaçant les agonistes par les antagonistes.

Figure 12. Çequence de l'analogue antagoniste de la LHRH; I'Antare(0c

Chez les antagonie de la LHRH, les acides m * W sont utilisés en positions 1 é 3 a n de supprimer

I'effet adogique de Séçrbtion caracMsüque de ces positions pour fa LHRH native, et en position 6 et 10

pour la liaison speafique aux récepteurs de WRH, ainsi que diminuer au maximum la

dégradation pepüdique (Weinbauer et N i i l a g , 1992). Dans le cas des produits les plus récents, ,

induant i'Antardix, les modifications suivantes sont retrouvées: I'aade aminé acetyi-DnaphthyCdanine en

position 1, Dchîorophenylalanine en position 2, Opfldylaianine ou D-tfyptophan en position 3, et D

alanine en posioon 10 (Wein bauer et Nieschlag, 1992) (fg. 12).

Les antagonistes sont la nouvelle généraüon bandogues etudiés qui maintenant sembient plus

intéressants que leurs pr&iécewurs les agonistes. II est dair, aujourd'hui, que la présence chronique

d'un agoniste de la LHRH se tradul par une r6ponse de désensibilisaüon pharmacologique qui résulte en

une déficience âes homiones sexudles StéroTdiennes (Sharoni et al., 1989). Ce phénomène est

techniquement appel4 'castration chimiquement induite' (Schally et al, 1987). Cette d6sensibilisation est

caractérisée par un nombre de mécanismes: diminuhn & l'expression des récepteurs gonadotropiques,

modulation @autres protéines telles que les protéines G, les phospholipases C, les protéines kinases C,

épuisement des réserves de gonadotropines sécrétaMes, et &ration des r o d i o n s post-

transaipfionnelles des gonadotropines résultant dune perte d'activité biologique (Davidson et al. 1994).

Cet effet est @autant plus intéressant, &nt donne qu'une grande quantité de cancers sont &éteurs

d'hormones sexuelles stéroïdiennes (LH, FSH) ou possbdent des récepteurs gonadotropes (ex: cancer du

sein, gastrique, dorectal, pana6atique, du poumon, de la prodate, et les himeurs œ~cales)

(Weckbecker et al, 1993). Ces caracMstiques tumordes sont donc exploitables et ouvrent la voie a des

mé#Odes, non seulement diagnostiques, mais aussi thérapeutiques.

II est demontr6 que l'antagoniste, en se logeant et en demeurant dans le site actif du récepteur, peut être

d'une plus grande uül i que l'agonie. L'antagoniste est un analogue qui, une fois logé dans le site acof

du récepteur, ne déclenche pas la cascade de réactions jumek à ce dernier. II a donc les avantages de

ne pas causer une hausse temporaire non désir& des hormones sexuelles stéroidiennes retrouvées lors

? I et al, 1990; Davidson et al., 1994; Habenitch etal, 1990; Szepshazi et al., 1991; Foekens et al, 1992),

mammaires (Shmni et aL, 1989; Davidson et al, 1994; S m & et al, 1990a; Reissmann et al. 1992;

Sandow et al, 1990; Miller et al, 1985; €idne et al, 1985; Bdne et al, 1987; Vincze et al, 1991 ; Segaf-

Abamson et al, 1 W), pancréatique (Szende et al, 1 W b ) . Cependant, i'efficaitk de l'antagoniste varie ,

beaucoup enlre chaque type de souche himorde et varie &mrmémnt dans le cas des tumeurs

mammaires. Une inhibioon de seulement 20% dlant jusqu'à 84% de la croissance tumorde chez les

souches du cancer du sein est obtenue avec i'uülisaüon d'un antagoniste de la LHRH (Schaily et al, 1990).

Comme menüonnb plus tôt, il est important de connailre les mécanismes d'action de ces molécules afin

#exploiter au maximum leurs potentiels diagnostiques. Ces systèmes sont absolument nécessaires A

l'élaboration de traceurs ontologiques, mais ne feront toutefois i'objet $aucune étude pharmacologique.

Seulement les p d u b modifiés seront investigués pour leurs carac&es diagnostiques.

Cest dans l'optique de déveiopper de nouveaux agents d'imagerie plus speafiques aux tissus anormaux

de l'organisme, tout en profitant des effeb anüturnoraux des analogues, que ce projet prit forme.

J'essaieraî donc d'analyser plusieurs methodeç de marquage et @en &der les effets in vm et in vivo,

afin de déterminer l'utilisation potentielle de ces produits chez l'humain pour le &pistage du cancer.

L II. Matériel et Méthodes

11. Matériel et Méthodes

1. Froduits chimiques

#

Les produits chimiques (salvents, sels, poudres, a.) utilisés proviennent de chez Aldich (Milwaukee, Wi,

USA), i'albumine bovine, sous brme de BÇA provient de chez Sigma (St-Louis. MO, USA), Irodogène de

chez Pierce ( R m r d , IL, USA) et l'azote provient de chez Praxair (Mississauga, Ontano, Canada). Le

rnM de laboratoire tel les tubes de ôorosiliœ proviennent de chez Fisher (Piburg, PA, USA), les

eppendorfs de chez Falcon (Becton Dickinson Labware, NJ, USA) et les tips de chez Sarstedt (St-Laurent,

Quebec, Canada). Le sy&me dandyse utilisé est un chromatographe liquide de haute résolution (HPLC)

Varian 5000 LC, avec une colonne à phase renversée Cl8 delta-pack sphbrique contenant de particules

de 15 prn parsemées de pores d'un diamètre moyen de 300 A, de chez Waters (Milfixd, MA, USA), ou G

18 a phase renversée, Ultrasphere ODS, 5 pm de chez Bedunan (Mississauga, Ontario, Canada). Un

détecteur variable uttrô-violet et visible Shimadzu SPDôAV. Une table graphique a double crayon Varian

Mode1 1200.

2. Produits biologiques

Les produits chimiques utilis6s pour les tampons et les milieux de culture cellulaire, Waymouth et MEM,

proviennent de chez GlBCO (Burlington, Ontario, Canada). Les souris et les rats utilisés sont

respectivement des souris d e s BalblC de 209 et des rats femelles Fisher de 150 g pravennant de chez

Charles River Breeding Labs (Montrhl, Qubbec, Canada). Les cellules tumorales 6tudibs sont les EMTô

(lignée expehentale mammaire) fournies par C.W. Lin de Massachusetts General Hospita (Boston, USA),

les cellules MAC (adénocarcinome mammaire) du Dr. Bogden a la Banque Tumorale de I'lnçoM de

Recherche Mason (Worcester, Massachusetts, USA) et îes MCF-7 (lign& humaine mammaire) de chez

ATCC (Rodonlle, Maryland, USA). Les P6Ss p-60, les flacons T-175, les tubes culture et les seringues

sont des produits Falcon qui proviennent de chez Bedon Dickinson (Mississauga, Ontario, Canada), ou de

chez Sarstedt (Newton, N.C., USA). Des micropipettes de 50, 200 et 1000 Gilson pipetman de chez

Mandel (Lachine, Q ~ é b e ~ , Canada). Un homogénéisateor Dounce de chez Wheabn Çaenüfïc (Millvilfe,

NJ, USA). Un incubateur Forma Saentific (Montréai, Québec, Canada). Une hotte Nuaire (Plymouth, MN,

USA). Une centrifugeuse f3echan (Pab A b , CA, USA), une centriQmse Baxter Varifuge ,

centrifugeuse eppendorf Cenlrhge 5415C (Mississauga. Ontario, Canada). Une ultracentrifugeuse

Sorvd (Newtown, Connecticut, USA). Un mpteur gamma Wallac (Turku, Finland). Des capillaires

Dnimmond (Broomdl, PA, USA). De IHdothanefluothane de chez VVjetbAyerçt (Montrbl, Canada). Un

étui ii dissection.

3. Radioactivité

L'iode radioactive-125, sous forme d'iodure de sodium (~a1251), provient de chez Amersham (Oakville,

Ontario, Canada), tandis que l'iode1 ll (~a1311) et l'indium1 1 1 (l 1 ln) provient de chez NEN Dupont

(PointeClaire, QuBbec, Canada). Le détecteur radioactif, un compteur à puits ;l crystaux de Nal(Tl) jumek

analyseur simplecanal, Ortec 449-2, débiûnètre 'loglin' a fenêtre muitiple. jumelé au HPLC, est dune

conception locale. Le compteur gamma (g) est un cornpugamma LKB WALiAC 1282.

4. Peptides

l'analogue de la çomatostaüne, le MKô78, provient de chez Merck-Frosst (KiiWand, Quebec, Canada),

tandis que I'Hexarelin, un GHRP, et l'AntareIix, un analogue de la LHRH, sont une gracieuseté

dEuropeptide (Argenteuil, France).

L IIA La Chimie

Lkdinaüon se produit par l'oxydation @un groupement aromatique qui s'effectue par un agent oxydant, tel

la chloramineT (N-chloro-ptoIu6!nesulfonamide) ou Iliodogène (1,3,4,6-Te~achloro-3a-6it-

diphenyiglycoluffl), capturant ainsi un atome d'hydrogéne. Cette depouille laisse sur le groupement

cydique une charge positive venant dune défiaence 6lecfronique. Le Nal, dans la solution environnante,

subit le même sort et f o m de l'iode moléculaire (12) Cette f o m moléculaire d'iode, en solution aqueuse,

est en dquilibre avec une autre f m appelée iode hydratb (H2017 (fig. 13) qui peut aussi rbagir avec le

groupement phényl able oxydé pour donner lbdination recherchee. Au point de vue des acides amin&, le

substrat aromatique est le plus souvent la tyrosine, mais Iliodination peut se faire aussi sur l'histidine, la

ûyptophane, la cystéine et la méthionine (Alexander et al., 1973).

Figure 13. Fornitde de la M o n de l'iode mdéudaim dans une soiution aqueuse. .

Figure 14. Stnicture et réaction & MK478 a l'iode radoacüve en pr6senœ dm agent oxydant (ChIoramine-T).

B. Technique

A une solution de MK-678 (26 pg, 0.03 pmole) dans 26 pl #eau a et6 ajouté de la chlorarnine-T (64 pg,

0.28 pmde) dans 6.4 pl d'eau, un tampon phosphate pH 7.5 1M (1 0 pl) et de l'iodure1 25 de sodium (500

di) dans 25 pl d'eau pH 9. La solution a été brassée pendant 10 minutes B 25 C et ensuite arrêtée avec

1 mg (4 pmole) de thiosulfate de sodium dans 100 pl d'eau. Ensuite, la W r e a &té injectée dans un

HPLC (G18, Ultrasphère ODS, 5 pm, Bedonan). et Quée à 1 ml par minute avec de l'eau (0.05% F A )

(SOM) et de I'acétonibiie (0.05% F A ) (s0î.B) avec le gradient suivant 0-1 0 min. (1 00% sol A), 10-40 min.

(gradient), 40 min. et plus (100% so1.B). Le &tecteur U.V. a été ajusté pour déteder a 279 nm a une

amplitude de 0.02 a&, et le détecteur radioactif, pour une détection éner@tique du ~ a l z l de 35 KeV B

une intensité de 3x103. Les deux détedeun donne leur détedion sur une table graphique il deux traceurs.

L'analogue marque a été collecté, Bvaporé sous un jet damte et dilue dans un volume p r e s (tout

dépendant des besoins de i'6tude) de PBS @H 7.4) (pour ies besoins donnés d'une étude) et trois

I échantillons de 1 % de la solution ont 4% comptés par un compteur a ça'nüllation. C

n.A.2 Synthèse de L'Hexareh iodé

A. Principe

(voir I I A l )

Figure 15. Sûucture et réactian de i'l-iexareline à l'iode125 en préçence cfun agent oxydant; b chiofamine-T.

B. Technique

A une solution d'Hexarelin (26 pg, 0.03 pmole) dans 26 pl d'eau a 6té ajout4 de la chloramine-T (64 pg,

0.28 pmole) dans 6.4 pl d'eau, un tampon phosphate pH 7.5 1M (10 pl) et de l'iodure1 25 de sodium (500

p pCi) dans 25 pl d'eau pH 9. La solution a &té brassée pendant 10 minutes A 25 ' C, et ensuite arr6té avec L

1 mg (4 prnde) de thiosulfate de sodium dans 100 pl d'eau. Ensuite, la mixture a W injectée dans un

L HPLC (G18, Ultrasphère ODS, 5 pm, Bedunan), et Uuée A 1 ml par minute avec de i'eau (0.05% TFA)

(soi A) et de P&nitriie (0.05% T A ) (soi.0) avec le gradient suivant 0-1 0 min. (1 00% sol A), 1 OaO min.

(gradient), 40 min. et plus (100% so1.B). Le déteckur U.V. a été ajusté pour détecter B 279 nm, et le

détedeur radioactif, pour une débection énergétique du Nalzl de 35 kev. Les deux détecteurs ont donne

leur détedion s u une table graphique B deux traceurs. Les pics radioactifs du& 30.4 et 312 minutes

ont éhé coilW, 6vaporés sous un jet @azote, et dii& dans 2 ml de PBS pH 7.4 et cies échantillons, en

kiplicata, de 1 % de la solution ont W compt& a raide &un compteur a çcihüilaüon.

KA. 3 Synthèse de Yhbrelix iodé

(voir section IlA.1)

1 Agent oxydant

Figure 16. Structure et réaction de i'hkrdiv: a l'iode425 en présenœ dun agent oxydant; I ' iodogb ou la chIoramine-T.

.; B. Technique

A une solution d'Antarelix (44 pg, 0.03 m e ) dans 44 pl d'eau a été ajo- de la chl0~amine-T (64 pg,

0.28 prnole) dans 6.4 pl d'eau, un tampon phosphate pH 7.5 1 M (1 0 pl) et de l'iodure 125 de sodium (500

pCi) dans 25 pl d'eau pH 9. La solution a été brassée pendant 10 niinutes 25 ' C, et ensuite arrQtée

avec 1 mg (4 pmole) de thiosulfate de sodium dans 100 pl d'eau. Ensuite, la mixture a été injectée dans

un HPLC (G18, Ulbaçphere ODS, 5 Pm, BedoMn) et du& à 1 ml par minute avec de l'eau (0.05% F A )

(solA) et de I'acétonitrife (0.05% F A ) (s0I.B) avec le gradient suivant: 0-10 min. (100% wlA), 1040 min.

(gradient), 40 min. et plus (100% sd.B). Le détecteur U.V. a 6% ajusté pour détecter a 267 nm et le

détecteur radioactif, pour une détection energétique du Nalzl de 35 keV. Les deux détecteurs ont donnd

leurs détections sur une tabie graphique $I deux traceurs. Le ~a1*=1 a W &Id a 2.6 min., la chloramineT

à 2.0 min., ItAntarelix seul B 26.8 min. et I'Antarelix marqué à 32.4 min. Ces derniers pics ont eté collectés,

évaporés sous un jet d'air et dilués dans 2 ml de PBS pH 7.4 et trois échantillons de 1 % de la solution ont

été comptés avec un compteur scintillation. Le rendement a et& de 21% (104 pCi).

ii) lodogène

Dans des tubes eppendorf, 1 ml dune solution de 1 rnglml d%do$ne (1,2,4,6-tetrachloro-3~,6adiphenyl

glycduril) dans du chlorofwme a W agitée vigoureusement et le chloroforme Bvaporé sous un jet cfamte.

Dans un tube recouvert d'une mince couche de l'agent oxydant, une solution (60 pl) @eau et de tampon

phosphate 1M (pH - 7.5) (vlv) contenant I'AnWlix (30 pg, 0.02 vmole) et de l'iodure125 de sodium (500

pCi) dans 30 pl d'eau pH 9, ont été ajout&. La sdulion a été brassée pendant 10 minutes B 25 'C. La

mixture a 6té injectée dans un HPLC et éiuée $I -1 ml par rninute avec de l'eau (0.05% TFA) (SOM) et de

I'acétonibile (0.05% F A ) (çd.6) avec le gradient suivant de 25 à 40% de la so1.B sur 60 minutes. Le

détecteur U.V. a et6 ajusté pour &&ter 230 nm et ce signal a W enregistré sur une taMe graphique. De

t

, plus, pour bien isoler chaque produit, des madllons de 0.5 ml ont été cdlectés à intervalles de 30

secondes. Les fiaxions ont ensuite W lues sur un spedmphotomèfre pour une détection U.V. B 280 nm

(longueur d'onde d'absorption maximale de la phényidanine), et des manollons de ces fractions ont et& comptés en ûiplicata B l'aide Bun compteur B scintülations. Le pic majeur Qu4 à 47.5 minutes a W ,

cdlecté, 6vapor6 sous un jet d'azote (aprés addition de 100 pl de P H ) , et garde a 4 'C sous forme de sel.

Avant uülisaüon. le produit a été dissout dans un volume connu d'eau, et trois échantillons de 1 % de la

solution ont été comptes avec un compteur 8 scintillation.

Cade di6thylénetriaminepentaacétique (DTPA) sert de ch6lateur à IHexareline pour lui attacher l'isotope

radioactif, l'indium1 11. Le DTPA doit d'abord &e jumel6 au pepfide avant d'y insérer i'indium. Le DTPA

possèâe anq groupes carboxyi (fig. 17) qui peuvent rbagiir avec des groupes amines retrouvés sur le

peptide. Cette reaction est spontanée dans un solvant organique lorsque le DTPA est sous f o m

dianhydreux.

Figure 17. Strucksie et Won de I'Hexareiine à l'acide dethylenettiamine pentaacetiqje (DTPA) danhydreux en solution de dmethytfmamide (DMF). Trois produits majeurs hypothétiques. D'autres peumt être obtenus induant des chaines continues de peptides et de DTPA

B. Technique

Dans un tube de borosilice, 500 pg (0.56 pmole) cPHexareline dans 100 pl de DMF ont été ins6res et un

excès de DTPA danhydreux (10x; 2.0 mg) a blé ajouté. La solution a été laissée pendant 24 heures à TPN

(20 - 25 'C; 1 atm.) en agitant constamment La solution de DMF a ensuite été évaporée sous un jet d'air

et resolubilisée dans une solution cfeau. La solution a eté filtrée sur un filtre de 0.45 pm Millex-HV de chez

MiIlipore (Bedford, MA, USA). Le fittré a ensuite été réduit de volume par Bvaporation et injedé sur HPLC.

Les fractions ont été r & o W sous un gradient de 20 B 50% acétonitrile (0.05% F A ) dans de l'eau

(0.05% V A ) sur 60 minutes. Les pics majeun ne conespondant pas a I'Hexareline non réagi ont eté

réévaporés (pour éliminer le solvant organique et le TFA) et resolubilisés dans 200 pl de detampon acétate P

(10 mM; pH 6.5) pré-traité au Chelex. L'indium111 (500 pCi) a ensuite été ajouté et la solution a 6% \

laissée de 30 minutes a 2 heures en kassant de kmp en temps. Le mélange a été i n j e sur HPLC et

les fractions radioactives ont ét6 récoltées. Pour la demière fois, les fracüons ont été 6vaporées et

reçolubilisées dans du PBS (pH 7.5) (1OIWr6 DMF) prés pur injedon.

ILA. 5 Synthèse du complexe Hexmelin-B&H

Le substrat de Bolton et Hunter (MH) fournit une aitemative pour le radiomarquage des peptides. où la

tyrosine est absente de la séquence ou parce qu'elle est importante pour l'activité biologique (Gaudnauk et

Vincent 1992). Le produit B&H possède un groupement reactif que l'on nomme ester achvé, qui peut se

jumeler à des groupements aminés souvent retrouvés chez les peptides (lysine). Le groupement BBH dol

eîre iodé avant même que son insertion soit effectuée dans une molécule.

Agent oxydant + Nat' CK)

O

L2-J Ta- phosphate

O 50 mh4; pH 7.5

II*

figure 18. Stnictures et réactions du subsbats BW avec l'iode125 et du produit iodé avec I'Hexardine.

B. Technique

Dans un tube de borosilice, 1 mg (4 pmole) de produit de Bolton and Hunter (B8f-l) et 1 mg de chloraminô

T (4.1 -le) ont W dilu& dans 150 pi d'eau. On y a ajouté 0.5 B 1.5 mCi d'iodure de sodium (~a1251,

~ a l ~ 1 1 ) dans 50 pl $eau (pH 9) et 35 pl de tampon phosphate 50 mM (pH 7.5). Aprés incubation (10-15

minutes) de la çoluüon a TPN, 200 pl â'une solution de 50 1 acétonibile (0.05% TFA) ont W introduits

pour arreter la &don. Le mélange a ensuite &é injecté sur HPLC pour séparer et récolter les fractions.

Les ftacüons radioactives ont ensuite été &vapor&s et 0.5 mg d'Hexareline a été ajovté dans 50 pl de

tampon boratelphosphate 50 mM (pH 7.5). Le mélange a été laiss4 pendant 1 a 2 heures. La fbacüon a t été arrtitée avec 200 pl dune solution de 50 % açétonibile (0.05% TFA) et le tout a 6% purifie par HPLC &

7 Q& sous un gradient & O à 40% de la soi. B (1 00% acébnitni; 0.05% TFA) dans la sol. A (100% ho; 0.05%

F A ) sur les 40 premières minutes, et de 40 a 60% de sol. 0 dans la sol. A sur les 10 dernieres minutes.

Findement les fractions radioactives ont W récoMs, 6vaporées et resolubilisk dans de i'eau ou PBS.

A. Principe

Le dextan (Dx) est une molécule possédant des groupements hydoryls qui, par la rhaction au perbdak

de sodium, deviennent des aldéhydes (1) pr&s a rbagir aux amines libres disponibles sur le peptide (2) et

former un complexe Hexarelin-Dexûan stable après réaction au cyanoborohydriâe de sodium (3.) (fig. 19).

Étant donné que le dextran est bien connu pour sa facilité a lier le WC, le complexe peptidique peut lui

aussi &e lié A cet isotope et faire du produit Hexaelineûextran, un agent d'imagerie.

Figure 19. Schema de la bansf-on du dexîran a la forme F i au pepüde. Fomration des gmqments aldéhydes (1); reacb'on des aWhyh aux amines peptidques (2); réductiai des dolbles lins et focmation d'un produit stable (3).

. B. Techniques

A une dufion & 1 mM (10 mg) de dexban T-10 (Pharmacia Biotech) dans 1 mi de tampon acétate (0.1 M;

pH 5.5) a eté ajoutés 6 mg (28.1 m i e ) de penodate & sodium. La mixture a été inaibée 24 heures B

TPN dans le mer. Le mélange a ensuite 6té pas& sur une colonne PD10 (Séphadex G25) ~ q u i l i M au

preaiabie avec 0.2M @un tampon phosphate (pH 6.0). La fraclion 4 contenant le plus de dexfran (fig. 31) a

été incubée a 1 mg cPHexareline dans 1 ml de tampon phosphate (pH 6.0). Une seconde incubalion de 24

heures, sous agitafion continue à 5 ' C dans la noirceur, a été appliquée. A la fin de la période

cPnicubaüon, 1.8 mg de cyanoborohydride de sodium dans 100 pi de tampon phosphate (0.2M; pH 6.0; 0.1

M de glyane) a été ajouté et laissé pendant 3 heures supplémenlares (traitement reducof). La W r e

finale a été purifiée sur une colonne PD40 dans un tampon phosphate (0.2M; pH 6.0). Des f &ons de 1

ml ont 4té rémhks et chaque fracüon a W analysée pour sa den- optique a 280 nm sur un

specbophoto~tre K i i ü-2000 (Tokyo, Japon) et sur plaque chromatograp hique a couche mince (TLC)

briilée l'acide sulfurique et cuit sur plaque chauffante.

ILA. 7 Synthèse du complexe I lh~-~ntarel ix

L'indium-111 a besoin de 3 groupements aminés (3 azote 'N") pow obtenir une liaison soiide. Le N-

terminai de ItAntarelix possède ces trois groupements qui, sous une forme bidimensionnelle, peut

f o m r une structure pouvant recevoir l'indium. Le peptide doit donc &e poussb à former la sfructure

désirée pour y insérer l'isotope lors de la période r6acüve.

Figure 20. Modéle du marquage direct de I'Antarelix a l'indium-1 1 1.

DMF

ll1lnCk

B. Technique

24Hr

25%

A 500 pCi d'indium1 11 évaporé sous azote, 100 pl (100 pg) d'AntareI'i dans du DMF ont été ajout&. La

t

réaction a W lais* a TPN pendant 24 heures, elle a ensuite été 6vaporée et resolubilisée dans de l'eau

pour fin de purification sur HPLC sous un gradient de 20 a 60% d'acétoniûile (0.05% F A ) dans de l'eau

(0.05% TFA) sur 60 minutes. Les pics radioacofs ont été récoltés, évaporés et resolubilisés dans un

solvant injectabie in vivo (eau ou mélange d'eau et de DMF).

n.B La biologie

1. Culture cellulaire

Dans des flacons de alture cellulaire ayant une surface de 75 cd, des cellules EMT-6 ont W implantées

avec 1 û-15 ml de mleu de culture cellulaire Waymouth complet (1 0% N a , 1 % pénicilline, 1 % glutamine).

Une fois les flacons a confluences, le milieu de cutture cellulaire a été retirb par succion de vacuum, les

cellules ont été rincées une a deux fois avec du PBS et ensuite traitées dans 510 ml de verskne (PBS et

10mM EDTA). Après incubation de 10-15 minutes a 37 ' C, la solution de vefsène a bien été agitée iî raide

d'une pipette afin de W l e r au maximum les cellules de la surface des ffacons. La solution cellulaire a

ensuite été transférée dans un tube culture cellulaire de 50 ml, centrifugée B -500 g pendant 10 minutes,

rincée de nouveau avec un volume égal de PBS, recentrifugée et un volume calculé de milieu de culture

cellulaire complet a kt6 ajouté afin d'obtenir la concentration de cellules voulue pour les besoins de

l'expérience.

Dans le cas des cellules MCF-7, le milieu utilisé a kt6 le MEM (minimum essential medium) complété de 10

% de NCS, 1 % de pénicilline, 1 % insuline, 1 % pymvate de sodium.

Les souris ont eté inoculées a raison d'une injedon par cuisse de 2x1 05 (50 pi) cellules tumorales EMT-6,

au niveau intradermique. Aprés un minimum de dix jours d'incubation, les souris ont été injectées avec 200

pi soit & 1 2 5 1 4 ~ 6 7 8 (172 $i), de 1251- exa are lin (0.13 $i), de 12%Marelix (1.4 pCi), ou de [1%

DTPAI-Hexarelin (20-101 pCi par la veine caudale. Lors de la biodisbibution, un nombre egd de souris a

été Sacrjfi8 à diirentç intenralles de temps (passant de 30 Mn. à 24 heures) afin d'identifier les tissus

t ables du produit marqué par rapport au temps. \

v Pour œ qui est & la clairance sanguine, d'aubes souris ont aussi é1é injectées avec 200 pl de produit *&

radioactif. Des échantillons sanguins ont été prekvés aprb l'injection au niveau occipital 8 l'aide de

miaocapiiaires, a âes temps variants de 2 min. 24 heures. Ces demiers ont & centrifug&, le plasma

&par&, pesé et compté pour la contenance en radioadMté. I

De plus, pour mesurer la anbtique d'exc&ion des peptides radioactifs, daubes souris ont encore une fois

été pesées et injedées avec la f o m radioacüve du produit Eks ont ensuite 6té placées individuellement

dans des cages où du papier absorbant recouvert de moustiquaire servaient respe&vement de collecteurs

pour l'urine et pour les selles. Le papier a ensuite été récolté et inb'oduit dans des tubes. De-plus, les

selles ont 6té récoltées et elles aussi. inserées dans des tubes. Le tout a ensuite été compté par le

compugamma (fig. 21). Cette mesure a été répétée a 24, 48 et 72 heures aprés l'injection pour un même

animal (n = 3 ou 4).

Figure 21. Schéma de la m6îhocie éiaborée pour les études Cpexcrétin chez la souris.

. des deux ensembies. Le geCdegel consiste a refroidir les cellules instantanément a 180 .C (dans de

l'azote liquide) et de les réchauffer à 37 % immédiatement après cristallisation compkk Cette

manipulation a été répebee de 3 a 4 fois et le pmduit a ensuite W centrifugé. La méthode de

i'homogénéisabur Dounce consiste ih forcer les cellules B se Mser par la famation Bun semkvide et par la

force mécanique obtenue ion du passage des œilules entre les &la parois de vene du piston. Pour une

meilleure optnnsafhn du système, les deux méthodes peuvent être coupiées et davantage par

l'utilisation dune solution hypotonique. Donc, les cellules sont rincées avec du PBS, centrifugées,

resuspendues dans un tampon Tris-HCI 10 mM (pH 7.6; 0.W sucrose; 1 mM MgCi2; 1 mM daiothreitd; 1

mM PMSF) et soumises au baitement du geldégel. La sdution cellulaire a imMiatwnent 6% incorporée

dans un homogénéisateur Dounce refroidi entre O et 4 O C et soumis à 8 coups de piston. La soiution a

ensuite été insbrée dans un tube à u ~ ~ n a i h i g e u s e et centrifugée à 1000 g pendant 10 minutes afin de

séparer les dékis cellulaires du cytosol. Le sumageant a alors W retiré et le culot reçuspendu dans 10 ml

de tampon Tris-HCi 10 mM (pH 7.6; 0.3M suaose; 1 mM MgC12; 1 mM dithiothrebl) et ultracemgé a ' 30000 g pendant 20 a 30 m i n m . Le surnageant a de nouveau 4té retire et les restes cellulaires ont blé

reçuspendus une dernière fois dans le même tampon. La concentration de protéines a eté déteminée par

la méthode b R a d (Mississauga, Ontario, Canada), et les fractions memkanaires ont &té en

échantillons de 0.1 ml et congelés a -20 OC jusqu'a leur utilisation.

Dans chaque essai, de 50-70 pg de protéines ont blé utilisés dans un volume find de 350 pl dans des

tubes eppendorfs en pdypropyiene traités une heure au prbalabie avec une solution de 1-2% BSA Les

essais 5 et NS ont W faits A 4 O C , ou a fa temphbre & la p i , pendant 90 minutes dans une solution

Tris-HCI 10 rnM (pH 7.6; 0.3M suaose; 1 mM MgQ; 1 mM dithiothreitol). Aprés l'incubation. [es tubes ont

été c e m g & à 12000 g pendant 10 minutes, la surnageant retir6 par vacuum, et les culots compteç sur

compteur gamma. Les essais ont tous W faits en tripkata.

Tous les tests de RIA ont W faits par la méthode de Rouini et al (1995) développée dans le laboratoire du

Dr. Huy Ong B la facutté de p h M e de FUniveW de MonW. J

I1.C Autres

Stockage des fractions pulnées par HPLC

Une fois la fraction désirée récuitée, 100 ml de PBS ont été ajoutés a la solution et cette demiere a ensu l

6th pl- sous un jet â'amte (ou bargon) afin @assécher le liquide dans lequel se lmuve le produit

(habituellement eau, acétonitrile et &de trilluoroacétique). Une fois le volume 4vapore, le produit lié au sel

du PBS peut &e gardé A 4 'C pendant plusieurs semaines, voir même des mois.

Lors de l'utilisation du produit, le complexe a W dissout dans un volume connu d'eau, ou dans un Mange

deau et d'une solution organique (DMF, CH3CN) chez certai'ns produits plus hydrophobes, tel I'HexareIin

OTPA.

II.C.2 Stabilité des produits en solution

Afin de verifier si les produits en solution dans la chambre hide peuvent etre gardes un certain temps sans

qu'il y ait degradation chimique ou enzymatique, les produits ont été soumis un test sur chromabgraphe a couche mirce.

t Technique .b

Un échantillon de la fracljon a été appliquée, 8 l'aide @un capillaire de vene, sur une plaque

chromabgraphique a couche mince (TLC). Une fois i'échantillon bien sédi6, le TLC a &té placé dans un P

contenant où se trouve la sdutian de migrdon (PBS). Lorsque celle-ci a été terminée, le TLC a W coupé

en plusieurs endroits et les fracbacbons ont été comptées individuellement dans un compteur gamma. La

stabili du produit a été déterminée grâce b la position ou l'on retrouve la radioactivité, génkralement

dirente entre celles liées et celles complexées B une molécule quelconque, toujours relativement aux

solution de migration utilis&s (fig. 22).

Compteur y

+ N I 8 8 8 Figure 22. Schema de la méthode danalyse de chromatogrqhie a cache mince.

III. Résultats L

III.A Études chimiques

Purification par Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)

La chromatographie a et6 effectuée par la méthode analytique, sur une colonne C l 8 deita-pack de chez

Waters (Milford, MA, USA) (sauf dans IIIAl, lllA.2 et lll.A.5, où la chromatographie a é@ effectuée sur une

colonne C-18, Ultrasphere ODS, 5 pm, de chez i3eckman (Mississauga, Ontario, Canada)) en prksence

dune concentration de 0.05% d'acide bifluoroacétique (TFA), échelonnbe sur une periode d'environ

soixante minutes. Un détecteur d'absorption WMS et un détecteur radioactif ont kt6 jumelés au système

de HPLC afin d'anaiyser les produits obtenus.

m.A. 1 Purification du MK-678 iodé

Le MK-678 a 6té purifié par HPLC avec le gradient d'acétonitrile et d'eau dans (0.05% TFA) comme suit: O-

10 min., 100 % eau; 10-40 min., gradient de 1 % &$nitrile par minute; 40-60 min., 100 % acétonitrile. La

détection optique a été effectuée dans I'W une longueur d'onde de 279 nm, a une intensité de 0.02 a&

et dans le spectre radioadif, B une sensibilité Bgde ;i 3x103. Les pics A, B. C et D correspondent

respectivement la chIoramineTl au MK-678, au ~a1251 et au 1251-~~-678 (fig. 23). Le ~ a 1 2 ~ 1 a &té Blué

B 3.2 min., la chIoramine-T B 9.4 Mn., MK-678 seule à 26 min. et le MK-678 marquk A 30.4 min. Le

rendement retrouvé de I'iodination au MK-678. sur la quantité initiale diode, est de 16% (82 pCi).

O 8 16 24 32 40 ELUTION TIME (min)

Figure 23. Chromatogramme de HPiC du MK-678 et de ses dérivés iodés.

LII.A.2 Purification de I'Hexarelin iodé

La chromatographie (fig. 24) a été effectuée B l'aide dune çolulion A (100% eau; 0.05% TFA) et d'une

solution 0 (100% acétonitrile; 0.05% F A ) . L'élution a été faite comme suit 0-10 min., 100% sol. A; 10-40

min., gradent de 1% sol. 8 par min.; 40-60 min., 100% de la solution B. Le débit &ait de 1 rnllmin. La

déwon a donne quatre pics majeurs soit, en A, la chlorarnine-T (2.4 min.) et autres rebuts comme les

sels; en B, l'absorption W de I'Hexarelin (32.8 min.) et des a&m formes dHexarelin (v&ifmtion de la

pureté initiale de i'Hexareline a été faite au préalable); en Cl la radioacüvité détectée du ~a1251 (3.2 min.);

et en Dl la radioadvit6 détectée de dirents produits marqués obtenus (30.4 et 31.2 min.). Le rendement

retrouvk de I'iodination a IHexareline, sur la quanîité inioaie 8iode, est de 6% (30 pCi). Les r6sultats

représentés en 0 pourmient indiquer une dégradation du peptide. La discussion est dailleun axée sur

cette possibilité. v

8 16 24 32 40

TEMPS D'ÉLUTION (min.)

Figure 24. Chromatogramme de HPLC de I'Hexardin et de ses dérivés iodés.

III.A.3 Purification de 1'Antarelix iodé à I'iodogène

Les fractions récoltées il toutes les 30 secondes (fig. 25) ont toutes été lues sur un spectrophotom&e,

pour la détection optique et des échantillons de 1 % (en triplicab) ont W comptés sur un compteur

sa'nbllation pour la détedon radioactive. Le ~a1251 a W Blué a 3.5 minutes, I'Antarelix seul a 38 minutes.

et I'AntareSi marque à 47.5,51 et 54 minutes après injection de la solution de rbaction dans le systéme. * \

O 10 20 30 40 50 60

Temps &lution (minutes ou miIlilies)

Figure 25. Chromatograpt!ie liquide de haute paformam (HPLC) de I'Antarelix et de ces analogues iodés. Oution de 25% a 40% acétonitrile (0.05% TFA) dans eau (0.05% TFA) sur 60 minutes. Débit & 1 milminute. Des fractions ont été récdtées a chaque 30 seamdes et diluées dans 0.5 ml deau.

Trois pics radioactifs ont été détectés très près i'un de l'autre. Ces pics peuvent representer la forme

monoiodée du peptide (le pic majeur; 47.5 min.), la f o m diio&e (le suivant; 51 min.), et un marquage

tertiaire inconnu qui peut reprhsenter I'iodinaüon a un autre site qu'a la tyrosine. ou une conformation

tridimensionnelle de plus haute énergie aute que celle retrouvée habituellement ctant donne que les

condiions favorisent la monoiodination sur la diiodination (voir sedon IV), le plus important des deux pics

est, sans doute, la forme monoiodée de I'Antarelix. Le rendement de I'iodination de I'Antarelk sur la

quantité d'iode initiale était de 28% (140 pCi). En moyenne le rendement etait de 25% aprés 10 minutes

de rtiaction, passant a 33% après 60 minutes avec une nette augmentation de la quantité de produit ? secondaire diiodé. \

i) Hexarelin-DTPA avant radioliaison

0

Le chmmatogramne (fig. 26) montre bien ies pmdumdriits fornies après &%on de I'HexareJin et du DTPA

dans le DMF. CHexarelin non r&gi a été Qué à 24 min. et k(s) proâuitç majeurs ont 6té retrouvés à 31

min. et 43 min. La fraction élu& a 31 minutes, r e p r w deux pics superposés (voir d o n suivante),

qui, seion des aitéres de dnnension et de probahTi de iiaison, sont les fonnes mondi&. Celle 43

minutes représente, selon les mêmes critéres, la fornie dl&. Grâce à l'excédant du substrat DTPA, les

autres possibilités de rkaction (+) ont grandement été diminuées. La f o m majoritaire est traitée de façon

a étre utjiisée pour les &des biologiques.

O 10 20 30 40 50 60

Fractions en milfiiiies ou minutes.

Figure 26. HPLC de I1Hexamiin lié au DTPA effectué sur 60 minutes, de 20% a 50% acétonibile (0.05% F A ) dans de i'eau (0.05% F A ) . Les fractions réagies et récoltées ont été retrouvées à 31 minutes (1' pic majeur) 'et à 43 minutes (T pic majeur). CHexarelin non réagi a été r e W a 24 minutes.

v ii) Hexarelin-[l In-DTPA] après radioliaison -4

Le marquage A l'indium11 1 de la fracfion 1 (31 minute) s'est fait avec un grand rendement (-43%). Le

chromatogramme du HPLC (fig. 27) montre très bien la liaison de l'indium radioactive au complexe

Hexarelin-DTPA. Les deux pics radioactifs montrent un dédoublement de la fraction récoltée. Cette dualité

a 6té mnfirmée par une seconde chromatographie plus 6tir& dans son gradient (20 a 50% de la sol. B sur

100 minutes; rksultats non prksentés) et signifierait la présence de deux isomères où la molécule de DTPA

serait liée, en un cas, la posiüon a (pic radioadif mineur), et hypothbîjquernent dans l'autre, a la position E

(pic radioactif majeur) (Langone, 1989). Le plus important des deux pics est sans doute celui qui indique le

produit du peptide lié au DTPA A la position s (la lysine), et l'autre, celui lie en position a (la terminaison

amine).

8

O 8 16 24 32 U )

Temps dtClution (minutes)

Figure 27. Chromatogramme du marquage L I'ïindum 11 1 du pic 1 élué à 31 minutes.

La liaison radioactive A la fraction 2 (43 minutes) a, ici aussi, 6% &ès appréciable (rendement - 48%) et

avec une concentratjon radioactive sensiblement égaie B celle obtenue pour la fraction 1 (fig. 28). Dans ce

cas si, la forme chélatée du peptide est traitée comme celle possédant deux DTPA par molécule. Ce qui

pourrait expliquer le bas niveau d'absorption U.V. détecté malgr6 la forte radioacüvkt6 présente.

Temps belution (minutes)

Figm 28. Chromatogramme du mafquage a I'irrdum-111 du pic 2 étué à 43 minutes.

I E A . 5 Purification de 1'Hexareli-n-B&H

A. Chimie

La purification du produit d'Hexarelin Ii4 au BBH (fig. 29) a 6té f a b par un gradient de 0 4 % dune solution r 'a. B (100% acétonibile; 0.05% TFA) dans la sol. A (100% H,O; 0.05% TFA) sur 40 minutes et de 40 60% de

v la çd. B sur les 10 minutes suivantes B un débit de 0.5 müm'n sur le HPLC sur une donne Uitrasphère .Y ODS, 5 pm C l 8 8 phase renversée. On peut lire en 1, le BBH non rw; en 2 IWexarelÏn; en 3,4 et 5, les

diii ints produits de la M o n de ch4latîon ( k a e l i n vs M). Ces fractions ont &é récokées et

6vaporées pour ensuite &e testées par la méthode radioimmunokgique de Roumi (1995) afin d'identifier >

le site de liaison du chélateur sur I'Hexarelin. Le détecteur U.V. ajusté pour une detedon à 280 nm (0.08

a&) et le détecteur radioactif une sensibilité égale a 1dl.

III.A.6 Purification du Hexarefin -Dextran

La skparation du complexe Dextran-Hexarelin a été faite sur une colonne chrornatographique traditionnelle

PD4 O (Sephadex G25), Quée avec un tampon phosphate. Les fractions ont toutes &té analys& sur un P

i spectophotomètre 3 280 nm et les données recueillies pour les fracbacbons cuntenant le dextran ont été

$4 obtenues grâce aux observations quantitatives c u ~ t r i q u e s sur plaque dir-graphique i î couche

mine (iLC) brûlée l'acide sulfurique. Celles possédant une absorption W indiquent la présence du

peptide et celles indiquant un diangement de couleur ontensité) montrent la présence de dexîran. Lorsque

les deux ph6nomènes sont observés, nous avons le produit HexarelikDextran (fig. 19). #

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

Fractions (ml)

Figure 30. Séparation sur cdorine PD40 des substrats et des produits liés de la réaction de I'Hexareiin et du Dextran.

La figure 30 montre une bonne purification du peptide lik par rapport au peptide libre. La juxtaposition de la

courbe Hexa-Dextran et de celle du Dextran libre, ne &rangera en rien la validité des tests de RIA. La

parüculaité des donnes PD40 sont leurs nombreuses micropores qui coincent les molécules de petites

dimensions laissant les plus grosses 4uer plus rapidement de façon prioritaire, phenornéne directement

relié a leurs tailles (ies plus grosses sont les premieres a étre 6luées).

E IIIA 7 Purification de 11[ 1 1 1 In] -Antarelix

Les résultats chromabgraphiques (fig. 31) ont montrb une bonne chWion de I'in61umlll A la molécule

peptidique. Le &le suggéré A la figure 20, un modble de marquage directe sans cMIateur, poumit etre

le produit détecté. Cependant, la reproductibilité &nt de mise, les résuitats n'ont pu 6tre r 6 p é e et le '

modèle do& étre rejeté.

O 8 16 24 32 40

Temps en minutes

Figue 31. Chromatogramme HPLC sur donne C 4 deltbpadc de I'Antarelix marqué a l'indium-1 11. Résuitab non reproduits.

III.B Études biologiques du 1251-MK-6 78

Temps

figure 32. Biodsûhtion du 1251-~~-678 chez la -s BalWC mâle à Mérents tempç après injection.

TaMeau 1. Résultats numérique de la biodstribuüon du 1251-M~-678 chez b swis d e BaiblC.

30 minutes lheue 3heues 6heires 12 heires 24 heues

f

.Y L'analogue iodé de la somaMaüne, '%MK-678, a été injecté M nYo chez la souris BaiWC et plusieurs

tissus ont été récoftés alin d'obtenir des données de localisation du pcoduit dans le temps. La

bio~çtn'buüon (fig. 32, tab. 1) montre bien: par le niveau de radio- de la thymI&, que la

radioiodinaüon du produit est relativement stabie h~ vivo (< 2.0 % di. but au long de i'btude, tandis qu'elle ,

est près de 100% pour le ~ a ' q pure (résultatr non présentés)); par le niveau de radioadjvitro de la

vésicule biliaire, que le complexe est en grande partie éliminé via les selles entre 6 et 12 heures apr&

Anjedion (a.i.); par le niveau de radioactivité de la tumeur, que la captaüon tumorde sembie étre

n8gligeable. Ces résultats indiquent que le peptide modii6 a l'iode n'est pas ideal pour le dépistage in si'

des tumeurs EMT-6. Une méthode cfexcr&ion hépatique est démontrée par le haut pourcentage de la

dose injectée par gramme chez la vésicule biliaire (8.0 % d. i. 1 heure a. i.).

ii) Clairance sanguine

Figure 33. Clairance piasmatique du 1251-M~-678 chez la souk W C mâle (n = 4). Gauche: % dose injectée par millilitre de piasma. Droite: logarithme du % dose injectée par millilitre de piasrna,

v .r: La dairanœ (fig. 33) du produit au niveau du syçtéme sanguin se traduit par une Blimination presque

cornpl& 3 heures après l'injection. Le mdde suggéré est deux exponentielles qui donnent un débit de

dairanœ sanguine &gaie à environ 17 ml de sang a l'heure (Annexe 1).

iii) Excrétion

O 1 2 3 . 4

P h d e (purs)

Figure 34. Excrétion du 1251-~~678 chez k souris M e BaOJC (n = 4).

L'hypotke de I'excrhüon par voie hepaüque retrouvée lors des &des de bi~di~but ion est confirmée ia

par lbôtention d'évidence d'exa6tion fécaie (fig. 34), allant près de 75% dès le premier jour, pour le produit

modifié de Merck-Frosst

.I iv) Autres observations

Lors des prkl6vernents faits pour l'étude de la dairance sanguine, le niveau de I'h6matoaite a été &valu6

pour 6tuhidier certains effets pouvant subvenir après l'incorporation d'un agent inconnu a l'organisme. La ,

figure 35 nous montre le maintient, 24 heures plus tard, d'une diminution de l'h&natoc&e survenue

quelques minutes apr& l'injection de 200 pl de 1%M-678 par voie intraveineuse.

Figure 35. Changement retrouvé dans l'hématocrite à la suite de l'injection du 1251-~~-678.

Cette diminution de I1h&natoaite peut être expliquée par la somme de plusieurs aitères. Les plus

important sont: 1) la destruction des globules rouges causée par le produit injecté; 2) la quantité du

volume de sang retirb du système sanguin (allant jusqu'a 4 0% du volume sanguin total de la souris, a la

f n de la période d'expérimentation); 3) les saignements externes r&uitants des ponctions occipitales des

capilaires d'échantillonnage; et 4) l'incorporation d'un volume équivalent a environ 25% du volume r' . sanguin total chez la souris BalWC de 20 grammes.

L'Hexarelin iodé

Temps a. i.

Figure 36. B i o b s M o n du 12514exadi~ chez la souris WWC (n=4); portant la tumeur €MT-6. ô différents temps apnk injection.

TaMeau 2. Résultats numeriques de la biodisûiion o b s h a la figure 36.

30 mmuts 1 hem 3 heues 6 heuras 12 havas 24 h m ris sus Y DUg t am Y DUg t esm % DUg t a m % OUg f esm Y DUg t esm W DUg t esm

3.362 0 3 243 t 027 1-35 t 0 2 0.50 î 0.07 0.30 i 0.01 0.06 î 0.00

ir A Des l'injection intraveineuse au niveau de la queue chez la souris ûaiblC. on peut marquer I'instabiiii

des produits marqués récoltées sur le HPLC (fig. 24), grâce fabsorpüon de Ilode radioactive a la

thyroïde (2.8 % dose injectée 6 heures ai.) (fig. 36). L'excr&ion (tg. 38), comme le démontre i'activité

détectée au niveau de la vésicule biliaire, de I'-, des imns et du colon, semble suivre en grande ,

pailie la voie hépatique. Néanmoins, i'activité contenue au niveau des reins s16taiant sur les 24 heures de

l'étude est un signe d'une excr6tion rénale. La quanüté de traceur au niveau tumoral est négligeable, ce

qui met en doute les capacités de œ produit d'etre un bon baceur (tab. 5, p. 66).

ii) Clairance sanguine

Fgure 37. Clairance plasmatique & 1251-~axarelin chez ia sains W C male (n = 3).

La dairance plasmatique (fig. 37) est pratiquement compktée dès la prerniéie heure avec une dairance du

volume sanguin @environ 5 mumin. et suit un mod6le A deux exponentielles (voir les données de calcul

comparatif en Annexe).

7

.r: iii) Excrétion

Chypothbse de I'exa&on hépatique cornna système prinapai d%vacuation, n'est pas exacte. Les

résultats montrent bien que le produit est principaieement dimin6 par I'udne (fig. 38). Cependant, la fibation ,

hepatique est aussi d'une grande importance 6tant dom& que i'on retrouve prés de 35 % de la dose

injectée dans les selles.

Figura 38. ExCretion du 1251~exarelin chez la -s mâle W C (n = 3).

iv) Autres observations

Lon des prélévements faits pour I'6tude de la ciairance sanguine, le niveau de i'hérnatcmk a 6té M u 6

pour btudier certains effets circulatoires pouvant subvenir aprb l'incorporation d'un agent inconnu a l'organisme. Une diminution graduelle a W obçenk allant jusqutà près de 20 %, 6 heures aprb

,P

\

t Ancorporation de 200 pi du produit par voie intraveineuse sans augmentation 24 heures a.i. (fig. 39). Les

eqiications la section III.Bk s'appliquent auusi bien ici.

figure 39. Variation du niveau de l'hématocrite chez la BalblC d e aprés incocporation & 1251-~ewelin.

L'Antarelix iode

figure 40. Biodstnion ch 1 * 5 1 - ~ n t d ~ chez la souris 8ablC d e (n = 4) portant la souche tumorale EMTG a différents temps après injection.

Tabieau 3. Valeurs numérique de la biodisbibution en % doçe injectée / gramme de tissu, et l'écart type sur la moyenne (-1-

c i a g p l i s m 8

C O r u r p o u m o n s r i l e r u in s Io i a v r s .b i l i i i r r p i a c r & i t r s l o m i c in l e s Lin C O Io n c u r r C n i l e s th y r o i d e s in u s c l r p e a u c e r v e a u t u m r u r h r p o p b y s e

3 0 m i n u t e s 1 b e o r e 3 h r o r r s 6 b r o r r s 2 4 b r u r r s T i s c a s % D l l p * r s m % O l l g î e r m l 6 O11g t r rn % 011g + r s m % O l l g I r s m

4.00 t 0.39 1.94 t 0.09 0 . 3 2 ~ 0.05 0.12 r 0.01

Les élernents importants retenus de cette &tude sont la grande stabiiité du produit in vivo (niveau bas de

radioativite i~ la thyrolde; 0.43 % dose injectée après 24 heures), I'excrbtion au niveau Mpatique

(représentée par l'activité refrouvée dans la vésicule biliaire et dans la voie gastro-intestinale) et surtout

i%cüvité biologique intacte de la miécule après radoiodination confirmée par le grand pourcentage de

dose injectée par gramme au niveau de hypophyse (0.24 % d.i. aprés 24 heures). De plus on peut

remarquer de faibles mak intéressants ratios tumoraux (tumeur vs peau, musde, sang) 24 heures a.i. (tab.

5, p. 66).

ii) Clairance sanguine

CUminaüon de la voie sanguine de I'Antarelii iodé est relativement rapide avec une dairance du

compartiment sanguin kgale a -3 mumin. La figure 41 nous montre bien la disparition rapide du taceur de

la voie sanguine ainsi qu'une dairance suivant un modèle deux exponentielles (voir les données de

calcul comparatif à i'Annexe 1).

Figure 41. Clairance plasmatique du 125i-~ntareiix chez la souris BalWC (n = 4). Gauche: d e linéaire. DrMte; d e logarithmique.

iii) Excrétion

L'klimination complète de I'organisme, telle qu'observée lors de la biodiçtibution, est environ 75%

Mpaüque. La grande partie de la radioactivit6 se retrouve, par le mécanisme d'élimination hbpatobiliaire,

dans la voie gastro-intestinale dans les premidres heures suivant I'injedon (fig. 42, tableau 3).

figure 42. Excrétion totale ch 125i-Antarelix chez la souris B W C mâle (n = 4) après injectionon

iv) Autres observations

figure 43. DiMnution de ll.iématoCnte après injection de 200 pl da l'lXl-~ntarelu chez la souris BalW mâie (n = 4).

1 On peut remarquer une dminution de I'Mmatoaik bu" peu pius de 10% après Ilncorporation de 200 pi

du &rive iodé de I'Antamiii. Ce qui correspond davantage au volume sanguin retirb but au long de la

période expérimentaie, qu'aux autres raisons mentionnks a la section IIIAiv.

Temps

Tissus

Figure 44. BiodsWution du [ l l l l w D ~ ~ m i n chez h -s BalblC mâie (n = 4) portant la tumeur EMT-6 à dffererits temps a.i.,

7 TaMeau 4. Valeurs numédqm de la biobsûibuüm du [ l l l ~ n U ~ ~ ~ ~ ~ i n chez les males BdWC (n = 4).

XI minutes 1 beur8 3 bauras 12 heuras 24 heuns 6 heures

piasma coeur poumocis

rate reins

rote ver .blœire

pancréas estomac interth

cdon suneneles thyroldes muscle tumeur

peau cerveau

OS

% OUg t m m % Wg t rsm % DUg t esrn % DUg É mm % DUg e M m l6 DUg t mm 3.12 t 0.05 128 t 0.16 0.28 t 044 0.15 t 0.01 0.06 t 0.01 0.03 i 0.01

Les r&~itats de biodistribution sembient démnîrer un fixation rhale du produit (fig. 44). L'[Il lin]-DTPA

est reconnu pour etre un très bon agent pour la scintigraphie rknale, surbut au niveau de la fibation

glom6rulaire du rein et est, par œ p henomène, Cftr4 en majeure partie dans les premieres heures suivant

Ilnjecüon. Donc une toute autre explication que la separaüon du lien amide doit &e consid6rée pour

comprendre la fixation rénale du produit Par contre, la captation tumorale est faible, mais poss6de un

leger gain sur le sang, la peau et les musdes (tab. 5; p. 66). .

ii) Clairance sanguine

Fgure 45. Clairance plasmatique du m e x e [11 l l ~ ~ ~ A l - ~ e x a r e l i n chez la s d s BaWC mâie (n = 4). Gauche: graphique linéaire & la dairance. Droite: graphique logarilhmique de la dairance.

On vait bien à la figure 45 que le produit est élimh6 du système sanguin, en majeure partie, dans les 3

premières heures suivant l'injection. Ces résultats sont malgr6 la grande quantité de traceur restant lie

aux reins Mme 24 heures ai., des plus rassurant et Bliminent toutes possibiliiés de refiux sanguin a partir de ces derniers.

iii) Excrétion

Malgré la fixation rende, I'excr&ion du produit est prouvée comme &tant -70% rénale et survient dans les

premieres heures a.i. (fig .M).

24 48 72 1 44

Temps (heures)

Figure 46. Excrétion du umpiexe l ~ n - ~ ~ ~ ~ ] - ~ e x a r e l i n chez b souris BaiWC d e (n = 2).

iv) Autres observations

Figure 47. haluatiion de Ihémataaite cher la sanis W C male apcés injection de 20 pl du dérive dHexarelin lié au DTPA; fraction 1.

L La figure 47 moMe I'effkt du dé"* dHexardin lie au DTPA sur le niveau de i'h6mabaite. On peut

remarquer une nette diminution de près de 15% six heures aprb l'injection de 200 pl du produit, et

aucune augmentation n'est observée sur les 24 heures de I'btude (voir section lI1.B.i~).

#

CHexareline posséde deux sites aminés (-NH-J pouvant reagir au DTPA anhydreux; un en position alpha

(a), l'histidine, et l'autre en position epsilon ( r ), la lysine. Afin de pouvoir caractériser les pics par leur type

de liaison au DTPA, des essais radioimmunologiques (RIA) ont été effectués A l'aide danficorps

spéafiques A Pune ou l'autre terminaison du peptide. La liaison de l'anticorps a sa terminaison, indique

que l'amine, correspondant à ceüe terminaison, n'a pas reagii au DTPA. Les trois pics ont été soumis,

indépendamment, a des tests pour déteminer si les liens du peptides au DTPA se sont faits a i'amine en

position a, ou à celle en position E. Les résultats à la figure 48 sont ceux de la compéüüon en presence

de l'anticorps 244, spécifique à la terminaison amine (a) du peptide. Les résuitats de i'anticorps 281,

s w q u e a la terminaison carboxylique du peptide (correspondant ici à la position E), sont comparables.

Le mouvement des courbes vers la droite indique que la spéaficité des produits pour l'anticorps est quasi

nulle; les pics 1, 2 et 3, representant divers types de liaison du DTPA à I'Hexareline, ont conseivé

respectivement 0.34%,0.24% et 0.21% de l'activité biologique initiale de IIHexareline. Le fait que bus les

pics suivent des courbes similaires montre que chaque produit est modW aux deux sites (alpha et epsilon)

eVou a compl&xnent perdu son ani té biologique, et n'est pas reconnu par i'anticorps. Ceci implique que

I1ident%cation dune fraction de HPLC possédant des liens a seulement un site au lieu de deux, est

impossible.

le-1 le+û 1-1 le+2 lec3 1e+4 1e+5

Logarythme de la dose des fractionç mpüves (fmde)

Figure 48. Essais raddmundogiques (RIA) des fractions récoitées sur HPLC de la réaction de 18HexareIin et du substrats DTPA Resultats obtenus de la compétition à l'anticorps 244 (N-temiinal) compak au standard Tyr- Hexardin -ode.

Tableau 5. Cornpaison des d f f h t s ratios pertinents pour l'imagerie médicale en catégories de temps e s injedion par voie caudale (ai.).

Temps ep& Produits nombre C himeu Ratio injedon (ai.) (radimarqub) d'animaux (SC doselg) tumeurlsan$ tumeurlpeau tumeudmuxie

(heures) (n) moyenne (karts) (moyenne) (moyenne) (moyenne) 0,5 MK478 3 O.@ (0241.15) 0.63 0.90 3.10

i) Test Radioimmunologique (RIA)

#

Comme dans le cas de I'Hexarelin-ûTPA, le peptide peut lier le groupement hydroxyphenylpropionate

son amine terminai (position a) et à celui de la lysine (position E ) . Pour bien caracWser les types de

liaisons a la purification obtenue sur HPLC, âes épreuves radioimundogiques ont eté faites, par la

méthode de Roumi et Ong (1995), sur les diverses M o n s purifiées.

La figure 49 résume dairement que les fractions 2 et 3 ré(30W (fig. 29) et testées par RIA ont presque

totalement perdu leur acfivité biologique, tandis que les fractions 4 et 5 ont, par contre, gardé une bonne

affinité envers les anticorps 244 (liaison a) et 281 (liaison E).

le-1 le+0 le+l 1-2 le+3 le+4 l e 4 1e+6 1e-1 fe*O 1-1 1 ~ 2 le+3 1sc4 le+5 le+6 1&7

Losayttune da la dose das fraEtions respectives Foie)

Fgum 49. Essais doirnrnuidogiques (RIA) des fractim récoltées sur HPLC de la réaction de fHexarelin et du substrat B U . Gauche: Résultats obtenus de la compétition a 244 (N4minal) comparés au standard Tyr-Hexarelin ioda. Droite: Ceux en compétition a I'anücorpç 281 (Ctminal).

7

-4 Quatre fractions punriees par HPLC ont été teçtées pour leur adivib5 imunologique l'anticorps 244 (N-

et 281 (Wminai) tel qu'expliqué a la page 65. La figure 49 montre bien Pacüvité obtenue pour

chacune des fractions pour chaque anticorps. Les fractions 2 et 3 sont pratiquement dépourvues d'activité

aux deux anticorps; Mes ont des retentions d'activité biologique de 0.08% et 0.04% respedvement pour ,

le 281, et de 0.73% et 0.046% pour le 244. Ceci indique que ces deux fractions r é c o W du HPLC (fig.

29) représentent des fwmes dénaturées de I'Hexareline au lieu de âÏÏrentes formes iiées au DTPA. Par

ailleurs, les fiadions 4 et 5 ont conçervé une certaine affinU aux deux anticorps; pour le 244, une activité

de 30.8% et de 21% respectivement et pour le 281, une activité de 36% et de 26.7%. Ceci indique qu'il y

a eu conservation de Pacüvité biologique du peptide et qu'il y a peut-etre liaison au DTPA. Ces deux test

ont comme rWence un analogue de I'Hexareline, la Tyr-Hexareiin (EP 921 10) marque a l'iode 125. Les

tests ont tous 6té faits en ûiplicata.

M n de vérifier si le chblateur peut nuire B l'activité biologique de la molécule peptidique. un test de

radioimmunologie (RIA) a W effechré sur le produit synth6tisé. Effectivement, comme le montre bien la

figure 50, la molécule conserve a, 6.3% pour l'Ab 244 et a 8% pour l'Ab 281, son intégrite biologique aux

terminaisons amines respectives.

Ces résultats ne démontrent en aucun cas à quel site de liaison le Dextran s'est lie au peptide. L'une des

raisons peut étre la dimension du dextran (-10000) par rapport a celle du peptide (-1000). Pour cette

raison, il nous est impossible de déterminer si ce complexe possède un quelconque intérêt pour la

mMecine nudeaire, et nous avons convenu de ne pas effectuer les études de marquages et de

biodistri bution.

figure 50. Essais radioimmundogiques (RIA) des fraelions recdtées su HPLC de la réacoon de I H d i n et du subsbat ûexûan. Droite: Résultats obtenus & la Cornpetition à I'antico(ps 244 (N-terminal) comparés au standard TyrHexareiin iodé. G a d : Ceux en cwip8ütion a hnticoips 281 (C-terminal).

1II.B. 7 Étude de liaison spécifique de 1'Antarelix iodé in vifro

Afin de v6Aer si les cellules tumorales possMent, ou non, des récepteurs spécifiques au peptides

invesügués, ces derniers ont été btudiés sous direntes condiins en présence de deux souches

tumorales mammaires; EMT-6 et MCF-7. Les figures 51 56 présentent les résultatç des études de

liaison h Maoeffectuées sur les cellules tumorales EMT-6 sous diirenteç conditions. On peut remarquer

dans la majorité des cas, que les liaisons non spécdiques (NS) sont plus élevées ou egdes a celles

s ~ q u e s (Bt). Toutes les observations effectuées lors de ces tests in vioo démontrent que la liaison

speciiique de i'anaiogue iodé de I'Antarelix, aux cellules tumorales investiguh, est irnposiible. Notez

que toutes les eneun'des figures suivantes sont repr6sentées en écart-type sur la moyenne (esm) (voir I

k i'Annexe 3 pour le calcul détaill4).

O e 1 1.5 2

Temps d'incubation (heures)

Figure 51. Liaisons h Mtrode I'Antardix iodé aux cellules tumorales €MT-6 en pourcentage de I'activite initialement incorporée. ctude effechiée sur des cellule en sumon a 4 4 Ceisius (n = 3).

La figure 51 montre une legère liaison specifique aprks 1 heure d'incubation sur les cellules EMT-6 en

suspension 3 4 ' C. Cependant, après v~rificaton des données repr6sentées par cette figure, on a pu

remarquer une trop grande variation des résultats pour condure qu'il y a eu liaisons spwques aux

cellules tumorales. Étant une méthode peu utilisée. les études en suspension ont 4té remplacées par des

ktudes en pétris.

Temps d'incubation (heures)

/ I NSlAct ini. / O BtlAct ini.

figure 52. Liaisons h &de I'Antarelix iodé aux callules tumorales EMT-6 en pourcentage de l'activité initialement incwporée. Étude effectuée sur des cellules en pétris a 4 dqph Celsius. Les temps dinubation sont suMs des différentes conditions binabation indquées par les lems A B et C: A, jeûne &que de 24 heures m t incubation; 0, Cellules en pétris rincées avec 1 ml de HBSS (10mM HEPES; 0.1 % MA); C, Cellules en péûis cécdtées avec 1 mI de HBSSa + 1 ml de NaOH IN; blanc, tests effectués dans HSSSa (n = 3).

.I La figure 52 montre bien que la grande majoM des résultats tend vers le non spédïque, l'exception de

ceux faits il 24 heures rincées avec 1 mi de HBSS (B). Pour augmenter la possibiiii de résultats posiofs

maisons spécifiques), les cellules ont et4 rrecoltées en présence ddbumine bovine et les pétris ont bien

été rincés a lai&. en plus, de 1 ml de NaOH. Les résultats ont montré, contrairement aux aspirations. & ,

moins bonnes liaisons (figure 52; inQce C).

T

Temps (heues)

Figure 53. Liaisons rir I&U de I'Antarelix iodé aux dlules tumorales EMT-S en pourcentage de I'actMte initiaIrnt incorpOree. effectuée sur des deslules en pébis à 37 degrés Cefsius. La lettre C signifie que les échanfillons ont été récoltées avec 1 ml de HBSSa + I ml de NaOH IN; i'astén'sque r) comqmd à l'incubation fait a 20 degrés Celsius; les biancs (absence de lettre), signifie que les tests ont effectués dans du HBSSa (n = 3).

La figure 53 montre une serie de tests e W 6 s en milieu HBSSa (voir sedon 1l.B). Les observations

tendent, une fois de plus, a démontrer une plus grande non spécificitb des liaisons de ItAntareIix ioâé aux

cellules €MT-6. Les résultats obtenus pour les incubations de 30 minutes divergent, à un endroit

seulement, favorablement pour les liaisons spéciliques aux cellules. Ces résultats viennent appuyer la

thèse que le produit est inad4quat pour les cellules tumorales EMT-6, ou que ces dernibres ne possédent

pas, ou plus, de récepteurs GnRH s ~ q u e s la LHRH et B ses analogues.

Y r: Mn de vbrifier si les résultatç négatifs obtenus a 37 degrés Celsius semient reliés B une intemalisation du

produit iode par les récepteurs transrnembranaires visés, les cellules EMT-6 ont W fragmentées et

seulement les membranes cellulaires de ces dernieres ont &té récupérées. La figure 54 représente les

études de liaisons membranaires effectuées 4 degr& Celsius, par la méthode de centrifugation, et ,

d'autres a 20 degrés Celsius, par filtration.

F G

Condiions

1 . NSlAct ini. /

Figure 54. Liaisons lil w h de I'Antardi iode aux membranes des cellules hrmorales EMT-6 en pourcentage de I'acfivité initialement incorporée. Étude effectuée à 4 degrés CelStis pour une mode de 90 minutes. Les caidtions caraspondent a: 0. incubation fait dans tanpon Tris (10mM; pH 7.7; 0.3M suame; 1mM MgCl$ 1mM DiîhioMtd); E, tubes rincés au BSA et séctihs; F, tribes traités a Ihuile de silicone (0.05%) et s&&; G, tubes ûaités a l'huile de silicone (0.05%). rincés au BSA et seches; H, test fait par filtration; 1. inabation a 20 degrés Wsius et produit récolte par filtration (n = 3).

La figure 54 montre que les membranes des cellules EMT-6 sont inMpendantes des diérentes condiions

d'incubation uülisées. L'ajout de BSA n'a en aucun cas aidé B l'obtention dune diminution des liaisons non

spécifiques aux membranes cellulaires. De plus, l'utilisation de membranes aux l ieu de cellules vivantes,

n'a pas rbpondu a l'hypothèse de I'intemalisaüon du produit iod4 a travers la membrane cytoplasmique des

celluIes.

Pour verifier si la lignée tumorale EMT-6 n16tait pas, tout simplement, dépourvue de récepteurs GnRH, une 4

autre souche tumorale mammaire a éte parallélement invesüguée. Les cellules MCF-7 ont été étudiées de L

. la méme façon que les M - 6 , cependant, des preuves de i'exhknce de récepteurs pour un diirent

analogue de la LHRH étaient disponibles Wnue etal.. 1991).

1 . NSIAct. ini. 1 O BtlAct ini. 1

Temps (heures)

Figure 55. Liaisons h M h de I'Antarelix iodé aux cellules tumorales MCF-7 en pourcentage de l'activité in i t ia I rn t incorpaée. Étude effectuée sur des cellules en summ à 4 degrés Celsius (n = 3).

Les résultats obtenus a la figure 55 et 56 demontrent que les cellules MCF-7 semblent, comme dans le cas

des EMT-6, ne pas posséder les récepteun GnRH visés par lvAntareIÏx iodé. Une v&i!lcation histologique,

par le biais @anticorps spéafiques ces récepteurs, aurait peut-êe pu confitmer la prksence ou

l'absence des récepteurs GnRH dans les deux types de cellules tumordes utili&. Cette technique n'a

pas été entreprise.

- - V) a 2 2 - NSlAct ini.

I 1 I l 1 1 I 1 I 1 I I 1

Temps (heures)

Figure 56. L i a i m h &de i'Antareli iodé aux dlules tumorales MCF-7 en paacentage de l'activité initialement incorpOree. Étude effectuée sur des cellules en pétri B 37 degrés Wsius (n = 3).

& Après n = 32 essais avec les cellules EM'i-6 et n = 11 avec les cdules MCF-7, aucun signe de liaisun

spéafique aux récepkurs n'a W détedé. Les niveaux & liaison non spéafique ont, dans la plupart des

cas, démonIr6 &&e bgaux, ou plus important que ceux indiquant les possibles liaisons.

Un test sur TLC a été effectué (voir sedion II.C.1) pour verifier la stabilité du produit marqué. Cette &tude a

permit d'évaluer si les condiions de travail s'effectuaient dans un environnement ou i'analogue iodé etait

stable et pur. La figure 57 confirme la stabilité du produit iodé après stockage à 4 O C après une période

&en?reposage en solution de 60 jours. Le ~a(4 migre allégrement lorsque la solution de migration est le

PBS, tandis que I'Antareli iodé reste la base du TLC. Notez que le NalT représente un échantillon

d'iode radioactif pur et non i'iode libre retrouvé dans le produl apr& remisage. L'iode libre retrouvé dans

I'échantjllon d'AntarelUc iodé suit le même cheminement que le ~a'"l . II est en quanW trop faible pour être

significatif, et n'apparait pas a la f gure S.

O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

Fraction de TLC

Figue !5ï. Chromatographie sur couche mince (lLC) dans le PBS.

7 IV. Discussion %&

v IV. Discussion

Nd La Chimie

N.A. 1 Chimie de l'iodination des peptides

Plusieurs opinions divergent sur le mécanisme chimique de la r&cüon fidination. Seevers et Counsell

(1982) soutiennent que la chlorân'ne-T, en sdulion aqueuse, forme de l'hypochlorib (HOCI) qui serait la

forme oxydaüve agissant sur l'iodure de sodium (Nal) pour donner une espèce électrophile de I'iode

H 2 Cette dernière serait la h m acbLe de I'iode responsable de l'&tape finale de Ibdinaüon. Par

contre, Wilbur et ses cdlègues (1992) Bmeitent que la hme active de lbde serait en fait le monochlorure

diode (ICI). D'un autre c&@. Hussah et ses coilègues (1993) soutiennent que la chloramineT implique la

conversion de l'iodure radbacof en iode diatomique (13. En somme, on peut condure que la chlorarnine-T

donne plusieurs rbacüons secondaires telle que la fomiation de $ de ICI et de H , O ~ Cependant

seulement I'iode oxydé; le ICI qui possède une polarité partiellement positive sur l'atome fiode (Seevers et

Counsell, 1982) et H201+ qui est produit de la réaction du 1, et du H20 (Hughes et al, 1957) (fig. 13),

&agissent sur le groupement phénol de la tyrosine. Le pH est aussi un éI6ment majeur de la rbcüon

d'iodinaüon; 8 pH moyen (-6) H,OI+ est la principale h m acbLe de I'iode, et a pH Qev6 (-8) la

concentration de H201+ diminue et le ICI prédomine (Sonoda et Çchlarnowitz, 1970).

La chloramine-T (sodium Nchlorotolu~nesulfonamide) a servi d'agent oxydant pour Ibdnaüon des

peptides. Cet agent d'oxydation est reconnu pour sa grande utilisation à radioioder bîrentes molécules

biologiques tel que le résidu tyrosine, reconnu pour son affinité a I'iodinaüon Irçomideç et Eisen, 1993).

Malgr4 la disponibilii des groupements phenyi, indole et imidazole, où une halogénation à un niveau

moindre est possible, I'iodinaüon se fait pffnapdement sur la tyrosine sous f o m du 5monoiodotyrosine

7 .& (Karonen et al., 1990). La fornie chiodée de ia tyrosine ($-ne) peut aussi 6tre produite, mais

ce produit sera en minorité sur la fornie monoiodée.

Plusieurs chercheurs ont radioiode différents types de moléa~les et ont obtenu divers rendement Par

exemple, Vakkuri et al (1984) ont marqué Ir& la mélab3nine et ont remarque un rendement

d'incorporation de Pide allant de 20 30% en utilisant 2.5 mg cfbdogène. D'aulre part, Hunter et

Greenwood (1962) affimnt I'iodination de I'homione hGH. avec une efhcité de marquage, de 60 a 75%

en utilisant la chIoranine-T comme agent oxydant Sdaa*nski efa1(1981) ont affirmé que liodination de la

Leuenkephaline, un penfapepiide d é p o u ~ i de résidu typtophane dans sa séquence, peut incorporer

jusqu'a 95% de l'iode radioactive; avec 1 mCi de ~a'=l, 1 mg f i g è n e et 5 nmde de peptide. Ce

rendement diminu respectivement a 75% et a 67% lors de I'ulilisaüon de la chloramine-T et du

lactoperoxidase comme agent d'oxydation. D'autre part, Manhall et Odell (1975) disent avoir marqué B

l'iode la LHRH avec un succès d'incorporafjon de l'iode de 55%. Différents facteurs sont a la base de la

reussite dun marquage. II faut d'abord connaître les caprices de la molécule iodé ('les groupements

fragiles qui peuvent réagir, la structure lridimensionnelie, etc.) et les sites Biodinaüon possible. Les

condiions physiques et chimiques de la rkacüon sont trds impor.ite; en plus du pH de la solution de

reacüon, il est important de considérer la quantité de peptide utilisé, la quantité d'agent oxydant et bien

sure celle de l'iode.

Pour une quantité 0.03 m e de peptide (26 pg de MK-678; 26 pg BHexarline; 44 pg BAnWeI'i), 500

pCi de Naml est ajouté pour Pination, ce qui donne un rapport de 130A pour les peptides et dï0dei25

respecüvement (voir la feuille de calcul a l'Annexe 2). La concentration du N ~ I est un fadeur important

dans la détermination du rendement du marquage; si elle est moins de 100 mCüml, le rendement sera

diminue (Bolton et Huntei, 1973). Dans ce@ &tude elle &ait efFecîivement de 100 mCüml. -

f

?ic i) Le MK-678 iodé

Dans le cas de I'iodnation du MK-678. la purification représentée B la figure 23 montre une bonne

séparaüon de Pandogue iodé offrant ainsi un produit pur communement appek; "citmer îieew. Les

& u W obtenus lors de i'étude phiCrmaCocinétique du MK-678 ont démontré une très bonne stabif-i UI

ive de l'iode du produit marqu& Cette stabilU depend probabiernent en parlie de la m m r e circulaire

que possède œ peptide. Cette parfiailarité fait que le goupementtyrosyi se situe dans la périphérie de la

molécule permettant un dégagement maximai du site de marquage. Étant donné qu'un atome d'iode est

d'une grosseur sensiblement comparable un groupement phenyl (Tçoniides et Eisen. 1993),

l'emplacement du groupe tyrosyl est d'une prionte fondamentaie pour qu'il y ait une bonne iodniaüon. La

radioiodination du MK-678 donne un rendement de 16% d'incorporation de l'iode sur la quana6 initiale du

radioisotope présent Dans des conditions ou la concentration de chloranu'ne'r est 10 fois plus importante

que celle du peptide, comme c'est le cas ici, un maximum d'incorporation Biode peut &e atteint tout

dépendant de la quantit6 Biode présent, du pH, et du temps @exposition la chforamineT (Sonoda et

Schlarnowitz, 1970). Le pH a été fixe 7.5 pour; bviter le plus possible de dénaturer la molécule a cause de

condiions trop acides ou Bop basiques, et pour optimiser l'incorporation de l'iode au groupement tyrosine

(Salacinski e l d , 1981). La quantité diode par rapport B celle du peptide aide a obtenir une seule source

de peptide marqué, c'est-à-dire la forme monoiodée (Sonoda et Schlamowitz, 1970). En ce qui concerne

le temps d'incubation, il a été h é a 15 minutes. Ce temps n'est pas le temps idéal pour un maximum

d'incorporation $iode, mais il réduit les risques d'oxydation du peptide qui peut survenir au niveau de la

tryptophane sous les conditions présentes (Alexander, 1973).

ii) L'Hexarelin iodé

Malgr6 la disponibili des groupements phenyi et bypbophanyl, où une halog6naüon a un bas niveau est

I possible (Bninings et al, 1947), nos résultats de chromatographie (fig. 24) &montrent que le produit iode \

de PHexarelin est sans doute sous forme de 2- et de Smonoiodohistidine (le pic majeur situ6 B -30

f

.r! minutes est en réaiii 2 pics d'intensg quasi bgde). On peut auai distinguer un 3e pic radioactif (-34

minutes) qui pourrait représenter la fornie d n i de i'hisübne. Cette fom diiodée serait la 2,s dliodohistidine. Cependant, dû aux extremes conditions doxydaüon nécessaires 8 ceüe r6aclion, au lieu

fiOder des groupements moins r6actifS tels la typbphane. une destrucb'on de ce& demière est possible , (Hughes etal., 1957; Alexander et al., 1973). La trypbphane est oxydé dans un milieu de pH 4 a pH 7.5

par la chioramine-T (Alexander etal, 1973), et &nt donné que la ruon cfiodnation sur l'histidine fornie

un produit iodé qui augmente de concentration avec une augmentation de pH. I'oxydaüon de la

byptophane peut &re réûuite B un minimum. Tçomides et Esen (1993) rapportent qu'a pH 9, le produit

iodé ptincipal entre l'histidine et la tyrosine se trouve etre l'histidine sous la forme de diodohiçtidine. Par

contre. WotfF et Covelli (1969) soutiennent que la âiiiodohistidine est prinapalement formée lorsque la

protéine ne contient aucun groupement tryptophane. CHexarelin ia en possède deux; une forme originale

(L) et une autre m o d Î (D) et possédant un groupement méthyle la position 2 (fig. 15).

De plus. ente les deux pics majeurs de radioactivité. un pic U.V. beaucoup supérieur aux autres est

enregistk Ce dernier est sans aucun doute la représemon du peptide original non rnarqu6. II est

possible que d'autres formes de marquage A l'iode (ex: iodolryptophane), ou des marquages

accompagnés chne dénaturation de la protéine (attaque aux résidus tryptophanes ou M s cfun lien

peptidique), ont eu lieu. Ceci expliquerait en partie i'observation faite a la figure 24 des nombreuses

dewons U.V. Tsomides et Eisen (1993) ont eux aussi obtenu une mixture de pics complexe qu'ils ont

atbibué a des dommages oxydatifs au niveau du groupement indole de la ûyptophane. Alexander (1973)

cite quatre facteurs affectant l'oxydation de la ûypbphane Ion de Iiodination d'un peptide ou Gune

protéine: le pH, la solution de réaction pour Ikdnation, la concentra6'0n relative de ûyptophane et des

autes acikies aminés telle la tyrosine et la disponibilité spatiale des résidus.

Les condiions dans lesquelles lbdination de I'Hexarelin ont eu lieux (pH 7 4 , laissent la possibili que la

tryptophane soit attaquée (Wolff et Covelli, 1969). Les airentes vaables de la r&cüon ont été 6valuées

de façon a favoriser le maintien de l'integité biologique du peptide, au lieu de maximiser riodination au

dépend du premier.

La radioiodinahn de Mexarelin donne un rendement d'incorporation d'iode radioactive de 6%. Cette

vdeur est représentaüve de I'iodinaüon d'un fragment peptidique ne possédant pas de groupement

tyrosine. Malgré sa disponibilité, le résidu histidyl est très peu utilisé comme molécule able, dû a sa

pauvre affinité pour I'iodinaüon. Deux grandes dÏÏcuttés peuvent venir contrer cette iodinatïon: (1) La

résistance pafüculi&e de Shisüdine a former un lien carboneiode sous ces conditions; et (2) la sdubilité de

lbdohistidine en solution aqueuse (Bninings et al., 1947). D'autres Meu rs a considérer comme les plus

importants aux conditions d'iodinaüon de I'histidne sont les propri6téç sbucturales de la protéine et surtout

les proprWs intrinsèques du résidu, c'est-à-dire, la rkactivite du groupement imidamle de l'histidine (Wolff

et Covelli, 1969). Pour en finir, Bolton et Hunter (1973) rapportent que la méthode d'iodination par la

chIoramine-T pourrait étre inadéquate pour des peptides manquant le residu tyrosyl.

iii) L'htarelix iodé

Nos résultats démontrent que le produl iodé de I'Antarelix est probablement sous forme de 3- et de 5-

mnoiodotyrosine (fig. 25). On peut aussi distinguer un 2e pic radioactif (-50 min.) qui poumit representer

la fom diiodée de la tyrosine. La dis ponibilU de plusieurs groupements aromatiques (nap hthyl, pyridyl et

chlorophenyl), a démont6 que des iodinaüon aubes que secondaires (diiodination), c'est-à-dire tertiaires,

sont possibles (fig. 25). De plus, un pic absorbant dans U.V. (-38 min.), n'ayant aucune radioadvit6

reliée, est enregistre et est probablement la représentation du peptide original non marqué. Si par contre,

des marquages accompagn6s d'une &naturation de la protéine (attaque aux r6sidus ou bris d'un lien

peptidique) ont eu lieu, elles sont en concentrations nbgligeaûies et non déectables A la sensibilii

préétablie des instruments. Ou, ils sont tout simplement blirninb au but &but lors de la &paration par

HPLC, ou alors ils se perdent dans le bruit de fond.

v -a Les résultats obknus lors de I'etude phamacociné(ique (fig. 40, tab. 3) de I'Antareiix ont démontré une trés

bonne stabiiii du produit iode in vivo. Ce& stabilité dépend en majeure parSe de la présence du résidu

tyrosyl, qui est parmi tous, le plus rkacof et aussi le plus stabie en raison de son lien covalent avec Ir&

(Karonen, 1990). Bien sûr, $autres groupements peuvent reagir grâce à l'iode activée (H~oI*), mais

malgré la dsponibilitt5 de ces groupements mentionnés, sur lesquels des halogénations à des niveaux

inconnus seraient possibles, I'iodinaüon se fait principalement sur la tyrosine sous fwme de 3- etlou de 5-

mnoiodotyroçine (Karonen et aL, 1 990). La forme diioàée de la tyrosine (3,5diodotyrosine) est aussi

probablement produite (fig. 25) et d'autres types dlodinations pourraient avoir l i eu dus aux extr&nes

conditions d'oxydation nécessaires à cette r6acüon (Karonen et al., 1990). Les r6sidus almes que la

tyrosine par contre pourraient souffrir des conditions d'oxydation a laquelle ils sont soumis. D'un aute

point de vue, Jorgensen et Slade (1971) ont démontré que malgr6 certaines conditions rigoureuses et

inadéquates pour les molécules biologiques, seule la tyrosine est iod& et non le groupement naphthyl.

Pour ce qui concerne les autres résidus aromatiques, chlorophenyl et pyridyl. aucune information

pertinente n'a pu étre trouvée dans la litterature.

IV.A.2 Chimie de chélation

La chélation est un moyen efficace de jumeler un radionudéide une molécule d'intérêt biologique, dans

notre cas un peptide, lorsque cette molécule ne possède aucun site permettant le marquage B Ibde, ou

lorsqu'un autre type de radionud6ides que l'iode est desiré, que ce soit pour des raisons de fenétres

6nergétiques, ou fi nanciéres. Plusieurs rnolkules peuvent &e exploitees et utilisées comme agent de

chélation. Le DTPA est probablement & loin, le ch6lateur le plus u61i& pour le marquage des molécules

biologiques (peptides, protéines, anticorps, etc.) B l'indium. Un exemple bien connu est l'("ln-DTPAI-

Ocbbtide decnt par Bakker et collégues (1 991) pour le diagnostic chez les patients atteints du cancer. Le

substrat B&H en est un de plas qui facilite le marquage des molécules biologiques, a lbde radioacüf

(Bolton et Hunter, 1973). Finalement, le dextran qui, grâce sa chaîne de polymères, permet le marquage

.I au ?C ainsi qu'a d ' a m types de radionud6ides sernbiables (possédant les mêmes exigences

chimiques) (Holmberg et al, 1 994).

Une chose les relie tous les uns aux autres, leur mécanisme de liason au peptide. Dans les Ws cas, la ,

rdaction se fait par substituoon nudéophilique (Solornon et Femandez, 1988), sur le groupement

carboxylique des agents de chélaüon, par les amines libres retrouvées chez le peptide. Cette r&acüon

f a m un lien covalent et stable in vivo qui permet lincorporation d'un radionudéide pour effectuer des

6tutudeç diagnostjques ou même thhpeutiques d'imagerie médicale.

La réadon se produit aux sites dianhydrew du DTPA en observant prinapalement, dans les condiions

données, la formation majeure #un lien h l'amine E et d'un second a I'amine a. II n'est pas impressionnant

de remarquer une tes fixk quantité de peptides beaucoup plus tard dans I'duüon (43 minutes) qui

pourrait représenter la forme doubiement liée (2 mdh les de DTPA) du peptide. Cependant, d'autres

liens ont pu se f o m r et les fractions observées lors de la purification peuvent etre tout autres que les

produits hypoth&ques (fig. 17). Le DTPA dianhydrew possède deux sites ré- et, pour cette raison. la

formation de dimères est possible. Toutefois, les condiions 21 laquelle la rbadion a eu lieu ne favorisent

pas cette condusion et les produits hypothétiques mentionnés en llA.4 devraient représenter la réalit6

malgr6 les résultats non concluants des tests radioimmunologiques. Bakker etal(1991) ont pour leur part

obtenu des r6suftats de monoliaison du DTPA B I'ûctréotide de 10% sur la quanüté initiale de peptide.

Ceci est prinapdement dû au ratio des substrats initidement ut%&; un ratio de 1:l de DTPA~peptide,

respectivement lu le même ratio est de 10:l ce qui diminue Anormêment les chances de f a m r des

&m&s (2 md&ules peptdiques pour un DTPA).

ii) L'Hexarelin-B&H

Le produit de Bolton et Hunter (N-hyboxysuccinimidyi p-hydroxyphénylproprionate) possède dans sa

structure un groupement ester qui est pmpice A la réaction de substitution nudéophiligue (Solomon et

Femandet, 1988). Cette r6aciion laisse sur la molécule peptidique la fraction phknyl qui peut être iodée à

l'avance et servir de chdateur radioactif a la moiécule peptKEque (Langone, 1989). La chimie de

Iliodinaüon du BW avant la réaction de œüe derni& au peptide (résuitais non présentés) ainsi que son

incorporation I'Hexarelin (molécule sensiblement fragile; voir NAl.ii), ont causé de sérieux

maux de tête lors des &pes de purification. C'est pour ces raisons que seuls les produits non iodés ont

&té 4tudiés. De plus, la chromatographie n'est pas des plus convainquantes et exprime de façon indirecte

la fatigue ressentie par la colonne (ODS, Bechan) lors des 6tapes de s4paration. Néanmoins, les

fractions pouvaient &te separées adéquaternent. Bolton et Hunter (1 973) ont obtenu une incorporation de

l'acide 3-(4-hydroxyphenyl) proprionique, de l'ester hydroxy-succinimide, allant de 13 à 53% (moyenne de

32%). De notre côté, la figure 29 montre bien une incorporation mpotentiellew de plus de 75%. Cette

différence majeure peut &re expliquée par l'accessibilité des différents groupements amines qui peuvent

reagir et fornier des liens stables. Dans le cas de la hGH (Bobn et Hunter, 1973), plusieurs de ces

amines, situbs sur les résidus lysines, sont probablement M a l e d d s 4 cause de la structure

triQmensionnelle que prend la molécule. la I'Hexarelin ne possMe que six addes aminés, ce qui

maximise les chances de liaison.

Le dextran possède une &rie de groupements hydroxyls pouvant &e iransfomés en liens réa& pour la

liaison aux amines peptidiques. II est par ailleurs dair que plusieurs peptides peuvent se lier au dextran

fwmant ainsi de nombreuses chaines secondaires peptkiiques (Hexarelin) a une seule molécule de

dextran. Le nombre & molécules peptidiques peut varier par mokule de dexîran et l'utilisation de la

colonne de purifidon PD-10 n'&nt pas de très bonne rbsolution, il est impossible de séparer ces

v .a dïïents produits (la purification par HPLC &nt fMement déconseillée pour la durabilii des colonnes de

séparation disponibles). II est toutefois dak que S4valuatbn de la q u a m de dexlran aclivé, &nt

maximisée et dans les limites du réel, un maximum de liaison simple de I'Hexarelin au dextran a pu êbe

atteint J

Le dextran a eté une tentative expéflmentée afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus avec

la matosMine (Hdmberg e f d , 1994), mais avec notre analogue de GHRP. La purification accomplie

montre qu'une q u a m importante de dexban libre a pu se joindre aux fiac%ons du Hexarelin-Dextran

récoltées. Cependant, I'él&nent important de cette purification est Fabsence de peptide libre dans les

fractions récoltées du complexe pour les études de RIA.

N.A. 3 Chimie de marquage direct

Une tierce alternative semblait prometteuse dans le marquage des peptides pour le dépistage du cancer;

celle du marquage direde. Par l'exploitation dune structure interne, comparable à celle d'un agent de

chblation kanger a la molécule, un peptide pourrait etre marquh radioadvernent avec des radioisotopes

plus intéressant du point de vue énergétique, chimique et financier. Cette méthode offrait une facilité

chimique (une &tape) pour un goupe de peptide ou de protéine possédant des waderistiques

semMaMes a celles de i'htaretix. L'Wnent le plus important de œ concept se trouve etre la tem'naiçon

triplement aminées de peptide. Trois groupements amines (fig. 20) pourraient omr les Bledrons

nécessaires a fincorporation d'une molécule accepûice; indium, technbtium, etc. II suffit que les b-ois

donneurs d'6lectron soient en posioon pour que le radioisotope puissent s'incorporer a la molécule

peptidique. Le DMF a seM de médiateur pour forcer la molécule A prendre la confmation désirée.

f En œ qui conceme l'analogue de la LHRH, i'Antarel'i, sa structure a été pensée et syntfiktisée afin

d'op'optimiser sa performance in MLOsur l'être humain d n d'inhiber la séaétion de la LH (Coy etal, 1982).

L'exploitation de sa temiinaison aminée comme chélateur interne semblait ouvrir une nouvelle avenue

dans le marquage radoactif des peptides. Mais malheureusement, les résultats a la figure 31 n'ont pu &re

reproduits. La seule explication applicable aux résultats obtenus ultérieurement serait que ce qui apparait

serait dü B un artefact et non 3 une liaison. Cette hypothèse est diiale a appuyer &nt donné que des

essais dans différentes condiins, au même moment, ont été effectués et ne démontraient aucune liaison.

tandis que le modèle suivi a la section l l A 6 démontre le contraire.

IV.B La biologie

N.B. 1 Études phannacocinétiques

La M e d'études biologiques de pharmacocinétique a W effectuée alin de déteminer la distribuüon

tissulaire des doiff6rents produits développés, pour évaluer la possibili de ces derniers a devenir des

agents diagnostiques pour l'imagerie médicale dans le dépistage des tumeurs.

i) Le MK-678 iodé

Le MK-678 iodé est un bon traceur in vko avec une très bonne stabilité et une bonne clairance sanguine

(voir Annexe 1). II est prinapaiement fi W du volume sanguin par le foie et se retrouve dans les intestins

dèç les 30 premieres minutes après l'injection par voie intraveineuse. Cependant d'autres &des

biologiques devraient etre entreprises avec une lignée tumorale comprenant des récepbeurs sensibles a œ

peptide. Malheureusement, les cellules tumorales utilisées (EMT-6) ne contiennent probablement aucun

récepteur compatible, contrairement demontr6 sur d'autres types tumoraux (Reisine ef a/., 1990). Les

r souches tumorales utilisées ne laissaient aoire en aucun temps qu'elles &taient dépourvues de 2.

v récepteun. Ces résultats ne nous donnent aucune indication sur i'éligibialé de ce produit a servir comme

traceur tumoral ii la détection des cancers chez l'humain.

ii) L'Hexarelin iodé

Les r6sultats obtenus lors de I'6tude pharrn~nét ique de I'Hexarelin iodé (fig. 36, tab. 2) ont démontre

une pauvre stabilité du produit iodé A vivo reprbsentée par le haut niveau de radioactivité retrouvb a la

thymide (foujours par rapport au NiifEl pure). Cet$ pi&e stabiiiiîé de la liaison de i'iode radioactive

dépend en majeure parlie de labsence de résidu tyrosyl. CHexarelin iodé est un pauvre traceur in vivo

avec une dairance sanguine plus faible que celle observée pour le MK-678 (Annexe 1). II est & 60% C M

par les reins et se retrouve en majeure padje dans l'urine. L'exa6tion est presque totale dés les 24

premi&es heures aprés l'injection i.v. Les données obtenues lors de I'btude de la biodisbibuüon montrent

bien que le produit est aussi constamment Blirnink par le bie sur la période entière de I'btude (24 heures).

Ces résultats pourraient néanmoins représenter le mouvement thyroïdien de l'iode libre dans l'organisme

de la soufis, faussant compléternent les observations. II ne faut surtout pas oublier que le produit injecté

&tait sous une forme hétérogene et que la dualité dans l'excrétion peut facilement être expliquée par œ

phénomène.

Il dot donc etre clair que des études futures, uI v h et h vivo, ûoivent étre faites pour essayer de corriger

le mangue de stabilité du produit iodé en dvitant d'utiliser des moyens chimiques trop runides pour la

molécule, ou en employant une nouvelle méthode de marquage ne requbrant pas la prksence de tyrosine.

En plus, @autres études biologiques devraient &re entreprises avec une lignée tumorale comprenant des

récepteurs sensibles à ce peptide. Malheureusement, les cellules tumoraies utilisées (EMT-6) ne

contiennent probablement aucun récepteur compatible et aucune souche cellulaire n'est fait mention dans

la I'irature possédant des r&pteurs identifiés de GHRP. Donc l'&Ride effeduée sur la lign& utilisée ne

I donne aucune indication sur l'6IigibiW de ce produit a servir comme traceur tumoral à la détecüon des b

cancers chez i'humain.

f .& iii) L'Antareiix iodé

CAntarelii iodé est relativement un bon traceur h vivo avec une bonne stabilii. II est ptMapalement

exmeté par le foie et se retrouve en majeure partie dans les selles dès les 12 premieres heures aprb ,

l'injection par voie intaveireuse (fig. 40, tab. 3). Sa ciairance sanguine (frg. 41) suit un modèle d deux

exponentielles, et se fait au rylhrne de -4.5 ml de sanghin (Annexe 1). D'autres etudes biologiques

devraient etre entreprises avec une lignée tumorale comprenant des récepteurs sensibles il ce peptide.

Malheureusement, les cellules tumorales uülisées (EMT-6) ne contiennent aucun récepteur compatible ou

elles en contiennent en quantité trop faible pour être &valu&. Ceci ne nous donne aucune indication sur

I'tiIigibilit6 de ce produit à s e ~ r comme m u r tumoral à la détection des cancers chez l'humain.

Plusieurs aspects de cette mol&ule biologique sont 4 la base de son intérêt pour l'imagerie médicale.

Prerniérement, c'est un peptide tes stable; une fois en solution, le peptide reste stabie plusieurs semaines

a basse température (fig. 57); deuxi&mrnent, elle se travaille bien en milieu organique; troisièmement, elle

est facilement marquaMe l'iode gr& a sa tyrosine retrouvée en position 5 (fig. 12).

IV.B.2 Essais radioimmunologiques (RLA)

La méthode de RIA est tph uüle pour l'identification de I'activite d'un agent biologique déteminé aiin de

mesurer le niveau de conservation de l'intégrité d'un site précis. Deux anticorps ont W développés B la

facuité de pharmacie de I'Universl de Montbal pour les deux terminaisons (amine et carboxylique) du

peptide Hexarelin. Ces deux anticorps semuaient très utiles pour des &udes d'identification des siteç de

liaison des diirents suMaCs rbagis à I'Hexarelin. Ce peptide poss6de deux groupements amines, un a la posioon a et l'autre A la lysine (position E ) , pouvant r&gir et fornier d*i&ents produits. C'est dans cet

optique d'identification que cette technique a été exploitée.

La possihili6 que le produit complexé Hexarelin-DTPA soit intéressant pour le dépistage deç tumeurs

reste a &e étudié. Le md&le tumoral utilisé ne semblait pas convenir au besoin recherché, malgré les

relativement hauts ratios aux différents tissus (voir taMeau 5, p. 66). La figure 44 monte dairement le haut

niveau de radioactivité fk6 aux reins et l'absence de radioactivité tumorale. Cependant les ha& niveaux

retrouvés aux reins restent a êîre plus profondément 6tudiés afin de conname le mécanisme responsabie

de cette spécitïdt6. L'Hexareiin, un GHRP rdik dans sa foncbon A la GHRH, powrait avoir un site de

liaison particulier au niveau rénal comme I'ont &montré ForsselEAronsson et ses colliigues (1 995) pour la

somatostatine. II est connu que cette derniére possède un effet antidiuréfique et que la section médullaire

du rein possMe de hautes densités de récepteurs pour ce peptide, et d'autres a plus faibles densites

distribuées de façon non homogène au niveau du cortex, c-M. aux tubules proximais et non aux

glomérules (Reubi etaL, 1993b). Ceci laisse la possibilité que daubes hormones (GHRP, GHRH) peuvent

agir de façon connexe aux mêmes sites pour peut-être conirer l'effet de la somatostatihe. Pour ces

raisons, l'analogue Hexareiin-OTPA devrait etre btudi6 plus intensément afin d'édairar se phénomène.

Notons que, Adnan ef a/ (1994) n'ont, pour leur part decouvert aucune fixation de l'analogue de la

somatoçtidine (lfl l n-DTPA-(D)-P hel-Ocb&tide) au niveau du rein chez l'humain.

ii) L'Hexarelin-B&H

Les r6sultats oknus montrent bien (fig. 49) que les fiacüons 4 et 5 ont conserve une affinité & liaison

respective de plus de 30% et de 20% aux deux anticorps, tandis que les fractions 2 et 3 I'ont presque

totalement perdue. Dans le cas où il y a consewab'on de i'inbogrité biologique du peptide, les expériences

n'ont quand même pas permis la classification des types de liens ente le peptide Hexarelin et le chélateur

B&H. Le fait qu'il y ait plusieurs produits lors de la chromatographie sugere la p r h n œ de plusieurs

r réactions entre les deux substrats. Cependant, les r6sultatç sérnent le doute en ce qui concerne la nature \

des complexes Hexarelin-BBH; la d&ermination d'une liaison a plut& que E ne peut &e evaluée. Si les

f

s fractions 2 et 3 avaient gardées une aflinité é seulement un des anticorps, liâentification du site de liaison

aurait pu &e détemine. Ces fractions auraient pu, dans le cas échéant &e investiguées plus

profondément afin d'exploiter au leurs potentiel diagnostique pour le dépistage du cancer.

Malheureusement, il en est but autrement, et c'est pour ces raisons que cette du projet B été mise ,

de côté.

Toutefois, malgré les piéûes condusions tirées des études faites sur les complexes Hexarelin-WH, les

autres 6tudes radioimmunologiques effeduees pour les complexes Hexareiin-DTPA et celles du Hexarelin-

Dextran ne viennent en aucun cas éclaircir le doute déja existant (fig. 48 et 50). Des etudes

spectrorn6tn'ques de masse des complexes de DTPA n'ont absolument rien amen6 de conduant (rbultats

non présentés). Par contre, les &udes d'imagerie SPECT f a i i sur le rat (résultats non présentés) ont

confirmé les observations faites chez la wuris concernant la fixation rhale du produit marque à l'indium.

Afin de deteminer la mol& des fiadons récoltées, un standard a été uüiisé m m point de référence.

Si, par malheur, une erreur s'est glissée dans le calcul des molarit& deç supposés complexes, il est fort

probable que les concenh-ations ont 6té exagérées. De plus, afin $établir une concentéition probable,

&nt donne que les fractions sont des supposées complexes peptideagent chélateur, des poids

moléculaires ont 6té atbibués B chacun. Ces valeurs ont été allouées de façon direde; par l'ajout du poids

moléculaire correspondant B une liaison simple ou double du chdateur. II est connu que la lysine possède

un groupement amine plus r8actif que celui en positions alpha (Gaudriauk et Vincent, 1992). Si un substrat

est en ex& (tel est le cas pour le BBH, le DTFA et le Dexûan), la majorité des produits seront basés sur

une seule moiécule peptidque (avec une possibilY de deux chdateurs par peptide, et non l'inverse).

Donc des poids similaires ont &é donnés aux deux premibres fractions du Hexarelin-DTPA et deux autes

aux Hexarelin-WH, tandis que des poids plus élevés ont 6té assignés aux dernieres fractions du

Hexarelin-DTPA et au Hexarelin-B&H.

1 Ces f&kurç peuvent avoir un effet négaüf sur les etudes entourant les produits synth6tisés et peuvent

contribuer aux condusions que ces agents mrnagerie sont inadéquats.

Le &&an est un agent fimagene non envahissant intéressant pour la visualisation de l'anatomie et des

mouvements cardiaques. II fournit une technique diagnoûtique d?ntér& pour le traitement des désordres

cardio1vasculaires (Borer et al, 19TI). Le choix du dextran axnme agent de chélaüon se résume a ceci: c'est un agent stable, il lie fortement le radÏoiisotope m c , la6~e); il passede une méthode de marquage

simple (basé sur la rbdudion de l'isotope), rapide et peu coûteuse; c'est aussi un agent B risque minimal

pour le paüent Par contre, le dextan, selon son poids moléculaire, peut rester dans le systeme sanguin

pendant plusieurs heures (Walkley et al., 1976).

r

%

Comme obsenk avec le DTPA, le dexlran de poids moléculaire de moins de 40000 est excrété par les

reins. Ce qui, comme dans le cas de I'Hexarelin-DTPA, aurait pu démonlrer une liaison parüculi&e au

niveau rknale. Les rh~ i ta ts de RIA obtenus de I'HexarelinDextran O- ralenti l'enthousiasme entourant ce

traceur, et les 4tudes pharmacologiques et phmacocinétiquas du produit lié au Y c , nbnt tout

simplement pas été entrepdses. Le mouvement vers la droite de la courbe &affinité du produit pour les

anticorps confirme la diminution de 15ntégnté du produit par rapport au standard. Cette diminution est

nomiale dû à l'&nome du &&an (1 OûOOglmole), par rapport B i'Hexarelin (886ghole), et ne devrait pas

affecter le cheminement de I'exploitaoon de œ produit vers le développement #un agent d'imagerie.

Cependant, le fait que des résultats sembiabies aient, une fois de plus, été obtenus pour les deux

anticorps, n'aident d'aucune façon a l'identification du site de liaison au peptide. De plus, n'ayant pas de

modeles himoraux adéquats, comme le démontrent les résultats de Hexarelin-DTPA, il n'a été d'aucun

i n t é t de pousser le développement du Hexarelin-Oexiran comme agent diagnostique pour la médecine

7 nudéaire. k

7

. Holmberg et ses coiiègues (1994) ont, eux aussi, eu espoir dans leur analogue de somatostaüne liée au

dextran et ont obtenu des nisuitats de liaison tumale s w q u e (58 %) beaucoup inférieurs a â'aaubes

types d'analogues de s ~ r n a t o ~ n e marquée (Bakker et al, 1991).

IV.B.3 Études de liaison in ~~

La LHRH (GnRH) et ses analogues sont connus c o r n &nt des ligands agissant, aux niveaux des

cellules tumorales abies, paf un mécanisme de liaison impliquant des récepteurs transrnembranaires. II

est donc possible de caractériser afférentes lignées cellulaires saines et tumorales pour un traceur defini.

En ce qui nous concerne, il est essentiel de savoir si certaines souches tumorales possèdent ou non, les

récepteurs nécessaires pour une bonne & M o n diagnostique.

Pour ce qui est des cellules tumorales EMI$ (lignée spécifiquement développée pour les souris BaiblC)

aucun essai de liaison h viiv aux récepteurs de GnRH n'avait W fait auparavant Les résultats

disponibles aux figures 51 il 54, montrent l'inefficacité de I'AntareK io& a se lier speafiquement aux

récepteurs de GnRH. Ces observations peuvent contenir plusieurs explications. Entre autres, les cellules

EMT-6 pouraient &e dépourvues de récepteurs de GnRH, ou en posseder une quanoté top faible pour

étre détectées. Le traceur pourrait aussi &re le facteur limitant dans ceüe &tude. Et finalement un

probléme technique au niveau du p m W e pourrait aussi venir Moquer la déwon des récepteurs

convoités.

La dua l i retrouvée dans les résultats de liaison in v i i , entre les cellules EMT-6 et MCF-7 (figures 51 a 56), laisse croire que l'analogue iodé de la LHRH n'est pas adéquat pour de telles expérimentations;

plusieurs chercheurs- ayant démontrés la pr6sence de récepteurs de GnRH dans plusieurs souches

tumorales induant les MCF-7 (Segal-Abramson et al, 1992; Mullen et al, 1993; Sake et al, 1994; Vincze

f

. etal, 1991; Yano etal., 1994). Cependant, les résuitab de liaison de I'Anatrelix iode la glande pituitaire,

représent6s A la figure 40, indiquent que i'hypothèse #un traceur inadéquat ne peut &e considérée.

Que œ soit lors des 6tutudes A v&, ou des tests de distributions tissulaires sur des souris portant Io ,

souche cancéreuse, la lignée tumorale EMT-6 n'a &mrW aucune sphficité à I'Antarelix iodé. Cette

souche himorale, Btant d'une origine mammaire. a W considérke comme pouvant possUer les

récepteurs de GnRH normalement retrouvbs chez plusieurs cellules de même provenance. Les résultatç

semblent r&v&er le contraire. Une des raisons pouvant expliquer ces observations peut &tre la

désensibilisation des récepteurs de GnRH qu'aurait pu subir les cellules EMT-6. Cette possible

désensibilisation peut être allouée a un usage excessif (plusieurs centaines de division mitotique) des

cellules, ou, malgré l'utilisation de protocoles déjà utilisés dans la littérature, à de mauvaises techniques

d'évaluation in &o.

En ce qui concerne l'existence de récepteurs de GnRH au niveau des cellules MCF-7, des résultats

relativement récents ont démontre I'incapacite de prouver une réelle liaison spéafique #un analogue

antagoniste de la LHRH (Mullen etal, 1993). De plus, la possibilii que i'analogue iodé utilisé ait pu subir

une perte d'activité spéafÏque, ne peut è e écartée. Néanmoins, la purification par HPLC (fig. 25) montre

bien la facilité à laquelle la séparation du complexe iodé, par rapport au peptide original. s'est faite.

Plusieurs types de cellules ont fai l'objet d'&des similaires. C'est le cas des LNCaP (Limnta et a/,

1992) et deç DU145 (Dondi et al, 1994), souches cancéreuses de la prostate; des OV-1063, cellules

Bpithbliales humaines des ovaires (Yano ef al, 1994); et des HEC1 A, cellules tumorales humaines de

l'endomètre (Emn et al, 1993). Ces âemi&res pourraient &e utilisées afin de bien démontrer que les

cellules utilis&s &aient, ou non, inadbquates. II ne faut surtout pas espérer trouver des récepteurs,

s w q u e a un ligand particulier, dans toutes les lignées tumorales. Comme il ne faut pas trop compter

sur des observations de liaison au site ultime (glande pituitaire), pour extrapoler ces rksuitats à cfaufres

sites secondaires d'intbrêt (les tumeurs). Mullen et ses collégues (1993) ont démontrb que des analogues

Y

.& se liant à des récepteurs GnRH du placenta ne se lie pas necessairement aux récepteurs de i'hypophyse. #

Marshail et Odeil (1975) ont aussi obsewé une non spéaficité de la LHRH iodé au niveau de membranes

de la glande pituitaire. Ces observations viennent confimr le fait que i'analogue de la LHRH, I'AntareIk.

est idéd pour aMer la glande pituitaire, et non pour seMr de traceur au dépistage de certains types de

cancer ailleurs dans i'organisme.

Les résultats obtenus de la liaison in v&o jumelés à cew observés Ion des &tudes in vivo démontrent

I'ineficacité de l'analogue antagoniste de la LHRH. IIAntarelk iodé, 8 servir d'agent diagnostique pour le

dépistage du cancer. Cette condusion s'applique aux études faites avec les cellules €MT-6, et avec les

cd 1 ules MCF-7.

Conclusion

L'utilisation des peptides pour le dépistage du cancer est une avenue en pleine expansion et semble &re

une aitemative intéressante pour détecter des tumeurs d'oigine mulople. Toutefois, la conception d'un

traceur tumoral ne peut être spontanée. Beaucoup de temps d7nvesügation et de patience doivent &re

investis afin damver fi un modèle profitable. II est important de bien définir, a l'avance, un modèle tumoral

pour s'assurer qu'il possède bien les wacléristiques nécessaires à une 4tude sur I'uülisaüon des

marqueurs peptidiques. La def de œ projet dépendait, avant Mme qu'il prenne forme, de la présence de

récepteurs spMques aux peptides uülisés.

Comme démontre dans cette rédation, les cellules utilisées n'&aient pas adéquates a ce type d'étude et

si elles démontraient fi l'occasion une certaine aRinité spécifique pour les cellules, les résultatç n'&aient

pas reproductibles. Malgr6 ce fait, certains produits tel que I'AntareI'i iode a demont& une forte liaison

aux tissus ables (hypophysaires), œ qui indique la possibiiiie d'une détecüon des cancers reliés à des

problèmes au niveau de la glande pituitaire. D'un autre cote, I'Hexarelin-DTPA, et peut-être la fom liée

au substrat B8H de I'Hexareline. avec son importante fixation rende, pourrait seMr a certaines études

diagnosüques: Par exemple, pour les carcinomes cellulaires rbnaux (Reubi efaL, 1992), ou pour effectuer

des 6bdes au niveau de la région médullaire rénale (Reubi etal, 1993b).

II est important de noter que les peptides utilisés dans ce travail de maitrise avaient été syntMtisés pour

remplir des rdles pharmacologiques aubes que la détection cancéreuse. Le but etait d'exploiter les

caractérisîiques de ces peptides afin Ben faire, en les modifiant, des agents diagnostiques. Les methodes,

les résultats, et les condusions tirés suite aux expérimentations sauront je l'espère, édairer les prochains

candidats qui oseront se lancer dans l'exploitation des peptides pour en faire des agents &agnostiques

pour le dépistage du cancer.

Je voudrais but d'abord remercier le Dr. J.E. van Lier pour la grande autonomie qu'il m'a allouée; sans lui,

le projet n'aurait pu prendre forme. Je voudrais &aiement remercier les Dn Nicole Brasseur, Jacques ,

Rousseau et René Ouellette pour leur patience face aux nombreuses questions et pour leur souüen

technique.

Je voudrais remercier les DE Benoit Paquette et J.E. van Lier du Departement de médecine nudéaire et

de radiobiologie, ainsi que le Dr. Gaétan Guillemette du Departernent de pharmacologie, à qui a été

imposé la tache ingrate d'arbitre pour ce mémoire.

Je voudrais finalement remercier spécialement Francine Lussier, sans qui Itéd'ication de ce memoire

aurait 6te beaucoup plus pénible et tous les gens du département pour leur disponibilité, leur amitie et leurs

encouragements continus tout au long de ces années.

Bibliographie

Adrian, H.J ., Dorr, U., Bach, U., Bi hl, H. (1 994) Bid/Sa7O&on of of I lln-Penhpepbüe and Dosimelnc Cons/&mtion W& Respecf ta Somtostaon Reeqptor fipresshg Tumor Burden. Biodisûibution and Dosimetry. 1 û-23. J

Aiexander, N.M. (1 973) ûxkiabun and oxidbve deavage of oypfophanflpeplW bonds during iodhation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 54(2), 614-621

Allain, Y.-M., Giraud, B., Labrie, F., Malkani, K., Porter, AI., R o m , R. (1994) Cancer de la pms&fe: Approches sbafdg@ues et #dmpeubque. (eds) Amette, Pans. 243-277.

Amer, P .V. The b3-adrenergic receptor - a wuse andcure of o s (1 995) The New En gland Journal of Medicine. 333 (6), 382-383.

Anrat, E., Gianoüi, L., Di Viol L., Irnbirnbo, B.P., Lenaerts, V., Deghenghi, R., Carnanni, F., Ghigo, E. (1995) Modulabun of GroHaZ Hormone-Releasing AcOvil of Nexareh in Man. Neuroendoainology. 61 ,51-56.

Anrat, E., Gianotü, L., Grottdi, S., Imbimba, B.P., Lenaerts, V., Deghenghi, R., Cammani, F., Ghigo, E. (1994) Aghlire and Growol Homone-Releashg Hormone Resfore f ie Blunted GrowlYl Homone- Reliashg a c M i of Hexareh ih E/dedy Subjeck. J. Clin. Endocfin. Met 79 (5), 1 440-1443.

Bajusz, S., Janaky, T., Csemus, V.J., Bokser, L., Fekete, M., Srkalovic, G., Redding, T.W., Schally, A.V. (1 989a) MghQ pofent me@//opepb'de analoges of lufehking hormone-releasing homone. Proc. Nd. Acad. Sa. USA. 86,631 3-631 7.

Bajusz, S., Janaky, T., Csemus, V.J., Bokser, L., Fekete, M., Srkalovic, G., Redding, T.W., Schally, A.V. (1 W b ) H@h& potent analoges of L M twn&/ining D-Phenylalanhe nnloagen musld in position 6 Proc. N d . Acad. Sci. USA. 86,6318-6322.

Bakker, W.H., Krenning, E.P., Breeman, WA.P., Koper, J.W., Koaij, P.P.M., Lameris, J.S., Reubi, J.-C., Visser, T.J., Lamberts, S.W.J. (1 991 a) ln vivo use of radoiidined somafosl7on analog: d p m i i , me&bo/ism and binding lu sornalos&biI re~~pftorpos~ve furnos in man. J . Nud . Med. 32,ll84-1189.

Bakker, W.H., Alben R., Bruns, C., Breeman, WAP., Hofland, L.J., Marbach, P., Pless, J., Pralet D., Stoitz, B., Koper, J.W., Lamberts, S.W.J., Visser, T.J., Kreening, E.P. (1991 b) [Illln-ûTPA-D-PheV OC5TZIOb'de, a apotenüa/~diophatmacceul).~/ /or imagihg of somatos&bh m p for-posiîSve furnom: Syn6îes&, radolabefng and in v h vafdation. üfe Sciences, 49,1583-1 591.

Bakker, W.H. (1 992) RadlphamaceubOw/s hr sah@#phy of somatoshtin receptor-poshfve tumors. université de Rotterdam. Thèse de Doctorat University Hospital Rotterdam. Rotterdam. The

J Netheriands.

V

Behre, H.M., Nashan, O., Hubeit, W., Nieschlag, E. (1992) Dept GnRH agonist b / i ote andrage- hduced suppression of spemafoggeulesis in a d a l hb/ Ibr male wntrac;epb'on. J. Clin. Endocrinul. Mdab. 74,84-90.

Bischof Delaioye, A, Delaloye, B. (1995) Tumor /mghg W& Monodonal An@oadis. Seminars in Nudear Medicine. 25 (2), 144-1 64. #

Blake, A.O. and Smith, R.G. (1991) Desensitiz;a&n sfud&s usingpe&/sedrafpiiui2îly mY.s sbowgm~@5 homone-deashg homne and H&--P TpAa- TpD-Phe-Lys-NH2 sbmulafe growot homone dease 6ç1rvugh dsbncf recepfors#es. Journal of Endoainology. 129,114 9.

Bolton, A.E., Hunter, W.E. (1 973) The hbelng of pmfeihs tu h@h sp&c activri3'es by wnjugabon fo a '25f-con&/ithg acflating agent Biochem. J. 133,529-539.

Borer, J.S., Bacharach, S.L, Green, M.V. et al. (1 977) ReaM'me radinucMe cheangiogrhy in he noninvasive evaluation of global and regMnal leR venûlew/ar hnction at rest and dukg exercise in pabents w i i wronary-adety disease. N. Eng. J. Med. 296,839-844.

Bowers, C.Y., Momany, F., Reynolds, GA., Chang, D., Hong, A., Chang, K. (1980) Strucfure-acbvip rdabonships of a syn fiebc pentapepb'de &?at spe&iw//v releases gram honnone in v ih . En docrinology . 106,663-667.

Bowers, C.Y., Sartor, A.O., Reynolds, GA., Badger, T.M. (1991) On tfre Action of bSe Gmwol Hormone- Releashg Uexapebide, GHRP. Endocrinology . 1 28 (4), 2027-2035.

Bowers, C.Y. (1 993) GroM Hormone-Refeaslng PephiXe - Smcfure and Kineb*~. J of Pedlabc Endocnnology. 6(1), 21-31.

Brunings, K.J. (1 947) Pi-epambun andPmpe&és m e /odohisMes. J. Amer. Chern. Soc. 69,205208.

Burgus, R., Butcher, M., Amoss, M., Ling, N., Monahan, M.W., Rivier, J., Fellows, T., Blackwell, R., Vale, W., Guillemin, R. (1 972) Pn'may saUcfure of d're ovhe hypobCIalarnic /lufhiuhg homone-releashg homone facfor (Mo. Proc M. Acad. Sa. USA. 69,278-285.

Carone, FA., Stetter-Stevenson, M A , May, V., LaBarbera, A., Flouret, G. (1987) Differennaes beween in v&v and in vivo degndation of LH-RH by yratbrain and ofier oqans. Am. J. P hysiol. 253 , E3l TE321 .

Cella, S. G., Locatelli, V., Poratelli, M., De Gennaro Colonna, V., Imbimbo, B.P., Deghenghi, R., Müller, E.E. (1 995) Hexarh a Pofent GHRP Anafwue: lnferacciHs W& GHRH and Clonidine in Young and Aged Dogs. Peptides. l6(l), 81-86.

Cheng, K., Chan, W.W.S., Barreto. A-, Convey, E.M., Smith, R.G. (1989) nie syneg&tic efecfs of H M - f

TpNa- TpD-Phe-Lys-N.2 on gram homone (Gff)-deashg facor-stimuhfed GU re/ease and inWlular adenoshe 3 J:5%onopbosphate accumu/abon in fie rat pnhaty cet7 cufkve. Endoainology. L

124,2791-2798.

Codd, E.E., Shu, A.Y.L., Walker, R.F. (1989) Bhdng of a g m m hormone lereasing hexapp~de to specBsc hpfia/amic andpifu&y bhding sites. Neurophamacology. 28,11391 144.

C

Conley, L K., Te&, JA, Deghenghi, Ra, Imtirnbo, B.P., Giusüna, A., Locatelli, V., Wehrenberg, W.B. (1995) Medankm of Acdon of Hexarefin and GURP4: AnaI)rs/S of me hvolkement of GHRH an Somalos&bn in fie Rat Neuroendoainology. 61 ,4450.

Conn, ?.M., Crowley, W.F. Jr. (1 991) Gonadobpp/iI-re/easlng hormone and 8 analogues. N. Engl. J. Med. 3NI93-lO3.

Coy, D.H., Horvath, A., Nokola, MN. Coy, EJ., Erchegyi, J., Schally, A.V. (1 982) Pepbae anhgonisf of W- RH: hge ~ircreases h annboyulahxy aciïwi5es producGd by basic Damino a ~ d s in bse sir posiOon. Endoainology. 110,1445-1449.

Dahl, K.D., Bicsac, TA., Hsueh, A.J.W. (1 988) Nafu/al& ocwnng antihomones: secretion of FSH antagonisi3 by women beafed w# a GnRHanat'bg. Science. 239,72-74.

Daneshdaost L., Paviou, S.N., Molitch, M.E., Gennarelli, TA, Savino. P.J.. Sergott, R.C., Bosley, T.M.. Rivier, J.E., Vale, W.V., Snyder, P.J. (1 990) lnhifion of Wde-sbinulabng hormone s e m h fiom gonadibvph adenomas by rqmb;b've adminisbabon of a gonadobpp/iIs-re/easing hormone an&gonkL J. Clin. Endoainol. Metab. 71,92-97.

Darnell, J., Lodish, H., Baltimore, D. (1990) Molecu/arCeIlBio/ogy (2e 6diion) Saentific Amencan Books, New York.

Davidson, J. S.. flanagan, C A , Becker, I.I., Illing, N., SeaHon, SC., Millar, R.P. (1 994) Mofecular funcbon of ~e gonadobuph-refeas~ng homone mpfoorr hs@h& h m site-direcfed mut?genesis. Molecular and Cellular Endocnnology. 100,944.

Deghenghi, R., Bouügnon, F., Wiithrich, P., Lenaefts, V. (1993) An&relU.(Ef ZW") a novel watersohbfe LHRHan&gonnisl Biomed and Phmacother. 47,107-1 1 0.

Deghenghi, R., Cananzi, MY., TorseIlo. A., Battis& C., Müller, E.E., Locatelli, V. (1 994) GH-/e/eashg activ* of Hexarekh, a new Gmwrol Hormone-Releas~ng Peptide (GHWJ in khnt and aduk ta&. üfe Sciences. 54 (1 8), 1321-1 328.

Dickson, S. L., Leng, G ., Robinson, I .C A.F. (1 993) Systemic Adminisbation of Gmwfh Homo~e-Re/easing Peptide Acbvates Hypo~alarnic h a f e Neurons. Neurosciences. 53 (2), 303-306.

v Dondi, D., Limonta, P., Moretli, RM., Marelii, M M , Garaüini, E., Motta, M. (1 994) Anb~ml~/ative E&& of LufeiMhng Homne-re/issing Honmne (LHRH) Agun&& on Human Andpgen-independent P d f e Qvncer Ce1 Line DU Evriienœ Ibr an Aufarrne-tirh/;b&y LHRH Lmp. Cancer Research. 54,4091 - 4095.

Eidne, KA., Ranagan, CA, Millar, R.P. (1985) Ganadobapin-re/easasing homone binding &es in human bmast camhoma. Science. 229,989. a

Eidne, KA., Flanagan, CA., Harris, N.S., Milla, R.P. (1987) Gonado6-op1iI-rel&asrirg homone (GnRff)- binding s2es in human bmst wnœr ce// lines and InhriFlifay enécts of GnRH anÉigonk&. J. Clin. Endocrinol. Metab. 64,425.

Gnons, G., SchrBder, B., Orûnann, O., Wesiphden, S., Schulz, K.-D., Schally, AV. (1993) H&h AffKt/ïL Bfiding and D i k t Anb@m/&m6've E&c& of Lu127liiEng Homone-Re/eas/Rg Homone Analqs h Human Ena'umebial Caner Ce8 Lhes. J. Clin. Endoainol . Met 77 (6), 1 4%-1464.

flouret, G-, Stettler-Stevenson, M A , Carone, F A , Peterson, D.R. (1984) E~~rna0cdeg~dad:olm dLH- RH and anafogs. /ln: Vickea B.H. Nestuc JJ. Jr., Hat& ESE (ka$) LHRH and A3 anafbgs. MTP. Press, Lancaster, 397-41 0.

Foekens, JA., Klijn, J.G.M. (1992) DiMtAnbïumorEffe&ofLH-RHAna/qs. Recent Resultç in Cancer Research. 124,747.

Forssell-Aronsson. E., Fjalling, M., Nilsson, o., Tisell, L.-E., Wlngberg, B., Ahlman, H. (1995) fndim-Ill Activq Concenîbtion ih Tissue Samples AAer Inhvenous lnjetion of lndlm lll-DTPA-D-Phe- I- Ocb-eobYe. J. Nud. Med. 36,742.

Frohman, LA., Downs, T.R., Kelijman. M., Clarke, LJ., Thomas, G; (1990) Sumatostaon S c ~ t i ~ n and Atm in fie Regulaifion of Gmwol Homone &mOun. Metabolism. 39 (9), suppl.2,43-45.

Gaudriault, G., Vincent, &P. (1 992) Selective Labelng of a- or eANro Groups lh Peptides &y d'le Bolton- Hunter ReagenL Peptides, 13 , l I 87-1 192.

Guillaume, V., Magnan, E., Catafdi, M., Dutour, A., Sauze, N., Renard, M., Razafindraibe, H., ConteDevolx, B., Deg heng hi, R., Lenaerts, V., Olivier, C. (1 994) GmW HomKne [GH)-Releasing Homone Secretion 1s Slmulatedby a New GH-Releashg gHexapepiti$e ln Sheep. Endoainology. 135 (3), 1073-1 076.

Guillemin, R. (1 978) Peptides in ae brain: fie new endmnofqqy of b Saence. 202,390-402.

Guyton, A.C. (1 987) Human Physh/qqy and MeCnanisms of Dbeases. Fourth ebion. W.B. Saunders Company. 631 -632.

Habenitch. U.F., Schneider, M.R., O Etreby, M.F. (1990) EffectofotenewpotentLH-RHanfagonistantde. J. Steroid Bkochem. Mol. Bi01 .37,937-942.

J

7 Hadiey, M.E. (1992) Wacnirak.py. (3e (3en). Prentice Hall, Englewood Cl i i . New Jerçey. *&

Henze, E., Robinson, G.D., Khul, D.E., W b e R H.R. (1982) TC-99m Dexban: A New Bfd-ho / - La&/ing Agent lbr Radionudide Angimrdiimph+ J. Nud. Med. 23,348353.

Hofmberg, A., Marquez, M., Westlin, J.-E., Nilsson, S. (1 994) Prepamtiun, ln V 7 Bhding, And Tednebum99m La&//ing of Somtosbün-DeXlt.an Chyuqates. Anfibody, imunocanjugates, and , radiophamaceuticals. 7(4), 253-259.

Hsueh, A.J.W., Schaeffer, J.M. (1985) Gimdobppin-re/eas/hg homne as a paramne homone and neumbansmh7er b e&-pi&iry stes. J. Steroid Biochem. 23 (5B), 757-764.

Hughes. J., Smith, T.W., Kosterfii H.W., Fotherhill, L A , Morgan, BA., Moms, H.R. (1 975) lden~cation of riuo relaaodpptides hm bSe bain *potentopate agonisf a*. Nature. 258,577-57'9.

Hugha, W .L. (1 957) The ChemWy of /odhaiion. Annds New York Academy of Sciences. 70,3-18.

Huhtaniemi, I.T., Dahl, K.D., Rannikko, S., Hsueh, A.J. (1988) Semm bioacbve and immunoreactive h//ic/e-sbmu/ating homone in pros&tic cancer patients duhg gonadob-oph- fefeashg homone agonist b-eaI)nentandaflerorchlaecfomy. J. Clin. Endoainol. Metab. 66,30831 3.

Hunter, W.M. and Greenwood, F.C. (1962) Preparabun oflodinel31 LaktAedHuman Gmwt9 H o m e of H@h Specic Acb'vii Nature. 495496.

Hussain, AA., Awad, R., Crooks, P A , Dittert, LW. (1 993) Chfummlne- T in Radiofaùe/ing Tedrniques: Mnebii andMedranism of b9e Reaction befween Chummiine- TandAmino Acids. Analyücal Biochernistry. 214,495499.

Jorgensen, E.C., Slade, P. (1 971) rnymxiire Anal~s. 20. Subso'fufed 7- and 2- Naphbiyl Ehem of $5 Diadopmshe. J. Med. Chem. 14(1 l), 1023-1026.

Karonen, S.-L. (1 990) Devefopmennts in leï%n@ues kK ma%oiodhabon of ppMe homanes and o b k pdehs. Scand. J. Clin. Lab. lnvest 50 (Suppl. 201), 135138

Katuing, B.G. (1995) WC and M m / phamaw/kyy 6th edioon, Appleton and Lange, Noiwalk, Connecticut, 460-477.

Klibanski, A., Jarneson, J.L., Killer, B.M.K., Cmwley, W.F. Jr., Zervas, N.T., Rivier, J., Vale, W.V., Bikkai, H. (1 989) Gonadoboph and abha-subunif responses n7 chmnic gonadobph-releasing hormone analog adm/i7&batcon in patients wil? g&copmferir hotmone-secretin9 lumors. J. Clin. Endoaino1 . Meta b. 6 8, 8 1 - 86.

Korbonitç, M., Trainer, P.J., Besser, G.M. (3 995) n e ehcf of an opiafe anbgonisi on b<le h o m a l changes induced by hexarein. Clinical Endacnnology . 43,365-371.

Krenning, E.P., Kooij, P.P., Bakker, WH.. Breeman, WAP., Postema, P.TE, Kwekkeboom, D.J., Oeil H.Y., l r ! De Jong, M., Visser, TT., Reijs, AEM., Larnberts, S.W. (1994a) RadbbCIerapy WB a RadbkrberdId

SoMos&6h Ana/que, [ I f f/mD TPAWhe-bde: A Case Hsfoy. Ann. New York Acad. Sa. 496- 506.

Krenning, E.P., Kwekkeboom, D.J., De Jong, M., Visser, T.J., Reubi, J -C. Bakker, W.H., Kooij, P.P., Lambertç, S.W. (1 994b) Essendak of PepMe Rec~pfor Sabbgmphy WW hphas& on &e lSrornatos&bh , Analog OcOeOtide. Seminas in Oncology. 21 (5), suppl.13,6-14.

Krohn, A.K., Knight, L.C., Hamig, J.F., Wefch, M.J. (1977) Di#krenœ in fie slies ofidhabon ofpmfehs @/Iowbg burmefiods of radoiodhation. Biochemica et Biop hysica Acta, 490,497-505.

Lamberts, S.W.J., Bakker, W.H., Reubi, J.-C., Krenning, E.P. (1 9%) Cknimal Applition of&mafos&bn Analqs; Pad /. fieabnent wii Sandos&bh and In Wvo Lodhbon of Tumo~ W# RadrÔlabe/ed SomafosltiMna/ogs. Metabolism, 39(9), suppl.2,152-155.

Langone, J.J. (1 989) Radoiodhabun by Use of Ihe Bolton-Hunter and Relafed Reagenb. Meütods in Enzyrnology. 70,221 -243.

Laron, Z., Frenkel, J., Gil-Ad, I., Klinger, B., Lubin, E., Wuthrich, P., BouGgnon, F., Lenaerts, V., Deghenghi, R. (1994) Gram hormone rieashg a&@ &y hiianasa/ admlnishtion of synbCIe6c hexapeptide (hexarreln). Clininic Ertdocfinology 41,539541.

Lei, T., Bucherfelder, M., Fahlbusch, R., Adams, E.F. (1994) GmwiH h o m e (GHJ deashg pepbide (GHRV stimuhted fpnnafiôn of inoslio/ phosphafes in h u m pifuifary sumatobr,phhinomass Journal of Endocrinology. Abstract 143, suppl. 52.

Lewin, M. J ., Reyl-Desmars, F., üng , N. (1 983 .) SomafociM recepfor mupfed w~ MP-dependenf prvfein kinase on &e anfe~orpifuthygranules. P m . Natl. Acad. Sa. USA. 80,6538-6542.

Urnonta, P., Dondi, D., Moretti, R.M., Maggi, R., Motta, M. (1992) AnOpro/ifembve Eficts of LufehEng Homone-Refeashg Homone Agonis& on he Human Pmsbtic Cancer Ce// Line LNCaR J. Clin. Endoainol. Met 75 (1 ), 207-21 2.

Loumaye, E. D. and Ca& K. J. (1 983) Agon&t-fnduœd figulation of Ph&ry Receptors for Gonadohph Releashg Homone. The Journal of Biilogicai Chemisûy. 258 (1 g), 12002-1 2009.

Macaulay, V.M. (1 992) InsulK-/ike grvwol factors and wnax Br. J. Cancer. 65,3 1 1 -320.

Maaaio, M., Anrat, E., Procopio, M., Gianoto, L., Grottoli, S., Imbimbo, B.P., Lenaeits, V., Deghenghi, R a l Camanni, F., Ghigo, E. (1995) Me&Oo/ic MModula of Be GroW HotmoneReIeashg AcbvQ of Hexarkn in Man. Metabolism, 44 (1 ), 1 34-1 38.

I Marshall, J. C. and Odell, W. B. (1 975) Prepambun of Bio/cyiw//u Acbve f 2 % ~ f f - ~ ~ Su&OIe br Membrane-Bhding Sfudies (38806). Proc. Soc. Exper. Bio . Med. 149 ,351 -355.

%

v Matçuo, H., Baba, Y., Nair, RM., Arimura, A., Schally, PLV. (1971) Sbuclure of lYle pamne LH and FSH- .r: e/eas~ng humne: l: The pmpsed amho a d sequene. Biodiem. Biop hys. Res. Comm. 43, 1 334-

1339.

Miller, W.R., Çcott, W.N., Morris, R., Fraser, H.M., Sharpe, R.M. (1 985) G r a m of human breast Cancer edls /irh&ifedbya lufehwng honnone-&easlng hormone agoM Nature. 3 1 3,231.

Moreüi, J.-L., Rigo, P., Bischof-Delaloye, A., Taillefer, R., CaillatVigneron, Ne, Karcher, G. (1991) /mage& nud&ii foncb8nneMe. (eds) Masson, Paris.

Mullen, P., Bramley, Tm, Menzîes, G., Miller, B. (1 993) Falun to Detect Gn-RH Receptois in Human Ben& and Ma/Slant Breast nssue and in MCF-7 and MDA-MM31 Canaer Ce/&. Eur. J. Cancer. B A (2) ,248252.

Müller, E. E., Cella, S.G., Parenti, M., Deghenghi, R., Locatelli, V., De Grennaro Colonna, V., Torsello, A.. Cocc hi, D . (1 995) Somalofropic Dysrqulation h Ofd Mammals. Hormone Research . 43,39-45.

Olson, GA. R.D. Olson and A.J. Kustin (1989). Endogenous ophte. Peptides 10,20536.

ûtt, R.J., Flower, MA., Babich, J.W., Mandon, P.K. (1988) i7jephysiics ofradioisotope imaghg. /ln: Tlie physii of Mediillmaghg. (eds) S. Webb, IOP Pubiishing .

Preisler, H.D. (1 994) The LeukeBia. Disease-a-Month. 40 (1 O), 525-580.

Prévost, G., Lanson, M., Thomas, F., Veber, N., Gonzaiez, W., Beaupain, R., Starzec, A. (1992) Mo/ecular hefemgenew of somatoslabn anafog HM-23074C recepfom in human breast wrcinma cels ushg ~e chemiwl cross-lliïkhg assay. Cancer Research. 52,843-850.

Reisine, Tet He, Hm-T., Rens-Domiano, S., Martin, J.-M., Raynor, K., Borislow, S., Thems, K. (1990) Bi iemiwf Propedes of Somafoshbn Recephm. Meta bolism. 39 (9), sup pl .2,70-73.

Reissmann, T., Hilgard, P., Harleman, J.H., Engel, J., CornaruSchally, A.M., Schally, A.V. (1992) i ieahwt lof e x m e n & / DMBA hducafmamrnary amnoma wm Ce6-orehx (SB-7q: a potent antagonlst of lutehwng homone-deashg hormone. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1 18 ,4449.

Reu bit J .-C., Kvols, L. (1 992) Somafosiab Recepfo~s in Human Cell Carunornas. Cancer Researc h . 52, 6074-6078.

Reubi, J.Ç. (1 993) The role pfpepbaes and UIerirecepto~ as funwr manie^. Endoain. Met Clin. North Arne&. 22 (4), 91 7-939.

Reubi, J.-C., Krenning, E., Lamberts, S.W.J., Kvols, L. (1993a) ln Ir70 Deteeban of Somatos&tin Receptorsin Human T u m . Digestion. 54, supp1.1,76-83.

Reubi, J-C., Horisberger, U., Studer, U.E., Waser, B., Laissue, J A (1 99313) Human Kdney as Taget tlbr .r! Somaos&tin: HM MMy Reaepfo~s lir Tubu/es and Vasa Re&- J- Clin. Endocnn. Met 77(6), 1323-

1328.

Riordan, J.R., Rommens, J.M., Kerem, B., Aion, N., Romahel, R., Grzelczak, Z., Zielensky, J., Lok, S., Plavsic, N., Chou, J.-L., Drumm, ML, lannuzzi, M.C., Collins, F.S., Tsui, L X . (1989) 1denb;liition oflYle C ' c Fbms13 Gene- C/on/hg and ChamCfe/L.aa'on of &e Complemenhy D M Science. 245, 1066- 1072.

Roemer, D., Buescher, H.H., Hill, R.C., Pless, J., Bauer, W., Cardinaux, F., Close, A., Hauser, D., Huguenin, R. (1 977) A synbebc enkephalin analque wM pro/ongerparenfera/and oralanalgesic acb'vii Nature. 268,547-549.

Roumi, M., Lenaertç, V., Boufjgnon, F., Wuthrich, P., Deghenghi, R., Bellemare, M., Adam A., Ong H. (1995) Radbimmunoassay br hexarekin, a pepbaic grou& homme secre&agouel and iis phamawkine6~. Peptides. 16 (7), 1 30 1-6.

Saha, G.B. (1 992) Fundamen&& of Nuclear Phamacy. (3e édition). Springer-Verlag. New York. 83.

Salacinski, P.R.P., McLean, C., Sykes, J.E.C., Clement-Jones, V.V., Lowry, P.J. (1981) /odlnabon of Pmfehs, G&wpmfehs, and Pepliaes Ushg a SOM-Phase Oxiiwng Agent Ir3.4,6-Te~ch/om3~,6tr- dpnenyl G&w/un'l(lodugen}. Analytical Biochemistry. 1 17,136-1 46.

Sandow, J., Kdnig, W. (1979) Sfudies W'i hgmenis of h@h& acbve ana/ogue of lufe~h/iing homone releasing homone. J . Endoainol. 8,175- 1 82.

Sandow, J., Stockemann, K., Kibet, P.G., Lill, N.M., Neubauer, H., Jerabek-Sandow, G., Hahn, M., Kille, S. (1990) Effecf of a new LH-RH antaganist on DMBA-hduced mammay furnous. 2nd international symposium on 'Hormonal manipulation of cancer: peptides, growth factors and new (an5)steroidal agents', Rotterdam, 911 April (Abstract 116). Eur. J. Cancer. 26,175.

Schally , A.V., Coy , D .H. (1 983) Stimulafoy and hh&ifory anafogs of LH-rdeasing homone. ln: McCann, SM, Dhinlda, D.S. ( e w Role ufpep6'ües andpdeibs h mnbnl of ~producüion. Bsevier, New York. 89- 110.

Schaily, A. V. and Redding, T. W. (1987) &rnatoss(in analogs as aqunci3 b? agomsts of/ufe/hrUng homone-releasing homone in bie &abnent of expenment3/pms&fe w n a e ~ Proc. Nd. Acad. W. USA. 84,72757279.

Schally , A.V. (1 988) Onmrg/iml AppfiwiTbns of Somafohtin Ana/ogues. Cancer Research. 48,6977- 6985.

Schally, A. V., SrMovic, G., Szende, B., Redding, T.W., Janaky, T., Jushasz, A., Korkut, E., Cai, R.-Z, Szepeshazi, K., Radulovic, S., Bokser, L., Groot, K., Serfozo. P., Comaru-Schally, A.M. (1990) Anoitmur

7 E H of Analogs of Lff-RH and Somatos&tin: fipenmennta/ and Chi'a/ Sfudies. J. Steroid Biochem. \

Malec. Biol. 37 (6), 1061 -1 067.

.& Seevers, R.H., CounçelI, R E (1 982) Rad&M/ i rn Teclln@ues fw S m Organic Mofecu/es. Chem. Rev, 82,575590.

Segd-Abamson, T.,Kiioser, H., Levy, J., Schdly, A.V., Sharoni, Y. (1 992) Diled eWt of lufeMing tionnone-deashg hormone agoni$& and an&gonkls on MCf7mmma1y wncer œ//s Roc. Natl. Acad. Sci. USA. 89,23362339.

Sharoni, Y ., Bosin, E., Miin&, A., Levy, J., Schally, AV. (1 989) hh&iDon of gmwbS of human mammaty fumor ae/s &y polent anbgon&ts of lufe/irwng homondeasli?g homne. Proc. Nd. Acad. Sa. USA. 861164&1651.

Solomons, T.W.G., Femandez, LE. (1988) Urganic demis& Fourth edion. Witey (eds), USA.

Sonoda, S.. Schlamowitz, M. (1970) Sfudies of '7 Tme Laoelig of fmmu~obl i r G &y Cliommhe-T: Immunochemistry. 7,885898.

Stryer, L. (1988) Biochemisby. (eds) Freeman, New York.

Szende, B., Lapis. K., Redding, T.W., Skalovic, G., Shally, A.V. (1 989) GroW lnluil%on of W t a m m a y wmboma by enhanchg ppgrammed ml deaüi (apoptos/S) M anafbgs of LH-RH and sornatos&tin. Breast Cancer Research and ireaiment 14,307-31 4.

Szende, B., Sikaiovic, G., Groot, K., Lapis, K., Schally, AV. (1 99Oa) Growth InhibiQon of Mouse M X Mmmary Timor by &e Lutehwng HomoneRefeashg Homone Antagonkt S M J. Nd. Cancer InsüMe. 82(6), 513-517.

Szende, B., Srkalovic, G., Groot, K., Lapis, K., Schdly, A.V. (1990b)Reg/ession of nlaasamide-~flduced pancleabc wnœs 1h hamsfen lreated lulîn lufenking homane-refeashg homone ana@onists or agonhts. Cancer Res. 50,371 6-3721 .

Szepeshazi, K., Korkut, E., Szende, B., Lapis, K., Schaily, A.V. (1991) Hisofbgiwf changes in dunnhg proslate &mois and testes ofmb beated wios W-RHantagon&f SB75 Prostate. I8,25$27O.

Sake, B., Horvath, J., Halrnos, G., Wkiisi, S., Gmt, K., Nagy, A., Schdly, A.V. (i 994) Lff-RHAnafiue Canyig a C'utoxic Radiwf fs hfemaked by Rat Pifu&y Ce& fn VNO. Peptides. 1 5(2), 359-366.

Thomer, M.O., Vance, M.L., Harûnan, R.W., Holl, W.S., Evans, J.D., Veldhuis, J.D., Van Cauter, E., Copinschi, G., Bowen, C.Y. (1 990) Physiof~iiml Rule of SamaosiWn on Gram H o m e Reguhbon in Humans. Metabolism. 39 (9), s~ppl.2~40-42.

Tsomides, T.J., Eisen, H. (1 993) Stoi'iomeb7c Laking of Peptides by lodinabun on 7jvrosyf or Hisbyl Residus. Analyücai Biochemisfry. 210,129-1 35.

Vakkuri, O., Lamsa, E., Rahkama, E, Rudsalainen, H., Lepmuoto, J. (1984) Iodhated Melatonin: .I Pizpam6'0n and Cham-h of bie Mofecrrhr SaUcture by Mils and 'If NMR S ~ s c ~ p p y .

Anaiyücal Biochernistry. 142,286289.

Vance, M.L. (1 990) GmWOr-H~mroneRe/ws/iIg Homone. Clin. C hem. 36 (3), 41 5420.

Vamum, J.M., Thakur, ML, Schally, A.V., Mayo, K.H. (1994) RheniumLabefed Sorna&&bh A n a i , , RC-160: WNMR and Canpar W e h g Combnnabunaf Ana/@& Journal of Biological Chemistry. 269 (1 7), 1 2583-8.

Veliçele bi, G., Saraswathi, P.. Kaiser, ET. (1 986) Des@ and blalQgicc3f activii of analbgs of growol hormone refeashg &etor wrolrpten&farnphiph/iric he/iw/ wr;boXyllermhi Pm. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 5397-5399.

Vincze, B., Palyi, I., Daubner, D., Kremner, T., Sme l , I., Bodrogi, I., Sug& J., Seprodi, J., Mezd, 1.. Teplan, I., Eddiardt, S. (1991) Muence of lufeinmng homone-deashg hormone agon&t on human mammay amhoma elMnes anddrrelixenogr&. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 38 (2), 1 1 9-1 26.

Walùiey, J.W., Tillman, J., Bonnar, J. (1976.) ïhepersisfence ofdeskan 70th b/mdp/asma folbwi~g ifs infuion dunflg sugefy forpmphflax& agahst 1YIrombtmbohm J. Pham. Phamac. 28,2431.

Weckbecker, G., Rauif, F., Stolz, B., Bruns, C. (1 993) So~os&bn a&logs bfor dagnosis and beabnent of cancer. Pharmac. Ther. 6û, 245-264.

L

Weckbecker, G., Tolcavai, L-, üu, R., Bruns, C. (1 992) Prechiwf Shdies on Ilie Antiwncer Ac~vW of bie Sumafoshtin Anafugue Ocûeotide (SMS20 1-995). Metabolism. 4 1 (9, suppl.2), 99-1 03.

Wein bauer, G.F., Nieschlag, E. (1 992) W-RH Anhgonisfs: Shte of he M and Fuwe Perqpeccves. Recent Results in Cancer Research. 124,113-1 36

Wieland, T., Bodanszky, M. (1991) 77ie Won'ü of PepbYes: A Bief Hisfoly of PqolWes Chemism Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

Mlbur, D.S. (1 992) Raakohafogenation of Pkoteein An Ovewhew of Radionudides, LaMing Meoiods, and Reagenb fw Con/gafe labetng. 8ioconjugate C hemistry . 3(6), 433-470.

Wolf, J., Covelli, 1. (1 969) Faclors h drre fod/i7ation of Hiktidine ih PPmhs. European J. Biochem. 9,371-

Yano, T., Pinski, J., Szepeshazi, K., Halmos, G., Radulovic, S., Groot, K., Schaily, AV. (1994a) Inhibrio~y Effect of Bom&esh/Gasa!n-Releasing PepGde Anhgonist RC-3095 and Lutehking HomoneReleasing Homne AnaQonist SB75 on bSe GmwlYl of MCF7 Mfli Human Breast Cancer Xenqpafk in A#ymic Nude M e . Cancer. 73 (4), 1 LW-1 238. .

Yano, T., Pinski, J., Radulovic, S., Schaiiy, AV. (1 9941) hh&ibon ofhuman eplîYKaf owMn caner cet7 & growl3Fi in M0-0 by a p n M and anlagon&tic anabues of Mehru'ng homne~/e/tashg hormone. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA. 91,1701-1705.

L Annexe 1

Clairance sanguine

Modèles à 2 exponentiels

MK-678 (sur 24 heures) Soucis Valeur Vdcur Aire sotu 1st rnomtat Ciairancc VOL Cornput, VOL Skady

No. A l AZ Ir wadx 1ntCat.I ( d h d Ccnfraf (ml) StptC (ml)

1 9433 48,I 2 5,77 1,72 1793 1,75 5.16

Hexarelin (sur 24 heures) Souris Vakttr Vdeor Airesous 1 A moment Clnirance V o l Cornput. VOL Skady No. A 1 A2 ia coarfx interrd ( d b d Ccafrd (ml) Stptt ( d l

MOYENNE 2 ESM ( IA5) 22 $2 6990 3.09 + 157 1.97 i 0.00 12.74 i 0.1 4

Hexarelin-DTPA (sur 24 heures) Souris V a k a r Valeur Aire sons 1 n momca t Ciairauce VOL CompacL VOL S b s d y No. AI A2 h courbe I n e r d (dhr) C t a f d (mi) StPk (d)

1 1035m -980,OS 45,14 288 1 292 182 1.4 1 2 1787,IO -1749,40 33J6 15,IS $0 1 2,65 1.37

3 21,72 5942 4386 6226 2,223 1 $3 3-24

4 13S6 6 1,76 39,60 6492 233 1,32 4.10

MOYENNE I ESM (3,4 S9JO 2197 2.61 10.12 2.24 I 0.03 1.39 I 0.43

AntareIix (sur 24 heures)

No. A l A2 & coaCfK h*d ( d h d Ccnfrd (mI) StptC (dl 1 4,Z 1 25P4 41.7 1 1 76,76 2 4 3,42 10,16

2 15,48 1 2,67 26,66 4 1,68 3,75 3,55 586 3 4,79 2335 3897 150,43 2.59 2457 IO,] 1

,L Annexe 1 (suite)

Élimination sanguine de l'iode

Souris Temps Moyenne ESM (n) a.1, (%dose@ (+H

T Annexe 2 .&

Calcul du nombre de mole d'iode dans 1 mCi.

1 mCi = 3.7~ 10' Bq (dés. x sec- 1 ) , 1 mole = 6.0% 1 OZ3 atomes (N. d'Avogadro)

Nd = nombre de désintégration, Na = nombre d'atome, Activité = Nd x A,

Tl-p = demi-vie physique du nucléide (60 jrs, T; 8 jrs , I 3 I I ; 2.8 jrs, IlIIn)

Exemple: pour l'iode- 1 2 5:

h = 1112/'?'1~p, 1 = 1 . 3 4 ~ 1 0 - ~ sec-'

Nd = Activité/h, Nd = 2 . 7 7 ~ 10" désintégratioii

Si ilne désintégration = itn atome d'ide- 125

Nc?=Nd/N.d'Avogadr.û, 4 .6~10 '~~mole ( IrnCi )

2.3 x 1 0 - I o mole (500pCi)

Ratio de mole:

Peptide (MK-67s) = 0.03 pmole, [ode- 125 = 0.23 nmole

kt io = n. de mole du peptideh. de mole d'iode

z 130:l

Annexe 3

Calcd de l'erreur

Écart-type sur la moyenne

OU n est le nombre de I'échantillon, et x est chaque valeur de l'échantillon.