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DESARROLLO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ACÉTICAS

José M. GuillamónDepartamento de Bioquimica i BiotecnologiaFacultat d’Enologia de TarragonaUniversitat Rovira i Virgili

Josemanuel.guillamon@urv.net Rovira i Virgili University

BACTERIA ACÉTICAS. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS

• Bacilos Gram negativos moviles

• Catalasa Positivos

• Metabolismo estrictamente aeróbio

• Capacidad para crecer en medio ácido

• Capacidad para oxidar una gran cantidad de sustratos

• Aplicaciones industriales: vinagre, Ácido glucónico,

sorbosa, celulosa, etc.

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Taxonomía de las bacterias acéticas

Taxonomía de las bacterias acéticas

• Persoon (1822)

Mycoderma

• Pasteur (1868)

Mycoderma aceti

• Beijerinck (1900)

Acetobacter

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Taxonomía de las bacterias acéticas

• Gluconobacter

G. oxydans

• Acetobacter:

A. aceti

A. pasteurianus

A. hansenii

A. liquefaciens

Taxonomía de las bacterias acéticasReordenación por pruebas moleculares (año 2003)

6 Géneros y 34 especies:

• Acetobacter (14 especies)

• Gluconobacter (3 especies)

• Gluconoacetobacter (11 especies)

• Acidomonas (1 especie)

• Asaia (4 especies)

• Kozakia (1 especie)

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Taxonomía de las bacterias acéticas

Acetobacter

A. aceti

A. pasteurianus

Especies aisladas en vinagres

Gluconoacetobacter

Ga. hansenii

Ga. europaeus

Ga. xylinus

Ga. oboediens

Ga. intermedius

Ga. entanii

Aislamiento y Recuento

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AISLAMIENTO Y RECUENTO DE ACÉTICAS

Toma de muestra Uva, vino o vinagre

Recuento en placa Dilución decimal o Centrifugación (10.000 rpm/10 min)

Medio de cultivo GYC• Glucosa 5%

• Extracto de levadura 1%• Pimaricina (100mg/l) • Penicilina (3U/ml)

• Carbonato Cálcico (0.5%)

Incubar 48 horas/ 28ºC

Disolución del CaCO3

Tinción Gram y prueba de la catalasa

Otros medios de aislamiento

Medio RAE (Sokollek et al., 1998)

Glucosa 40 g

Extracto levadura 10 g

Peptona 10 g

Fosfato sódico 3,38 g

Ácido cítrico 1,5 g

Etanol 20 ml

Ácido acético 10 ml

Agar 10 g

Agua 1 Litro

Medio Manitol

D-Manitol 25 g

Extracto levadura 5 g

Peptona 3 g

Agar 15 g

Agua 1 Litro

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Técnicas de identificacióny recuento independientes

del cultivo

Identificación de especies de bacterias acéticas medianteanálisis de restricción del gen ribosomal 16S

16S 23S 5SITS ITS

1) Amplificación mediante PCR del gen ribosomal 16S

2) Digestión del fragmento amplificado con diferentes enzimas de

restricción

3) Separación de los fragmentos en base a su tamaño en un gel de

agarosa

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Técnicas moleculares de identificación

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)Permite amplificar una región del genoma bacteriano

millones de veces

Reacción de PCR:• DNA molde• Oligonucleótidos (20-24 nt) complementarios

a los extremos del fragmento a amplificar

• Nucleótidos• Polimerasa

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Técnicas moleculares de identificaciónLa Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Técnicas moleculares de identificaciónEl análisis de restricción o RFLPs

Enzimas de restricción

EcoRI

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Análisis de restricción del rDNA 16S

1. Amplificación del rDNA 16S mediante la PCR

Se obtuvieron amplificados de todas las cepas de referenciade un tamaño aproximado de 1450 pb

Productos de PCR∼∼∼∼ 1450 bp

Productos de PCR ∼∼∼∼ 1450 bp

Análisis de restricción del rDNA 16S

2. Digestión del fragmento amplificado mediante diferentes enzimas de restricción (hasta 8 enzimas)

Patrones de restricción obtenidos con TaqI

Ga. hansenii A. acetiG.oxydans Ga.liquefaciensGa. XylinusGa. europaeus

A. pasteurianus

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Cepa Enzima de restricción TaqI Enzima de restricción RsaI

G. oxydans 1408 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90

G. oxydans 360 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90

G. oxydans 1484 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90

G. oxydans 1414 350+190+175+160+120+120+110 400+400+400+150+90

A. aceti 1261 850+350+210 500+400+300+150+125

A. aceti 298 850+350+210 500+400+300+150+125

A. aceti 1505 850+350+210 500+400+300+150+125

A. aceti 1372 850+350+210 500+400+300+150+125

A. pasteurianus 1262 500+350+330+210 500+400+300+150+125

A. pasteurianus 1553 500+350+330+210 500+400+300+150+125

Ga. hansenii 1527 650+350+210+175 500+400+400+150

Ga. liquefaciens 1381 500+350+210+175+160 500+400+400+150

Ga. liquefaciens 1347 500+350+210+175+160 500+400+400+150

Ga. xylinus 1515 500+350+210+175+160 500+400+400+150

Ga. xylinus 1518 500+350+210+175+160 500+400+400+150

Ga. europaeus 6160 500+350+210+175+160 500+400+400+150

Tamaños de los fragmentos de restricción

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Mo

sto

M.F

. In

oc-

M.F

. Esp

on

t.

F.F

. In

oc.

F.F

. Esp

on

t.

Ga. liquefaciens

Ga. hansenii

A. pasteurianus

A. aceti

G. oxydans

Diversidad de especies de bacterias acéticas

ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓN VÍNICA

11

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 12 17

Ga. liquefaciens

Ga. hansenii

G. oxydans

A. aceti

% e

spec

ies

de

acét

icas

Diversidad de especies de acéticas durante la FML

Día de Fermentación Malolactica

ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓNMALOLÁCTICA

Tipificación de cepas de bacterias acéticas mediante la técnica ERIC-PCR

⊇⊇⊇⊇ En bacterias se han descrito secuencias repetitivas en el genoma:• Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)

⊇⊇⊇⊇ Ya existen oligonucleotidos diseñados para la amplificación por PCR de las secuencias comprendidas entre estos elementos repetitivos

ERICs

LMG 1390LMG 1484LMG1282LMG 1408

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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas

mediante la PCR cuantitativa

• No es necesario el cultivo previo

• Cuantifica poblaciones de bacterias mediante

cuantificación del ADN bacteriano de la muestra

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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas

mediante la PCR cuantitativa

Recuento de poblaciones de bacterias acéticas

mediante la PCR cuantitativa

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Perspectivas de futuro:

• Cuantificar las distintas especies mediante la PCR

cuantitativa en vinagre

• Identificar mediante distintas técnicas independientes

del cultivo la diversidad de especies y de cepas

• Seleccionar cultivos iniciadores para acetificación

(cepas seleccionadas)