DESCRIPCIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS: reacciones de color para aminoácidos, destinado a la identificación de sus propiedades moleculares.Junior Álvarez Ortega1, Enrique Dávila Ochoa1, y Elkin Monterrosa Berrio1

RESUMEN

Los aminoácidos forman la estructura primaria de las proteínas, y existen diferentes métodos o pruebas, que mediante serie de reacciones específicas, propias de cada reacción, permitan identificar aminoácidos con propiedades diferentes. Los aminoácidos se clasifican, esencialmente, según la estructura de su cadena lateral, es decir, la estructura de la cadena lateral va a determinar qué tipo de aminoácido es, y las propiedades químicas que posee. En las pruebas se utilizaron diferentes reactivos que intervinieron en cada una de las reacciones de diferentes pruebas de identificación.

La prueba xantoproteica identifica aminoácidos con grupos bencénicos en su cadena lateral, como la tirosina o el triptófano, que generan tinción amarilla al reaccionar con el ácido nítrico o anaranjada al reaccionar con un álcali durante la neutralización, este último confirma la prueba. La prueba de Ehrlich identifica a los aminoácidos con grupos aromáticos que reaccionaron con el ácido Sulfanílico y nitrito de Sodio. La prueba de Hopkins- cole identifica proteínas que contenga triptófano en su estructura, es decir, la prueba identifica el triptófano es por eso que solo se experimentó con el triptófano y no con otros aminoácidos. La prueba de azufre reducido busca identificar a sustancias con azufre en su estructura, que mediante diferentes pasos permite separar el azufre y formar una sal. La prueba de Sakaguchi identifica el grupo guanido o guanodino, el cual se encuentra en la arginina, por ende es una prueba para identificar arginina en una sustancia.

Palabras Claves: Reactivo, solución, soluto, aminoácidos, proteínas, hidróxido de sodio, ácido nítrico hidróxido de amonio, ácido clorhídrico, formaldehido, ácido sulfúrico.

INTRODUCCION

1 Estudiantes de medicina, III semestre, participantes del Experimento Bioquímica # 1

Un aminoácido es una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Los aminoácidos más frecuentes y de mayor interés son aquellos que forman parte de las proteínas. Dos aminoácidos se combinan en una reacción de condensación entre el grupo amino de uno y el carboxilo del otro, liberándose una molécula de agua y formando un enlace amida que se denomina enlace peptídico; estos dos "residuos" de aminoácido forman un dipéptido. Si se une un tercer aminoácido se forma un tripéptido y así, sucesivamente, hasta formar un polipéptido. Esta reacción tiene lugar de manera natural dentro de las células, en los ribosomas.

Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son L-alfa-aminoácidos. Esto significa que el grupo amino está unido al carbono contiguo al grupo carboxilo (carbono alfa) o, dicho de otro modo, que tanto el carboxilo como el amino están unidos al mismo carbono; además, a este carbono alfa se unen un hidrógeno y una cadena (habitualmente denominada cadena lateral o radical R) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de cada uno de los diferentes aminoácidos. Existen cientos de radicales por lo que se conocen cientos de aminoácidos diferentes, pero sólo 20 (actualmente se consideran 22, los últimos fueron descubiertos en el año 2002) forman parte de las proteínas y tienen codones específicos en el código genético.

Existen muchas formas de clasificar los aminoácidos; las dos que se presentan a continuación son las más comunes.

Según las propiedades de su cadena:

•Neutros polares, polares o hidrófilos: serina (Ser, S), treonina (Thr, T), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), asparagina (Asn, N), tirosina (Tyr, Y) y glicina (Gly, G).

•Neutros no polares, apolares o hidrófobos: alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I), metionina (Met, M), prolina (Pro, P), fenilalanina (Phe, F) y triptófano (Trp, W).

•Con carga negativa, o ácidos: ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E).

•Con carga positiva, o básicos: lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H).

•Aromáticos: fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptófano (Trp, W) (ya incluidos en los grupos neutros polares y neutros no polares).

Las propiedades de estos aminoácidos determinan muchas de sus propiedades y reacciones frente a otros compuestos y biomoleculas, tal es el caso de los aminoácidos aromáticos, los cuales por ejemplo al reaccionar con ácido nítrico se crean nitroderivados que cambian el color del aminoácido permitiendo detectar la presencia de grupos aromáticos en los mismos, está entre otras reacciones pueden llevarse a cabo para detección de grupos funcionales, o específicos en los aminoácidos, principalmente aquellos que afectan sus propiedades químicas y se ubican en sus cadenas laterales.

MATERIALES Y METODOS

Materiales y reactivos

Instrumentos

Tubos de ensayo Gradilla Beakers Mechero Soporte Universal Aro Metálico Rejilla de asbesto Pinzas Hielo Llama

Reactivos

Aminoácidos:o Histidina (al 2%)o Tirosina (al 2%)o Triptófano (al 2%)o Cisteína (al 2%)o Arginina (al 2%)

Reactivos y solucioneso Ácido nítrico (HNO3)o Hidróxido de Amonio (NH4OH)o Ácido Sulfanílico 0.5%

(C6H7NO3S) en Ácido Clorhídrico (HCl) (al 2%)

o Agua (H2O)o Ácido Sulfúrico (H2SO4)o Hidróxido de Sodio (NaOH 6N)o Acetato de Plomo

(CH3COOPb)o Hipoclorito de Sodio (NaClO)o α – Naftol o Nitrito de sodio (NaNO2)

Método y diseño del experimento

El experimento tuvo como método la determinación de tipo cualitativa, en cada una de sus pruebas, con el uso de reacciones de identificación cromática, es decir, el uso de colorantes determinados por reactivos, que resalte por medio de colores las propiedades de las proteínas, y más específicamente de los aminoácidos.

Se realizaron cinco tipos de prueba para determinar las propiedades químicas, de cinco aminoácidos. Estas fueron las siguientes:

1. Prueba xantoproteica: es un método que se utiliza para determinar proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado que da origen a compuestos nitroderivados de color amarillo o anaranjado2. Esta prueba va a determinar cuál o cuáles de los aminoácidos (presentes en proteínas) utilizados, poseen propiedades químicas aromáticas, es decir, cuales poseen un grupo aromático en su estructura; y luego se neutraliza con un álcali.

Para este experimento se agregaron 2ml de solución de aminoácidos (entre ellas Tirosina, Histidina y Triptófano3) en un tubo de ensayo y se procedió a agregar 1ml de Ácido nítrico (HNO3), luego se calentó lentamente en baño de maría4. Y posteriormente la solución, se retiró del calor y se añadieron 8 gotas de Hidróxido de Amonio (NH4OH), un álcali.

2 Por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano3 En tubos de ensayo separados, es decir, cada solución de aminoácidos en su respectivo recipiente. 4 Se usó para su calentamiento un trípode, un mechero de bunsen, un beaker de 800ml y 600ml de agua

2. Prueba de Ehrlich: de composición (p-dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCl concentrado.) que reacciona con un buen número de compuestos orgánicos tales como indoles, aminas aromáticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados.

Para este experimento agregaron 2ml de solución de aminoácido (Histidina o Tirosina) y agregar 1ml de ácido Sulfanílico 0.5% en HCl 2%, luego colocar en baño de hielo por un tiempo de 3 minutos y luego adicionar 1ml de NaNO2 0.5% y 2 ml de NH4OH.

3. Prueba de Hopkins-Cole: La reacción de Hopkins cole se usa principalmente para identificar en una sustancia o una proteína la presencia de un aminoácido específico, el triptófano.

Para este experimento agregaron 2ml de solución de aminoácido (Histidina o Tirosina) y agregar 1ml de nitrito de sodio y luego se le agregan ocho gotas de ácido sulfanilico

4. Prueba de Azufre reducido: Para este experimento agregaron 2ml de solución de aminoácido (Cisteína) y agregar 2 ml de NaOH 6N y 1 ml CH3COOPb, colocar en un baño de hielo durante 5 minutos y por ultimo añadir ocho gotas de hipoclorito de sodio.

5. Prueba de Sakaguchi: Es una reacción de los compuestos que contengan grupo guanido o guanodino. De ahí que se dé una indicación de la presencia de arginina libre de proteínas que contengan arginina. La prueba consiste en tratar la muestra con alfa-naftol e hipoclorito de sodio, con lo cual se desarrollara un color rojo intenso. El desarrollo del color se altera o se previene por completo por la presencia de amino, histidina o triptófano. La arginina libre de la prueba positiva.

Para este experimento agregaron 2ml de solución de aminoácido (Arginina) y agregar 0.5ml de NaOH6 N y 1 ml de α – naftol, colocar en un baño de hielo durante 5 minutos y por ultimo añadir ocho gotas de hipoclorito de sodio.

RESULTADOS

1 PRUEBA XANTOPROTEICA

Sustancia: Histidina 2%

La histidina es un aminoácido transparente al cual se le agregó ácido nítrico, ni en el momento de la aplicación, ni tiempo después mostro cambio apreciable en su color, al momento de mezclar los componentes las solución libera calor, por lo tanto es una reacción exotérmica. Cabe resaltar que apreciando detenidamente la solución se observaron dos fases una densa de líquido claro y otra sobrenadante de líquido turbio y aceitoso ambas de color transparente.

Al cabo de la aplicación de calor, la solución continuó con ese mismo estado, no hubo cambio de calor ni mucho menos después de agregarles las 8 gotas de hidróxido de amonio

Color inicial: Transparente Color final: Transparente Observación: No hubo cambio

Fig. 1

Sustancia: Triptófano 2%

El triptófano es un aminoácido de color blancuzco con grumos blancos, se clasifica entre

los aminoácidos apolares, también llamados hidrófobos. Y al igual que el anterior proceso, se le adicionó el ácido nítrico; con la diferencia de que al momento de mezclarse las sustancias, se generó un color ocre dorado, y creó una reacción exotérmica. Luego con la adición de calor la solución cambio de color a un naranja claro, y tras el añadido de hidróxido de amonio reaccionó creando una nube espesa sobre la solución y en su color no hubo ningún cambio.

Color inicial: Blanco o semitransparente Color final: Naranja claro Observación: Hubo cambio de color

Fig. 2

Sustancia: Tirosina 2%

La tirosina es un aminoácido liquido con partículas sólidas que forma cristales y que generalmente presenta un color blanquecino5, se clasifica como un aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su síntesis se produce a partir de la hidroxilación de otro aminoácido: la fenilalanina. Se considera un aminoácido polar y protonable. 6 En la reacción con el ácido nítrico la solución cambió a un color amarrillo parecido al aceite de oliva, y tras el calentamiento el

5 Aunque también puede ser incoloro

color de la sustancia cambio a un verde limón y luego de que se terminara el último pasó de la prueba, el cual era agregar el NH4OH, la solución cambio de color nuevamente a un miel claro.

Color inicial: Blanco Color final: Miel claro Observación: Hubieron diversos cambios de color (De amarillo a verde y de este último, a color miel)

Fig. 3

2 PRUEBA DE EHRLICH

La prueba de Ehrlich se encarga de identificar la presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido Sulfanílico y nitrito de Sodio.

Sustancia: Histidina y Tirosina 2%

En el proceso que se llevó a cabo la reacción de la histidina y la tirosina genero cambios de color, desde el inicial que es el que posee la histidina que es transparente, hasta el color ferroso (gris) que era el color final, de igual manera ocurrió con la tirosina exceptuando el hecho de que el color inicial de esta última es semitransparente con grumos blancuzcos

3 PRUEBA DE HOPKINS-COLE

Sustancia: Triptófano 2%

Al agregarle a la solución, el agua destilada más las gotas de formaldehido se creó un granulo sobrenadante blanco sobre una solución rojiza, que tenía un degradado que se aclaraba hacia el final del tubo de ensayo y luego con el posterior baño de maría, cambio el color de toda la solución a un color canela oscuro. Conservando su degradante cromático más oscuro en el fondo

Color inicial: Transparente con grumos blancos Color final: Canela oscuro Observación: El fondo del tubo de ensayo aun después del calentamiento permaneció con una coloración oscura al igual que el sobrenadante

Fig. 4

6Aunque normalmente se clasifica como aminoácido hidrofóbico a causa de su anillo aromático.

4 PRUEBA DE AZUFRE REDUCIDO

Sustancia n: Cisteína 2%

La cisteína es un aminoácido de color blanco hueso, al agregarle el Hidróxido de sodio ese color pasa a ser transparente, luego al agregarle el acetato de plomo se genera una solución espesa sobrenadante parecida a la espuma.

Color inicial: Blanco Color final: Transparente en la porción más densa de la solución y sustancia espumosa Observación: Hubieron diversos cambios de color (De blanco a transparente y de este último, a una mezcla heterogénea entre una sustancia blanca y transparente)

5 PRUEBA DE SAKAGUCHI

Sustancia: Arginina 2%

A la arginina que es de color transparente se le añadió, hidróxido de sodio que es una sustancia también transparente, luego a esta mezcla se le enfría por cinco minutos y se le agrega el alfa-naftol que es una solución rosa más ocho gotas de hipoclorito de sodio. En la reacción se crearon dos fases una de color naranja rojizo que se encontró en el sobrenadante y una solución más densa de color transparente

ANALISIS DE RESULTADO

1 PRUEBA XANTOPROTEICA

En la prueba xantoproteica el cambio de color en ciertos aminoácidos es debido a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.

Sustancia: Histidina 2%

En la histidina no hay cambio de color puesto que este aminoácido, no posee en su estructura un grupo benceno, lo que no le brinda a este la propiedad aromática. En la reacción del grupo fenilo del aminoácido demarca por acción del ácido nítrico coloreando la solución de un amarillo parecido al color miel

Sustancia: Triptófano 2%

El triptófano es un aminoácido cuya fórmula es la siguiente:

La estructura de este aminoácido contiene un grupo indol7, este grupo lo hace un aminoácido aromático por lo tanto la reacción debe dar positiva para esta sustancia. Gracias a la nitración del anillo bencénico presente en este tipo de aminoácidos se obtienen nitrocompuestos de color amarillo, que luego

de añadirse un álcali (Base) se torna aun color más anaranjado.

Sustancia: Tirosina 2%

Al igual que el triptófano la tirosina es un aminoácido aromático cuya fórmula es la siguiente:

Aquí se observa que la tirosina posee un grupo fenólico este le da la propiedad de aromático.

Por eso al agregarle el ácido nítrico reacciona formando un color más anaranjado que el formado antes en el triptófano.

2 PRUEBA DE EHRLICH

Cuando se formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptido y proteínas

En el experimento se observó que la solución se coloreó de gris debido a la presencia de grupos fenólicos que reacción con el reactivo y forman el color gris

3 PRUEBA DE HOPKINS-COLE

Sustancia: Triptófano 2%

7 El indol es un compuesto orgánico heterocíclico, que consiste en un benceno unido a un pirrol

En la prueba de Hopkins-Cole, el color es debido a la presencia del grupo triptófano, aunque el triptófano puro no da la prueba excepto en presencia de trazas de iones férricos o cúpricos.

En cualquier proteína que contenga aminoácidos de triptófano, la prueba de Hopkins cole, dará positiva, o inclusive en el aminoácido libre existe el cambio de color que es siempre característicos por su gradiente rojo - oscuro

4 PRUEBA DE AZUFRE REDUCIDO

Sustancia: Cisteína 2%

Para la cisteína este tipo de prueba es positiva debido a que estos aminoácidos poseen azufre en su estructura. La reacción se lleva a cabo en

un medio alcalino, es decir en presencia de NaOH, el cual permite la separación del azufre de la estructura del aminoácido. Al añadir una sal soluble en agua, como lo fue el acetato de plomo, el azufre se combina con el plomo para producir un precipitado de color negro que corresponde a sulfuro de plomo. De todo esto podemos decir que esta reacción es solo para aquellas sustancias o aminoácidos que contengan azufre en su estructura.

5 PRUEBA DE SAKAGUCHI

Sustancia: Arginina 2%

La prueba es positiva para la arginina porque esta presenta a el grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la arginina esta cadena reacciona con el alfa - naftol y pierde el grupo imino por oxidación. La arginina oxidada reaccionó con otra molécula de alfa-naftol cuando se le adiciona un compuesto alcalino formando un complejo coloreado rojo.

CONCLUSIÓN

Los aminoácidos se pueden clasificar según la estructura de su cadena lateral, lo que les confieres propiedades que los caracterizan. Existen pruebas que permiten identificar a los aminoácidos, como la prueba xantoproteica, la prueba de Ehrlich o la prueba de Hopkins-cole. Cada prueba identifica ciertas propiedades de los aminoácidos, lo cual permite clasificarlos.

En la prueba xantoproteica se busca identificar los aminoácidos que en su estructura presentan grupos aromáticos, que al reaccionar con el ácido nítrico forman compuestos nitroderivados y así dar positiva la prueba. El triptófano y la tirosina dan positiva esta prueba (tienen grupos aromáticos en su estructura), mientras que la histidina da negativa a la prueba.

La prueba de Ehrlich identifica a la histidina y a la tirosina, ya que estos aminoácidos presentan en su estructura un grupo fenol.

La prueba de Hopkins-cole identifica sustancias que presenten en su estructura el aminoácido triptófano.

La prueba de azufre reducido identifica a loa aminoácidos que en su estructura llevan azufre, que en medio alcalino, permite separar el azufre y así identificarlo mediante la reacción con una sal.

La arginina está compuesta por el grupo guanidinio, el cual es identificado en la prueba. Generalmente la prueba se utiliza para identificar proteínas en distintas sustancias, ya que la arginina está

presente en la estructura de la mayoría de las proteínas.

Estas pruebas se utilizaron con una variedad de reactivos e instrumentos, esto debido a la diferente naturaleza de diferentes aminoácidos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Franco, A. G. (2006). Experimentos de Química Orgánica.

Graff, L. (2007). Análisis de orina: atlas color. Mexico: Editorial medica Panamerica.

Kathy. (2011). Laboratorio Kathy. Obtenido de http://kathy-bioquimicaguia-laboratorios09.bligoo.es/experiencia-3-pruebas-cualitativas-para-aminoacidos-y-proteinas#.UUJ71hzNmwg

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