Rocio Inga PeñaDpto. Bioquímica, Biol Mol

& Farmacología

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Modificaciones:

Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…

Extracto crudo(mezcla de proteínas)

Gel de apilamiento (menor concentración)

Gel de separación (la concentración depende de la resolución que se busque )

Marcadores de Peso Molecular

Inicio de corrida(donde inicia el gel separador)

Frente de corrida (línea donde termina el colorante)

DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA

DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA

RF = distancia recorrida por la banda distancia total al frente de la corrida

(RF)

• Acrilamida (C3H5NO) – formación de polímeros

• Bisacrilamida (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas de polímeros

• SDS : saturación con cargas negativas

• APS y TEMED : catalizadores de la reacción de polimerización

• DTT o βME : agentes denaturantes

• Azul de Bromofenol: Permite la visualización de la corrida electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.

REACTIVOS:

• La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta 50 ng

• La tinción con plata incrementa la sensibilidad de detección ( 50 veces aprox)

Tinción del Gel SDS-PAGE

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Separación por:

• Punto isoeléctrico

• Tamaño

Separación por Punto Isoeléctrico

Punto isoelectrico diferentepero del mismo tamaño

Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño

Análisis de Proteínas Multiméricas

- Se puede determinar el número y tamaño de subunidades mediante la electroforesis bajo condiciones denaturantes

Agentes denaturantes frecuentemente usados:

- Dithiotreitol (DTT)- β-mercaptoetanol (βME)

El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA DIMENSION

CONDICIONES:

• DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)

PRACTICA A REALIZAR

Las muestras para analizar serán diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa:

• Extracto crudo

• Fracción con proteìna, sin actividad

• Fracción con proteìna, con actividad

Dos tipos de tratamiento de muestras:

A) Denaturación directa de las muestras:

- Mezclar 25 uL de la fracción + 15 uL de Loading Buffer (Buffer de carga)

- Hervir por 4 - 5 minutos

- Cargar 20-25 uL en el gel.

B) Precipitación previa a denaturación

- Se utilizará el protocolo de precipitación con Etanol (33%)

Actividad enzimática Cantidad de Proteína (Pirazinamidasa) (Bradford)