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Design de Primers. Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes. Primers determinam o sucesso de uma PCR!. - PowerPoint PPT Presentation
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Design de Primers..
Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes.
Primers determinam o sucesso de uma PCR!
Specificity?
Proper annealing to
the template?
Comprimento do Primer
Determina especificidade e afeta seu anelamento com o DNA molde!
• Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação não específica
• Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos.
• Comprimento ideal:18-24 bp para PCR comum30-35 bp para PCR multiplex
Tamanho do amplicon
150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb 50-150 bp para qPCR, evitar >400 bp
Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los de possíveis dímeros de primers!
Temperatura de melting (Tm)
A temperatura na qual 50% da dupla
fita de DNA se dissocia para fita
simples.
• Determinado pelo comprimento,
composição de base e concentração
dos primers e pela concentração de sal
no PCR mix • Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para
<18mer)
• Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta):
Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of PCR product) – 25
• Regra geral: Ta = Tm-5°C
Ta ótima • 52°C - 60°C • Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a
especificidade• Ta alto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da
PCR. • Ta >65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos
com elevado conteúdo de GC.
Diferenças de Ta entre o par de primers• Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à
má amplificação • Desejável diferença Ta <5°C
Temperatura de anelamento (Ta)
Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo fabricante ou calculada +/- 2°C) e correr gel!
Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!
Especificidade e homologia cruzada
Especificidade • Determinada principalmente pelo comprimento do primer
assim como sua sequência • A adequação da especificidade do primer é relativo à
natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR.
Homologia Cruzada• Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA
genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos. • Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva
são propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando a amplificação de DNA genômico.
Para evitar amplificação não específica..
Além da temperatura e comprimento ideal dos primers:
• BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas.
• Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por cDNA.
• Para qPCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por gDNA.
Conteúdo G/C do Primer • Conteúdo ideal de G/C: 45-55% • Conteúdo semelhante para o par de primers • Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação)
Runs (streches de base única, ex aaaaaaa)• Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico • O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp
Conteúdo CG e repetições
Repetições (streches de di-nucleotídeos consecutiva, ex. acacacac)• Repetições aumenta o potencial de anelamento incorreto/inespecífico • O número máximo de repetições aceitável é de 4 di-nucleotídeos
Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers
Grampos • Formados por interações intra-
moleculares no mesmo primer
Auto-dímero (homodímero) • Formado por interações inter-
moleculares entre dois iniciadores iguais
Cross-dímero (heterodímero) • Formado por interações inter-
moleculares entre os primers sense e antisense
• Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplificação
• Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura)
Softwares..
Primer3 (gratuito)
Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos