Designer steroids

Designer Steroids

Corso di Chimica Analitica V

A.A. 2012/2013

Dalle Luche Greta

Dilillo Marialaura

Lari Matteo

Introduzione

Per Designer Steroids si intendono tutti i composti steroidei non reperibili commercialmente e impiegati come sostanze dopanti.

Comprendono molecole studiate per la ricerca farmaceutica e mai giunte sul mercato oppure, meno frequentemente, di steroidi appositamente sintetizzati.

Cos’è uno steroide anabolizzante?

Effetto anabolizzante – incremento della produzione di proteine, lipidi complessi e polisaccaridi.

Effetto androgenico – comparsa di caratteri sessuali secondari maschili.

1986. Heidi Krieger atleta della RDT sottoposta a sua insaputa, all'assunzione di steoidi.

La struttura chimica degli steroidi

Storia dei designer steroids

2002 – Norbolethone – Don Catlin

2003 – Tetrahydrogestrinone – Don Catlin

2004 – Madol – Michael Sekera

2002 – Norbolethone – Don Catlin

Ormone della crescita sintetizzato nel 1966 ma mai commercializzato per motivi di tossicità

Catlin et al. Rapid Comm Mass Spectr 2002, 16

2003 – Tetrahydrogestrinone – Don Catlin

Steroide anabolizzante sintetizzato da Partick Arnold come sostanza dopante per aggirare i controlli antidoping.

Catlin et al. Rapid Comm Mass Spectr 2004, 18

Caso BALCO: il commercio illegale del THG fu scoperto in seguito alla denuncia anonima di Trevor Graham, un

preparatore atletico, che inviò anonimamente alla USADA una siringa contenente lo steroide. Il laboratorio fu chiuso e

il suo presidente, Victor Conte, e il chimico organico responsabile delle sintesi, Patrick Arnold, incarcerati.

2004 – Madol – Michael Sekera

Desoxymethyltestosterone con forte effetto anabolizzante negli animali sintetizzato nel 1961, mai commercializzato perché causa danni epatici ed ipertrofia cardiaca.

Sekera et al. Rapid Comm Mass Spectr 2005, 19

Procedura generale d’analisi: matrici

Urine – poco invasiva, facilmente conservabile

Sangue – invasiva, richiede presenza di personale medico specializzato

Capelli (meno diffusa) – vantaggio di monitorare nel tempo l’assunzione di sostanze dopanti

Procedura generale d’analisi: riferimenti

Materiali certificati (quando disponibili)

Bianchi spikati con opportune aliquote di reagenti puri

Campioni reali da studi di escrezione – campioni di matrice biologica ottenuti dopo somministrazione di una sostanza proibita o di un metodo proibito (numero consistente di dati)

Procedura generale d’analisi: trattamento del campione

Tampone fosfato (Ph=7.0) Idrolisi enzimatica (β-glucuronidasi) 50°C/1h

Tampone carbonato/bicarbonato di sodio(Ph=9.5) Estrazione liq-liq (pentano, etere, tert.-butil metil etere)

Portato a secco e ripreso con i solventi di eluizione (+ deriv. per GC-MS)

Donike et al. Deutsche Zeitschrift Sportmed. 1984; Catlin et al. Rapid Co mmun. Mass Spe ctro m. 20 04; Sekera et al. Rapid Co mmun. Mass Spe ctro m. 2005; Thevis et al. J. Mass Spectrom 2005 ;Costas et al. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2007; Mazzarino et al. Anal. Biochim Chem 2008

La maggior parte degli steroidi anabolizzanti è escreta dal corpo sotto forma di glucuronide. Il trattamento enzimatico risulta necessario per rimuovere la coniugazione tra l'anello A dello steroide e la molecola di acido glucuronico.

Procedura generale d’analisi: le tecniche

Saggi immunologici

GC-MS HPLC-MS MS/MS GC-IRMS

Tecniche spettroscopiche (es. NMR)

Problema analitico

Nel caso dei designer steroids l’analita è potenzialmente sconosciuto e, senza opportuni accorgimenti, non è possibile individuarli con metodi di analisi convenzionali.

Necessità di metodi analitici che permettano la determinazione di

steroidi sconosciuti.

Esempi di metodi analitici

Mazzarino M., Turi S., Botre F. “A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urin by liquid chromatography-mass

spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways” Analytical and Biochimical Chemistry 2008, 390

Nielen M. W. F., Bovee T.F.H., van Engelen M. C., Rutgers P, Hamsers A. R. M., van Rhlyn J. A., Hoogenboom L. A. P.“Urine testing for Designer

Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification”

Analytical Chemistry 2006, 78

Thevis M., Geyers H., Mareck U., Schänzer W. “Screening for Unknown Synthetic Steroids in Human Urine by Liquid Chromatography-Tandem

Mass Spectrometry” Journal of Mass Spectrometry 2005, 40

“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid

chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways”

13 glucocorticosteroidi + Deflazacort (ISTD)

Campioni positivi d’urina ottenuti da studi d’escrezione forniti dal laboratorio WADA di Cologne

Sistema HPLC-ESI-QqQ in modalità Precursor Ion Scan

“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation

pathways ”

Procedura sperimentale – Pretrattamento campione

• Tampone fosfato pH 7,4• 50μL β-Glucurunidasi • Alcalinizzazione, 1 ml

Tampone carbonato (pH=9)

Idrolisi50°C per 1h

3mlCampione

Estrazione

Ripreso in 50µl di fase mobile

• 10mL tert-butilmetiletere• Evaporazione a secchezza

IniezioneHPLC (15µl)


chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways ”

Condizioni d’analisi HPLC

Colonna C18 (2,1 x 150 mm)

Fase mobile (A) Acetonitrile 0,1% Acido Formico(B)Acqua 0,1% Acido Formico

Gradiente di eluizione B: 15%100%

Fase mobile 0,25 mL/min

Spettrometro di massa

Sorgente ESI in modalità positiva

Energia di collisione 30eV

Analizzatore Triplo quadrupolo

Masse per il Precursor Ion Scan

237,2 e 279,4 m/z


chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways ”

Cromatogramma acquisito in modalità precursor ion scan di un bianco fortificato

Cromatogramma acquisito in modalità precursor ion scan di un campione positivo al

Betamethasone

“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”

Preparazione del campione:

procedura standard. Campione iniettato in 60 uL metanolo, acido acetico(0.1%) contenente 5mM di acetato di ammonio (1:1)

Analisi in sistema LC-ESI-MS/MS in modalità Precursor Ion Scan

Ripetizione dell'analisi in caso di profili sospetti, in modalità Product Ion Scan

Stima dei detection limit


Le modificazioni nella struttura degli steroidi solitamente vanno a variare il peso molecolare dei composti, l'elemento sul quale si basa l'identificazione nei test antidoping.

Tuttavia esistono degli ioni secondari che si mantengono invariati dipendentemente dalla posizione della modifica.



“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization

tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005

21 steroidi, con struttura di 4,9,11-triene, 3-keto-4-ene e 3 keto-1-ene

sono indagati riguardo ai loro cammini di frammentazione




21 steroidi, con struttura di 4,9,11-triene, 3-keto-4-ene e 3 keto-1-ene

sono indagati riguardo ai loro cammini di frammentazione




4,9,11-triene (analoghi del gestrinone)

m/z 241 e 199




4,9,11-triene (analoghi del trenbolone)

m/z 227 e 249




3-keto-4-ene (analoghi del testosterone)

m/z 109 e 97




3-keto-1-ene (analoghi del 1-testosterone)

m/z 187

Steroidi commericiali scelti come modelli:

Gestrinone

Trenbolone

Testosterone

1-testosterone

5 Steroidi sintetizzati strutturalmente correlati ai modelli:

Ethyltestosterone

Norbolethone

Dihydrogestrinone

THG

Propyltrenbolone

ISTD: d4-THG



Gestrinone

Trenbolone

Testosterone

1-testosterone

5 Steroidi sintetizzati strutturalmente correlati ai modelli:

Ethyltestosterone

Norbolethone

Dihydrogestrinone

THG

Propyltrenbolone

ISTD: d4-THGI cromatogrammi dei rispettivi ioni precursoni sono

generati dai composti di riferimento in soluzione 2ug/mL in acetonitrile



Gestrinone

Trenbolone

Testosterone

1-testosterone

5 Steroidi sistetizzati strutturalmente correlati ai modelli:

Ethyltestosterone

Norbolethone

Dihydrogestrinone

THG

Propyltrenbolone

Tutti i composti scelti, ad eccezione di Androsterone e Etiocholanone, hanno una consistente affinità protonica grazie alla funzionalità chetonica in posizione 3. La protonazione permette la ionizzazione con interfaccia ESI.La presenza di AcNH4 nella soluzione eluente favorisce la formazione di addotti con l'azoto in composti con una ridotta affinità protonica.


Corsa cromatografica

Colonna C18 (5 μm;70x4.0mm)

Fase mobile (A) CH3COOH(0.1%) con 5 mM di AcNH4(B) Acetonitrile

Gradiente di eluizione 0 min: 10%B10 min: 100%B


Sorgente ESI in modalità positiva

Spray voltage 5500 V Ion source 350°C

Azoto (4.6x10-5 Torr) Gas nebulizzante e di collisione

Analizzatore QqQ (Tandem Massa)

Range precursor scan 250-500m/z



Il protocollo genera spettri diagnostici che comprendono i segnali di steroidi endogeni come Androsterone e Etiocholanone. L'osservazione di picchi ulteriori rispetto a quelli dei composti endogeni può significare la presenza di agenti anabolici sconosciuti ma strutturalmente correlati.

Per questo è registrato il cromatogramma, in modalità Precursor Ion Scan di un bianco, cioè un campione di urina negativo.

È stato scelto di lavorare in Base Peak chromatogram. Visualizzando ad ogni punto della corsa solo il frammento più abbondante.

Il protocollo genera spettri diagnostici che comprendono i segnali di steroidi endogeni come Androsterone e Etiocholanone. L'osservazione di picchi ulteriori rispetto a quelli dei composti endogeni può significare la presenza di agenti anabolici sconosciuti ma strutturalmente correlati.

Per questo è registrato un cromatogramma di base analizzando in modalità Precursor Ion Scan un bianco, cioè un campione di urina negativo.


Viene analizzato un bianco di urina fortificato con 50 ng/mL di

Gestrinone

Dihydrogestrinone

Ethyltestosterone

Propyltrenbolone

ISTD: d4-THG




Gestrinone

Dihydrogestrinone

Ethyltestosterone

ISTD: d4-THG

5Precursor Ion Scan

5Spettri di massa


Gestrinone

Dihydrogestrinone

Ethyltestosterone

Propyltrenbolone

ISTD: d4-THG

In presenza di picchi non riconosciuti nel cromatogramma ottenuto per Precursor Ion Scan, l'analisi del campione è ripetuta in modalità Product Ion Scan con diversi voltaggi, con lo scopo di ottenere informazioni strutturali dettagliate.



Gestrinone

Dihydrogestrinone

Ethyltestosterone

Propyltrenbolone

ISTD: d4-THG

In presenza di picchi non riconosciuti nel cromatogramma ottenuto per Precursor Ion Scan, l'analisi del campione è ripetuta in modalità Product Ion Scan con diversi voltaggi, con lo scopo di ottenere informazioni strutturali dettagliate.

Spettro in Product Ion Scan di propyltrenbolone ottenuto a 35 V(M+H)+=313


“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-

of-Flight Mass Spectrometry Identification”

Campioni utilizzati

• Analisi di campioni di urina maschile e femminile

• Analisi di campioni di urina maschile e femminile fortificati tramite aggiunta di 15ng/ml di THG (designer steroid)



Procedura sperimentale

• Pretrattamento campione

• LC/Bioassay

• LC/QTOF



Procedura sperimentale – Pretrattamento campione

• Tampone (pH=4.8)• 20μL β-Glucurunidasi e arilsolfatasi• 37°C per una notte

• Lavaggi con tampone pH=4.8, H2O, MeOH:H2O 1:1• Eluizione con 4ml ACN:H2O 90:10 • Preconcentrazione

a 2mL (N2, 40°C)



Procedura sperimentale – LC/Bioassay





Fase stazionaria C18 (5μm; 3.0x150mm)

Fase mobile (A) Acqua:Acetonitrile 10:90(B) Acqua:Acetonitrile 90:10

Flusso 0.4mL/min

Gradiente di eluizione 0min: 65%A, 35%B20min: 100%B




Cultura cellulare- Cultura di cellule di lievito ricombinante contenente il gene per l’espressione sia del recettore umano α-androgeno (AR) e della proteina yeast-enhanced green fluorescent (y-EGFP)- Lievito inserito in terreno di cultura e incubato per 24-48h (30°C)- Conservato a 4°C e, prima dell’utilizzo, aggiunta di 10mL di terreno con agitazione (225rpm) a 30°C per un giorno (fase Log)- Diluzione e aggiunta CuSO4




Piatto con recettore di androgenecità Piatto senza recettore di androgenecità

- 2μL DMSO + 50μL H2O - Su ogni piatto viene depositata una quantità di eluito pari a 20s di corsa cromatografica - 200μL di soluzione di coltura di lievito - Misura dell’intensità di fluorescenza a t=0 (fluorescenza iniziale) e t=24h mediante Cytofluor Series 4000 multiplate well reader (λexc=485nm; λemi=530nm)



Procedura sperimentale – UPLC/QTOF

• Portato a secchezza e ripreso con ACN (50μL)• Trasferito nel vial e riportato a secchezza• Ripreso con 30%ACN e 70%H2O e iniettato (20μL)


Colonna C18 (1.7μm; 2.1x50mm)

Fase mobile (A) Acido formico:Acqua:Acetonitrile 0.2:90:10(B) Acido formica:Acqua:Acetonitrile 0.2:10:90

Gradiente di eluizione 0min: 70%A; 30%B2min: 100%B

Flusso 0.2mL/min


Sorgente ESI (30V) in modalità positiva

Analizzatore Q-TOF (Tandem Massa)

Energia di collisione 25eV

Range 80-1100m/z





LC/Bioassay

NO

FINE

CxHyOz nel database?

Confronto riferimento?

FINE

NO

NO

SI

SI

SI



Biogrammi

Steroidiendogeni

Steroide esogenoWell Plate m/z [M+H]+ Formula

elementareSteroide

24 289.2170 C19H28O2 Testosterone

31 291.2321 C19H30O2DHT

(metabolita)

34-35 291.2328 C19H30O2 Androsterone

33 313.2173 C21H28O2 ?



[M+H+]

[313-H2O][295-C2H5]

[313-C4H6O]

97 109

C21H28O2

SteroideIdrossilato

17-idrossi, 13-etil, 11-deidro steroide

17-idrossi,17-etil steroide

Scheletro 4,9,11-triene[C4H15O]

Assenza frammentazioneAnelli A e B

Conclusioni

• Lo studio di metodi analitici per l’identificazione di designer steroids segue di pari passo l’evoluzione di metodi adeguati all’identificazione del maggior numero possibile di sostanze proibite con caratteristiche analoghe. Questa ricerca risulta ancora più rilevante dal fatto che la lista di sostanze proibite stilata dal WADA è una lista “aperta”.• I metodi di analisi proposti infatti risultano utili non solo per la determinazione di designer steroids, ma sono un potente metodo di screening per steroidi esogeni, metaboliti e proormoni.• La presenza di steroidi endogeni all’interno delle urine è rivelata mediante tali metodi di analisi: sono resi necessari accorgimenti per la distinzione tra specie esogene ed endogene

Bibliografia

Gerace E. “Analytical strategies for determining doping agents of the last generation” Tesi di dottorato WADA “”The 2012 prohibited list, international standard” Catlin et al. “Detection of norbolethone, an anabolic steroid never marketed, in athletes’ urine” Rapid

Comm. Mass Spectr. 2002, 16. Catlin et al. “Tetrahydrogestrinone: discovery, synteses, and detection in urine”Rapid Comm. Mass

Spectr. 2004, 18. Sekera “Another designer steroid: discovery, synthesis, and detection of ‘madol’ in urine” Rapid Comm.

Mass Spectr. 2005, 19. Pozo O. et al “Efficient approach for the comprehensive detection oh unknown anabolic steroids and

metabolites in human urine by Liquid-Chromatography- Electrospray-Tandem Mass Spectrometry” Anal Chem 2008, 80

Schänzer W. “Metabolism of anabolic androgenic steroids” Clinical Chemistry 1996, 42 Mazzarino M., Turi S., Botre F. “A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in

human urin by liquid chromatography-mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways” Analytical and Biochimical Chemistry 2008, 390

Thevis M., Geyers H., Mareck U., Schänzer W. “Screening for Unknown Synthetic Steroids in Human Urine by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry” Journal of Mass Spectrometry 2005, 40

Nielen M. W. F., Bovee T.F.H., van Engelen M. C., Rutgers P, Hamsers A. R. M., van Rhlyn J. A., Hoogenboom L. A. P.“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detction and Electron Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification” Analytical Chemistry 2006, 78

Grazie per l'attenzione

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