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Detección e identificación de hormonas peptídicas, proteínas y glicoproteínas de elevado interés
terapéutico
Detección e identificación de hormonas peptídicas, proteínas y glicoproteínas de elevado interés
terapéutico
J. BarbosaSevilla, 2004J. BarbosaSevilla, 2004
Estudio de las proteínas, de sus transformaciones y de sus funciones.
Se deben descodificar unos 30000 genesen un organismo vivo.
Deben estudiarse cientos de miles de proteínas, que pueden sufrir transformaciones y que se encuentran en los seres vivos a concentraciones diferentes.
Las PROTEÍNAS (cadenas de aminoácidos) juegan un papel básico en multitud de procesos biológicos.
ENZIMAS
NEUROTRANSMISORES
ANTICUERPOS
HORMONAS, etc.
Problema analítico de gran interésen numerosos campos científicos
Son fundamentales en un gran número de procesos metabólicos que tienen lugar en los seres vivos.
•Alteraciones protéicas Disfunciones metabólicas Su estudio permite el diagnóstico de enfermedades
•Una vez detectada,caracterizada y secuenciada, la administración de la proteína responsable puede solucionar la enfermedad.(Insulina-diabetes).
AUGE DE LAS BIOCIENCIAS
ENZIMA 1 ENZIMA 4ENZIMA 3
DEFICITARIAENZIMA 2
Conocer el metabolismo
Detectar y caracterizar enzima deficitaria
Sintetizarla
Administración
Diagnóstico de enfermedad
Solución A Solución B
Problema de gran interés pero también complejo
En una célula se cree que hay unas 10000 proteínas (se detectan aproximadamente 1000).
Actúan como enzimas, hormonas, etc. Están a concentraciones muy bajas.
Moléculas de PM elevado. Problemas de separación, detección, caracterización y secuenciación. (Fuente de ionización por MALDI o ES).
A diferencia de los genes están sujetas a modificaciones post-translacionales
GlicoproteínasGlicoproteínas
GLICOPROTEÍNASGLICOPROTEÍNAS
Una de las modificaciones post-translacionales más comunes de las proteínas es la glicosilación protéica
Consiste en la unión covalente al núcleo peptídico de cadenas decarbohidratos
GlicoproteínasGlicoproteínas
Principales estructuras de las glicoproteínas
Bi- o Tetra-antenarias
Principales estructuras de las glicoproteínas
Bi- o Tetra-antenarias
S2
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
S2
A las diferentes especies que se generan se les llama
GLICOFORMASGLICOFORMAS
GlicoproteínasGlicoproteínas
GLICOFORMASGLICOFORMAS
MICROHETEROGENEIDAD
Diferentes Glicoformas
El tipo, el número y la posición de las cadenas de azúcares varía
Una glicoproteína la componen una mezcla de glicoformas con igual núcleo peptídico pero diferentes cadenas de carbohidratos
Las glicoformasvarían lo que puede ser de gran interés analítico
Las glicoproteínas recombinantes difieren de las naturales (EPO, NESP)
El perfil glicoprotéico cambia con determinadas patologías (CDG, EET)
Las especies glicoprotéicas cambian con el proceso de obtención seguido. (Diferente estructura según laboratorio que las sintetice)
Isoformas: MetalotioneínasIsoformas: Metalotioneínas
ISOFORMASISOFORMASUna proteína no sólo puede presentar diferentes cadenas de azúcares, también puede cambiar su núcleo protéico y presentarpolimorfismo, es decir, cambios en la estructura primaria por variacion de los aminoácidos que la componen
Si son varios los aminoácidos que varían hablamos deisoformas. Si el número de aminoácidos que varia es mínimo hablamos de subisoformas.
Unas proteínas importantes que presentan polimorfismo son lasmetalotioneínas (MTs)
Entre sus funciones principales cabe destacar el control homeostático de metales esenciales ( Cu, Zn)
Isoformas: MetalotioneínasIsoformas: Metalotioneínas
MTs como medidores del impacto de la contaminación ambiental MTs como medidores del impacto de la contaminación ambiental
Importantes en estudios de contaminación
Importantes en estudios de especiación por su capacidad de formar complejos metal-proteína
Su estudio se puede abordar:
1. Mediante la caracterización directa de las distintas isoformas protéicas
2. A través del estudio de los metales enlazados a ellas
LC-MS
CE-MS
LC-ICP-MS
CE-ICP-MS
Detección de MTDetección de MT
Dentro de los estudios de proteínas con cambios en el núcleo protéico, realizamos el estudio de la :
SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE METALOTIONEÍNAS DE HÍGADO DE CONEJO POR CE-MS Y LC-MS
SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE METALOTIONEÍNAS DE HÍGADO DE CONEJO POR CE-MS Y LC-MS
Las metalotioneínas presentan dos isoformas MT1 y MT2 y seis subisoformas
MetAspPro AsnCysSer CysAla Thr
GlyAsnSer CysThrCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla
MetAspPro AsnCysSer CysAla AlaAlaGlyAspSer CysThrCysAlaAsnSer CysThrCysLysAlaCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro ProGlyCysAlaLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla
MetAspPro AsnCysSer CysAla Thr
GlyAspSer CysThrCysAlaSerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla
MetAspPro AsnCysSer CysAla ThrAlaGlyAspSer CysThrCysAlaAsnSer CysThrCysLysAlaCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro ProGlyCysAlaLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla
MetAspPro AsnCysSer CysAla Thr
ArgAspSer CysAlaCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla
MetAspPro AsnCysSer CysAla Thr
ArgAspSer CysAlaCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla LeuAspLysCysSer CysCysAla
MT-1a MT-2a MT-2b MT-2c MT-2d MT-2e
Secuencias primarias de MTsde hígado de conejo
Detección de MT por CE-UVDetección de MT por CE-UV
V= 10kVCapilar 57 cm x 75 µmInyección 10s, 5psi
Temp 25ºCλ 200 nmSeparaciones de MT-2Separaciones de MT-2
MT-2 FLUKA MT-2 SIGMA
10 20 30 40 50 60
t (min)
mAU
10 20 30 40 50 60
t (min)
mAU
Fórmico 100 mM,pH 2,2
Fosfato 100 mM / NH3pH=2,5
10 20 30 40 50 60
t (min)
mAU
10 20 30 40 50 60
t (min)
mAU
Fórmico 100 mM,pH 2,2
Fosfato 100 mM / NH3pH=2,5
INTERFASE CE-MS Y LC-MSINTERFASE CE-MS Y LC-MS
Técnica de ionización
ELECTROSPRAY
VENTAJAS: Ionización suave a presión atmosférica; transferencia directa de moléculas en fase líquida a iones gaseosos multiplemente cargados
INCONVENIENTES EN CE-MS:
No tener ningún vial que permita la continuidad eléctrica.
3 tipos de interfaseSheathlessLiquid-junctionSheath liquid
CE-MSCE-MS
1. Sheathless Recubrimiento conductor
CapilarAguja acero
Voltaje electrospray
Contacto eléctrico entre recubrimiento y
electrolito de separación
Son las interfses más utilizadas en CE-ESI-MS2. Sheath flow
Aguja acero
Voltaje electrospray
Gas nebulizador Contacto eléctrico entre
sheath liquid y electrolito de separación
Capilar
Sheath liquid
Se obtiene una resolución similar con ambas interfases. Interfase Sheathless
8.2 16.4 24.6 32.8 41.00
50
100
% In
tens
idad
Tiempo de migración (min)
Triptorelina + BuserelinaOxytocina + Met-encefalina
Bradicinina
Leu-encefalina
Eledoisina
Baja reproducibilidad
Poca durabilidad de las puntas
8.2 16.4 24.6 32.8 41.00
50
100
% In
tens
idad
8.2 16.4 24.6 32.8 41.0
Tiempo de migración (min)
0
50
100Triptorelina + Buserelina
Bradicinina Met-encefalina
Eledoisina
Leu-encefalina + Oxitocina
Interfase Sheath Flow
Interfase estable
Buena reproducibilidad
tm más cortos.
Detección de MT por CE-MSDetección de MT por CE-MS
OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALESOPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
TOFTOF--MS MARINERMS MARINER((Applied BiosystemsApplied Biosystems))
SpraySpray Tip PotentialTip Potential: : 2000 VNozzleNozzle PotentialPotential: : 100 VNozzleNozzle TemperatureTemperature: : 90ºCGas Gas Curtain FlowCurtain Flow: : 1 L/min
Sheath Liquid SplitSheath Liquid Split: : Flow rate 2ml/min
HPHP3D3D CAPILLARY CAPILLARY ELECTROPHORESISELECTROPHORESIS
((Agilent Agilent TechnologiesTechnologies))
CapillaryCapillary: : 100 cm x 75 µm I.D.
RunningRunning Buffer:Buffer:100 mM Acetic Acid :100 mM Formic Acid (pH 2.3)
InjectionInjection:: 50 mbar for 10s
LC LC PumpPumpSheath LiquidSheath Liquid: : 0.05 % Acetic Acid in 50% Isopropanol (v/v)
Detección de MT por CE-MSDetección de MT por CE-MS
MT-IMT-I
600 800 1000 1200 1400 1600
0
20
40
60
80
100
120
140
160[M + 7H][M + 7H]7+7+
[M + 4H][M + 4H]4+4+
[M + 6H][M + 6H]6+6+
[M + 5H][M + 5H]5+5+
[M + 8H][M + 8H]8+8+
[M + 9H][M + 9H]9+9+
1041.26892.54
1249.26
1036.69
888.93
781.20
694.54
777.96
M=6215.76M=6215.76 ApoMTApoMT--2d2dM=6241.95M=6241.95 ApoMTApoMT--2e2e
m/z
Inte
nsity
(cps
)
Time (min)0 4 8 12 16 20
0
5000
10000
15000
20000
25000
ApoMTApoMT--1a1a
ApoMTApoMT--2d2dApoMTApoMT--2e2e
((ApoMTApoMT--1a non1a non))
((ApoMTApoMT--2d 2d nonnon))
ApoMTApoMT--2e2enonnon
CE-ESI-MS (TIC)CE-ESI-MS (TIC) TOF spectrumTOF spectrum
Detección de MT por CE-MSDetección de MT por CE-MS
Espectros deconvolucionados a carga cero para todos los picos de MTs de hígado de conejoEspectros deconvolucionados a carga cero para todos los picos de MTs de hígado de conejo
6000 6100 6200 6300 64000
Mass
6215.28
6144.68
6241.74ApoApo--MT2eMT2e
ApoApo--MT2dMT2d
ApoApo--MT1aMT1a
6103.73
Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT1aMT1a
6173.87
Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT2dMT2d
6198.98
Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT2eMT2e
6000 6100 6200 6300 6400
Mass
6125.82ApoApo--MT2aMT2a
6145.6ApoApo--MT2bMT2b
6154.44ApoApo--MT2cMT2c
6083.38
NonacetylatedNonacetylatedApoApo--MT2aMT2a
Detección de MT por LC-MSDetección de MT por LC-MS
LC-ESI-MSLC-ESI-MS
DeclusteringDeclustering PotentialPotential:: 80 VFocusing PotentialFocusing Potential:: 250 VEntrance PotentialEntrance Potential:: -7 VNebulizer Nebulizer Gas (NGas (N22):): 10CurtainCurtain Gas (NGas (N22):): 10IonIon Spray VoltageSpray Voltage:: 4000 VNebulizer TempNebulizer Temp:: 400 ºCAuxiliar Gas (NAuxiliar Gas (N22):): 8 L/h
MS: PEMS: PE--SCIEX API 3000 TripleSCIEX API 3000 Triple--QuadrupoleQuadrupole(TurboIonspray source)
LC: LC: AgilentAgilent 1100 Series1100 Series
Column: NUCLEOSIL 120 C18 / 5 mm / 20 x 0.21 cm
Mobile Phases:A: 0.05% TFA (v/v) in H2OB: 0.05% TFA (v/v) in MeCN
pH: 2.2 – 2.3Flow: 400 µL/min
Injection Volume: 5 ml
ColumnColumn:: NUCLEOSIL 120 C18 / 5 mm / 20 x 0.21 cm
Mobile PhasesMobile Phases::A: 0.05% TFA (v/v) in H2OB: 0.05% TFA (v/v) in MeCN
pH: pH: 2.2 – 2.3FlowFlow: : 400 µL/min
Injection VolumeInjection Volume: : 5 ml
Detección de MT por LC-MSDetección de MT por LC-MS
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
0.0E+0
1.0E+5
2.0E+5
3.0E+5
4.0E+5
5.0E+5
6.0E+5
[M + 3H][M + 3H]3+3+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
0.0E+0
5.0E+4
1.0E+5
1.5E+5
2.0E+5
2.5E+5
3.0E+5
M=6214.9M=6214.9ApoMTApoMT--2d2d
1037.1
1555.0
1244.0
889.12073.3[M + 3H][M + 3H]3+3+
[M + 5H][M + 5H]5+5+
[M + 4H][M + 4H]4+4+
[M + 6H][M + 6H]6+6+
[M + 7H][M + 7H]7+7+
m/z
Inte
nsity
(cps
)[M + 5H][M + 5H]5+5+
[M + 4H][M + 4H]4+4+
[M + 6H][M + 6H]6+6+
[M + 7H][M + 7H]7+7+
M=6240.9M=6240.9ApoMTApoMT--2e2e
1041.7
1561.6
1249.6
892.82081.3
m/z
Inte
nsity
(cps
)
0 10 20 30 40 500.0E+0
5.0E+6
1.0E+7
1.5E+7
2.0E+7
2.5E+7
3.0E+7
Inte
nsity
(cps
)
Time (min)
ApoMTApoMT--1a1aApoMTApoMT--2d2d
ApoMTApoMT--2e2e
ApoMTApoMT--1a non1a non
ApoMTApoMT--2d non2d non
ApoMTApoMT--2e non2e non
ApoMTApoMT--2d nonac2d nonac
CdCd33CuCuMTMT--1a1aCdCd33CuCuMTMT--1a non1a non
CdCd33CuCuMTMT--2d2dCdCd33CuCuMTMT--2d2d nonnon
CdCd33CuCuMTMT--2e non2e nonCdCd44MTMT--2e2e nonnon
CuCu44MTMT--2e non2e nonCdCuCdCu33MTMT--1a1a nonnon
TIC
Q spectraMT-I
LC-ESI-MSLC-ESI-MS
Problemasa resolver
MÉTODOS DE DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS EN MUESTRAS BIOLÓGICASMÉTODOS DE DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
LC-MS, CE-MS (Tradicionalmente electroforesis seguida de masas off line )
Glicoformas. Diferente carga (ácido siálico), semejante masa CE-MS
Detección y caracterización rápida. Elevada selectividad, resolución y eficacia. Bajo consumo de muestra y reactivos
En la mayoría de ocasiones, sin embargo, tenemos que estudiar la parte protéica y también las cadenas azucaradas de las proteínas, ya que la mayoría son glicoproteínas.
CEAdsorción
proteínas paredcapilar
CE-MS•Interfase•Obtención de señal de glicoproteínas
Sensibilidad
Clean-up y preconcentración off-line muestra
LC, ALC, IALC
Preconcentración on-line con CE-MS
SPE-CE-MSIA-SPE-CE-MS Recubrimientos
• Dinámicos (Putrescina)
• Permanentes (PB, PB-DS)
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADESDIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GLICOFORMAS DE TRANSFERRINAGLICOFORMAS DE TRANSFERRINA
679 aminoácidos
Un 6% de su peso coresponde acarbohidratos
Proteína transportadora de Fe en suero y fluido cerebroespinal
Su anormal glicosilación se asocia con enfermedades como:
CDG (Congenital Disorder of Glycosilation)
Alcoholismo
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
GLICOFORMAS DE TRANSFERRINAGLICOFORMAS DE TRANSFERRINA
Protein surface
Protein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn Asn Asn Asn
Asn
S6
S5
S4
S3
S2
S1
S0
Protein surfaceProtein surface
Protein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surfaceProtein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surfaceProtein surface
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surfaceProtein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
Protein surfaceProtein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc
Gal
SA
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
Protein surface
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn
GlcNAc GlcNAc
Gal
SA
Gal
SA
Man Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn Asn Asn Asn
Asn
S6
S5
S4
S3
S2
S1
S0
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
ELECTROFEROGRAMASELECTROFEROGRAMAS
12 14 16 18
0
5000
10000
15000
20000
12 14 16 18
0
2000
4000
6000
Healthyserum
CDG serum
S4
S0
S2
S0
S4
S2
Concentration of glycoformsobtained from the
electropherogram data
Healthy serum
CDG-I serum
Healthy serum
CDG-I serum
S0 - 13 - 2-29
S2 1 23 1-7 14-37
S4 61 25 46-73 18-57
Glycoform concentration (% of total Tf)
Reference values [4]
(% of total Tf)Glycoform
MÉTODO ACTUAL DE DIAGNOSIS DE CDG
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
MÉTODO ELECTROFORÉTICO COMPATIBLE CON DETECCIÓN POR MSMÉTODO ELECTROFORÉTICO COMPATIBLE CON DETECCIÓN POR MS
Malos resultados
Se realizaron pruebas utilizando recubrimientos conpolibrén (PB)
Sí se han obtenido buenos electroferogramas con recubrimiento de polibrén-dextrano (PB-DS)
Silanoles de la pared de sílice del capilar. Carga negativa.
o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-o-+ + + + + + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - - - - - - -
o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-o-++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-
+ + + + + + + + + + + + + + + +- - - - - - - - - - - - - -
o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
Recubrimiento de polybren. Carga positiva. Recubrimiento de
dextrano (sulfato). Carga negativa.
EOF de ánodo a cátodo (NO inversión de flujo)
Polibrén
Dextran
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
ELECTROFEROGRAMAS DE TRANSFERRINAELECTROFEROGRAMAS DE TRANSFERRINA
Condiciones compatibles con CE-ESI-MS
min35 36 37 38 39 40
mAU
10
20
30
40
50
60
S4
S2
S5 S6
S3
Tf standardTf standard
S4
S2
12 14 16 18
0
10
20
mAU
Método con putrescinaMétodo con putrescina Método con PB-DSMétodo con PB-DS
25 mM tetraborato
100mM DABIncompatible con CE-ESI-MS
Transferrin standard
23 24 25 26 27 28
T26.5
T26.9 T27.3
Retention Time (Min)
4.1E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
CE-ESI-MS electropherogram obtained with a PB-DS method
Detección de TransferrinaDetección de Transferrina
LC-ES-MS. Deconvoluted dataLC-ES-MS. Deconvoluted data
72000 76000 80000 84000Molecular Mass
0
50000
100000
150000
200000
72000 76000 80000 84000Molecular Mass
0
20000
40000
60000
S4, 79555.6 Da S2, 77352.0 Da
S4, 79550.0 Da
S0, 75144.6 DaHealthy serum
CDG serum
Detección de EPO por CE-UVDetección de EPO por CE-UV
ERITROPOYETINA HUMANA (EPO)ERITROPOYETINA HUMANA (EPO)
Asn 24
Asn 38
Asn 83
Ser 126
Asn 24
Asn 38
Asn 83
Ser 126
Asn 24
Asn 38
Asn 83
Ser 126
Asn 24
Asn 38
Asn 83
Ser 126
Posiciones N-glicosiladas
Puentes disulfuroPosición O-glicosilada
165 aminoácidos30 kDa (38 % carbohidratos) 4 puntos de glicosilaciónSe sintetiza en riñones
Estimula la producción de eritrocitosaumentando la capacidad portadora de O2Tratamiento de: anemias, SIDA, artritisreumatoide, nacimiento prematuroProhibida por el COI desde 1989Es la proteína que genera más dinero.
Aplicaciones
NESPAnálogo hiperglicosilado. 37.1 KDa (51% carbohidratos)Mayor vida media en sangre
rHuEPO and NESP
40.00
0.00
4.00
8.00
12.00
16.00
80.00
1
3
45
6
7
2
12
3
4
5
7
89
20.00 40.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.006
Abs
orba
nce
at21
4 nm
Abs
orba
nce
at21
4 nm
a) rHuEPOpH 5.5
b) NESPpH 4.5
Time (minutes) Time (minutes)
CE separation of rHuEPO and NESP glycoforms using a separation buffer containing putrescine and urea (Sample: 1000 ppm NESP filtered; Injection: 15 s, 33.5 mbar; Voltage: 15.4 kV; T : 35 ºC; λ: 214 nm; Bare-fused silica capillary: 68.5 cm x 50 µm; Separation Buffer: 0.01 M tricine, 0.01 M NaCl, 0.01 M NaAc, 7 M urea, 2.5 mMputrescine, pH value adjusted with 2 M HAc to a) rHuEPO pH 5.5 b) NESP pH 4.5.
Separación de EPO y NESP por CESeparación de EPO y NESP por CE
SEPARACIÓN GLICOFORMAS POR CE CON RECUBRIMIENTO PERMANENTE POLIBREN (Amina Cuaternaria)
4’
min12 12.5 13
mAU
-2
0
2
4
1’
2’
3’
5’
min12
mAU
-5
0 EPO BetaEPO Beta
EPO BRPEPO BRP
12 12.5
mAU
-2.5
0
2.5EPO AlfaEPO Alfa
1’
2’
3’4’
5’
1’
2’
3’4’
5’
6’
12.5
-5
min
Recubre la pared del capilar de una elevada carga positiva, produciendo una inversión del flujo electroosmótico
Muy Buena Repetibilidad y Reproducibilidad.
Compatible con la detección en línea por MS debido a lavolatilidad del electrolito deseparación.
Electrolito de separación: 400mM HAc/NH4Ac pH 4.75;LT:57cm; V:10kV; T:25ºC;
λ:214nm
Detección de EPO por CE-MSDetección de EPO por CE-MS
CE-ES-MSCE-ES-MS
0 2.4 4.8 7.2 9.6 12.0
Retention Time (Min)
0
3.7E+4
0
50
100
% In
tens
ity
400 540 680 820 960 1100Mass (m/z)
0
51.8
0
10
20
30
40
% In
tens
ity
703.4
707.3606.4
584.4 704.3293650.5562.4
738.6 805.1 870.7498.7
915.3
981.3825.7483.7 958.7
1047.9469.0
Se pierde la resolución
Espectro muy complicado
No se puede deconvolucionar
Detección de EPO por MALDI-TOFDetección de EPO por MALDI-TOF
INFLUENCIA DE LA INTENSIDAD DEL LASER Al obtener los espectros de masas se pueden perder azúcares con lo que se debe controlar la energía suministrada
27000
28000
29000
30000
31000
32000
33000
34000
60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80
% In t e n s i t a t Làs e r
BSA
EPO BRP
EPO Beta
EPO Alfa
No influenciada por el láser
BSA no glicoproteína
rHuEPOse fragmenta
perdiendo ácidossiálicos y gruposglucosamina
Al aumentar laintensidaddel láser
Láser de N2Láser de N2
Masas Moleculares Medias a 65%
Intensidad del láserEPO BRP: 29451 Da
Detección de EPO por MSDetección de EPO por MS
rHuEPO por MALDI-TOFPermite determinar masas moleculares de proteínas.
(65% de intensidad del láser)
Técnica que no puede acoplarse en línea con la CE.
9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090
100
9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090
100
9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090
100
29384.5[M+H]+
X 2
EPO alfaEPO alfa
28854.9[M+H]+
29477.5[M+H]+
X 2
EPO BRP EPO BRP
EPO beta EPO beta
% In
tens
itat
Da/z
58810.6[2M+H]+
14775.8[M+2H]+2
58332.2[2M+H]+
14431.2[M+2H]+2
58259.4[2M+H]+
14606.7[M+2H]+2
65% intensidad del láser
Detección de EPO por CE-MSDetección de EPO por CE-MS
Aumento de la sensibilidad por CE-ES-MSAumento de la sensibilidad por CE-ES-MSClean-up y preconcentración “off-line” de la muestra (célula, sangre,orina, líquido encefaloraquídeo, lágrimas, etc)
Preconcentración “on-line” con CE-MSPreconcentrador de afinidad (C18)
Preconcentrador con anticuerpos de inmunoafinidad
Para trabajar con metodologia de inmunoafinidad necesitamos disponer de anticuerpos que en general interesa que sean lo más específicos posible.
Anticuerpos comerciales (caros y poco específicos)
Inoculación a conejos de peptidos conjugados.
(L)
Región HipervariableSitio de unión del antígeno
Cadena ligera (L) Carbohidratos
Cadena pesada
rHuEPO / IA-SPE-CErHuEPO / IA-SPE-CE
PROTOCOLO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO AL SOPORTE SÓLIDOPROTOCOLO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO AL SOPORTE SÓLIDO
NaAnticuerpo (Ab-NH2)
GLUTARALDEHÍDOLos grupos aldehído son reactivos
con aminas primarias y secundarias.
O O
H H
E tO
E tOO
O Si O
O
Na Si CH2 N CH CH2 CH
O
( )3
O
O Si O
O
Na Si CH2 N CH CH2( )3
CH N Ab
O
O Si O
O
Na Si CH2 N CH CH2Na
3
O
O Si O
O
Na Si CH2 N CH CH2Na( )3 ( )3
E tO
E tO
2. Activación
3. Inmovilización
+Grupo SILANOL de
la superficie del soporte
3
3-APTSReactivo que introduce un
grupo alquilamino en la superficie
E tO
Si CH2 NH 2
E tO
E tO ( )
Superficie aminoderivatizada o silanizada
1. SilanizaciónONa CH2 N 2
E tO
O
Si O
O
Si H
E tO
( )3
O
O Si OH
O
Na
PreconcentraciónPreconcentración
METODOLOGÍA SPE-CE:INTERACCIÓN reversible de los ANALITOS con una FASE
ESTACIONARIA, inmovilizada sobre un soporte sólido.
PRECONCENTRADOR: contiene la fase estacionaria retenida entre dos fritados.
Capilar de separación
VentanaUV
Outlet Inlet Faseestacionaria
Fritado
Soporte sólido
rHuEPO / IA-SPE-CErHuEPO / IA-SPE-CE
11.0 12.0 13.0
-532.0
-530.0
-528.0
-526.0
-524.0
0.0 40.0 80.0
40.0
44.0
48.0
52.0
56.0
60.0
1
2
34
5
rHuEPO 500 ppm rHuEPO 50 ppm rHuEPO 10 ppmmin min min
mAU mAU mAU
11.0 12.0 13.0
-532.0
-530.0
-528.0
-526.0
-524.0-524
-532
-524
-53211 13 11 13 0 80
56
40
CE-UV IA-SPE-CE
• Capilar de sílice fundida (57cm × 50µm)• Recubrimiento de polibrén• 400 mM HAc (pH=4,75)• 10 kV, 25 ºC, 214 nm
CE:• Muestra: 35 mbar, 5sSPE-CE:• Muestra: 930 mbar, 15 min• Eluyente: 100 mM H3PO4 (pH=1,5)
Desarrollando procesos de:
- Clean-up y preconcentración de la muestra por ALC e IALC.
- Preconcentradores de afinidad e inmunoafinidad en linea con CE-MS (IACE- MS).
Establecer procedimientos analíticos para la detección y caracterización de proteínas y glicoproteínas por LC-MS y CE-MS.
Anicuerpo policlonal
José Barbosa Torralbo
Victoria Sanz Nebot
Fernando Benavente Moreno
Pilar González Sánchez
Balbina Andón Fernández
Elvira Balaguer Ardanuy
Elena Hernández López
Estela Giménez López
José Barbosa Torralbo
Victoria Sanz Nebot
Fernando Benavente Moreno
Pilar González Sánchez
Balbina Andón Fernández
Elvira Balaguer Ardanuy
Elena Hernández López
Estela Giménez López