DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

Presentado por: DUVAN ALBERTO VALENCIA PRECIADO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA PEREIRA

2015

DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

Presentado por: DUVAN ALBERTO VALENCIA PRECIADO

Código: 1087123615

TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al título de Químico Industrial

DIRECTOR DEL PROYECTO Dr. OSCAR MARINO MOSQUERA MARTÍNEZ

GRUPO BIOTECNOLOGÍA - PRODUCTOS NATURALES

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA PEREIRA

2015

NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO

DETECCIÓN in vitro DE INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA EN PLANTAS DE LA FLORA COLOMBIANA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

Presentado por:

DUVAN ALBERTO VALENCIA PRECIADO

El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de: _______________.

Con la connotación: _______________.

Para la constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy 2 de Marzo de

2015.

Director: ___________________________ Oscar Marino Mosquera Martínez

Jurado: ___________________________

Francisco Javier Jiménez

DEDICATORIA

Dedicado a mis padres y hermanos por toda la paciencia, cariño y comprensión brindados.

Duvan Alberto Valencia Preciado

AGRADECIMIENTOS

• A mi madre, Ruby Consuelo Preciado Landazuri por ser mi gran amiga y su apoyo incondicional, incluso en los momentos más difíciles.

• A mi padre, William Alberto Valencia Cajiao por haberme dado un gran ejemplo de un buen ciudadano.

• A todos los miembros de mi familia, por la paciencia, los consejos y el apoyo brindado.

• A mis profesores, Oscar Marino Mosquera y Jaime Niño Osorio, por haberme confiado la responsabilidad de pertenecer al Grupo de Biotetecnología – Productos naturales, la paciencia, las experiencias compartidas, los conocimientos y consejos brindados.

• A mis compañeros del Grupo de Biotetecnología – Productos naturales, por toda la asistencia brindada.

• A la Universidad Tecnológica de Pereira por brindarme todas las herramientas e insumos necesarios para culminar esta etapa de mi vida.

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO ......................................................................................... 3

LISTA DE TABLAS .................................................................................................. 5

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 6

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. 8

RESUMEN ............................................................................................................... 9

ABSTRACT ............................................................................................................ 10

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 11

2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 13

2.1. LA ACETILCOLINESTERASA (AChE) ........................................................ 13

2.2. INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA ...................................... 14

2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA ........................................................................................................................... 15

2.3.1. DERIVADOS ANÁLOGOS DE LA TETRAHIDROACRIDINA ............... 15

2.3.2. DERIVADOS DE LA N-BENCILPIPERIDINA ....................................... 16

2.3.3. DERIVADOS DE LA BENZOFENONA ................................................. 16

2.3.4. ANÁLOGOS DEL DIBENZOFURANO .................................................. 17

2.3.5. GALANTAMINA .................................................................................... 18

2.3.6. FISOSTIGMINA .................................................................................... 19

2.3.7. DERIVADOS DE LA HUPERZINA ........................................................ 19

2.4. MÉTODOS PARA DETECTAR INHIBIDORES DE LA AChE ..................... 20

2.4.1. MÉTODO DE ELLMAN ......................................................................... 20

2.4.2. MÉTODO FLUOROMÉTRICO .............................................................. 22

2.4.3. BIOAUTOGRAFÍA ................................................................................ 22

2.4.4. HPLC-UV-VIS-MS Y DETECCIÓN BIOQUÍMICA ................................. 24

2.5. PARQUE REGIONAL NATURAL UCUMARÍ (PRNU) ................................. 25

2.5.1. FAMILIAS DE PLANTAS A ESTUDIAR ................................................ 27

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 34

4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 35

4.1. OBJETIVO GENERAL................................................................................. 35

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 35

3

5. SECCIÓN EXPERIMENTAL .............................................................................. 36

5.1. REACTIVOS Y EQUIPOS ........................................................................... 36

5.1.1. REACTIVOS ......................................................................................... 36

5.1.2. EQUIPOS ............................................................................................. 36

5.1.3. MATERIAL VEGETAL .......................................................................... 36

5.2. METODOLOGÍA .......................................................................................... 38

5.2.1. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES ............................. 38

5.2.2. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA ................................................... 38

5.2.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN MICROPLACAS .............................................................................................. 39

5.2.4. REGISTRO Y EVALUACIÓN DE DATOS ............................................ 41

5.2.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA ................... 42

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 43

6.1. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA .......................................................... 43

6.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN MICROPLACAS ........................................................................................................................... 47

6.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA .................................... 50

7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 58

8. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 59

9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 60

ANEXOS ................................................................................................................ 71

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Actividades biológicas encontradas en las familias en estudio. ............... 33 Tabla 2. Lista de plantas a evaluar su actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa. ................................................................................................ 37 Tabla 3. Reveladores y controles usados para evaluación fitoquímica de los extractos crudos. .................................................................................................... 38 Tabla 4. Preparación de las soluciones para la evaluación de la actividad inhibitoria de la AChE (Nair et al., 2011). ............................................................................... 39 Tabla 5. Caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y diclorometano. ............................................................................................................................... 44 Tabla 6. Actividad inhibitoria sobre la AChE de extractos metanólicos. ................. 47 Tabla 7. Extractos metanólicos con verdadera actividad inhibitoria de la AChE. ... 55 Tabla 8. Detección in vitro de inhibidores de la acetilcolinesterasa por el método de Ellman en plantas de la flora colombiana. ............................................................. 57

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de la galantamina, (McNulty et al., 2009). ............................. 12 Figura 2. Reacción entre la acetilcolinesterasa y la acetilcolina (Milkani et al., 2011). ............................................................................................................................... 13 Figura 3. Pasos involucrados en la hidrólisis de la acetilcolina en el sitio activo de la AChE (Milkani et al., 2011). ................................................................................... 14 Figura 4. Estructura de la tacrina, inhibidor de la AChE (Singh et al., 2013). ........ 15 Figura 5. Estructura química del donepezilo. ......................................................... 16 Figura 6. Inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona (Belluti et al., 2009). ............................................................................................................................... 17 Figura 7. Rivastigmina (A) y su derivado 5-tio-1-azaciclopentano [α] naftaleno. ... 18 Figura 8. Fisostigmina, el primer inhibidor de la AChE usado como medicamento (Singh et al., 2013). ................................................................................................ 19 Figura 9. Huperzinas, huperzina A y huperzina B. ................................................. 20 Figura 10. Reacciones implicadas en la determinación de actividad de la acetilcolinesterasa in vitro por el método de Ellman (Ellman et al., 1961). ............ 21 Figura 11. Hidrólisis del Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) a Ioduro de 7-hidroxi-1-metilquinolina (HMQI) por la AChE (Rhee et al., 2003b)......................... 22 Figura 12. Reacción de la AChE con el acetato de α-naftilo para formar el α-naftol y la posterior formación de un colorante diazoico (púrpura) con la sal de diazonio (sal de Fast Blue) (Marston, 2011). .............................................................................. 23 Figura 13. Esquema de HPLC acoplado en línea con UV-VIS-MS – Detección Bioquímica (Ingkaninan et al., 2000). ..................................................................... 25 Figura 14. Mapa del Parque Regional Natural Ucumarí (CARDER). ..................... 26 Figura 15. Flores de especies de la familia Apocynaceae (A) Cynanchum ellipticum y (B) Cynanchum formosum (Jürgens et al., 2009). ............................................... 27 Figura 16. Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org). ................................................................................ 28 Figura 17. Aster amellus L. (Asteraceae) (Münzbergová et al., 2011). .................. 29 Figura 18. Ricinus communis (Euphorbiaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org). ................................................................................ 29 Figura 19. Faramea occidentalis (Rubiaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org). ................................................................................ 30 Figura 20. Piper sarmentosum (Piperaceae) (Zakaria et al., 2010). ...................... 31 Figura 21. Withania somnifera (Solanaceae) (Vanden Berghe et al., 2012). ......... 32 Figura 22.Urera lianoides (Urticaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org). ............................................................................................................................... 32 Figura 23. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos metanólicos. ........................................................................................................... 40 Figura 24. Esquema para la determinación de la actividad inhibitoria de la AChE por el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas (Nair et al., 2011). ....... 40

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Figura 25. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en los extractos vegetales demetanol y diclorometano. ................................................... 46 Figura 26. Número de plantas con actividad contra acetilcolinesterasa. ............... 48 Figura 27. (A) Detección IAChE de los extractos metanólicos por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos metanólicos. Los extractos evaluados fueron: Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp (130), Faramea sp (138), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ...................................................... 51 Figura 28. (A) Detección IAChE de los extractos metanólicos por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos metanólicos.Los extractos evaluados fueron: Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum sp (129), Boehmeria bullata (142), Phenax uliginosus (143), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ................................. 52 Figura 29. (A) Detección IAChE de los extractos de diclorometano por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos de diclorometano. Los extractos evaluados fueron: Urera ballotaewfolia (150) (extracto metanólico), Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp (130), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ..................................................................................................................... 53 Figura 30. (A) Detección IAChE de los extractos de diclorometano por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos de diclorometano. Los extractos evaluados fueron: Faramea sp (138), Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum sp (129), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI). ................................................................. 54 Figura 31. Extractos con actividad inhibitoria verdadera contra acetilcolinesterasa. ............................................................................................................................... 56

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LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Cálculos de porcentaje de actividad inhibitoria sobre la enzima acetilcolinesterasa. ................................................................................................ 72 Anexo 2. Pruebas fitoquímicas por CCD. .............................................................. 73 Anexo 3. Prueba de Dragendorff para alcaloides. ................................................. 73 Anexo 4. Prueba de ninhidrina para aminas. ......................................................... 73 Anexo 5. Prueba de 2,4 - dinitrofenilhidracina para aldehídos. .............................. 74

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RESUMEN

En el presente trabajo se exhiben los resultados de un estudio dirigido a evaluar la actividad inhibitoria verdadera contra la acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7.) de extractos de metanol y diclorometano de 31 plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae, recolectadas en el Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU).

En la búsqueda de plantas como fuente potencial de fitocompuestos inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (AChE) se validó el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas, para determinar el porcentaje de actividad inhibitoria de la AChE de los extractos metanólicos a concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 ppm.

La aplicación de Cromatografía de Capa Delgada (CCD) permitió detectar aldehídos y aminas como falsos-positivos en el ensayo de inhibición de la AChE, los cuales no pueden ser discriminados por el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas.

La verdadera actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa fue observada en los extractos metanólicos de Critoniela acuminata (Asteraceae), Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla (Euphorbiaceae), Piper crassinervium (Piperaceae), Solanum cf umbellatum y Solanum lepidotum (Solanaceae) los cuales presentaron actividad inhibitoria sobre la AChE mediante el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas y mostraron halos de inhibición de la AChE por Cromatografía de Capa Delgada; los mismos extractos fueron también positivos con el revelador de Dragendorff a excepción de Alchornea coelophylla y Piper crassinervium.

El extracto metanólico de Alchornea coelophylla mostró el mayor porcentaje de actividad inhibitoria verdadera 18,92% a 100 ppm. Se determinó la concentración inhibitoria media del extracto metanólico de Solanum cf umbellatum (IC50 = 1,22 mg/L).

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ABSTRACT

In the present work, we report the results of a study aimed to evaluate the true inhibitory activity against acethylcholinesterase (EC 3.1.1.7.) of methanol and dichloromethane extracts of thirty one plants belonging to the family Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae and Urticaceae, which were harvest in the Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU).

In quest of plants as potential source of phytocompounds inhibitors of the acethylcholinesterase enzyme (AChE) was validated spectrophotometric method of Ellman microplate, to determine the percentage of inhibitory activity AChE of methanol extract at concentrations of 0,1, 1, 10 and 100 ppm.

The application of Thin Layer Chromatography (TLC) allowed detection of aldehydes and amines as false-positive test inhibition of AChE, which can’t be discriminated by the spectrophotometric method of Ellman in microplates.

True inhibitory activity on acetylcholinesterase was observed in methanol extracts of Critoniela acuminata (Asteraceae), Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla (Euphorbiaceae), Piper crassinervium (Piperaceae), Solanum cf umbellatum y Solanum lepidotum (Solanaceae) which showed inhibitory activity AChE with Ellman spectrophotometric method in microplates and showed halos of inhibition of AChE by Thin Layer Chromatography; the same extracts were also positive with the developer of Dragendorff except Alchornea coelophylla and Piper crassinervium.

Alchornea coelophylla methanolic extract showed the highest percent of true inhibitory activity 18.92% to 100 ppm. The mean inhibitory concentration of methanolic extrac of Solanum cf umbellatum (IC50 = 1,22 mg/L) was determined.

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1. INTRODUCCIÓN

"Demencia" es un término general que describe una variedad de enfermedades y condiciones médicas que se desarrollan cuando las células nerviosas del cerebro mueren o dejan de funcionar normalmente. La muerte o el mal funcionamiento de las neuronas, causa cambios en la memoria, comportamiento e incapacidad para pensar con claridad (Thies y Bleiler, 2012). El tipo más conocido de demencia es la enfermedad de Alzheimer (EA) (Nie et al., 2009). La EA es un trastorno neurológico irreversible, que se caracteriza por la pérdida de memoria, disfunción cognitiva, trastornos de la conducta y déficits en las actividades cotidianas (Konrath et al., 2012).

La principal estrategia terapéutica para el tratamiento de la EA es el aumento del nivel de acetilcolina (ACh) en el cerebro, mediante la intervención catalítica de la enzima acetilcolinesterasa (AChE). Actualmente, cuatro de los cinco fármacos utilizados en el tratamiento de la EA son inhibidores de la AChE, tales como tacrina, rivastigmina, donepezilo y galantamina. Cada fármaco tiene un efecto diferencial en los individuos con EA, ya sea retrasar la neurodegeneración o la estabilización de la función cognitiva. Sin embargo, el éxito de estos fármacos se ve limitado por su toxicidad hepática dependiente de la dosis y los efectos secundarios periféricos relacionados (Lakshmi et al., 2013).

Los efectos secundarios más comunes de estos medicamentos incluyen náuseas y vómitos, los cuales están relacionados con la presencia de neuronas colinérgicas en exceso en el cerebro. Efectos adversos menos frecuentes, incluyen bradicardia, calambres musculares, disminución del apetito y pérdida de peso, así como el aumento de la producción de ácidos gástricos. Por lo tanto, se necesitan nuevas moléculas que sean potencialmente más eficaces inhibiendo la AChE para reducir al mínimo estos efectos secundarios (Chen et al., 2012). Hasta la fecha, no hay una cura disponible para la EA, excepto para el tratamiento sintomático. En consecuencia, actualmente hay una gran demanda por el descubrimiento de nuevas alternativas médicas para el tratamiento de la EA (Orhan y Aslan, 2009).

Los productos naturales desempeñan un papel esencial en muchas áreas de la sociedad, por ejemplo, como agentes nutricionales y terapéuticos para prevenir o curar enfermedades. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que aproximadamente el 65% de la población mundial se basa principalmente en las plantas usadas en las medicinas tradicionales para su atención primaria de salud. En 1990, el 80% de las sustancias usadas como medicamentos para el tratamiento de enfermedades eran productos naturales o sus análogos (Kvalheim et al., 2011). Su potencial terapéutico también se ha demostrado con éxito en el campo de la EA. Por lo tanto, la naturaleza puede ser considerada como una importante fuente de nuevas entidades químicas potencialmente interesante para el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo la EA (Di Giovanni et al., 2008).

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Los metabolitos secundarios de las plantas se han utilizado como inhibidores de varias clases de enzimas. Varios miles de extractos de plantas de diferentes lugares del mundo han sido probados contra la enzima acetilcolinesterasa, varias especies vegetales han demostrado actividad inhibitoria sobre la AChE. Estas plantas, por lo tanto, tienen importancia terapéutica potencial (Ashraf et al., 2011).

Tradicionalmente, las plantas han sido una rica fuente de inhibidores de la AChE. Los habitantes de Cáucaso usan bulbos de campanillas (Galanthus sp, Amaryllidaceae) para tratar la falta de memoria. El compuesto activo de esta planta se ha aislado y llamado galantamina (Figura 1). Hoy en día este compuesto se produce comercialmente a partir de especies del género Narcissus y se utiliza para tratar la enfermedad de Alzheimer, se comercializa bajo el nombre Reminyl. Otros inhibidores de la AChE derivados de plantas utilizadas para el tratamiento de la EA incluyen la huperzina A aislada de Huperzia serrata y rivastigmina (Excelon); el último es un derivado de fisostigmina, la cual fue aislada de la haba de Calabar (Physostigma venenosum) (de Jong et al., 2006).

HH

OH

CH3O

CH3

N

O

Figura 1. Estructura de la galantamina, (McNulty et al., 2009).

Colombia es un país con una gran riqueza de especies de plantas pertenecientes a muchas familias taxonómicas, lo que lo convierte en una fuente excelente en la búsqueda de productos naturales con actividad benéfica para el hombre, tanto desde la perspectiva biológica como económica (Correa y Gaviria, 2010).

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2. MARCO TEÓRICO

2.1. LA ACETILCOLINESTERASA (AChE) La enzima acetilcolinesterasa (AChE; código enzimático 3.1.1.7) juega un papel vital en los sistemas nerviosos central y periférico (Asadabadi et al., 2009). Finaliza las transmisiones de impulsos en las sinapsis colinérgicas en el sistema nervioso al hidrolizar el neurotransmisor acetilcolina a colina y acetato, como se detalla en la figura 2 (Milkani et al., 2011; Pohanka et al., 2011).

La AChE es una serina esterasa que pertenece a la categoría de las enzimas hidrolasas. Es una proteína globular con una forma elipsoide que tiene unas dimensiones aproximadas de 45 x 60 x 65 Å (Sussman et al., 1991).

CH3

O

O

CH3CH3

CH3

N+

OHCH3

CH3

CH3

N+ +AChE

Acetilcolina Colina Acetato

O-

CH3

O

Figura 2. Reacción entre la acetilcolinesterasa y la acetilcolina (Milkani et al., 2011).

El sitio activo de la AChE contiene dos regiones: (i) la región catalítica donde se hidroliza el enlace éster y (ii) la región aniónica que acomoda la parte con carga positiva de la acetilcolina. La primera región contiene la tríada catalítica de Ser203, His447 y Glu334. Esta tríada catalítica es similar a otras serina esterasas. El mecanismo de este tipo de enzima se basa en el ataque nucleofílico del grupo hidroxilo del residuo de serina en el carbono carbonilo del enlace éster de la AChE. El residuo de serina es acetilado temporalmente, mientras que la colina se forma y difunde fuera del sitio activo. El residuo de serina acetilado a través del grupo hidroxilo del aminoácido es hidrolizado hasta acetato, regenerando así nuevamente, el sitio activo (figura 3) (Milkani et al., 2011).

La AChE juega un papel vital en los sistemas nerviosos central y periférico. Hay evidencias que muestran tanto la relación de la función de la enzima y deficiencias con las siguientes enfermedades: enfermedad de Parkinson (Asadabadi et al., 2009), enfermedad de Huntington (Adam y Jankovic, 2008), miastenia gravis (Mahadeva et al., 2008), esquizofrenia (Stip et al., 2007), el glaucoma (Millard y Broomfield, 1995), esclerosis múltiple (Christodoulou et al., 2008) y la enfermedad de Alzheimer (Seltzer et al., 2007; Bartus et al., 1982).

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Figura 3. Pasos involucrados en la hidrólisis de la acetilcolina en el sitio activo de la AChE (Milkani et al., 2011).

2.2. INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia en las personas de edad avanzada. Lamentablemente, hasta la fecha una cura efectiva o incluso una terapia preventiva siguen siendo difíciles de alcanzar. Los tratamientos disponibles tienen sólo un efecto paliativo, proporcionando una retención temporal de las funciones cognitivas y de memoria, pero sin alterar la progresión de la enfermedad (Puiatti et al., 2013).

En la actualidad, los inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE) son los primeros y el grupo más desarrollado de medicamentos aprobado para el tratamiento sintomático de la EA (Yang et al., 2012). En el mercado se encuentran cinco medicamentos, cuatro de ellos (tacrina, donepezilo, rivastigmina y galantamina) son inhibidores de la AChE. No obstante, todos estos medicamentos presentan efectos secundarios no deseados en los pacientes y su eficacia disminuye después un tratamiento prolongado. Debido al rápido aumento de población de edad avanzada a nivel mundial, hay una gran demanda de necesidades médicas no cubiertas en este campo (Hu et al., 2013).

Un gran número de investigaciones se han dirigido a la extracción de nuevos compuestos con actividad inhibidora obtenidos de diferentes especies de plantas, la síntesis y ensayo de los nuevos inhibidores de la AChE y estudios de la relación estructura-actividad de inhibidores de la AChE (Asadabadi et al., 2009).

Se ha encontrado un número significativo de compuestos de origen natural que inhiben la AChE. El grupo más destacado de estos, son los alcaloides de las Amaryllidaceae, tales como: galantamina y sanguinina, así como los alcaloides del Lycopodium, huperzina A y B. El inhibidor de la AChE, el bromohidrato de galantamina (Reminyl) fue el primero de los alcaloides de las Amaryllidaceae en ser aprobado como medicamento para el tratamiento de la EA. Aunque el alcaloide relacionado, sanguinina es un inhibidor más potente que la galantamina, su baja abundancia natural ha impedido considerablemente su desarrollo como

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medicamento, debido a esto la búsqueda de nuevos inhibidores de la AChE con mejores perfiles biológicos continúa siendo de gran interés para los químicos (McNulty et al., 2010).

2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA ACETILCOLINESTERASA Varios derivados naturales, semisintéticos y sintéticos han sido descubiertos o diseñados para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y se pueden clasificar en términos generales por sus estructuras químicas (Singh et al., 2013).

2.3.1. DERIVADOS ANÁLOGOS DE LA TETRAHIDROACRIDINA La tacrina (9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina) (figura 4) fue el primer fármaco aprobado para el tratamiento de la EA en 1993. Desafortunadamente, la administración de tacrina para el tratamiento de la EA está asociada con una alta incidencia de hepatotoxicidad (Khoobi et al., 2015). Es un potente inhibidor tanto de la acetilcolinesterasa (IC50 = 0,28 ± 0,02 µM) como de la butirilcolinesterasa (IC50 = 0,35 ± 0,2 µM) (BuChE). Su estructura ha sido modificada basándose en el anillo de la 4-aminopiridina en el sistema tetrahidroacridina. Se ha encontrado que el segmento 4-aminopiridina en la molécula tetrahidroacridina está relacionado con la potente actividad de esta. Las modificaciones, clasificadas en la modificación del anillo heterocíclico y la sustitución de 4-amino, pueden orientarse manteniendo el grupo 4-aminopiridina intacto (Barreiro et al., 2003).

NH2

N

Figura 4. Estructura de la tacrina, inhibidor de la AChE (Singh et al., 2013).

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2.3.2. DERIVADOS DE LA N-BENCILPIPERIDINA

El donepezilo (figura 5) fue aprobado en 1996 para el tratamiento de leve a moderado de la EA. Fue diseñado como inhibidor bivalente de la AChE a partir de la fisostigmina (IC50 = 11,6±1,6 nM). La estructura del donepezilo ha sido modificada y se observó el potencial efecto inhibitorio de sus derivados conservando intacto el anillo de donepezilo, mientras que el anillo de indanona del donepezilo ha sido sustituido por otros anillos heterocíclicos (Camps et al., 2008).

CH3

CH3

O

OO

N

Figura 5. Estructura química del donepezilo.

2.3.3. DERIVADOS DE LA BENZOFENONA Estos compuestos abarcan una función aromática y un grupo amino terciario conectado por un espaciador adecuado. En particular, el núcleo de la benzofenona como función aromática y la N, N-bencil metilamina como función amino terciaria han sido más usados. En la figura 6 se presenta la estructura de dos inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona, Belluti et al., (2009) sintetizaron estos compuestos y determinaron sus IC50, los cuales fueron 0,57 ± 0,04 µM y 1,41 ± 0,14 µM para A y B respectivamente.

16

A

B

CH3

CH3 O

CH3N

O

O

CH3

CH3

ON

O

O

Figura 6. Inhibidores de la AChE derivados de la benzofenona (Belluti et al., 2009).

2.3.4. ANÁLOGOS DEL DIBENZOFURANO La rivastigmina (figura 7A) es una pequeña molécula que cruza la barrera hematoencefálica fácilmente y posee propiedades inhibitorias de la AChE (IC50 = 2,07 µM) y la BuChE (Li et al., 2014). Fue aprobada en el año 2000 para el tratamiento de leve a moderado de la EA. En 2007, fue reformulada para su dosificación a través de parches transdérmicos. Esto ha resultado en una disminución de los efectos secundarios comparados con la cápsula oral. Se han sintetizado varios derivados de la rivastigmina, por ejemplo el compuesto 5-tio-1-azaciclopentano [α] naftaleno (Figura 7B), exhibió la mayor actividad entre estos (Bolognesi et al., 2004).

17

CH3 CH3

CH3N

NCH3

CH3

O

O

H

HCH3

CH3 NHO

OS

N

A

B

Figura 7. Rivastigmina (A) y su derivado 5-tio-1-azaciclopentano [α] naftaleno.

2.3.5. GALANTAMINA

La galantamina (figura 1) es un alcaloide terciario, quiral que se puede extraer de diferentes especies de la familia de las Amarilidáceas incluyendo bulbos y flores de narciso (Narcissus) y de la campanilla caucásica (Galanthus woronowii). La galantamina se emplea en el tratamiento de los síntomas de leves a moderados de la enfermedad de Alzheimer y otras alteraciones de la memoria como la demencia. Además, se utiliza para las enfermedades neuromusculares o para antagonizar la depresión respiratoria inducida por fármacos.

18

La galantamina es un inhibidor selectivo, reversible y competitivo de la acetilcolinesterasa (IC50 = 1,9 ± 0.16 µM) (Nair et al., 2011), así como un modulador alostérico del receptor nicotínico neuronal de acetilcolina y fue aprobada como un medicamento recetado por la Food and drugs administration (FDA) en 2001 (Lilienfeld, 2002). El costo de la obtención de la galantamina a partir de fuentes naturales (especies del género Narcissus) es muy alto (Marques et al., 2011)

2.3.6. FISOSTIGMINA

La fisostigmina (figura 8), también conocida como eserina es un alcaloide aislado de las semillas de Physostigma venenosum, posee actividad inhibidora contra la AChE (IC50 = 1,0 nM). La fisostigmina puede penetrar el sistema nervioso central, así que se ha emprendido el desarrollo de los derivados de la fisostigmina, esto resultó en la obtención de análogos lipofílicos adicionales de la eserina, entre estos destacan la fenserina y geneserina (Zhan et al., 2010).

H

CH3

CH3CH3

CH3NH

O

O

NN

Figura 8. Fisostigmina, el primer inhibidor de la AChE usado como medicamento (Singh et al., 2013).

2.3.7. DERIVADOS DE LA HUPERZINA

Las Huperzinas A y B son alcaloides aislados de la hierba china Huperzia serrata, la cual es un miembro del género Lycopodium, utilizada en la medicina herbal tradicional. Induce una mejoría significativa de la memoria en sujetos de edad y pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

19

Huperzina A Huperzina B

Ambos alcaloides son potentes inhibidores reversibles de la AChE. Huperzina A (figura 9A) se ha encontrado más potente que la huperzina B (figura 9B) en la inhibición de la AChE; Sin embargo, la huperzina B exhibió un mayor índice de terapéutico en comparación con la huperzina A, esta ha sido aprobada en China como un medicamento para el tratamiento de EA (Jiang et al., 2003).

Figura 9. Huperzinas, huperzina A y huperzina B.

2.4. MÉTODOS PARA DETECTAR INHIBIDORES DE LA AChE Para la detección de compuestos con actividad inhibitoria de la AChE se han utilizado métodos espectrofotométricos como el método de Ellman (Ellman et al., 1961; Yang et al., 2012); el fluorométrico (Rhee et al., 2003b); bioautografía (Marston, 2011; Rhee et al., 2003a), HPLC-UV-VIS-MS y detección bioquímica (Ingkaninan et al., 2000). A continuación se describe brevemente cada uno de ellos.

2.4.1. MÉTODO DE ELLMAN De acuerdo con Ellman et al., (1961), la acetiltiocolina es hidrolizada por la AChE produciendo tiocolina y acetato, la tiocolina reacciona con el ácido 5,5’- ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) generando la 5-tio-2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina y el anión 5-tio-2-nitrobenzoato (color amarillo) (Ver figura 10), el cual se detecta a través del espectrofotómetro de UV-VIS a una λ= 412 nm.

Este método es el más empleado, porque el espectrofotómetro UV-VIS es de mayor disponibilidad en muchos laboratorios, de fácil manejo y permite un análisis rápido; sin embargo, es poco selectivo y la presencia de aminas y aldehídos, pueden originar falsos-positivos en los estudios de inhibición de la AChE (Hernández, 2004).

20

N+

O

CH3 S CH3

CH3 CH3AChE O

-

O

CH3

+ N+

SH CH3

CH3 CH3

I-

N+SH CH3

CH3

CH3+

SS

OOH

OOH

N+O

-

O N+

O-

O

N+S CH3

CH3

CH3

S

OOH

N+O

-

O

SO

O-

N+O

-

O-

S-

OO

-

NO

O

I-

I-+

Ioduro de acetiltiocolina Acetato Ioduro de tiocolina

Ioduro de tiocolina Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB)

I-

5-tio-2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina 5-tio-2-nitrobenzoato (Amarillo)

Figura 10. Reacciones implicadas en la determinación de actividad de la acetilcolinesterasa in vitro por el método de Ellman (Ellman et al., 1961).

Pagliosa et al., (2010) a través de este procedimiento encontraron que la AChE extraída del cerebro de ratas de noventa días de edad fue inhibida más del 50% por montanina a una concentración de 1 mM. La montanina fue obtenida de Hippeastrum psittacinum y Hippeastrum vittatum las cuales son especies de la familia Amaryllidaceae.

Chen et al., (2012) evaluaron la actividad inhibitoria de extractos metanólicos de tofus fermentados de 15 marcas distintas contra la AChE a través del método de Ellman mediante un lector de microplacas. La actividad inhibitoria del tofu No. 5 (procedente del sur de Sichuan Wutongqiao, el cual no contenía pimienta) fue la mejor y presentó un IC50 = 0.191 mg/mL.

21

Además, por medio de este método se han detectado extractos de plantas que tienen actividad inhibitoria sobre la enzima AChE; por ejemplo, Torras-Claveira et al., (2013) evaluaron la actividad inhibitoria de más de 100 plantas del género Narcissus (Amaryllidaceae), en donde la galantamina fue encontrada en 97 y sanguinina en 22 de estas. La sanguninina es un inhibidor de la AChE más potente que la galantamina.

2.4.2. MÉTODO FLUOROMÉTRICO En el método fluorométrico el Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) (sustrato fluorogénico) es hidrolizado por la acetilcolinesterasa para dar como producto, el Ioduro de 7-hidroxi-1-metilquinolina (IHMQ) (figura 11), este es un compuesto altamente fluorescente, el cual es detectado fluorométricamente (Hernández, 2004).

De acuerdo a Rhee et al., (2003b) para el ensayo de la acetilcolinesterasa (AChE); los métodos fluorométricos son más sensibles que los colorimétricos; sin embargo, el costo de los equipos para aquellos es relativamente mucho más alto.

CH3

N+

O

O

CH3CH3

N+

OHI-

I-+

O

O-

CH3

AChE

IAMQ IHMQ

(λexc 320 nm; λemis 410 nm) (lexc 406 nm; lemis 505 nm)

Acetato

Figura 11. Hidrólisis del Ioduro de 7-acetato-1-metilquinolina (IAMQ) a Ioduro de 7-hidroxi-1-metilquinolina (HMQI) por la AChE (Rhee et al., 2003b).

2.4.3. BIOAUTOGRAFÍA La bioautografía es un ensayo de detección de la actividad biológica de una muestra que ha migrado en una placa de cromatografía de capa delgada (CCD) con un sistema de elución adecuado. Sólo se requieren pequeñas cantidades de muestra y es ideal para la investigación de constituyentes de una planta, que a menudo se presentan como mezclas complejas (Marston, 2011).

22

O

O

CH3OH

+AChEO

OH CH3

OH

CH3

CH3

O

O

N N+ NN++

CH3 CH3

O O

N

N

N

N

OHOH

Acetato de α−naftilo α-Naftol

α-Naftol Sal de Fast Blue B

Colorante diazoico (Púrpura)

Ácido acético

Figura 12. Reacción de la AChE con el acetato de α-naftilo para formar el α-naftol y la posterior formación de un colorante diazoico (púrpura) con la sal de diazonio (sal de Fast Blue) (Marston, 2011).

En contraste con HPLC, muchas muestras se pueden evaluar al mismo tiempo por CCD. Los solventes orgánicos, que causan la inactivación de las enzimas o la muerte de los organismos vivos, pueden ser completamente eliminados antes de la detección biológica. Muchos bioensayos son compatibles con CCD. Las evaluaciones antimicrobianas, de radicales libres, de actividad antioxidante e inhibición enzimática son algunos de los ensayos compatibles (Marston, 2011).

23

Rhee et al., (2003a) desarrollaron un método para detectar falsos positivos en la determinación de la inhibición de la AChE mediante el método de Ellman, los cuales se deben a que algunos aldehídos y/o aminas inhiben la reacción entre la tiocolina y el DTNB, esta reacción es imprescindible en el método de Ellman porque produce el anión 5-tio-nitrobenzoato el cual tiene su máxima absorción a 405 nm.

SatheeshKumar et al., (2010) determinaron la verdadera actividad inhibitoria de la AChE mediante el ensayo en microplacas y bioautografía de ambos ensayos por el método de Ellman del extracto hidroalcohólico de Trigonella foenum graecum L y trigonelina purificada a partir del extracto. La trigonelina mostró un valor IC50 de 233±0.12 µM; mientras que la galantamina usada como estándar de inhibidor de la AChE, mostró un valor IC50 de 1.27±0.21 µM.Según Marston, (2011) la actividad inhibitoria de la AChE también se puede detectar por una reacción de diazotación combinada con bioautografía, en la cual la AChE hidroliza el acetato de α-naftilo produciendo ácido acético y α-naftol, seguida a esta reacción, el α-naftol reacciona con la o-dianizidina diazo azul B (Fast Blue B Salt) produciendo un colorante diazoico púrpura (figura 12).

2.4.4. HPLC-UV-VIS-MS Y DETECCIÓN BIOQUÍMICA Ingkaninan et al., (2000) desarrollaron un método de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) acoplada en línea con detectores de ultravioleta (UV), un espectrómetro de masas (MS) y con detección bioquímica para la evaluación de la actividad inhibitoria de la AChE.

Mediante la combinación del poder de separación de HPLC, la alta selectividad de la detección bioquímica, y la capacidad de proporcionar la masa molecular y la información estructural a través del espectro de masas, los inhibidores de la AChE pueden ser identificados rápidamente. La detección bioquímica se basa en el método Ellman (Ingkaninan et al., 2000) (Figura 13).

24

Figura 13. Esquema de HPLC acoplado en línea con UV-VIS-MS – Detección Bioquímica (Ingkaninan et al., 2000).

2.5. PARQUE REGIONAL NATURAL UCUMARÍ (PRNU) El Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU) es una reserva natural ubicada al sureste de Pereira. Adjunta al Parque Nacional Los Nevados, la Reserva de Ucumarí cubre 42 km2 de terreno perteneciente a la cuenca media del río Otún (Figura 14). La misión del parque es conservar el bosque andino dentro de una zona agrícola (CARDER).

El PRNU limita al norte y al oriente con el Parque Natural de los Nevados, al sur con la divisoria de aguas del río Otún y del río Quindío y por el occidente con la quebrada Palo Blanco hasta su confluencia con el río Otún; posee un rango altitudinal entre los 1850 y 2650 m. Tiene una temperatura promedio de 14 ºC, una pluviosidad de 2600 mm/año y una humedad del 87% (Rangel y Garzón, 1994).

25

Figura 14. Mapa del Parque Regional Natural Ucumarí (CARDER).

Hasta el momento se han encontrado 598 especies, pertenecientes a 113 familias de plantas superiores, se estima que este número corresponde aproximadamente a un 80% de todas las especies existentes en el PRNU. De las familias que presentan el mayor número de especies se destacan la Solanaceae con 39 especies, la Orquidaceae con 35, la Asteraceae con 33 y la Melastomataceae con 31. En total estas cuatro familias abarcan alrededor del 20% de todas las plantas superiores del Parque Regional Natural Ucumarí (Galeano y Bernal, 1993).

26

2.5.1. FAMILIAS DE PLANTAS A ESTUDIAR Este estudio se realizó con 31 especies de plantas, recolectadas en el Parque Regional Natural Ucumarí. Las familias a las que pertenecen las plantas colectadas fueron: Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae. A continuación se hace una breve descripción de cada una de las familias de plantas empledas en este estudio.

2.5.1.1. FAMILIA APOCYNACEAE La familia Apocynaceae está constituida por cerca de 200 géneros y 2000 especies, se encuentran comúnmente en las regiones tropicales y subtropicales, y tienen valor ornamental (Figura 15). Estas plantas son también bien conocidas por los alcaloides que contienen, muchos de cuales son venenosos, un buen número de estos ha encontrado su lugar en la medicina moderna (Joselin et al., 2012).

Figura 15. Flores de especies de la familia Apocynaceae (A) Cynanchum ellipticum y (B) Cynanchum formosum (Jürgens et al., 2009).

Son plantas herbáceas (hay muchas especies volubles o trepadoras), leñosas de hojas enteras y opuestas. Las estípulas son muy raras. Fruto bacciforme o capsular o formado por dos mericarpos distintos que constituyen sendos folículos o frutos abayados. Semillas por lo común comprimidas (García, 1992).

Las especies de esta familia siempre poseen tubos laticíferos simples y floema intraleñoso. El látex frecuentemente es blanco pero también pueden ser de color amarillento a marfil (García, 1992).

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2.5.1.2. FAMILIA ASCLEPIADACEAE La familia Asclepiadaceae agrupa a unas 1700 especies (Correa y Gaviria, 2010). Son plantas herbáceas, lianas, arbustos y árboles ocasionalmente, que crecen en zonas despejadas, bosques en regeneración y raras veces en bosques maduros. La inflorescencia es cimosa en cabezuela o capítulo. El fruto es una cápsula indehiscente pequeña similar a un filamento (Figura 16) (Trujillo, 2008).

Figura 16. Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).

2.5.1.3. FAMILIA ASTERACEAE Son hierbas (rastreras o trepadoras), plantas leñosas (arbustos, árboles, bejucos). Poseen hojas alternas y opuestas, simples o compuestas; flores dispuestas siempre en capítulos, hermafroditas o unisexuales. Fruto en aquenino sésil, algunas veces con un apéndice y frecuentemente con el vilano adherido a la testa; semillas sin endospermo en íntimo contacto con el pericarpio (Correa y Gaviria, 2010).

Para la flora colombiana esta familia comprende numerosísimas especies que crecen desde 0 metros sobre el nivel del mar hasta el páramo a 4.000 metros. Sin embargo, la mayor distribución de las especies de esta familia está en los páramos y subpáramos de las 3 cordilleras (Figura 17) (García, 1992).

28

Figura 17. Aster amellus L. (Asteraceae) (Münzbergová et al., 2011).

2.5.1.4. FAMILIA EUPHORBIACEAE Son hierbas, arbustos, árboles y con frecuencia vegetales crasos. La mayoría de las especies de ésta familia tienen en todos sus órganos tubos laticíferos. Las semillas contienen gran cantidad de aceite y granos en forma de aleurona; hojas sencillas o digitadas y las flores son unisexuales (Figura 18) (García, 1992).

Figura 18. Ricinus communis (Euphorbiaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).

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Esta familia es una de las más grandes a nivel mundial y ocupa el sexto lugar en diversidad después de Orchidaceae, Asteraceae, Fabaceae, Poaceae y Rubiaceae. Está conformada por alrededor de 8700 especies distribuidas en 320 géneros (Lagos, 2009).

2.5.1.5. FAMILIA RUBIACEAE La familia Rubiaceae comprende cerca de 620 géneros, de los cuales 26 contienen más de 100 especies. En Colombia se registran 105 géneros nativos distribuidos en 25 tribus (Gonzáles, 2011).

Pueden encontrarse en esta familia árboles o arbustos, hierbas o trepadoras. Poseen hojas opuestas, simples; estípulas generalmente interpeciolares, persistentes o caducas (Figura 19).

Figura 19. Faramea occidentalis (Rubiaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).

Flores perfectas o unisexuales; cáliz con el tubo unido al ovario formando un hipanto, limbo con 4–5 dientes o lóbulos o espatulado; corola gamopétala, actinomorfa, infundibuliforme, campanulada o rotada, lóbulos usualmente 4–6, imbricados, valvados o abiertos; estambres en igual número y alternos con los lóbulos de la corola, insertos en el tubo de la corola, anteras dehiscentes por hendiduras longitudinales; ovario ínfero, usualmente 2-locular, coronado por un disco carnoso, estilo simple o furcado con estigma terminal; numerosos óvulos en cada lóculo. El fruto puede ser una baya o una cápsula (Henao, 2008).

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2.5.1.6. FAMILIA PIPERACEAE La familia Piperaceae comprende un número extenso de arbustos, hierbas y lianas que se encuentran en lugares sombríos y húmedos de todo el mundo. Tienen tallos nodosos, hojas esparcidas, flores en inflorescencias densas en espigas o en racimos; androceo en 1-10 estambres y gineceo de 1-4 carpelos, generalmente tricarpelar; ovario unilocular, con un rudimento seminal ortótropo de inserción basal; fruto en baya o en drupa; semillas con embrión muy pequeño. Comprende de 10 a 12 géneros entre ellos se enceuntran el género Piper, Piperomia, Pothomarphe, Ottonia, Sarchorhachis y Trianaeopiper; todos representados en la flora colombiana (Figura 20) (Giraldo, 2012).

Figura 20. Piper sarmentosum (Piperaceae) (Zakaria et al., 2010).

2.5.1.7. FAMILIA SOLANACEAE Las plantas de esta familia se pueden encontrar como hierbas, lianas, arbustos o árboles pequeños, terrestres o epífitas, las cuales crecen en el interior de los bosques o en zonas abiertas; poseen pelos estrellados y algunas veces tiene espinas, su inflorescencia es cimosa, con frutos en baya o algunas veces en cápsula (Figura 21); sus especies se caracterizan por biosintetizar alcaloides (Trujillo, 2008).

Especies como el borrachero (Brugamsia aurea) y la dama de noche (Cestrum nocturnum), se caracterizan por ser venenosas y alucinógenas, debido a la producción de alcaloides como escopolamina, que causa mareos, alucinaciones y perdida del conocimiento. La escopolamina es el alcaloide producido en mayor proporción por la dama de noche y la causa principal de los trastornos (Trujillo, 2008).

31

Figura 21. Withania somnifera (Solanaceae) (Vanden Berghe et al., 2012).

2.5.1.8. FAMILIA URTICACEAE Las plantas de la familia Urticaceae son hierbas u ocasionalmente semiarbustos, rara vez pequeños árboles o lianas, a menudo con pelos urticantes especializados (Figura 22). Tienen hojas simples, opuestas o alternas, con tendencia a mineralizarse con sílice o carbonato de calcio (Mañas et al., 1990).

Figura 22.Urera lianoides (Urticaceae) (Tomado de: http://plantasdecolombia.org).

Las flores de las especies pertenecientes a la familia Urticaceae son anemófilas, de distribución monoica, dioica (plantas macho y hembra en distinto pie) o polígama, pequeñas con inflorescencias axilares, con 4 ó 5 sépalos y 4 ó 5 estambres.

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Dentro de la familia Urticaceae se distinguen 45 géneros y 700 especies, ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales y más escasas en regiones templadas y frías (Mañas et al., 1990).

A continuación se presenta la tabla 2, donde se muestran algunas de las actividades biológicas reportadas para especies pertenecientes a las familias antes antes mencionadas en este trabajo.

Tabla 1. Actividades biológicas encontradas en las familias en estudio.

Familia Genero / especie Actividad biológica Referencia

Apocynaceae Cynanchum Citotóxica Stærk et al., 2000

Asclepiadaceae Oxypetalum Antifúngica Navarro et al., 2003

Asteraceae

Baccharis Antiinflamatoria dos Santos et al., 2010

Clibadium Antileishmaniasis Odonne et al., 2009

Critoniella acuminata Antiinflamatoria Jaimes, 2010

Mikania Antiinflamatoria,

antialérgica y analgésica

Rufatto et al., 2012

Pentacalia urbanii

Antimalárica y antileishmaniasis

Morais et al., 2012

Euphorbiaceae Acalypha Antioxidante Thambiraj et

al., 2012 Alchornea coelophylla Inmunomoduladora Kouakou et

al., 2013

Piperaceae Piper

crassinervium Antioxidante Yamaguchi et al., 2006

Piper umbellatum

Antibacterial, citotóxica

Roersch, 2010

Solanaceae Cestrum Antiepiléptica

Pérez-Saad y Buznego,

2008

Solanum Antimicrobiana Al-Oqail et al., 2012

Urticaceae Boehmeria bullata Antimicrobiana Al-Shamma

et al., 1982

33

3. JUSTIFICACIÓN

Con este proyecto se pretende realizar un tamizado de los extractos vegetales de las treinta y un plantas recolectadas en el Parque Regional Natural Ucumarí (PRNU), para determinar cuales tienen actividad inhibitoria verdadera sobre la acetilcolinesterasa, enzima clave para el tratamiento sintomático de la enfermedad de Alzheimer.

Los productos naturales son fuente de la medicina herbal tradicional y sintética. Son el sistema de atención primaria de salud en algunas partes del mundo (Marimuthu et al., 2012). De los varios cientos de miles de especies de plantas en todo el mundo, sólo una pequeña proporción se ha investigado tanto fitoquímica como farmacológicamente. Cuando se considera que una sola planta puede contener miles de constituyentes químicos las posibilidades de hacer nuevos descubrimientos medicinales se hacen evidentes (Hostettmann, 1999).

Actualmente la investigación de productos naturales está enfocada en la búsqueda de fármacos prometedores contra las enfermedades humanas. Por tanto, investigadores de todo el mundo participan activamente en la detección de productos naturales como inhibidores de la AChE (Khan et al., 2012).

Un gran número de plantas se ha utilizado en remedios de la medicina tradicional para tratar la memoria y trastornos cognitivos, entre ellas se encuentra Huperzia serrata (Qian Ceng Ta), la cual ha sido utilizada durante siglos en China para el tratamiento de contusiones, la hinchazón y la esquizofrenia (Konrath et al., 2012).

Los aspectos botánicos de las plantas de Colombia se han estudiado a fondo desde el siglo XVIII. Sin embargo, aunque las plantas se utilizan en gran medida en la medicina tradicional en Colombia, ha habido poca investigación sobre sus propiedades fitoquímicas (Gonzalez, 1980). La importancia de la diversidad de las plantas medicinales de un país no sólo radica en su valor quimioterapéutico en la medicina tradicional, sino también en su potencial como fuentes de nuevas entidades químicas para el descubrimiento de fármacos (Vital y Rivera, 2011).

A pesar de que Colombia es uno de los países mas biodiversos del mundo y posee ricas tradiciones culturales sobre el uso plantas, la comprensión científica de las plantas medicinales sigue siendo en gran parte inexplorada. La flora del Parque Regional Ucumarí posee gran potencial como fuente de metabolitos secundarios, en ella se han encontrado plantas con actividad bactericida, antimicótica, antioxidante y citotóxica (Niño et al., 2002), se propuso identificar nuevas plantas que posean actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa, lo cual constituiría un aporte significativo a la búsqueda de nuevas sustancias con potencial para ser usadas en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y contribuir, al mismo tiempo al conocimiento de la flora Colombiana y a la valoración de la flora regional.

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4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL Detectar inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE) en extractos vegetales procedentes de treinta y un plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar por cromatografía de capa delgada (CCD) la presencia de alcaloides, aldehídos y aminas, usando el reactivo de Dragendorff, 2,4-dinitrofenilhidracina y ninhidrina respectivamente como reveladores.

• Establecer la actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE) en

extractos vegetales mediante el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas.

• Comprobar por bioautografía la existencia de falsos-positivos (aldehídos y/o

aminas) como inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE).

35

5. SECCIÓN EXPERIMENTAL

5.1. REACTIVOS Y EQUIPOS

5.1.1. REACTIVOS Se emplearon los solventes grado analítico: acetona, acetato de etilo, cloroformo, diclorometano, metanol y n-hexano de las marcas Mallinckrodt, J.T Baker (Phillipsburg, Estados Unidos) y Carlo Erba (Arese Milano, Italia). Los reactivos Acetilcolinesterasa de Electrophorus electricus tipo VI-S, Ácido-5,5’- Ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) (Reactivo de Ellman), ioduro de acetiltiocolina (IATC) y la fisostigmina fueron de la marca Sigma-Aldrich (San Luis, Estados Unidos). La galantamina (Reminyl) fue de la marca Janssen-Cilag (Zug, Suiza). Se utilizó buffer Base-Tris, Promega (Fitchburg, Estados Unidos). Las cromatoplacas en aluminio de silica gel 60 F254 con un espesor de 0.25 μm fueron de la marca Merck (Darmstadt, Alemania).

5.1.2. EQUIPOS

• Agitador magnético, Fisher (Leicestershire, Reino Unido). • Balanza analítica, Ohaus Adventure (Distrito Federal, México). • Baño termostático, Memmert WBU - 45 (Köln, Alemania). • Cámara cromatográfica, Aldrich (San Luis, Estados Unidos). • Lector de microplacas, Thermo Scientific Multiskan GO (Helsinki, Finlandia). • Microplacas de fondo plano de 96 pozos, BD Falcon (Madrid, España). • Minishaker, Ika Works IK-LP-3617000 (Wilmington, Estados Unidos) • Potenciómetro, Fisher Scientific AB15 (Florida, Estados Unidos). • Pipetas de precisión, Eppendorf 0-10, 10-100, y 100-1000 µL (Hamburgo,

Alemania). • Rotaevaporador, Heidolph Laborata 4000 (Schwabach, Alemania). • Vidriería en general, Schott Duran (Tirschenreuth, Alemania)

5.1.3. MATERIAL VEGETAL El material vegetal correspondió a treinta y una (31) plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Piperaceae, Solanaceae y Urticaceae, recolectadas en el Parque Regional Natural Ucumarí (Pereira, Risaralda - Colombia), un voucher de cada una de ellas se encuentra depositado en el Herbario de la Universidad de Antioquia (HUA) como se reporta en la tabla 2.

36

Tabla 2. Lista de plantas a evaluar su actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa.

FAMILIA ESPECIE VOUCHER

Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964 Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981

Asteraceae

Baccharis sp FJR 3972 Clibadium pentaneuron FJR 3966 Critoniela acuminata FJR 3968 Lepidaploa lehamannii FJR 3976 Mikania banisteriae FJR 3965 Mikania lloensis FJR 3977 Pentacalya urbanii FJR 3963 Tilesia baccata FJR 3974

Euphorbiaceae

Acalypha diversifolia FJR 3967 Alchornea coelophylla FJR 3969 Alchornea sp FJR 3982 Hyeronima sp FJR 3971

Rubiaceae Faramea sp FJR 3979 Rubiacea sp FJR 3973

Piperaceae Piper crassinervium FJR 4021 Piper pesaresanum FJR 3996 Piper umbellatum FJR 4012

Solanaceae

Cestrum sp FJR 3978 Depprea aff sachapapa FJR 4024 Dunalia solanacea FJR 3992 Lycianthes radiata FJR 3993 Solandra coriacea FJR 4013 Solanum acerifolium FJR 3961 Solanum cf umbellatum FJR 3962 Solanum lepidotum FJR 3975 Solanum sp FJR 3970

Urticaceae Boehmeria bullata FJR 3989 Phenax uliginosus FJR 3990 Urera ballotaewfolia FJR 3998

37

5.2. METODOLOGÍA

5.2.1. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES La parte aérea del material vegetal recolectado se secó en estufa a una temperatura de 50 ºC por 72 horas, se molieron para ser extraídas. Se realizaron cinco extracciones sucesivas de siete días cada una por el método de maceración pasiva, empleando los solventes hexano, diclorometano y metanol, los extractos fueron concentrados en rotaevaporador a presión reducida a 50 ºC hasta sequedad, marcados y almacenados a 4 ºC hasta su utilización.

5.2.2. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA Los extractos crudos fueron caracterizados a través de una marcha fitoquímica por medio de cromatografía de capa delgada (CCD) (Mosquera et al., 2004) (Tabla 3). Los extractos de metanol se eluyeron con la mezcla de solventes cloroformo – isopropanol en proporción (95:5); en tanto que los extractos de diclorometano fueron eluidos con el sistema cloroformo – acetato de etilo - isopropanol en proporción (78:20:2), los extractos de n-hexano no fueron caracterizados. Se utilizaron cromatoplacas en aluminio de sílica gel 60 F254. Los extractos de metanol y diclorometano fueron evaluados con el reactivo de Dragendorff, el cual reacciona con los alcaloides presentes originando una coloración naranja en el fondo blanco de la placa (Yin y Sun, 2011). Además, se evaluó la presencia de aldehídos en los extractos usando 2,4 – dinitrofenilhidracina (Sandner et al., 2001), la cual reacciona con los aldehídos formando fenilhidrazonas (coloración naranja); de igual forma se evaluó la presencia de aminas mediante la reacción con ninhidrina, la cual produce coloración púrpura en presencia de aminas (Xu et al., 2008).

Tabla 3. Reveladores y controles usados para evaluación fitoquímica de los extractos crudos.

Núcleo fitoquímico Revelador usado Control positivo Alcaloides Dragendorff Fisostigmina Aldehídos 2,4- dinitrofenilhidracina Benzaldehído

Aminas Ninhidrina Dietilamina

38

5.2.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN MICROPLACAS La actividad enzimática fue medida, usando una adaptación del método descrito por Nair et al., (2011) basado en el método de Ellman (Ellman et al., 1961) en microplacas, siguiendo la siguiente metodología:

Las soluciones utilizadas en el ensayo se prepararon de la siguiente manera: buffer A (50 mM Tris HCl, pH 8,0); buffer B (50 mM Tris HCl, pH 8,0, conteniendo 0,1% albúmina de suero bovino (ASB) en buffer A); buffer C (50 mM Tris–HCl, pH 8,0, que contenía 0,1 M de NaCl y 0,02 M MgCl2·6H2O en búfer A). En la tabla 4 se describe datalladamente la preparación de cada una de las soluciones usadas en el ensayo in vitro.

Tabla 4. Preparación de las soluciones para la evaluación de la actividad inhibitoria de la AChE (Nair et al., 2011).

Solución Composición Ajuste de pH

A Buffer Tris HCl 50 mM.

Disolver 3,0285 g de Tris HCl en 500 mL de agua desionizada.

8

B Buffer Tris

HCl 50 mM, con 0,1% de

ASB.

Disolver 0,0007 g de ASB en 100 mL de buffer Tris HCl 50 mM.

8

C DTNB 3 mM en buffer Tris HCl 50 mM.

Disolver 0,1138 g de (DTNB) reactivo de Ellman, 0,585 g de NaCl, 0,4066 g de

MgCl2·6H2O en 100 mL de buffer Tris HCl 50 mM.

8

D Ioduro de

acetiltiocolina (IATC), 15

mM.

Disolver 0.0866 g de IATC en 20 mL de agua desionizada.

Preparar al momento de realizar el ensayo. No se ajustó

Preparación de las soluciones de los extractos metanólicos: Se pesó 1 mg de cada extracto en estudio y se disolvió en 1000 µL de la solución A (Ver tabla 4) para obtener la solución del extracto a una concentración de 1000 ppm. De las soluciones de 1000 ppm de cada extracto metanólico se prepararon las disoluciones seriadas, como se ilustra en la Figura 23.

En cada pozo se añadieron 25 µL del extracto en estudio a (1, 10, 100 y 100) ppm. Seguidos de 125 µL de solución 3 mM de DTNB (solución C), 50 µL de buffer Tris HCl 50 mM, con 0,1% de ASB y 25 µL de la solución AChE 0,3 U/mL. La placa se incubó por 15 minutos a 37 °C, luego se midió la absorbancia a 405 nm utilizando

39

un lector de microplacas Multiskan GO cada 45 s (tres veces). Entonces se agregó el ioduro de acetiltiocolina (25 µL, 15 mM) y la absorbancia se leyó cada 45 s (cinco veces). 1 mg de

extracto 100 µL 100 µL

100 µL

900 µL solución A 900 µL solución A 900 µL solución A

1000 µL solución A

1000 ppm 100 ppm

10 ppm 1 ppm

Figura 23. Preparación de las diferentes concentraciones de los extractos metanólicos.

Figura 24. Esquema para la determinación de la actividad inhibitoria de la AChE por el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas (Nair et al., 2011).

1• Transferir 25 µL de extracto (1, 10, 100 o 1000) ppm a cada pozo

2 • Adicionar 125 µL de la solución C.

3 • Adicionar 50 µL de la solución B.

4 • Adicionar 25 µL de la solución AChE 0,3 U/mL.

5 • Incubar por 15 minutos a 37 °C.

6 • Leer la absorbancia a 405 nm (Acti).

7 • Añadir 25 µL de IATC 15 mM (solución D).

8 • Leer la absorbancia a 405 nm, cada 45 segundos por 5 veces (Actf).

40

Donde:

Acti = actividad inicial de la enzima

Actf = actividad final de la enzima

Para la detección de la capacidad inhibitoria de los extractos contra la AchE por microplacas se usó:

• Un blanco fotométrico: 250 µL de Buffer Tris HCl 50 mM. • Un control negativo: todos los reactivos a excepción del extracto, el cual fue

reemplazado por 25 µL de Buffer Tris HCl 50 mM. • Controles positivos: galantamina y fisostigmina a una concentración de

147,32 ppm y 100 ppm respectivamente.

5.2.4. REGISTRO Y EVALUACIÓN DE DATOS

• Se realizarán seis determinaciones individuales para cada extracto, dos triplicados en ensayos independientes.

• El dato de la cinética enzimática se usó como control y se determinó con todos los reactivos a excepción del extracto a evaluar en cada ensayo (control negativo).

• Los datos de la actividad inicial (Acti) se leyeron con todos los reactivos usados en la preparación de las muestras a excepción del yoduro de acetilcolina, con lo cual se tiene en cuenta los efectos de la hidrólisis espontánea.

• Los datos de la actividad final (Actf) se leyeron cuando se adicionó el yoduro de acetiltiocolina.

• El porcentaje de la actividad inhibitoria (%AI) de la acetilcolinesterasa se determinó comparando las velocidades de reacción de las muestras en relación con el control negativo (el cual contiene todos los reactivos excepto la muestra), se empleó la ecuación 1 (Nair et al., 2011):

%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 − �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑓𝑓𝐴𝐴𝑓𝑓𝐴𝐴𝑓𝑓 �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓�−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴𝑓𝑓𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑖𝑖)�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴𝑐𝑐𝑓𝑓𝐴𝐴𝑐𝑐𝑐𝑐𝑓𝑓 𝑓𝑓𝑛𝑛𝑛𝑛𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑐𝑐 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑛𝑛)

� 𝑥𝑥 100 (1)

41

Donde:

Acti = actividad inicial de la enzima

Actf = actividad final de la enzima

Actn = actividad del control negativo

Todos los análisis se realizaron por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA seguido por el test de Tukey. Las diferencias se consideraron significativas a P ≤ 0.05. Todos los análisis se realizaron mediante Microsoft Excel 2013.

5.2.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA La actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa de los extractos vegetales de metanol y diclorometano se efectuó por cromatografía de capa delgada, con base en la metodología descrita por Marston, (2011), mediante el método de Ellman sobre cromatografía de capa delgada (bioautografía). La cromatoplaca se desarrolló como se describió anteriormente. Después, la placa de IAChE fue rociada uniformemente usando un atomizador con una solución 3mM ATCI y 3 mM de DNTB en buffer A. Luego se secó a temperatura ambiente y seguidamente se reveló con una solución de AChE 3 U/mL. Los inhibidores de la acetilcolinesterasa se mostraron como manchas blancas en el fondo amarillo de la placa cromatográfica. Para este bioensayo se utilizaron como control positivo galantamina 147,73 ppm (Nair et al., 2011) y la fisostigmina 100 ppm (Marston, 2011). Para determinar los falsos positivos, se desarrolló otra placa en paralelo a la de la actividad inhibitoria con igualdad de condiciones. Se incubó a 37 °C durante 30 minutos una solución enzima-substrato (3 U/mL AChE y 3 mM IATC). Se roció la placa con una solución 3 mM de DTNB. A continuación se secaron a temperatura ambiente y seguidamente se revelaron con una solución enzima-substrato. Los falsos inhibidores de la acetilcolinesterasa se visualizaron como manchas blancas en el fondo amarillo de las placas cromatográficas. Si las manchas blancas solo fueron observados en ensayo de IAChE, y no en el de los falsos positivos, se consideró que hubo actividad inhibitoria verdadera (Rhee et al., 2004).

42

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA

Los resultados de la caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y diclorometano de 31 plantas recolectadas en el Parque Regional Ucumarí evaluadas en este trabajo se muestran en las tabla 5; con el signo (+) se confirma la presencia del núcleo fitoquímico en estudio y con el signo (-) la ausencia de este en los extractos evaluados.

Las plantas pertenecientes a la familia Asteraceae se caracterizaron por la presencia de Alcaloides en todas las especies en estudio de los estractos metanólicos, en tanto solo los extractos de diclorometano de las especies Baccharis sp y Critoniela acuminata presentaron alcaloides. La especie Pentacalya urbanii mostró presencia de aldehídos en los extractos de metanol y diclorometano, además, Clibadium pentaneuron y Tilesia baccata mostraron evidencia de estos, solo en el extracto de diclorometano. Las especies de esta familia también evidenciaron presencia de aminas en todos los extractos metanólicos, sin embargo, los extractos de dilorometano no evidenciaron presencia de aminas.

Las especies de la familia Euphorbiaceae presentaron aldehídos en los extractos de metanol y diclorometano, con la excepción de Acalypha diversifolia, la cual solo evidenció presencia de aldehídos en el extracto metanólico. Además, las especies de esta familia no mostraron presencia de aminas y alcaloides en los extractos de diclorometano, en los extractos se evidenció presencia aminas en todas las especies y solo las especies Acalypha diversifolia y Alchornea sp mostraron alcaloides.

Mavar et al., (2004) hallaron alcaloides en el extracto metanólico de Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae), sus hojas son ampliamente utilizadas en la medicina tradicional africana, desde Senegal hasta Uganda. Hay mucha convergencia en su uso tradicional en África tropical como antiinflamatorios: para el tratamiento del chancro, heridas, cicatrización, úlceras, caries, dolor de muelas, inflamación de las encías y conjuntivitis

Los extractos metanólicos de las plantas de la familia Solanaceae evaluados se caracterizaron por la presencia de alcaloides, en tanto, solo mostró presencia de estos el extracto de diclorometano de Lycianthes radiata. Cestrum sp y Solanum cf umbellatum fueron las únicas especies que evidenciaron aldehídos en el extracto metanólico, en tanto, los extractos de diclorometano mostraron presencia de aldehídos, a excepción de Cestrum sp y Depprea aff sachapapa. Todos los extractos de metanol de esta familia expusieron presencia de aminas.

43

Tabla 5. Caracterización fitoquímica de los extractos de metanol y diclorometano. FAMILIA ESPECIE VOUCHER

Alcaloides Aldehídos Aminas MeOH DCM MeOH DCM MeOH DCM

Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964 + - + - + - Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981 + - - - + -

Asteraceae

Baccharis sp FJR 3972 + + - - + - Clibadium pentaneuron FJR 3966 + - - + + - Critoniela acuminata FJR 3968 + + - - + - Lepidaploa lehamannii FJR 3976 + - - - + - Mikania banisteriae FJR 3965 + - - - + - Mikania lloensis FJR 3977 + - - - + - Pentacalya urbanii FJR 3963 + - + + + - Tilesia baccata FJR 3974 + - - + + -

Euphorbiaceae

Acalypha diversifolia FJR 3967 + - + - + - Alchornea coelophylla FJR 3969 - - + + + - Alchornea sp FJR 3982 + - + + + - Hyeronima sp FJR 3971 - - + + + -

Rubiaceae Faramea sp FJR 3979 + - - + + - Rubiacea sp FJR 3973 + - - + + -

Piperaceae Piper crassinervium FJR 4021 - - + - - - Piper pesaresanum FJR 3996 + + - - + + Piper umbellatum FJR 4012 + - - - + -

Solanaceae

Cestrum sp FJR 3978 + - + - + - Depprea aff sachapapa FJR 4024 + - - - + - Dunalia solanacea FJR 3992 + - - + + - Lycianthes radiata FJR 3993 + + - + + - Solandra coriacea FJR 4013 + - - + + - Solanum acerifolium FJR 3961 + - - + + - Solanum cf umbellatum FJR 3962 + - + + + - Solanum lepidotum FJR 3975 + - - + + - Solanum sp FJR 3970 + - - + + -

Urticaceae Boehmeria bullata FJR 3989 + + + + + + Phenax uliginosus FJR 3990 + + + + + + Urera ballotaewfolia FJR 3998 + + - - + +

Cynanchum sp (Apocynaceae) reportó la presencia de alcaloides, aldehídos y aminas únicamente en el extracto metanólico. El extracto metanólico de la especie Oxypetalum cordifolium (Asclepiadaceae), mostró presencia de alcaloides y aminas. Lasisi et al., (2012) encontraron alcaloides en extractos etanólicos de hojas y raíces

44

de Alafia barteri en un porcentaje de 3%; Vital y Rivera, (2011) encontraron alcaloides en el extracto metanólico de las hojas de Voacanga globosa ambas plantas pertenecientes a la familia Apocynaceae.

Las especies de la familia Urticaceae evidenciaron la presencia de alcaloides, aldehídos y aminas, con la excepción de Urera ballotaewfolia, la cual no expuso presencia de aldehídos.

Toyang y Verpoorte, (2013) reportaron un número relativamente pequeño de especies del género Vernonia (Asteraceae) que contienen alcaloides. Sotoing et al., (2012) detectaron alcaloides en el extracto acuoso de Crassocephalum bauchiense (Asteraceae). Estas referencias concuerdan con los resultados obtenidos en este trabajo.

Hasta la fecha se han aislado alrededor de 90 alcaloides del indol de 15 especies de la familia Rubiaceae. Dos grupos principales de compuestos alcaloidales conocidos como, alcaloides semi-indol o alcaloides indol sencillos y los alcaloides sesquiterpénicos del indol se han identificado en Uncaria rhynchophylla. Los alcaloides del indol son compuestos heterocíclicos aromáticos, que tienen una estructura bicíclica que consta de un anillo de benceno fusionado a un anillo de pirrol. Se encuentran principalmente en ocho familias de plantas, de las cuales Apocynaceae y Rubiaceae proporcionan las mejores fuentes (Ndagijimana et al., 2013).

Investigaciones fitoquímicas llevadas a cabo sobre especies de Piper han conducido al aislamiento de muchos productos naturales bioactivos. Del género Piper, 44 especies fueron sometidas a investigaciones fitoquímicas o de bioactividad, siendo P. cubeba la más intensamente estudiada con cerca del 8%, seguida en número de investigaciones por P. longum y P. aduncum con 7%, P. methysticum y P. tuberculatum con 6%, P. santuario, P. nigrum y P. crassinervium con un 5%. Teniendo en cuenta el tipo de compuestos, se ha encontrado la prevalencia de alcaloides en la mayoría de las especies. Se han reportado actividades relacionadas con el sistema nervioso central como sedante y relajante, antiprotozoaria, citotóxica, antimicrobiana, anticáncer, insecticida, antioxidante, actividad inhibidora frente a varias enzimas, antiinflamatoria, anticoagulante, alelopática, cicatrizante y actividad antiviral (López et al., 2010).

Gomes et al., (2009) reportaron que los alcaloides provenientes de las especies Atropa belladona, Brugmansia arbórea, Capsicum annuum, Datura inoxia, Datura stramonium, Hyoscyamus niger, Mandragora officionarum, Nicotiana tabacum y Withania somnifera, pertenecientes a la familia solanaceae tienen actividades neurobiológicas. Además, concluyeron que los alcaloides fueron los principales compuestos con actividad neurológica, los cuales demostraron un alto grado de actividad en el sistema nervioso central.

45

Figura 25. Porcentajes de abundancia relativa de metabolitos secundarios en los extractos vegetales demetanol y diclorometano.

De acuerdo con la figura 25 destaca:

• El 90,32% de los extractos de metanol presentaron alcaloides, en tanto solo el 22,58% de los extractos de diclorometano presentó estos compuestos, Zhang et al., (2015) aislaron 37 alcaloides del extracto metanólico de los bulbos de planta Tabernaemontana officinalis (Apocynaceae), de los cuales 4 exhibieron actividad citotoxicidad contra tres tipos de cáncer humano. Torras-Claveria et al., (2009) expone que los alcaloides son característicos de extractos polares como los de metanol, etanol y agua.

• La mayoría de los extractos de metanol (96,77%) tienen aminas, en contraste con los de diclorometano (12,90%), esta tendencia se da debido a que al igual que en los tejidos animales, las aminas libres presentes en el interior o fuera de las células de los tejidos vegetales se encuentran en sus formas catiónicas lo que implica interacciones iónicas, debido a esta característica estas se encuentran presentes en extractos polares como los metanólicos y en soluciones ácidas de ácido perclórico, tricloroacético o clorhídrico (Bouchereau et al., 2000).

90,32%

22,58%35,48%

54,84%

96,77%

12,90%

Metanol Diclorometano Metanol Diclorometano Metanol Diclorometano

Alcaloides Aldehídos Aminas

ABUNDANCIA RELATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN LOS EXTRACTOS VEGETALES

46

6.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN EN MICROPLACAS La actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa (E.C. 3.1.1.7.) se determinó usando una adaptación del método descrito en la literatura (Nair et al., 2011). Fueron evaluados los 31 extractos metanólicos a las concentraciones de: 0,1, 1, 10 y 100 ppm. En la tabla 6 se presentan los resultados obtenidos de este ensayo. Tabla 6. Actividad inhibitoria sobre la AChE de extractos metanólicos.

FAMILIA ESPECIE VOUCHER % Actividad Inhibitoria

Concentración (ppm) 0,1 1 10 100

Apocynaceae Cynanchum sp FJR 3964 ND ND ND ND Asclepiadaceae Oxypetalum cordofolium FJR 3981 ND ND ND ND

Asteraceae

Baccharis sp FJR 3972 ND ND ND 8,35 Clibadium pentaneuron FJR 3966 ND ND ND ND Critoniela acuminata FJR 3968 ND ND ND 8,04 Lepidaploa lehamannii FJR 3976 ND ND ND ND Mikania banisteriae FJR 3965 ND ND ND 3,04 Mikania lloensis FJR 3977 ND ND ND 23,43 Pentacalya urbanii FJR 3963 ND ND ND ND Tilesia baccata FJR 3974 ND ND ND 24,24

Euphorbiaceae

Acalypha diversifolia FJR 3967 ND ND ND 16,17 Alchornea calophylla FJR 3969 ND ND ND 18,92 Alchornea sp FJR 3982 ND ND ND 3,11 Hyeronima sp FJR 3971 ND ND ND ND

Rubiaceae Faramea sp FJR 3979 ND ND ND ND Rubiacea sp FJR 3973 ND ND ND ND

Piperaceae Piper crassinervium FJR 4021 ND ND ND 6,47 Piper pesaresanum FJR 3996 ND ND ND 14,15 Piper umbellatum FJR 4012 ND ND ND ND

Solanaceae

Cestrum sp FJR 3978 ND 4,89 5,49 8,65 Depprea aff sachapapa FJR 4024 ND ND ND 4,51 Dunalia solanacea FJR 3992 ND ND ND ND Lycianthes radiata FJR 3993 ND ND ND ND Solandra coriacea FJR 4013 ND ND ND 5,94 Solanum acerifolium FJR 3961 ND ND ND 14,15 Solanum cf umbellatum FJR 3962 ND 4,89 5,49 8,65 Solanum lepidotum FJR 3975 ND ND ND 4,51 Solanum sp FJR 3970 ND ND ND 8,95

Urticaceae Boehmeria bullata FJR 3989 ND ND ND ND Phenax uliginosus FJR 3990 ND ND ND ND Urera ballotaewfolia FJR 3998 ND ND ND ND

* ND: Actividad inhibitoria no detectada

47

Conforme a los resultados obtenidos en la tabla 6, los extractos metanólicos de la familia Solanaceae fueron los que presentaron más especies con actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa (ver figura 26), Solanum acerifolium con un 14,15% de inhibición a 100 ppm fue la especie de esta familia con mayor actividad. Este valor es alto en relación con la α–Solanina un glucoalcaloide purificado de Solanum tuberosum (papa) el cual mostró una actividad inhibitoria sobre la AChE de 44,3% a 8,68 ppm (Mukherjee et al., 2007), debido a que en el extracto los compuestos responsables de esta actividad se encuentran en concentraciones bajas. Además, Cestrum sp con 8,65%, Solandra coriacea con 5,94%, Solanum cf umbellatum con 8,65% y Solanum sp con 8,95% mostraron actividad actividad inhibitoria sobre la AChE a 100 ppm.

Figura 26. Número de plantas con actividad contra acetilcolinesterasa.

La familia Asteraceae fue la segunda en cuanto a cantidad de especies con actividad inhibitoria, en la cual se destacaron Mikania lloensis y Tilesia baccata con actividades inhibitorias de 23,43% y 24,24% a 100 ppm respectivamente. Ercetin et al., (2012) determinaron que la actividad IAChE del extracto metanólico de las flores de Calendula officinalis L fue de 22,37% a 1000 ppm y la del extracto de acetato de etilo de las flores Calendula arvensis L fue de 31,24% a 1000 ppm, ambas especies pertenecientes a la familia Asteraceae.

0 0

53

02

7

0

1 1

8

42

3

9

3

NÚMERO DE PLANTAS CON ACTIVIDAD CONTRA ACETILCOLINESTERASA

Activas Total

48

Comparando estos resultados se puede establecer que los extractos de Mikania lloensis y Tilesia baccata mostraron actividad significativa, la cual puede deberse a alcaloides con importancia farmacológica. Baccharis sp con una actividad de 8,35% y Critoniela acuminata con 8,04% igualmente presentaron actividad. La familia Euphorbiaceae se destacó en este estudio con los extractos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla con porcentajes de inhibición de 16,17% y 18,92%, respectivamente; de acuerdo a la caracterización fitoquímica Alchornea coelophylla no evidenció la presencia de alcaloides, esto coincide con la investigación realizada por Aderogba et al., (2013) en la cual detectaron que la actividad inhibitoria sobre la AChE de Croton penduliflorus (Euphorbiaceae) se debió principalmente a compuestos fenólicos tales como el aldehído protocatéquico 54,6%, la quercetina 3-O-ramnósida 60%, el kaempferol 7-O-ramnósido 68,3% y el ácido p-hidroxybenzoico 51,6%, todos estos evaluados a 1000 ppm.

Piper crassinervium y Piper pesaresanum presentaron porcentajes de inhibición de 6,47% y 14,15% respectivamente. La familia Piperaceae contiene un gran número de especies que han reportado actividades biológicas importantes como insecticida, antibacteriana, antifúngica, antioxidante, entre otras. El género Piper contiene alrededor de 2000 especies y es considerado como el más importante y estudiado de dicha familia, al comprobarse que las actividades biológicas mostradas por algunas especies se debe principalmente a la presencia de metabolitos secundarios como amidas, alcaloides y compuestos fenólicos, presentes en cada especie (López et al., 2010).

Vinutha et al., (2007) clasificaron los extractos activos en cuatro categorías con relación al porcentaje de actividad inhibitoria de AChE, potente (> 50%), moderada (30% – 50%), baja (< 30%) o nula (< 5%) a una concentración de 100 ppm. Con respeto a esta clasificación 33,33% de los 31 extractos metanólicos evaluados presentaron actividad inhibitoria baja y el 66,67% actividad nula.

Torras-Claveira et al., (2013) evaluaron la actividad inhibitoria de 105 plantas del género Narcissus (Amaryllidaceae), la galantamina fue encontrada en 97 de estas; la sanguinina un inhibidor de la AChE más potente que la galantamina fue encontrada en 22 de las 105 especies evaluadas, estas investigaciones indican que en las plantas se pueden encontrar inhibidores de la AChE con mayor biodisponibilidad, menores efectos adversos con respecto a los medicamentos actuales y mayor eficiencia en la inhibición. De acuerdo con la caracterización fitoquímica, la mayoría de los extractos con actividad inhibitoria presentaron alcaloides, con excepción de Alchornea coelophylla y Piper crassinervium. Este hecho hace necesario descartar los falsos positivos mediante un ensayo adicional, para el cual Rhee et al., (2004) desarrollaron un método combinando la bioautografía y el método de Ellman.

49

6.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA SOBRE LA ACETILCOLINESTERASA POR BIOAUTOGRAFÍA La determinación de los falsos inhibidores de la AChE fue realizada mediante bioautografía por aspersión, combinada con el método de Ellman (Marston, 2011), se emplearon las mismas condiciones cromatográficas usadas en la caracterización fitoquímica.

De acuerdo con Rhee et al., (2003a) y la figura 27, los extractos metanólicos de las plantas Baccharis sp (131), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Tilesia baccata (133) y Alchornea sp (140) tienen actividad inhibitoria falsa, esto es debido a que dieron positivos en la prueba de falsos inhibidores de la AChE.

En cuanto a los extractos de Critoniela acuminata (127), Acalypha diversifolia (126) y Alchornea coelophylla (128) se puede concluir que tienen actividad inhibitoria verdadera; sin embargo, el extracto metanólico de Alchornea coelophylla no evidenció alcaloides (ver tabla 6); por lo tanto y en asociación con lo reportado por Aderogba et al., (2013) la actividad inhibitoria sobre la AChE se puede deber a la presencia de compuestos fenólicos.

De la figura 28 se puede concluir que los extractos metanólicos de las plantas Piper crassinervium (167), Solanum cf umbellatum (121) y Solanum lepidotum (134) mostraron actividad inhibitoria verdadera contra la acetilcolinesterasa, no obstante las plantas Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Solanum acerifolium (120) y Solanum sp (129) mostraron falsa actividad inhibitoria, estas especies presentaron aldehídos y/o aminas, lo cual puede ser causante de su falsa actividad inhibitoria.

Conforme a la figura 29 se puede considerar que los extractos de diclorometano de las plantas Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125) y Critoniela acuminata (127) tienen actividad inhibitoria falsa contra la acetilcolinesterasa. Acorde con la figura 30 se puede observar que ninguno de los extractos de diclorometano de las plantas estudiadas mostraron actividad inhibitoria verdadera, esto se puede deber a que solo 4 especies evidenciaron la presencia de alcaloides (ver tabla 6), a los cuales se les atribuye en gran parte la actividad inhibitoria contra la acetilcolinesterasa (Asadabadi et al., 2009).

50

Figura 27. (A) Detección IAChE de los extractos metanólicos por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos metanólicos. Los extractos evaluados fueron: Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp (130), Faramea sp (138), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).

A

B

51

Figura 28. (A) Detección IAChE de los extractos metanólicos por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos metanólicos.Los extractos evaluados fueron: Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum sp (129), Boehmeria bullata (142), Phenax uliginosus (143), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).

A

B

52

Figura 29. (A) Detección IAChE de los extractos de diclorometano por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos de diclorometano. Los extractos evaluados fueron: Urera ballotaewfolia (150) (extracto metanólico), Cynanchum sp (123), Oxypetalum cordofolium (139), Baccharis sp (131), Clibadium pentaneuron (125), Critoniela acuminata (127), Lepidaploa lehamannii (135), Mikania banisteriae (124), Mikania lloensis (136), Pentacalya urbanii (122), Tilesia baccata (133), Acalypha diversifolia (126), Alchornea coelophylla (128), Alchornea sp (140), Hyeronima sp (130), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).

A

B

53

Figura 30. (A) Detección IAChE de los extractos de diclorometano por bioautografía y (B) Falsos positivos de los extractos de diclorometano. Los extractos evaluados fueron: Faramea sp (138), Rubiacea sp (132), Piper crassinervium (167), Piper pesaresanum (148), Piper umbellatum (163), Cestrum sp (137), Depprea aff sachapapa (170), Dunalia solanacea (145), Lycianthes radiata (146), Solandra coriacea (164), Solanum acerifolium (120), Solanum cf umbellatum (121), Solanum lepidotum (134), Solanum sp (129), Galantamina (GAL), Fisostigmina (ESE), Dietilamina (DEA), Anisaldehído (ANI).

A

B

54

Con base en lo anteriormente expuesto, se puede concluir que las evaluaciones por cromatografía de capa delgada combinada, funcionaron satisfactoriamente para la detección de aldehídos y aminas en los extractos de metanol y diclorometano, los cuales dieron resultados como falsos-positivos en la inhibición de la AChE. Los extractos con actividad inhibitoria verdadera contra la AChE se resumen se presentan en la tabla 7, la cual es debida fundamentalmente a la presencia de alcaloides.

Tabla 7. Extractos metanólicos con verdadera actividad inhibitoria de la AChE.

Familia Especie Voucher Marcha fiquímica

Alcaloides Aldehídos Aminas

Asteraceae Critoniela acuminata FJR 3968 + - +

Euphorbiaceae Acalypha

diversifolia FJR 3967 + + +

Alchornea coelophylla FJR 3969 - + +

Piperaceae Piper crassinervium FJR 4021 - + +

Solanaceae Solanum cf umbellatum FJR 3962 + + +

Solanum lepidotum FJR 3975 + - +

Piper crassinervium y Alchornea coelophylla presentaron una actividad inhibitoria verdadera de 6,47% y 18,92% respectivamente (ver figura 31). Alchornea coelophylla es la planta que mayor actividad mostró; sin embargo en la caracterización fitoquímica ninguna de estas plantas evidenció presencia de alcaloides pero si de aldehídos y aminas, por lo tanto esta actividad se puede deber a compuestos de naturaleza glucósida, flavonoides o xantonas (Mukherjee et al., 2007; Aderogba et al., 2013). Giraldo, (2012) reportó la presencia de flavonoides en en el extracto metanólico de Piper crassinervium.

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Figura 31. Extractos con actividad inhibitoria verdadera contra acetilcolinesterasa.

El género Solanum es el mayor género de la familia de las solanáceas, consta de más de 1.700 especies distribuidas por todo el mundo. Varias especies del género Solanum se utilizan en la medicina popular de diferentes países, Brasil, India, Taiwán, Alemania, Sudáfrica y Kenia, como remedio para diversas dolencias, como hipoglucemia, antiespasmódico, epilepsia, el tratamiento de la bronquitis, dolores en el cuerpo y el cáncer. El género Solanum es una rica fuente de muchas clases de compuestos como compuestos fenólicos y alcaloides (Al-Oqail et al., 2012).

Solanum cf umbellatum fue la única especie que mostró actividad inhibitoria contra la acetilcolinesterasa a 1, 10 y 100 ppm, com porcentajes de inhibición de 4,89%, 5,49% y 8,63% respectivamente. Debido a esto es la única planta en estudio que se la determinó la concentración inhibitoria media (IC50) con un valor de 1,22 mg/L.

Este hecho hace que esta especie pueda ser objeto de futuras investigaciones en las que se pueda aislar el o los compuestos remposables de esta actividad, para poder estudiados individualmente y obtener mejores resultados, puesto que los extractos crudos son matrices muy complejas y es muy probable que hayan compuestos que interfieran con la calidad de los resultados.

4,89%5,49%

8,04%

16,17%

18,92%

6,47%8,65%

4,51%

Critonielaacuminata

Acalyphadiversifolia

Alchorneacoelophylla

Pipercrassinervium

Solanum cfumbellatum

Solanumlepidotum

EXTRACTOS CON ACTIVIDAD INHIBITORIA VERDADERA CONTRA ACETILCOLINESTERASA

1 ppm 10 ppm 100 ppm

IC50 = 1,22 mg/mL

56

Tabla 8. Detección in vitro de inhibidores de la acetilcolinesterasa por el método de Ellman en plantas de la flora colombiana.

OBJETIVO GENERAL: Detectar actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa en extractos de diclorometano y

metanol de treinta y un plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Piperaceae, Rubiaceae, Solanaceae y Urticaceae.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ACTIVIDADES META, LOGRO O

RESULTADO METODOLOGÍA TIEMPO RECURSOS SUPUESTO

Caracterizar por cromatografía de capa delgada (CCD) la presencia de alcaloides, aldehídos y aminas, usando el reactivo de Dragendorff, 2,4- dinitrofenilhidracina y ninhidrina respectivamente como reveladores.

Caracterización fitoquímica de alcaloides, aldehídos y aminas

Encontrar alcaloides, los cuales son responsables de IAChE

Cromatografía de capa delgada

4 meses

El GBPN proporcionará la mayor cantidad de los recursos necesarios para completar cada una de las etapas del trabajo

Equipos en estado defectuoso, agotamiento de reactivos, anormalidad académica.

Establecer la actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE) en extractos vegetales mediante el método espectrofotométrico de Ellman en microplacas.

Medición de actividad inhibitoria de los extractos

Detectar actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa en los extractos metanólicos

Método de Ellman en microplacas

4 meses

El GBPN proporcionará la mayor cantidad de los recursos necesarios para completar cada una de las etapas del trabajo

Equipos en estado defectuoso, agotamiento de reactivos, anormalidad académica.

Comprobar por bioautografía la existencia de falsos- positivos (aldehídos y/o aminas) como inhibidores de la enzima acetilcolinesterasa (IAChE).

Identificación de extractos con IAChE falsa

Descartar extractos con IAChE falsa

Cromatografía de capa delgada combinada con bioautografía

4 meses

El GBPN proporcionará la mayor cantidad de los recursos necesarios para completar cada una de las etapas del trabajo

Equipos en estado defectuoso, agotamiento de reactivos, anormalidad académica.

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7. CONCLUSIONES

• Mediante la caracterización fitoquímica se logró comprobar la presencia

alcaloides en todos los extractos metanólicos a excepción de Alchornea coelophylla y Piper crassinervium, especies que a pesar de esto, presentaron actividad inhibitoria verdadera.

• Mediante bioautografía se determinó que los extractos metanólicos de las especies Critoniela acuminata, Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla, Piper crassinervium, Solanum cf umbellatum y Solanum lepidotum, presentaron actividad inhibitoria verdadera sobre la acetilcolinesterasa. Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla mostraron la mayor actividad verdadera con valores del 16,17% y 18,92 respectivamente.

• Se determinó la concentración inhibitoria media de Solanum cf umbellatum (IC50 = 1,22 mg/mL), es 220 veces mayor al de la galantamina (IC50 = 0,005453 mg/mL). Aun así es una planta con una actividad prometedora debido a que se evaluó el extracto crudo a bajas concentraciones.

• El presente trabajo es un aporte a la bioprospección de la flora del Parque Regional Natural Ucumarí y un avance en la búsqueda de metabolitos secundarios que puedan ser empleados en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

58

8. RECOMENDACIONES

• Continuar con la separación, purificación e identificación de los principios

activos presentes en los extractos de plantas que presentaron actividad inhibitoria verdadera sobre la enzima acetilcolinesterasa, especialmente la especie Solanum cf umbellatum (Solanaceae); debido a que es una especie prometedora en la búsqueda de nuevas fuentes de compuestos que puedan llegar a ser usados como medicamentos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

• Tener en cuenta para futuras investigaciones de inhibidores de la acetilcolinesterasa no solo el estudio de alcaloides como familia de compuestos con actividad sobre la enzima, también enfocarse en compuestos de carácter fenólico.

• Seguir con la búsqueda de plantas con actividad inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa, en la medida de lo posible evaluar la actividad sobre fracciones de alcaloides de los extractos o con alcaloides purificados, debido a que los extractos crudos son matrices complejas de compuestos; en las cuales algunos compuestos pueden interferir en la calidad de los resultados.

59

9. BIBLIOGRAFÍA

Adam, O. Jankovic, O. 2008. Symptomatic treatment of Huntington disease. Neurotherapeutics. 5: 181–197.

Aderogba, M. Ndhlala, A. Van Staden, J. 2013. Acetylcholinesterase inhibitory activity and mutagenic effects of Croton penduliflorus leaf extract constituents. South African Journal of Botany. 87: 48–51.

Al-Oqail, M. Hassan, W. Ahmad, M. 2012. Phytochemical and biological studies of Solanum schimperianum Hochst. Saudi Pharmaceutical Journal. 20: 371–379.

Al-Shamma, A. Drake, S. Guagliardi, L. Mitscher, L. Swayze, J. 1982. Antimicrobial alkaloids from Boehmeria cylindrical. Phytochemistry. 21: 485–487.

Asadabadi, E. Abdolmaleki, P. Barkooie, S. 2009. A combinatorial feature selection approach to describe the QSAR of dual site inhibitors of acetylcholinesterase. Computers in Biology and Medicine. 39: 1089–1095.

Ashraf, M. Ahmad, K. Ahmad, I. Ahmad, S. Arshad, S. Ali, S. Nasim, F. 2011. Acetylcholinesterase and NADH oxidase inhibitory activity of some medicinal plants. Journal of Medicinal Plants Research. 5: 2086-2089.

Barreiro, E. Camara, C. Verli, H. Brazil-Más, L. Castro, N. Cintra, W. Aracava, Y. Rodrigues, C. Fraga, C. 2003. Design, Synthesis, and Pharmacological Profile of Novel Fused Pyrazolo[4,3-d]pyridine and Pyrazolo[3,4-b][1,8]naphthyridine Isosteres: A New Class of Potent and Selective Acetylcholinesterase Inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 46: 1144–1152.

Bartus, R. Dean III, R. Beer, B. Lippa, A. 1982. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217: 408–417.

Bazílio De Omena, Christhiane Maria. Atividade antioxidante e anticolinesterase dos extratos etanólicos dos frutos: Siriguela Spondia purpurea Linneaeus; Umbu Spondia tuberosa Arruda; Jenipapo Genipa americana Linneaeus e Mangaba Hancornia speciosa Gomes. Dirigida por Antônio Euzébio Goulart Sant’Ana. Tesis de posgrado. Unirvesidade Federal de Alagoas, Instituto de Química e Biotecnologia. 2012.

Belluti, F. Piazzi, L. Bisi, A. Gobbi, S. BArtolini, M. Cavalli, A. Valenti, P. Rampa, A. 2009. Design, synthesis, and evaluation of benzophenone derivatives as novel acetylcholinesterase inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry. 44: 1341-1348.

60

Bolognesi, M. Bartolini, M. Cavalli, A. Andrisano, V. Rosini, M. Minarini, A. Melchiore, C. 2004. Design, synthesis, and biological evaluation of conformationally restricted rivastigmine analogues. Journal of Medical Chemistry. 47: 5945-5952.

Bouchereau, A. Guénot, P. Larher, F. 2000. Review: Analysis of amines in plant materials. Journal of Chromatography B. 747: 49–67.

Bustamante Pelaez, Angelica María. 2007. Evaluación de 42 extractos vegetales para el control de la broca de café (Hypothenemus hampei, FERRARI). Dirigida por Jaime Niño Osorio. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Camps, P. Formosa, X. Galdeano, C. Gómez, T. Muñoz-Torrero, D. Ramírez, L. Viayna, E. Gómez, E. Isambert, N. Lavilla, R. Badia, A. Clos, V. Bartolini, M. Mancini, F. Andrisano, V. Bidon-Chanal, A. Huertas, O. Dafni, T. Luque, J. 2010. Novel Donepezil-Based Inhibitors of Acetyl- and Butyrylcholinesterase and Acetylcholinesterase-Induced β-Amyloid Aggregation. Journal of Medical Chemistry. 51: 3588–3598.

Camps, P. Formosa, X. Galdeano, C. Gómez, T. Muñoz-Torrero, D. Ramírez, L. Viayna, E. Gómez, E. Isambert, N. Lavilla, R. Badia, A. Clos, V. Bartolini, M. Mancini, F. Andrisano, V. Bidon-Chanal, A. Huertas, O. Dafni, T. Luque, J. 2010. Tacrine-based dual binding site acetylcholinesterase inhibitors as potential disease-modifying anti-Alzheimer drug candidates. Chemico-Biological Interactions. 187: 411–415.

Christodoulou, C. MacAllister, W. McLinskey, N. Krupp, L. 2008. Treatment of cognitive impairment in multiple sclerosis: is the use of acetylcholinesterase inhibitors a viable option? CNS Drugs. 22: 87–97.

Chen, J. Quan, M. Chen, Y. Sun, J. Li, L. 2012. Acetylcholinesterase inhibitory activity of Chinese sufu (fermented tofu) ethanol-extract. Food Chemistry. 134: 1263–1266.

Choma, I. Grzelak, E. 2010. Bioautography detection in thin-layer chromatography. Journal of Chromatography A. 1218: 2684–2691.

Correa Soto, Clara Eugenia. Gaviria Mendoza, Andrés. 2010. Evaluación de la capacidad antioxidante y actividad anti-topoisomerasa i y/o ii sobre cepas mutadas de saccharomyces cerevisiae de plantas de la ecorregión cafetera colombiana. Dirigida por Jaime Niño Osorio. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Crowch, C. Okello, E. 2009. Kinetics of acetylcholinesterase inhibitory activities by aqueous extracts of Acacia nilotica (L.) and Rhamnus prinoides (L’Hér.). African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 3(10). 469-475.

61

de Jong, C. Derks, R. Bruyneel, B. Niessen, W. Irth, H. 2006. High-performance liquid chromatography–mass spectrometry-based acetylcholinesterase assay for the screening of inhibitors in natural extracts. Journal of Chromatography A. 1112: 303-310.

Di Giovanni, S. Borloz, A. Urbain, A. Marston, A. Hostettmann, K. Carrupt, P. Reist, M. 2008. In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: Thin layer chromatography versus microplate methods. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 33: 109-119. dos Santos, D. Fukui, M. Nanayakkara, D. Khan, S. Sousa, J. Bastos, J. Andrade, S. da Silva, A. Quintão, N. 2010. Anti-inflammatory and antinociceptive effects of Baccharis dracunculifolia DC (Asteraceae) in different experimental models. Journal of Ethnopharmacology. 127: 543–550.

Ellman, G.L. Courtney, K.D. Andres, V. Featherstone, R.M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88–95.

Ercetin, T. Sezer, F. Erdogan, I. Toker, G. 2012. Comparative assessment of antioxidant and cholinesterase inhibitory properties of the marigold extracts from Calendula arvensis L. and Calendula officinalis L. Industrial Crops and Products. 36: 203–208.

Galeano M, Bernal R. 1993. Guía de las plantas del Parque Regional Natural Ucumarí. Tomo I. Instituto de Ciencias Naturales. Universidad Nacional de Colombia. CARDER. p. 11-49.

García H. 1992. Flora Medicinal Colombiana. Segunda Edición. Editorial Tercer Mundo. Tomos I-III.

Giraldo Aricapa, Angélica. Estudio fitoquímico de Piper pesaresanum Y Piper crassinervium (Piperaceae). Dirigida por Jaime Niño Osorio. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías. 2012.

Gomes, N. Campos, M. Órfão, J. Ribeiro, C. 2009. Plants with neurobiological activity as potential targets for drug discovery. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 33: 1372–1389.

Gonzalez, J. 1980. Medicinal plants in Colombia. Journal of Ethnopharmacology. 2: 43-47.

Gonzáles Cadavid, Lina María. 2011. Caracterización de ciclótidos aislados de guettarda crispiflora (rubiaceae) con actividad antimicrobiana. Dirigida por Oscar Marino Mosquera. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

62

Heinrich, M., Teoh, H.L., 2004. Galanthamine from snowdrop-the development of a modern drug against Alzheimer’s disease from local Caucasian knowledge. Journal of Ethnopharmacology 92: 147–162.

Henao Betancur, Lina Marcela. 2008. Control de la broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) por extractos vegetales de plantas de la flora regional. Dirigida por Jaime Niño Osorio. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Hernández Bustamante, Jimmy Alexander. 2004. Detección in-vitro de Inhibidores de la Acetilcolinesterasa Mediante el Método de Ellman en Extractos Crudos de Cuarenta Plantas de la Flora Colombiana. Dirigida por Oscar Marino Mosquera. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Hostettmann, K. 1999. Strategy for the biological and chemical evaluation of plant extracts. Pure and Applied Chemistry. 70: 11-20.

Hu, Y. Zhang, J. Chandrashankra, O. Ip, F. Ip, N. 2013. Design, synthesis and evaluation of novel heterodimers of donepezil and huperzine fragments as acetylcholinesterase inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21. 676–683.

Ingkaninan, K. Best, D. Heijden, V.D. Hofte, A.J.P. Karabatak, B. Irth, H., Tjaden, U.R. Greef, V.D. Verpoorte, R. 2000. High-performance liquid chromatography with on-line coupled UV, mass spectrometric and biochemical detection for identification of acetylcholinesterase inhibitors from natural products. J. Chromatogy A. 872: 61–73.

Jahn, S. Seiwert, B. Kretzing, S. Abraham, G. 2012. Metabolic studies of the Amaryllidaceous alkaloids galantamine and lycorine based on electrochemical simulation in addition to in vivo and in vitro models. Analytica Chimica Acta. 756: 60– 72.

Järvinen, P. Vuorela, P. Hatakka, A. Fallarero, A. 2011. Potency determinations of acetylcholinesterase inhibitors using Ellman’s reaction-based assay in screening: Effect of assay variants. Analytical Biochemistry. 408: 166–168.

Jaimes Galvis, Diana Carolina. 2010. Evaluación in vitro de compuestos presentes en Critoniella acuminata y Salvia rubescens frente a enzimas de desgranulación leucocitaria. Tesis de maestría. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias.

Jiang, H. Luo, X. Bai, D. 2003. Progress in Clinical, Pharmacological, Chemical and Structural Biological Studies of Huperzine A: A Drug of Traditional Chinese Medicine Origin for the Treatment of Alzheimers Disease. Current Medicinal Chemistry. 10: 2231-2252.

63

Joselin, J. Shynin, T. Rajam, A. Jeeva, S. 2012. Screening of select ornamental flowers of the family Apocynaceae for phytochemical constituents. Asian Pacific Journal of Tropical Disease.S260-S264.

V, M. Elhussei, S. Khan, M. Khan. N. 2012. Anti-acetylcholinesterase activity of Piper sarmentosum by a continuos immobilized-enzime assay. APCBEE Procedia. 2: 199-204.

Khoobi, M. Ghanoni, F. Nadri, H. Moradi, A. Hamedami, M. Moghadam, F. Emani, S. Vosooghi, M. Zadmard, R. Foroumadi, A. Shafiee, A. 2015. New tetracyclic tacrine analogs containing pyrano[2,3-c]pyrazole: Efficient synthesis, biological assessment and docking simulationstudy. European Journal of Medicinal Chemistry. 89: 296 – 303.

Khorana, N. Changwichit, K. Ingkaninan, K. Utsintong, M. 2012. Prospective acetylcholinesterase inhibitory activity of indole and its analogs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22: 2885–2888.

Konrath, E. Neves, B. Passos, C. Lunardi, P. Ortega, M. Cabrera, J. Gonçalves, C. Henriques, A. 2012. Huperzia quadrifariata and Huperzia reflexa alkaloids inhibit acetylcholinesterase activity in vivo in mice brain. Phytomedicine. 19: 1321-1324.

Kouakou, K. Schepetkin, I. Yapi, A. Kirpotina, L. Jutila, M. Quinn, M. 2013. Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Alchornea cordifolia. Journal ofEthnopharmacology. 146: 232–242.

Kvalheim, O. Chan, H. Benzie, I. Szeto, Y. Hing-chung, A. Kam-wah, D. Chau, F. 2011. Chromatographic profiling and multivariate analysis for screening and quantifying the contributions from individual components to the bioactive signature in natural products. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 107: 98–105.

Lagos Giraldo, Ana Marcela. 2009. Normalización de la dieta artificial y evaluación de actividad insecticida contra la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) de extractos vegetales de plantas recolectadas en la ecorregión cafetera. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Lakshmi, V. Santhosh, V. Boopathy, R. 2013. Identification of potential bivalent inhibitors from natural compounds for acetylcholinesterase through in silico screening using multiple pharmacophores. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 40: 72-79.

Lasisi, A. Olayiwola, M. Balogun, S. Akinyole, A. Ojo, D. 2012. Phytochemical composition, cytotoxicity and in vitro antiplasmodial activity of fractions from Alafia barteri olive (Hook F. Icon)-Apocynaceae. Journal of Saudi Chemical Society. http://dx.doi.org/10.1016/j.jscs.2012.05.003.

64

López, S. Aparecida, A. Batista, M. Flausino, O. Bolzano, S. Kato J. Furlan, M. 2010. Geranylation of benzoic acid derivates by enzimatic extracts from Piper crassinervium (Piperaceae). Bioresource Technology. 101: 4251 – 4260.

Li, Y. Peng, P. Tang, L. Hu, Y. Hu, Y. Sheng, R. 2014. Design, synthesis and evaluation of rivastigmine and curcumin hybrids as site-activated multitarget-directed ligands for Alzheimer’s disease therapy. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 22: 4117 – 4725.

Lilienfeld, S. 2002. Galantamine - A novel cholinergic drug with a unique dual mode of action for the treatment of patients with Alzheimer's disease. CNS Drug Reviews. 8: 159-176.

Mahadeva, B. Phillips, B. Juel, V. 2008. Autoimmune disorders of neuromuscular transmission. Semin. Neurol. 28: 212–227.

Mañas, A. Belmonte J. Roure J.1990. Estudio aeropolínico de Urticáceasen algunas localidades de la Península Ibérica y Baleares. 3. 323-328p.

Mandel, S. Amit, T. Bar-Am, O. Youdim, M. B. H. 2007. Iron dysregulation in Alzheimer’s disease: Multimodal brain permeable iron chelating drugs, possessing neuroprotective-neurorescue and amyloid precursor proteinprocessing regulatory activities as therapeutic agents. Progress in Neurobiology, 82: 348–360.

Marston, A. Kissling, J. Hostettmann, K. 2002. A rapid TLC bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochem. Anal. 13: 51–54.

Marston, A. 2011. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. Journal of Chromatography A. 1218: 2676–2683.

Mavar, H. Brkic, D. Marie, D. Quetin-Leclercq, J. 2004. In vivo anti-inflammatory activity of Alchornea cordifolia (Schumach. & Thonn.) Müll. Arg. (Euphorbiaceae). Journal of Ethnopharmacology. 92: 209–214.

McNulty, J. Nair, J. Singh, M. Crankshaw, D. Holloway, A. Bastida, J. 2009. Selective cytochrome P450 3A4 inhibitory activity of Amaryllidaceae alkaloids. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 19: 3233–3237.

McNulty, J. Nair, J. Little, J. Brennan, J. Bastida, J. 2010. Structure–activity studies on acetylcholinesterase inhibition in the lycorine series of Amaryllidaceae alkaloids. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20: 5290–5294.

Milkani, E. Lambert, C. McGimpsey, G. 2011. Direct detection of acetylcholinesterase inhibitor binding with an enzyme-based surface plasmon resonance sensor. Analytical Biochemistry. 408: 212–219.

65

Millard, C .Broomfield, C. 1995. Anticholinesterases: medical applications of neurochemical principles. J. Neurochem. 64: 1909–1918.

Morais, T. Romoff, P. Fávero, O. Reimão, J. Lourenço, W. Tempone, A. Hristov, A. Di Santi, S. Lago, J. Sartorelli, P. Ferreira, M. 2012. Anti-malarial, anti-trypanosomal, and anti-leishmanial activities of jacaranone isolated from Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. (Asteraceae). Parasitology Research. 110: 95-101.

Mosquera, O.M. Niño, J. Correa, Y. Hernández, J. 2004. Detección in-vitro de inhibidores de la acetilcolinesterasa en extractos de cuarenta plantas de la flora colombiana mediante el método cromatográfico de Ellman. Scientia Et Technica. 26: 155-160.

Mukherjee, P. Kumar, V. Mal, M. Houghton, P. 2007. Acetylcholinesterase inhibitors from plants. Phytomedicine. 14: 289–300.

Münzbergová, Z. Raabová, J. Castro, S. Pánková, H. 2011. Biological flora of Central Europe: Aster amellus L. (Asteraceae). Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics. 13: 151–162.

Nair, J. Aremu, A. van Staden, J. 2011. Isolation of narciprimine from Cyrtanthus contractus (Amaryllidaceae) and evaluation of its acetylcholinesterase inhibitory activity. Journal of Ethnopharmacology. 137:1102–1106.

Navarro, V. Gonzalez, A. Fuentes, M. Aviles, M. Rios, M. Zepeda, G. Rojas, M. 2003. Antifungal activities of nine traditional Mexican medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology. 87: 85–88.

Ndagijimana, A. Wang, X. Pan, G. Zhang, F. Feng, H. Olaleye, O. 2013. A review on indole alkaloids isolated from Uncaria rhynchophylla and their pharmacological studies. Fitoterapia. 86: 35–47.

Nie, K. Yu, J. Fu, Y. Cheng, H. Chen, F. Qu, Y. Han, J. 2009. Age-related decrease in constructive activation of Akt/PKB in SAMP10 hippocampus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378: 103–107.

Niño, J. Mosquera, O.M. Correa, Y. M. Victoria, P.A. Espinal, C.M. 2002. Evaluación preliminar de la actividad biológica y tamizados fitoquímicos de cincuenta plantas del Parque Regional Natural Ucumarí. Scientia et Technica. 19: 151-157.

Odonne, G. Bourdy, G. Castillo, D. Estevez, y. Lancha-Tangoa, A. Alban-Castillo, J. Deharo, E. Rojas, R. Stien, D. Sauvain, M. 2009. Ta’ta’, Huayani: Perception of leishmaniasis and evaluation of medicinal plants used by the Chayahuita in Peru. Part II. Journal of Ethnopharmacology. 126: 149–158.

66

Orhan, I. Aslan, M. 2009. Appraisal of scopolamine-induced antiamnesic effect in mice and in vitro antiacetylcholinesterase and antioxidant activities of some traditionally used Lamiaceae plants. Journal of Ethnopharmacology. 122: 327–332.

Orhan, I. Kartal, M. Naz, Q. Yilmaz, G. Kan, Y. Konuklugil, B. 2007. Antioxidant and anticholinesterase evaluation of selected Turkish Salvia species. Food Chemistry. 103: 1247–1254.

Pagliosa, L. Monteiro S. Silva, K. de Andrade, J. Dutilh, J. Bastida, J. Cammarota, M. Zuanazzi, J. 2010. Effect of isoquinoline alkaloids from two Hippeastrum species on in vitro acetylcholinesterase activity. Phytomedicine. 17: 698–701.

Pereira, D. Ferreres, F. Oliveira, J. Gaspar, L. Faria, J. Valentão, P. Sottomayor, M. Andrade, P. 2010. Pharmacological effects of Catharanthus roseus root alkaloids in acetylcholinesterase inhibition and cholinergic neurotransmission. Phytomedicine. 17: 646–652.

Pérez-Saad, H. Buznego, M. 2008. Behavioral and antiepileptic effects of acute administration of the extract of the plant Cestrum nocturnum Lin (lady of the night). Epilepsy & Behavior. 12. 366–372.

Pohanka, M. Hrabinova, M. Kuka, K. Simonato, J. 2011. Assessment of Acetylcholinesterase Activity Using Indoxylacetate and Comparison with the Standard Ellman’s Method. International Journal of Molecular Sciences. 12: 2631-2640.

Puiatti, M. Borioni, J. Vallejo, M. Cabrera, J. Agnese, A. Ortega, M. Pierini, A. 2013. Study of the interaction of Huperzia saururus Lycopodium alkaloids with the acetylcholinesterase enzyme.

Rangel, C. H. Garzón.1994 Aspectos de la estructura, de la diversidad y de la dinámica de la vegetación del Parque Regional Natural Ucumarí. p 85-108.

Rhee, I.k. Van Rijin, R. M. Verpoorte, R. 2003a. Qualitative determination of false–positive effects in the acetylcholinesterase assay using thin layer chromatography. Phytochemical Analisys. 14: 127-131.

Rhee, I.k. Appels, N. Luijendijk, Teus. Irth, H. Verpoorte, R. 2003b. Determining acetylcholinesterase inhibitory activity in plants extracts using a fluorometric flow assay. Phytochemical Analisys. 14: 145-149.

Rhee, I.k. Appels, N. Hofte, B. Karabatak, B. Erkelens, C. Stark, L. Flippin, L. Verpoorte, R. 2004. Isolation of the Acetylcholinesterase Inhibitor Ungeremine from Nerine bowdenii by Preparative HPLC Coupled On-Line to a Flow Assay System. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 27: 1804-1809.

67

Roersch, C. 2010. Piper umbellatum L.: A comparative cross-cultural analysis of its medicinal uses and an ethnopharmacological evaluation. Journal of Ethnopharmacology. 131: 522–537.

Rufatto, L. Gower, A. Schwambach, J. Moura, S. 2012. Genus Mikania: chemical composition and phytotherapeutical activity. Brazilian Journal of Pharmacognosy. 22(6): 1384-1403.

Salles, M.T., Viana, F.V., van de Meent, M., Rhee, I.K., Verpoorte, R. 2003. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from plants to treat Alzheimer disease. Quimica Nova. 26: 1-7.

Sandner, F. Dott, W. Hollender, J. Sensitive indoor air monitoring of formaldehyde and other carbonyl compounds using the 2, 4 - dinitrophenylhydrazine method. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 203: 275-279.

SatheeshKumar, N. Mukherjee, P. Saha, B. 2010. Acetylcholinesterase enzyme inhibitory potential of standardized extract of Trigonella foenum graecum L and its constituents. Phytomedicine. 17: 292–295.

Singh, M. Kaur, M. Kukreja, H. Chugh, R. Silakari, O. Singh, D. 2013. Acetylcholinesterase inhibitors as Alzheimer therapy: From nerve toxins to neuroprotection. European Journal of Medicinal Chemistry. 70: 165-188.

Stærk, D. Christensen, J. Lemmich, E. Duus, J. Olsen, C. Jaroszewski, J. 2000. Cytotoxic Activity of Some Phenanthroindolizidine N-Oxide Alkaloids from Cynanchum vincetoxicum. Journal of Natural Products. 63 (11): 1584–1586.

Seltzer, B. 2007. Donepezil: an update, Expert Opin. Pharmacother. 7: 1011–1023.

Sezer, F., Orhan, I., Celep, F., Kahraman, A., Yilmaz, G., Sener, B. 2010. Survey of 55 Turkish Salvia taxa for their acetylcholinesterase inhibitory and antioxidant activities. Food Chemistry. 120: 34–43.

Sotoing, G. Ngo, E. Talla, E. Dawe, A. Okomolo, F. Temkou, G. Sidiki, N. DAbole, B. Djomeni, P. Dimo, T. De Ward, M. 2012. Antipsychotic and sedative effects of the leaf extract of Crassocephalum bauchiense (Hutch.) Milne-Redh (Asteraceae) in rodents. Journal of Ethnopharmacology. 143: 213–220.

Stip, E. Sepehry, A. Chouinard, S. 2007. Add-on therapy with acetylcholinesterase Inhibitors for memory dysfunction in schizophrenia: a systematic quantitative review, part 2. Clin. Neuropharmacol. 30: 218–229.

Sussman, J. Harel, M. Frolow, F. Oefner, C.Goldman, A. Toker, L. Silman, I. 1991. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. Science 253: 872–879.

68

Thies, W. and Bleiler L. 2012 Alzheimer's disease facts and figures. 2012. Alzheimer’s & Dementia. 8: 131–168.

Thambiraj, J. Paulsamy, S. Sevukaperumal. R. 2012. Evaluation of in vitro antioxidant activity in the traditional medicinal shrub of western districts of Tamilnadu, India, Acalypha fruticosa Forssk. (Euphorbiaceae). Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. S127-S130.

Torras-Claveria, L. Berkov, S. Codina, C. Viladomat, F. Bastida, J. 2013. Daffodils as potential crops of galanthamine. Assessment of more than 100 ornamental varieties for their alkaloid content and acetylcholinesterase inhibitory activity. Industrial Crops and Products. 43: 237– 244.

Torras-Claveria, L. Berkov, S. Jáuregui, O. Caujapé, J. Viladomat, F. Codina, C. Bastida, J. 2009. Metabolic Profiling of Bioactive Pancratium canariense Extracts by GC-MS. Phytochem. Anal. 21: 80–88.

Toyang, N. Verpoorte, R. 2013. A review of the medicinal potentials of plants of the genus Vernonia (Asteraceae). Journal of Ethnopharmacology. 146: 681–723.

Trujillo Sánchez, Ana Fernanda. 2008. Determinación de la actividad alelopática de extractos vegetales sobre lactuca sativa. Dirigida por Oscar Marino Mosquera. Tesis de pregrado. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Tecnologías.

Uchiyama, S. Inaba, Y. Kunugita, N. 2011. Derivatization of carbonyl compounds with 2, 4-dinitrophenylhydrazine and their subsequent determination by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B. 879: 1282–1289.

Vanden Berghe, W. Sabbe, L. Kaileh. Haegeman, G. Heyninck, K. 2012. Molecular insight in the multifunctional activities of Withaferin A. Biochemical Pharmacology. 84. 1282–1291.

Vinutha, B. Prashanth a, D.K, Salma, S. Sreeja, L. Pratiti, D. Padmaja, R. Radhika, S. Amita, A. Venkateshwarlu, K. Deepak, M. 2007. Screening of selected Indian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity. Journal of Ethnopharmacology. 109: 359–363.

Vital, P. Rivera, W. 2011. Antimicrobial activity, cytotoxicity, and phytochemical screening of Voacanga globosa (Blanco) Merr. leaf extract (Apocynaceae). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine.824-828.

Weiner, M. Aisen, P. Jack, C. Jagust, W. Trojanowski, J. Shaw, L. Saykin, A. Morris, J. Cairns, N. Beckett, L. Toga, A. Green, R. Walter, S. Soares, H. Snyder, P. Siemers, E. Potter, W. Cole, P. Schmidt, M. 2010. The Alzheimer’s disease Neuroimaging Initiative: Progress report and future plans. Alzheimer’s & Dementia. 6: 202–211.

69

Xu, W. Tang, J. Ji, C. He, W. Tan, N. 2008. Application of a TLC chemical method to detection of cyclotides in plants. Chinese Science Bulletin. 53: 1671-1674.

Yang, Z. Duan, D. Xue, W. Yao, X. Li, S. 2012. Steroidal alkaloids from Holarrhena antidysenterica as acetylcholinesterase inhibitors and the investigation for structure–activity relationships. Life Sciences. 90: 929–933.

Yamaguchi, L. Lago, J. Tanizaki, T. Di Mascio, P. Kato, M. 2006. Antioxidant activity of prenylated hydroquinone and benzoic acid derivatives from Piper crassinervium Kunth. Phytochemistry. 67: 1838–1843.

Yin, H. Sun, Y. 2011. Vincamine-producing endophytic fungus isolated from Vinca minor. Phytomedicine. 18: 802–805.

Zhan, Z. Bian, H. Wang, J. Shan, W. 2010. Synthesis of physostigmine analogues and evaluation of their anticholinesterase activities. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20: 1532-1534.

Zhang, B. Teng, X. Bao, M. Zhong, X. Ni, L. Cai, X. 2015. Cytotoxic indole alkaloids from Tabernaemontana officinalis. Phytochemistry. Article in press.

Zhang, H. Liang, H. Kuang, P. Yuan, Q. Wang, Y. 2012. Simultaneously preparative purification of Huperzine A and Huperzine B from Huperzia serrata by macroporous resin and preparative high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B. 904: 65– 72.

Ziemianin, A. Ronco, C. Dolé, R. Jean, L. Renard, P. Lange, C. 2012. Screening of new huprines—Inhibitors of acetylcholinesterases by electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 70: 1 - 5.

70

ANEXOS

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Anexo 1. Cálculos de porcentaje de actividad inhibitoria sobre la enzima acetilcolinesterasa.

Para calcular el porcentaje de actividad inhibitoria (% A.I.) de la AChE de los extractos a cada concentración se procedió de la siguiente manera:

El dato de cinética control negativo, el cual se usó como control, se leyó con todos los reactivos a excepción del extracto a evaluar.

Los datos de actividad inicial (Acti) se leyeron con todos los reactivos a excepción de la enzima para corregir errores por hidrólisis espontánea. Los datos de actividad final (Actf) se leyeron cuando se adicionó el ioduro de acetiltiocolina.

Planta Concentración

del extracto metanólico

Control negativo

(Actn)

Actividad inicial (Acti)

Actividad final (Actf)

% Actividad Inhibitoria

Solanum cf umbellatum

(137)

100 ppm 0,224

0,484 0,687

8,65 0,485 0,688 0,483 0,689

promedio promedio 0,484 0,688

El porcentaje de A.I. de la AChE se calculó como se describe a continuación:

%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 − �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑓𝑓𝐴𝐴𝑓𝑓𝐴𝐴𝑓𝑓 �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓�−𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴𝑓𝑓𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑓𝑓 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑖𝑖)�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴𝑐𝑐𝑓𝑓𝐴𝐴𝑐𝑐𝑐𝑐𝑓𝑓 𝑓𝑓𝑛𝑛𝑛𝑛𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑐𝑐 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝑛𝑛)

� 𝑥𝑥 100 Donde:

Acti = actividad inicial de la enzima

Actf = actividad final de la enzima

Actn = actividad del control negativo

%𝑨𝑨𝑨𝑨 = �1 −(0,741 − 0,537)

0,224� 𝑥𝑥 100 = 8,65%

72

Anexo 2. Pruebas fitoquímicas por CCD.

Para el análisis fitoquímico por CCD se desarrollará el cromatograma de los extractos a estudiar y este se revelará con los reveladores particulares para cada núcleo que se describen a continuación: Anexo 3. Prueba de Dragendorff para alcaloides.

Positivo: Mancha de color naranja.

Preparación del revelador Dragendorff:

Solución A: 2,125 g de subnitrato de bismuto (Nitrato básico de Bismuto) + 25 g de ácido tartárico + 80 mL de agua

Solución B: 20 g de KI + 50 mL de agua.

La mezcla de la solución A y B origina la solución patrón.

Revelador: 50 mL de la solución patrón + 500 mL de agua + 100 g de ácido Tartárico. El revelador puede durar varias semanas, antes de que se descomponga. Rociar o fumigar la placa con revelador Dragendorff, apropiado para detectar alcaloides; los cuales se visualizan como manchas de color zapote.

Control positivo: Fisostigmina o galantamina.

Anexo 4. Prueba de ninhidrina para aminas.

Positivo: Mancha de color púrpura.

Preparación del revelador Ninhidrina:

Se disolverán 200 mg de ninhidrina en 95 mL de butanol y 5 mL de etanol al 10 %

Las placas se deben rociar con el revelador y se calentar hasta 105 ºC de 5 a 10 minutos se deberá observar el color producido (Púrpura).

Control positivo: Dietilamina

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Anexo 5. Prueba de 2,4 - dinitrofenilhidracina para aldehídos.

Positivo: Mancha de color naranjado.

Preparación del revelador (2,4 DNFH):

Disolver 0,4 g de (2,4 DNFH) en 100 mL de ácido clorhídrico 2 M.

Control positivo: Acetofenona, benzaldehído.

No se debe calentar la cromatoplaca.

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