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Detección depatógenos en alimentos

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A diario consumimos diferentes ali-mentos que son la principal fuentede energía para realizar las activida-des de nuestra vida, pero estos ali-mentos pueden causar enfermedadessi no han sido elaborados bajo nor-mas de higiene adecuadas. Este tipode enfermedades se conocen con elnombre ETAs –Enfermedades Trans-mitidas por Alimentos–. A nivel mun-dial las ETAs son una de las causasmás preocupantes en salud pública yaque ocurren de 24 a 81 millones decasos y más de diez mil muertes porconsumo de alimentos contaminados.

Los alimentos y el agua pueden serla vía de transmisión de bacterias, pa-rásitos, virus, priones –causantes delmal de las vacas locas–, toxinas debacterias y hongos. En Colombia seha reportado que los alimentos po-tencialmente dañinos son aquelloscon alto contenido proteico, baja aci-dez y alta humedad tales como la car-ne, mariscos, lácteos, huevos, arrozy pastas. Entre los factores de riesgoasociados con la presentación de es-tas enfermedades tenemos deficienteshábitos higiénicos, el manejo inapro-piado de temperaturas –enfriamiento,calentamiento, descongelamiento– yalmacenamiento inadecuado.

Figura 1.Casos de ETAs en Colombia de 1998 a 2001. Datos tomados de SIVIGILA,

consultados en http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8de noviembre de 2004

Los grupos de mayor riesgo son losniños, ancianos, mujeres embaraza-das y pacientes inmunosuprimidos,aunque se presenten casos en pobla-ción sana entre quince y cuarenta ycuatro años. Según reportes de la Se-cretaria Distrital de Salud de Bogotá,los lugares en los cuales se ha pre-sentado la mayoría de casos son encasas, colegios, escuelas, hogares in-fantiles, restaurantes escolares y si-tios turísticos.

Los síntomas típicos de la gastroen-teritis causada por estos microor-ganismos son dolor de cabeza,náuseas, diarrea, vómito, dolor ab-dominal y, en algunos casos, escalo-frío o fiebre. El período de incubación

depende del agente etiológico implicado y puede ser muy corto, o hasta desetenta y dos horas después de ingerido el alimento contaminado. Las ETAs,además de causar la gastroenteritis, ameritan especial atención porque pue-den generar complicaciones y secuelas como meningitis, artritis, desórde-nes auto inmunes, enfermedades cardiovasculares, neoplasias, y abortos.Por otra parte los gastos económicos causados por incapacidades laboralesy por pérdidas industriales debido al rechazo de productos contaminadoscon estos patógenos son bastante altos. Por estas razones, es necesario que

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Figura 3.Placa de electroforesis de productos de 235 pares de

bases que identifican a las cepas de Listeriamonocytogenes. Los números de las columnas

corresponden a: 0 y 13-escala DNA Ladder; 1-L.monocytogenes ATCC 7644. 2-10 Cepas de Listeria sp.,

–las columnas 6 y 7 no fueron identificadas como L.monocytogenes–; 11-Control Negativo: S .aureus ATCC

25923. 12. En blanco

Figura 2.Placa de electroforesis de productos de amplificacióndel gen para la identificación de cepas de Salmonellaspp. Los números de las columnas corresponden a:

0 y 11-escala DNA Ladder; 1- Salmonella typhi ATCC6539. 2-9. Cepas de Salmonella sp. aisladas de

alimentos. 10. Control

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

se preste la atención adecuada a esta problemática y seoptimicen los métodos de detección de estos microor-ganismos en los laboratorios de microbiología.

En Colombia, como en otros países del mundo, han au-mentado las ETAs bacterianas debido a que no se ha lo-grado controlar efectivamente la contaminación de losalimentos (figura 1). Estos reportes no muestran la di-mensión real del problema, las estadísticas pueden sermayores debido a que falta mejorar el registro de la in-formación ante las entidades pertinentes, ya que el con-sumidor se automedica y desconoce la magnitud de laenfermedad. Además, los médicos no siempre ordenanlos exámenes adecuados para determinar el agente cau-sante de la sintomatología. Por lo tanto, es necesariodesarrollar la investigación en esta área e implementarmétodos de microbiología más sensibles y específicospara detectar los patógenos en los alimentos.

Detección de los microorganismosPara aislar e identificar bacterias de alimentos en el la-boratorio se han utilizado, tradicionalmente, métodos demicrobiología clásica en los cuales los protocolos tar-dan mucho tiempo en generar resultados y son poco sen-sibles, permitiendo el crecimiento de otras bacterias, loque dificulta la detección del patógeno. Por esta razón yteniendo en cuenta la necesidad de detectar con rapidezlos microorganismos en los alimentos, para evitar queestos salgan a la venta contaminados, se está implemen-tando el uso de la reacción en cadena de la polimerasa,PCR, que permite identificar de manera más rápida y es-pecífica los microorganismos productores de ETAs enalimentos destinados al consumo humano.

Esta técnica permite multiplicar el fragmento de un genespecífico de la bacteria patógena, para que se evidenciesu presencia al observarlo por el método de electrofore-sis. Este método permite identificar el gen al compararlocon un patrón de escala (DNA-Ladder) que indica el nú-mero de pares de bases del gen1. (Figuras 1 y 2).

1 Para una explicación de las técnicas de PCR y de electroforesis, serecomienda el artículo “Detectives del Mal de Chagas” en Hipótesis No. 1

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Figura 4.Curvas generadas por la PCR en tiempo real de la detección de Salmonella enteritidis

El Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos,LEMA, de la Universidad de los Andes, ha realizado estu-dios para identificar dos de las bacterias más importan-tes dentro del grupo de productoras de ETAs: Salmonellaspp., causante de gastroenteritis y fiebre tifoidea y Listeriamonocytogenes causante de abortos y meningitis.

Para Salmonella se estandarizó la técnica de PCR me-diante identificación de un fragmento del gen invA, quepermite la invasividad de la bacteria en las células epite-liales del intestino. Mediante esta técnica se han confir-mado cincuenta cepas de Salmonella spp. aisladas de

diferentes tipos de alimentos como pollo, tocineta y ja-món de cerdo, entre otros. (Figura 2).

Para Listeria monocytogenes se amplificó el gen quecodifica para la Listeriolisina O, que es el factor de viru-lencia que inicia la infección. Se trabajaron sesenta ce-pas de L. monocytogenes, provenientes de derivadoslácteos, las cuales fueron identificadas por la banda deamplificación de 235 pares de bases (figura 3). Los ali-mentos estaban disponibles para su venta en plazas demercado de Bogotá.

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> Referencias

[1] D. De Medici, L. Croci, E. Delibato, D. Pasquale, E.Filetici & L. Toti. Evaluation of DNA extractionmethods for use in combination with SYBR GreenI real-time PCT to detect Salmonella entericaserotype Enteritidis in poultry. AppliedEnvironmental Microbiology 69(6), 3456–3461(2003).

[2] C. Jaramillo, A. Diaz. Detectives del mal deChagas. Revista Hipótesis No. 1, 42–49 (2003).

[3] A. D. Sails, A. J. Fox, D. R. Wareing & D.L.Greenway. A real-time PCR assay for the detectionof Campylobacter jejuni in foods after enrichmentculture. Applied Environmental Microbiology69(3): 1383–1390 (2003).

[4] J. S. Way, K. L. Josephson, S. D. Pillai, M.Abbaszadegan, C. P. Gerba & L. I. Pepper. SpecificDetection of Salmonella spp. by multiplexpolymerase chain reaction. Applied EnvironmentalMicrobiology 59(5), 1473–1479 (1993).

[5] Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública.Enfermedades transmitidas por alimentos enSanta Marta durante la temporada de vacaciones.Boletín epidemiológico Semanal. SemanaEpidemiológica No. 6. febrero 03 a 09 de 2002.Consultado en http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembrede 2004.

> Reseña de los autoresMaría Consuelo Vanegas López.mvanegas@uniandes.edu.co

Profesora asistente, Microbiología. Directora delLaboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos,LEMA, Universidad de los Andes.

Johanna Rojas. Microbióloga.in-rojas@uniandes.edu.co

Asistente graduada, Laboratorio de EcologíaMicrobiana y de Alimentos, LEMA. Estudiante deMaestría en Ciencias Biológicas con énfasis enMicrobiología de Alimentos en la Universidad de losAndes.

> AgradecimientosA la Facultad de Ciencias y aRoche-Diagnóstica por el apoyo financiero prestadopara la realización de estas investigaciones.

A pesar de que la PCR es una técnica rá-pida, se ha desarrollado una modificacióna ésta, en la cual no se realiza electrofo-resis, de tal forma que los resultados seobtienen simultáneamente con la ampli-ficación del gen. Esta técnica se conocecon el nombre de “PCR en tiempo real” yse realiza utilizando un marcador, comoSYBR GREEN-I, que produce fluorescen-cia al unirse al ADN de cadena doble, conun equipo que la detecta y genera una cur-va de la intensidad de fluorescencia con-tra temperatura. El pico de la curva indicala temperatura de fusión –melting peak–,en la cual el 50 por ciento del ADN se en-cuentra en doble cadena. De esta mane-ra, cada cepa bacteriana genera unatemperatura de fusión específica que in-dica su presencia.

En la figura 4 se observan los picos de am-plificación obtenidos para la detección deSalmonella enteritidis. Esta bacteria gene-ra una temperatura de fusión de 86.47°Cmientras las otras cepas evaluadas, utili-zadas como controles negativos (véase latabla de la figura 4), expresan temperatu-ras de fusión diferentes, indicando que noson Salmonella enteritidis. Esto demues-tra la alta especificidad de la prueba.

En el Laboratorio de Ecología Microbiana yde Alimentos, LEMA, de la Universidad delos Andes, se está utilizando la técnica dePCR en tiempo real para la detección deSalmonella enteritidis en muestras de polloa la venta en supermercados de Bogotá,Listeria monocytogenes en leches crudasdistribuidas en Boyacá, y Campylobacter,utilizando menudencias de pollo distribui-das en Bogotá.

El uso de estos métodos permite obtenerresultados más rápidos y seguros, por locual deberían utilizarse en la industria paratener un control de calidad más estricto yreducir el riesgo de distribución y ventade alimentos contaminados. De esta for-ma se podría disminuir la circulación debacterias patógenas en los alimentos yreducir la generación de infecciones e in-toxicaciones.