Embed Size (px)
Citation preview
Alimentární onemocnění
• Celosvětově trvalý zdravotnický problém
• Nárůst případů ve vyspělých zemích
• Příčiny společensko-ekonomické, lidský faktor, vlastnosti mikrobů
• Riziko závažných stavů včetně úmrtí pro nejmladší a nejstarší věkové skupiny v důsledku dehydratace
Alimentární onemocnění
• onemocnění z potravin
• Podle charakteru mikroorganismu vyvolávajícího onemocnění a podle mechanismu jeho účinku rozdělujeme onemocnění z potravin na:
• alimentární infekce – S. Typhi, L. monocytogenes
• otravy z potravin
• alimentární toxoinfekce – vyvolaná uvolněnými endotoxiny z baktérií, jedná se převážně o zoonotická agens vyvolávající průjmová onemocnění, např. kampylobakteriózy
• alimentární intoxikace – S. aureus (enterotoxiny), Bacillus cereus (emetický toxin), Clostridium botulinum (botulotoxin)
Alimentární onemocnění v EU v roce 2014
Kampylobakteriózy
• termotolerantní kampylobaktery z čeledi Campylobacteriaceae
• C. jejuni (drůbež, ptáci)
• C. coli (prasata)
• C. upsaliensis (psi, kočky)
• C. lari (racci)
• malá odolnost k podmínkám vnějšího prostředí, nepřežívají v suchém prostředí a v přítomnosti kyslíku
• možnosti kontaminace potravin• fekální cestou - výskyt ve střevním traktu teplokrevných zvířat • křížová kontaminace při manipulaci se syrovými potravinami a potravinami k přímé spotřebě• vzácně primární kontaminace mléka v důsledku mastitid, nebo fekální kontaminace při dojení
• nejčastější zdroj onemocnění• konzumace nedostatečně tepelně opracované drůbeže
• ID: 102 – 103
• Příznaky: horečka, bolesti břicha, průjem, někdy hemoragický
hlavní etiologické agens
Salmonelózy
• bakterie rodu Salmonella
• S. enterica - dělí se do 6 poddruhů: • S. enterica subsp. enterica (více než 95 % izolovaných kmenů)
• S. enterica subsp. salamae
• S. enterica subsp. arizonae
• S. enterica subsp. diarizonae
• S. enterica subsp. houtenae
• S. enterica subsp. indica
• S. bongori (dříve S. enterica subsp. bongori)• více než 2600 serovarů (prevalence může v čase měnit, některé jsou druhově specifické, např. S. Dublin –
skot, S. Pullorum - drůběž)
• nejčastější sérovary vyvolávající onemocnění u lidí v EU
• S. Enteritidis (kontaminované vejce a drůbeží maso)
• S. Typhimurium (kontaminované vepřové, hovězí a drůbeží maso)
Bakterie rodu Salmonella
• odolné vůči podmínkám vnějšího prostředí, vyschnutí, nedostatku kyslíku, v potravinách se za vhodných podmínek dobře pomnožují
• primárně se vyskytují ve střevním traktu zvířat a lidí
• významným rezervoárem je drůbež
• na šíření onemocnění se mohou podílet rovněž hlodavci, volně žijící ptáci a hmyz
• přenos• zejména konzumace syrového nebo nedostatečně tepelně upraveného masa (drůbežího,
vepřového), vajec a mléka
• ID: 102 -105 baktérii
• Příznaky: nevolnost, bolesti břicha, teplota kolem 39 °C, průjmy
Listeriózy
Listeria monocytogenes
• fakultativně intracelulární baktérie
• ubikvitární výskyt (půda, vegetace, voda, rostliny, faeces zvířat i lidí, potraviny)
• schopnost růstu při chladírenských teplotách
• vyskytuje se zejména u rizikových skupin populace
• vysoká mortalita: 20 – 30 %
• z pohledu potenciální kontaminace potravin je významná schopnost LM perzistovat v prostředí zpracování potravin
• zdroj onemocnění: zejména potraviny k přímé spotřebě
• ID: u zdravých jedinců 108 – 109, u rizikových skupin 103
• klinický obraz: sepse, meningitidy, meningoencefalitdy, u těhotných žen – potrat, narození mrtvého dítěte, onemocnění ohrožující život novorozence
Stafylokokové enterotoxikózy
• kmeny S. aureus produkující termostabilní toxiny
• hojně rozšířen v prostředí
• běžný komenzál kůže a sliznic lidí i zvířat
• v současnosti popsáno 21 enterotoxinů
• alimentární intoxikaci obvykle vyvolávají toxiny A,B,C,D (vzácněji E a H)
• hlavní zdroj kontaminace• suroviny živočišného původu (nejčastější původce mastitid)• potravináři s hnisavým onemocněním kůže na rukou a nosiči enterotoxinogenních kmenů• prostředí potravinářských provozoven
• toxická dávka: 0,1 – 1,0 µg toxinu/kg tělesné hmotnosti • (>105-106 S. aureus)
• příznaky: velmi rychlý nástup (příznaky se objeví 1-6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny), zvracení, bolesti hlavy, vzácně průjmy
Alimentární onemocnění v ČR v letech 2005-2015
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
salmonelóza kampylobakterióza
Listeriózy v ČR v letech 2005-2015
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Vehikula epidemií v EU v roce 2014
Místa vzniku epidemií v EU v roce 2014
Šetření epidemií
Členské země EU jsou povinny dle rozhodnutí 2119/98/EC vykazovat a hlásit zoonózy:
- ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control)
- sběr, předávání dat v rámci provozování nového informačního systému ECDC (TESSy – The European Surveillance System)
- EFSA (výroční zpráva EFSA)
Směrnice 2003/99/EC stanovuje požadavky na epidemiologické šetření ohnisek choroby, šetření zahrnuje přiměřené epidemiologické a mikrobiologické studie.
Šetření epidemií
• Nařízení rozlišuje hlášení potvrzených a pravděpodobných
epidemií – v závislosti na (ne)potvrzení vehikula nákazy
• Nutná spolupráce epidemiologů, hygieny výživy, mikrobiologů a
veterinárních lékařů
Manuál pro hlášení epidemií – potvrzená epidemie definice
Za potvrzenou epidemii je možné považovat
pouze takovou, u které je laboratorně
potvrzeno i vehikulum nákazy.
Metody typizace
IDENTIFIKACE - zařazení neznámých izolátů (rod, druh, poddruh)
TYPIZACE - metoda bližší identifikace baktérií – zařazení kmenů pod úroveň druhu (poddruhu)
- sérotypizace
FINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho druhu poddruhu nebo variety
- metody na bázi PCR- makrorestrikční analýza bakteriálního genomu
Požadované vlastnosti pro typizační metody
• vhodnost použití pro široký okruh izolátů
• dobrá rozlišovací účinnost
• dobrá reprodukovatelnost
• stabilita
• rychlost
• jednoduchost provedení
• možnost PC analýzy
Terminologie
Izolát – populace buněk odvozená z jedné kolonie na Petriho misce
Kmen – izolát nebo skupina izolátů s vlastnostmi odlišnými od jiných
izolátů téhož druhu
Klon – populace buněk vzniklých asexuální reprodukcí ze společného
předka
Fenotypové typizační metody
BIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základě biochemických vlastností (API, Enterotest, Stafytest atd.)
SÉROTYPIZACE - nejstarší typizační technika, sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H
REZISTENCE k AML - zkoumání citlivosti kultur k antimikrobiálním látkám (disková difuzní, metoda MIC)
FÁGOVÁ TYPIZACE
Serotypizace
Serotypizace Listeria monocytogenes
Metoda sklíčkové aglutinace
Serotyp O-antigen H-antigen
1/2a I, II, (III) AB
1/2b I, II, (III) ABC
1/2c I, II, (III) BD
3a II, (III), IV AB
3b II, (III), IV, (XII), (XIII) ABC
3c II, (III), IV, (XII), (XIII) BD
4a (III), (V), VII, IX ABC
4ab (III), V, VI, VII, IX, X ABC
4b (III), V, VI ABC
4c (III), V, VII ABC
4d (III), (V), VI, VIII ABC
4e (III), V, VI, (VIII), (IX) ABC
7 (III), XII, XIII ABC
- více než 2600 serovarů (prevalence může v čase měnit, některé jsou druhově specifické, např. S. Dublin – skot, S. Pullorum - drůběž)
Distribuce 10 nejběžnějších serovarů salmonel u lidí v EU v roce 2012
Serotypizace salmonel
– až 250 různých sérotypů
• klasická aglutinační reakce -založena na detekci somatických O-antigenů (174 typů), bičíkových H-antigenů (53 typů) a kapsulárních K-antigenů (80 typů)
Význam séroskupin
• „top five“ O157, O26, O103, O111, O145
• O104 - (významná ve spojitosti s epidemií v roce 2011 v Německu)
• O45 a O121 - (epidemie v USA vázané zejména na konzumaci hovězího masa)
• O55, O91, O113, O128 a O146 - (séroskupiny nejčastěji hlášené z humánních případů v Evropě)
Serotypizace Escherichia coli
Rezistence k antimikrobiálním látkám
Fágová typizace
Jimmy Dunbar – v roce 1947 vyvinul metodu fágové typizace pro baktérie Salmonella Typhi.
Fágová typizace
Pracovní postup:
• pomnožení testované bakteriální kultury v živném médiu 37 °C 1-2
hodiny
• přelití pomnožené mladé kultury na povrch předsušených
agarových ploten
• po odsátí přebytečné suspenze a vsáknutí kultury do média se
aplikují specifické fágy
• inkubace přes noc při 37 °C
• odečtení lytických reakcí a jejich vyhodnocení pomocí příslušného
schématu.
Fágová typizace
Fágová typizace
• analýza• plazmidové DNA• chromozomální DNA
• bez amplifikace cílové sekvence• vyžadují velké množství cílových NK
• hybridizace - metoda specifické komplementace mezi hledaným jednovláknovým úsekem DNA a sondou značenou např. chemiluminiscenční značkou
• amplifikační• vysoká senzitivita a specifita
• metody na bázi PCR(např. RAPD, REP PCR)• qRT (real time)-PCR - využívá fluorescenčně značené sondy umožňující sledovat průběh reakce v každém
kroku, kvalitativní i kvantitativní metoda
• restrikční analýza
– využití restrikčních endonukleáz• ribotypizace• RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů)• PFGE (pulzní gelová elektroforéza) – tzv. zlatý standard typizačních metod
• DNA sekvenování
Genotypové typizační metody
Plazmidy a jejich analýza
Bakteriální plazmidy jsou extrachromozomální kovalentní vazbou uzavřené
cirkulární molekuly DNA schopné samostatné replikace.
Mohou obsahovat geny, charakterizující fenotypový projev (rezistenci k
antibiotikům, virulenci, metabolickou aktivitu).
Některé plazmidy (konjugativní) mají schopnost přenášet své vlastní kopie
na další druhy baktérií.
Analýza plazmidové DNA
• izolace plazmidové DNA (alkalická lýza, kolonky)
• rozdělení DNA v elektrickém poli
• vizualizace a určení velikosti a počtu plazmidů
• porovnání shodnosti plazmidů (o stejné velikosti)po restrikčním štěpení
Metody na principu PCR
Druhová identifikace kampylobakterů
Sledování faktorů virulence Escherichia coli
- detekce stx1a, stx2a, stx2c, stx2d - detekce genů eae, aaiC, aggR, popř. dalších
Metody na principu PCR
ISO TS 13136 (2012) Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing E. coli (STEC) and determination of O157, O111, O26, O103 a O145 serogroups
- kombinace RT-PCR a klasické kultivace- cílené vyhledávání kmenů nesoucích geny stx1,2
1. část screening faktorů virulence
testovaný vzorek v g nebo ml 9 x ml mTSB + N/A nebo BPW
pomnožení 18 – 24 h 37 °C
izolace DNA z 1 ml pomnoženého vzorku
detekce genů stx a eae, popř. sérospecifických genů RT-PCR
detekce genů stx
kultivace
negativní výsledek
do 24 h
+
2. část – kultivace vzorků pozitivních na přítomnost genů stx
pomnožený vzorek
vyočkování na TBX a další půdy dle výběru
výběr 50 typických kolonií – detekce genů stx (48h)
průkaz genů stx u
izolátu (72 h)negativní výsledek
konfirmace a typizace izolátu
(4. den)
Serotypizace L. monocytogenes
Metoda multiplex PCR (Doumith et al., 2004)
970 bp
155 bp1/2a, 3a
1/2b, 3b, 7 1/2c, 3c 4b, 4d, 4e
Serotyp
Amplifikace fragmentů
lmo1118(906 bp)
lmo0737(691 bp)
ORF2110 (597 bp)
ORF2819 (471 bp)
prs
(370 bp)
1/2a, 3a - + - - +
1/2b, 3b, 7 - - - + +
1/2c, 3c + + - - +
4b, 4d, 4e - - + + +
4a, 4c - - - - +
Metody na principu PCR
Sledování virulence L. monocytogenes
Gen Protein Funkce
prfA pozitivně regulační faktor A (PrfA) regulace transkripce
hlyA listeriolysin O (LLO) porušení membrány fagosomů
plcA fosfatidylinositol fofolipáza C (PI-PLC) porušení membrány fagosomů
plcB fosfatidylcholin fosfolipáza C (PC-PLC) porušení membrány fagosomů
mpl zinek dependentní metaloproteáza (MPL) štěpení proenzymu PC-PLC
actA aktin polymerizující protein (ActA) intracelulární motilita
LIPI-1 (Listeria pathogenicity island 1)
Internaliny A (inlA) a B (inlB) zajišťují penetraci do hostitelských buněkrůzná buněčná specifita
PCR-RFLP genu inlA (Rousseaux et al., 2004)- detekce potenciálně invazivních kmenů L. monocytogenes
• RFLP profil 2, 3, 5 – potenciálně invazivní kmeny
• RFLP profil 1, 4 – potenciálně neinvazivní kmeny
Metody na principu PCR
Detekce stafylokokových enterotoxinů
-nepřímá
PCR, RT-PCR
• citlivá, rychlá, ale poskytuje pouze informace o přítomnosti genů u izolátů S. aureus
• zatím jediná možnost jak stanovit nové toxiny
Metody na principu PCR
Detekce genů virulence u S.aureus
- např. gen pvl, tsst1,..
Detekce genů kódujících rezistenci k AML
- např. detekce MRSA, ESBL
DNA sekvenování
Multilocus sequence typing (MLST)
• metoda využívající sekvenčních polymorfismů několika lokusů,
• vychází z produktu získaného pomocí PCR,
• je založena na sekvenování úseků několika vybraných klíčových
(housekeeping) genů (6-7), konzervativní sekvence
• výsledkem sekvenace je alelický profil, který slouží jako nástroj
pro porovnávání izolátů mezi sebou
Multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA)
• Analýza přirozeně se vyskytujících rozdílů v počtech vybraných tandemových repetic
• Základem je PCR sledovaných úseků a následná sekvenace
• Rychlé změny v počtech repetic – porovnávání kmenů v rámci suspektní epidemie
spa typizace• typizace S. aureus
• jedná se o analýzu krátkých repetitivních sekvencí (21 až 27 bp) v polymorfní oblasti X genu pro stafylokokový protein A (spa)
WGS – whole genome sequencing
Kompletní informace o kmeni: geny rezistence, virulence, změny v genomu.
Velké množství údajů k porovnání
Odpadá nutnost vyhledávání vhodného cíle analýzy
Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)
Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu,technika určená pro separaci molekul DNA o velikostiaž 12 Mb.
Zapínání a vypínání protilehlých hexagonálně rozmístěných elektrod umožňuje pohyb a dobré rozdělení velkých částí DNA v gelu. Molekuly DNA putují pohybem cik-cak v závislosti na pulzním čase a napětí.
PFGE
endonukleázy vzácně štěpící
– rozpoznávají a štěpí sekvence, které se v genomové DNA vyskytují zřídka a vytváří dlouhé restrikční fragmenty (XbaI, SpeI, SmaI, NotI)
Počet fragmentů 15-30
o velikosti 10-1000 kb
Pulzní gelová elektroforéza
Pulsenet International
• The International Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance
• http://www.pulsenetinternational.org• umožňuje mezilaboratorní i mezinárodní srovnání
• PFGE protokoly pro vybrané původce alimentárních onemocnění:
• Campylobacter jejuni• Clostridium botulinum• Escherichia coli (O157:H7 and non O157), Salmonella, Shigella
sonnei and Shigella flexneri• Listeria monocytogenes• Vibrio cholerae and Vibrio parahemolyticus• Yersinia pestis
• MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem repeat Analysis) protokoly
• E. coli O157 (STEC),• S. Typhimurium • S. Enteritidis
• Informace k práci s databází BioNumerics
Vyhodnocení PFGE
Vizuální analýza dat
Numerická analýza profilů
• Výpočet podobnosti
• Shluková analýza
Archivace dat (elektronická)
Porovnávání profilů mezilaboratorně (mezinárodně)
Využití typizačních metod
A. Epidemiologické účely - sledování zdrojů a cest šíření agens v humánní populaci.
B. Epizootologické účely - sledování zdrojů a cest šíření agens v animální populaci.
C. Environmentální účely
• Potravinářské výrobny - sledování šíření agens v potravinářském průmyslu.
• Prodej potravin – sledování a hodnocení hygieny prodeje nebalených výrobků.
Epidemiologické případy listerióz v ČR
Epidemie I
Období: květen 2006 – březen 2007
Lokalita:Čechy i Morava
Počet potvrzených případů: 85
Počet úmrtí: 15
Zdroj: zrající sýr
Sérotyp/pulzotyp: 1/2a/700
Epidemie II
Období: červenec 2008 – únor 2009
Lokalita: 2 oblasti (Jihočeský kraj)
Počet potvrzených případů: 9
Počet úmrtí: 4
Zdroj: vakuově balená dušená šunka
Sérotyp/pulzotyp: 1/2a/733 a 735
Epidemiologické případy listerióz v ČR
Analýza zdrojů a cest šíření L. monocytogenes v prostředí mlékárenského podniku vyrábějícího zrající sýry
LM serotyp 1/2a; pulzotyp 713
Výsledky typizace S.aureus izolovaných z masných výrobků zakoupených v jednom supermarketu
Místo Potravina Výrobce Prodejna Genotyp
Žďár nad Sázavou
salám šunkový A I A, I, G
salám gothajský B I A, I, G
párky B I A, I, G
klobásy B I A, I, G
šunka vepřová C I A, I, G
tlačenka vepřová D I A, I, G
Ústí nad Labem
salám vysočina E II C
salám turistický E II C
salám šunkový F II C
salám gothajský F II C
šunka vepřová F II C
jelita F II C
Výsledky typizace L. monocytogenes izolovaných z masných výrobků zakoupených v jednom supermarketu
Místo Potravina Výrobce Prodejna Sérotyp Pulzotyp
Jablonec nad Nisou
salám vysočina A I 1/2a 713
salám herkules A I 1/2a 713
salám turistický B I 1/2a 713
salám gothajský C I 1/2b 505
šunka vepřová D I 1/2b 505
Děkuji za pozornost
