Deteksi DNA Seara Visual Dengan Teknik Elektroforesis

Laurencius Sihotang

I. Tujuan

1. Mempelajari

2. Mendeteksi DNA yang telah di isolasi dengan teknik spektrofotometrik

2. mengetahui konsentrasi dan jumlah DNA

II. Kajian Pustaka

Teknik Elektroforesis

Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan

dibawah pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA

memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik

molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa

dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus

hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat

diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-

fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.

Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah

terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara

lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium

bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (media UV-transilluminator).

III. Alat dan Bahan

Alat 1. Elektroforesis 2. Sisir pembentuk sumur pada gel 3. Pemasok daya 4. Transimuloator dan sinar ultraviolet

Bahan

1. Bubuk gel agarose 2. Larutan etidium bromide 10 mg/mL 3. Larutan elektroforesis TAE 4. Larutan zat pewarna/loading buffer

IV. Cara Kerja

Pembuatan Gel Agarose 1% Pengenceran larutan TAE dari 10% menjadi 1% dengan rumus m1v1 = m2v2,

volume TAE 1% yang akan dibuat adalah 250 mL. Ukur larutan tae sebanyak 25 mL

kemudian tambahkan akuades hingga volumnya menjadi 250 mL, sehingga

diperoleh larutan TAE 1%. Untuk membuat agarose campurkan TAE 1% sebanyak

40 mL dengan agar 0,4 gram. Aduk sampai merata dan panaskan pada microwave.

Setelah itu tuangkan larutan agarose tersebut kedalam cetakan yang sudah

disiapkan dengan lengkap dengan sisir pembuat sumur pada agarose. Diamkan

beberapa saat sampai agarose dingin dan mengeras. Sisa TAE 1% akan digunakan

dalam proses elektroforesis.

Elektroforesis Setelah agarose mengeras, dilepaskan dari cerakan dan sisir pembentuk

sumurnya juga dilepaskan. Kemudian agarose diletakkan ke dalam elektroforesis,

setelah itu bagian kanan dan kiri di isi dengan larutan TAE 1% sampai menggenangi

agarose yang berperan sebagai cairan elektrolit. Ambil sampel DNA sebanyak 1μL,

kemudian campurkan dengan larutan zat pewarna/loading buffer 1μL.

Setelah dicampur merata antara sampel DNA dan loading buffer masukkan ke

dalam sumur pada agarose dengan menggunakan mikropipet tanpa merobek

agarose. Apabila semua sampel DNA sudah dimasukkan kedalam sumur agarose,

elektroforesis dihubungkan dengan sumberdaya dan dinyalakan pada tegangan 90

volt selama 30 menit. Langkah selanjutnya adalah ambil agarose dari elektroforesis,

analisis dengan di atas transimulator sinar ultraviolet. Sampel yang terdapat DNA

genomnya akan terlihat berpendar.

V. Hasil Genom yang sudah berhasil di isolasi dari sampel darah kemdian diuji dengan elektroforesis dan diperoleh hasil sebagai berikut:

Sumur Gel No. Sampel darah Deteksi DNA

1 -

2 -

3 -

4 -

5 -

6 -

7 -

8 -

9 -

10 -

11 -

12 -

13 -

14 -

15 -

Tabel 2. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-1

Keterangan:

Agarose sebanyak 1 %

Waktu : 30 menit

Daya : 90 volt

Gambar 2. Elektroforesis Genom pertama

*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan

seterusnya

Sumur Gel No. Sampel darah Deteksi DNA

1 3 +

2 17 -

3 4 -

4 6 +

5 7 +

6 9 -

7 13 -

8 Marker

9 3 -

10 4 -

11 6 -

Tabel 3. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-2

Keterangan:

Agarose sebanyak 0,9 %

Waktu : 25 menit

Daya : 90 volt

Sumur gel no 9, 10, 11 merupakan hasil PCR

Sumur Gel No 12, 13, 14, 15 rusak sehingga tidsak dapat digunakan

Gambar 3. Elektroforesis Genom dan hasil PCR pertama

Berpendar

*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan

seterusnya

Hasil Elektroforesis Isolasi DNA darah yang kedua yang sudah di PCR dan terlihat

pendaran pada sumur 1, 4, dan 5 tetapi mengarah dengan jalur terbalik.

VI. Pembahasan

Setelah dilakukan elektroforesis diperoleh hasil seperti diatas, dimana

pengujian pertama tidak ada terdeteksi genom hasil isolasi. Kemungkinan penyebab

tidak terlihatnya genom dari uji pertama adalah waktu untuk pengujian

elektroforesis terlalu lama lebih dari 30 menit. Selain itu daya pada leketroforesis

juga terbalik, sehingga pergerakan genom menjadi terbalik dimana jalur yang pendek

bermuatan negatif dan jalur panjangnya positif. Dengan terbaliknya sumber daya

listrik tersebut mengakibatkan genom berjalan terbalik. Dengan waktu yang panjang

dan jalur genom dalam agarose pendek memungkinkannya genom sudah melewati

agarose sehingga tidak ada yang terlihat tampak pada saat diamati dibawah

Transimuloator sinar ultraviolet (UV).

Hasil yang diperoleh tersebut sangat tidak memuaskan, hal itu mungkin

terjadi akibat seperti dijelaskan diatas sehingga dilakukan pengujian ulang, akan

tetapi ada beberapa sampel yang genom hasil isolasi tersebut masih banyak terdapat

darah/protein sehingga dilakukan kembali pemurnian dengan memberikan

isoplropanol sehingga hanya tabung 2, 4, 6, 7, 9, 13 dan 14 yang di uji kembali. Akan

tetapi karena sumur gel ada 15 dengan memikirkan efesiensi dilakukan juga

elektroforesis terhadap DNA hasil PCR pertama yaitu sampel tabung nomor 3, 4 dan

6.

Setelah melakukan elektroforesis kedua terhadap genom, dan di amati diatas

transimulator UV diperoleh hasil seperti diatas. Cukup membuat lega karena sampel

tabung nomor 3, 6 dan 7 terlihat pendaran genom saat diamati di transimulator UV

dengan arah yang terbalik. Untuk sampel lain yang tidak terlihat kemukinan yang

terjadi human eror yaitu pada saat pengambilan sampel dr tabung sampel kurang

tepat atau memang pada saat isolasi genom tidak berhasil. Hal lain yang dapat

menyebabkan kegagalan seperti faktor praktikan belum terbiasa melakukan

praktikum yang membutuhkan ketelitian serta keakuratan pengisian bahan serta

perlunya waktu yang lebih lama agar dapat menghasilkan isolate yang terbaik serta

maksimal. Kesalahan selanjutnya dapat terjadi pada saat melakukan langkah kerja,

misalnya langkah kerja yang kurang tepat, atau adanya kontaminasi sehingga DNA

yang seharusnya diambil supernatannya tetapi malah ikut terbuang bersama hasil

sentrifugasi yang tidak diinginkan.

Akan tetapi yang cukup membuat bingung adalah sampel tabung nomor 3

dan tabung nomor 6 genom terlihat berpendar, akan tetapi pada sampel nomor

tersebut hasil PCR tidak ada pendaran. Kemungkinan penyebabnya adalah DNA yang

diamplifikasi cukup sedikit dan kemungkinan lain adalah kurang sensitifnya hasil uji

PCR. Hal inilah yang menumbuhkan harapan masih bisa dilanjutkan ke tahap

selanjutnya.

VII. Kesimpulan

Hasil uji genom pertama tidak tampak berpendar diatas transimulator UV,

kemungkinan penyebabnya adalah terlewatnya genom pada agarose karena sumber

daya yang terpasang terbalik. Hal ini diperkuat dengan uji elektroforesis kedua

dimana diperoleh hasil sampel nomor 3, 6 dan 7 terdapat pendaran genom.

Daftar Acuan

Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA.

Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga. Jakarta

Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins, Inc. Maryland

Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas Negeri malang. Malang

McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group. Madison Avenue, NY, US.

Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.