Prinsip

Detektor fluoresensi mungkin yang paling sensitif di antara yang ada detektor HPLC modern.Hal

ini dimungkinkan untuk mendeteksi bahkan kehadiran molekul analit tunggal dalam aliran

sel.Biasanya, sensitivitas fluoresensi adalah 10 -1000 kali lebih tinggi dibandingkan dengan

detektor UV untuk bahan menyerap UV yang kuat.Detektor fluoresensi sangat spesifik dan

selektif antara lain detektor optik.Hal ini biasanya digunakan sebagai keuntungan dalam

pengukuran spesies neon tertentu dalam sampel.

Ketika senyawa memiliki gugus fungsional spesifik sangat antusias oleh energi panjang

gelombang lebih pendek dan memancarkan radiasi panjang gelombang yang lebih tinggi yang

disebut fluoresensi.Biasanya, emisi diukur pada sudut yang tepat untuk eksitasi.

Kira-kira sekitar 15% dari semua senyawa memiliki fluoresensi alam.Kehadiran terkonjugasi pi-

elektron terutama di komponen aromatik memberikan aktivitas neon yang paling intens.Juga,

alifatik dan senyawa alisiklik dengan gugus karbonil dan senyawa dengan ikatan rangkap

terkonjugasi yang sangat berpendar, tetapi biasanya untuk tingkat yang lebih rendah.Kebanyakan

hidrokarbon aromatik tersubstitusi berpendar dengan yeld kuantum meningkat dengan jumlah

dering, derajat mereka kondensasi dan kekakuan struktural mereka.

Intensitas fluoresensi tergantung pada kedua eksitasi dan panjang gelombang emisi, sehingga

secara selektif mendeteksi beberapa komponen sementara menekan emisi lain.

Deteksi komponen apapun secara signifikan tergantung pada panjang gelombang yang dipilih

dan jika salah satu komponen dapat dideteksi pada 280 ex dan 340 em., Yang lain bisa

terjawab.Sebagian besar detektor modern memungkinkan cepat beralih dari eksitasi dan emisi

panjang gelombang, yang menawarkan kemungkinan untuk mendeteksi semua komponen dalam

campuran ..Sebagai contoh, dalam sangat penting kromatogram aromatik polynuclear eksitasi

dan emisi panjang gelombang yang 280 dan 340 nm, masing-masing, untuk pertama 6

komponen, dan kemudian berubah menjadi nilai-nilai masing-masing 305 dan 430 nm, nilai-nilai

yang terakhir merupakan kompromi terbaik untuk memungkinkan deteksi sensitif senyawa.

Detektor fluoresensi

Gambar dibawah menunjukkan skema optik dari detektor fluoresensi khas untuk kromatografi

cair.Detektor tersedia di pasar berbeda dalam metode di mana panjang gelombang

dikendalikan.Instrumen lebih murah menggunakan filter, unit sedang harga menawarkan kontrol

monokromator minimal emisi panjang gelombang, dan instrumen penelitian-grade kemampuan

penuh memberikan kontrol monokromator kedua eksitasi dan panjang gelombang emisi.

Skematik optik dari detektor fluoresensi khas untuk kromatografi cair.

Prinsip dari detektor ini adalah sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan

berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar

fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati.

Tipe-tipe Detektor Fluorescence : -Single wavelength excitation fluorescence detector -Multi

wavellength fluorescence detector -Laser Induced Fluorescence Detector (LIFD)

Single beam biasanya lebih populer karena dapat meningkatkan efektifitas cahaya dan

meningkatkan potensial untuk detection limit yang lebih rendah. Namun, single beam memiliki

kelemahan yaitu rentan mengalami goyangan atau turun naiknya lampu, sehingga menyebabkan

ketidakstabilan. Untuk mengatasi ini maka digunakan dual beam detector

2. Detektor ini merupakan pengembangan dari single beam detektor.Cahaya  yang berasal dari

sumber akan dibelokkan oleh sebuah quartz beam splitter dalam diode atau photomultiplier. Pada

detektor ini terdapat dua buah monokromator. Pertama untuk mengukur signal yang keluar dari

lampu, dan  yang kedua untuk mengukur emisi dari analit. Sama seperti halnya pada single beam

detektor, pada dual beam detektor juga memiliki potensi terjadinya goyangan pada

lampu.Namun hal ini dapat diatasi dengan ditambahkannya magnet di sekitar lampu.

3. Mendeteksi Emisi optical dari molekul yang mengalami eksitasi menuju tingkat energi yang

lebih tinggi akibat penyerapan radiasi elektromagnetik.LIFD merupakan teknik deteksi optical

yang paling sensitif. LIFD biasanya digunakan untuk analisis

‘capillary electrophoresis’. LIFD

dipakai sebagai alat terpisah untuk analisis produk reaksi berantai polimer, penentuan larutan

seperti protein, asam nuleat, siklik hidrokarbon aromatik, dan senyawa yang beracun seperti

sianida .

sumber :

Deuterium Lamps : lampu ini merupakan pilihan yang baik jika eksitasi ultraviolet serta

stabilitas yang panjang diperlukan. Lampu ini minim gangguan dan memiliki hasil yang terbatas.

Ini akan menghambat

‘background’

mencapai photomultiplier.

1. Single Wavelength Eksitasi Fluorescence Detector

Panjang gelombang detektor eksitasi fluoresensi tunggal mungkin adalah detektor LC paling

sensitif yang tersedia, tetapi dicapai dengan mengorbankan fleksibilitas. Adiagram o fa bentuk

sederhana dari detektor fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 36.

Lampu eksitasi biasanya disediakan oleh tekanan rendahlampu merkuri yang relatif murah

dan menyediakan relative tinggi intensitas UV cahaya di 253,7nm. Banyak zat yang berpendar

akan senang dengan cahaya dari panjang gelombang ini.

 

Gambar 36.Single Wavelength Eksitasi Fluorescent Detector

Lampu eksitasi difokuskan oleh lensa kuarsa melalui sel.Sebuah lensa kedua, set normal

terhadap insiden ringan, memfokuskan cahaya fluorescent ke sel foto.Sebuah panjang gelombang

detektor fluoresensi tetap akan memiliki kepekaan (konsentrasi minimum terdeteksi pada

panjang gelombang eksitasi 254 nm) dari sekitar 1 x 10 -9 g / ml dan dynamic range linier dari

sekitar 500 dengan indeks respon dari 0,96 <r <1,04.

Sebuah contoh dari pemisahan dimonitor oleh detektor fluoresensi sederhana adalah pemisahan

campuran polutan prioritas yang ditunjukkan pada gambar 37.Lampu eksitasi adalah sekitar

monokromatik pada 254 nm dan semua panjang gelombang cahaya neon dirasakan oleh sel foto.

Kolom: 2 Pecosphere ™-5C C18 (150 mm x 4,6 mm) dalam seri.Ponsel Phase: 90%

acetonitrile/10% air.Laju alir: 2,0 ml / menit.Detector Fluorescence (Eksitasi 254 Total emisi nm

merasakan).Contoh: 20l dari NBS Standard.

1.Naftalin 2.Fluorene 3.Acenaphthene

4.Phenanthrene 5.Antrasena 6.Fluoranthracene

7.Pyrene 8.Benzo (a) antrasena 9.Chrysene

10.Benzo (b) fluoranthen 11.Benzo (k) fluoranthen 12.Benzo (k) fluoranthen

13.Dibenz (a, h) antrasena14.Indeno (1, 2, 3, cd)

pyrene15.Benzo (ghi) perylene

Courtesy dari Perkin Elmer Korporasi

Gambar 37.Pemisahan Polutan Prioritas Dimonitor oleh Fluorescence Detector Sederhana

Ada beberapa kompromi antara mahal detektor spektrometer fluoresensi dan panjang gelombang

eksitasi detektor fluoresensi tunggal.Beberapa memiliki monochromators tunggal yang memilih

panjang gelombang cahaya eksitasi, lain mempekerjakan monokromator tunggal untuk memilih

panjang gelombang emisi atau memberikan spektrum emisi.

2. Multi Panjang Gelombang Fluoresensi Detector

Detektor multi-panjang gelombang fluoresensi berisi dua monochromators, satu untuk

memilih panjang gelombang eksitasi dan yang kedua untuk memilih panjang gelombang

fluoresensi atau menghasilkan spektrum fluoresensi Diagram panjang gelombang detektor multi-

fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 38.

Gambar 38.The Fluorescence Spectrometer Detector

Detektor ini terdiri dari spektrometer neon dilengkapi dengan sel penyerapan cocok yang cukup

kecil sehingga tidak menurunkan resolusi kolom LC.Ada dua jalur cahaya jelas berbeda satu

untuk cahaya eksitasi dan satu untuk cahaya yang dipancarkan.Jalan cahaya yang berbeda

digambarkan secara terpisah, cahaya eksitasi dalam gelap biru dan cahaya yang dipancarkan

dalam biru muda.

Sumber eksitasi band yang luas (biasanya lampu deuterium) ditempatkan pada titik fokus

dari cermin ellipsoid (ditampilkan di bagian atas pojok kiri dari diagram).Yang dihasilkan sinar

paralel jatuh pada cermin toroidal yang berfokus itu ke kisi-kisi pada sisi kiri diagram.Kisi-kisi

ini memilih panjang gelombang cahaya eksitasi.Cahaya dengan panjang gelombang yang dipilih

lolos ke cermin bulat dan kemudian ke cermin ellipsoid (ditunjukkan di dasar diagram) yang

berfokus itu ke sampel.Jalan cahaya eksitasi dalam gelap biru dan terletak di sisi kiri dari

diagram.

Sebuah beam splitter terletak antara cermin bulat dan cermin ellipsoid (di pusat diagram) yang

mencerminkan sebagian dari cahaya insiden ke cermin toroidal lain yang berfokus itu ke sel foto

referensi. Jalur dari lampu neon adalah warna biru muda dan sebagian besar di sisi kanan

diagram. Fluorescent cahaya dari sel difokuskan oleh cermin ellipsoid pada sebuah cermin bulat

yang kemudian memfokuskan cahaya ke kisi-kisi terletak (terlihat di sekitar pusatkanan dari

gambar).Kisi-kisi memilih panjang gelombang tertentu dari cahaya neon yang akan dimonitor.

Cahaya dari panjang gelombang yang dipilih lolos ke sel fotolistrik yang memonitor

intensitasnya.

Instrumen ini cukup kompleks tapi sangat serbaguna.Penggunaan detektor untuk

mengoptimalkan kedua cahaya eksitasi dan lampu fluoresensi untuk memberikan selektivitas

tinggi untuk Fluoropa turunan dari neomycin ditunjukkan pada Gambar 39. Ini adalah contoh

yang sangat baik dari pemilihan panjang gelombang cahaya eksitasi spesifik dan komplementer

cahaya emisi panjang gelombang untuk memberikan sensitivitas maksimum.

Kolom: Supercosil LC-8, 15 cmx4,6 mm,partikel5m: Mobile Tahap: tetrahidrofuran: 0.0056M

natrium asetat sulfate/0.007M acid/0.01M pentana sulfonat, 3:97.Laju alir: 1,75 ml /

menit.Posting Kolom reagen: 1L 0,4 M borat acid/0.38M kalium hidroksida yang mengandung 6

ml 40% Brij-35, 4 ml mercaptoethanol, 0.8g o-phthalaldehyde.Laju alir 0,4 ml / menit.Mixer 5

cmx4,6 mm kolom dikemas dengan manik-manik kaca.10 reaktor ft x 0,5 mm rajutan Teflon

kapiler tabung.Reaksi Suhu 40 o C.20 ml sampel dari ekstrak fase gerak dari sampel

komersial.Eksitasi panjang gelombang 365 nm, emisi panjang gelombang 418 nm.

 Courtesy of Supelco Inc

Gambar 39.Deteksi Neomycin OPA Derivatif pada Eksitasi Panjang gelombang 365 nm

dan emisi Panjang gelombang dari 418 nm

Mengoptimalkan eksitasi dan emisi panjang gelombang cahaya untuk mendapatkan sensitivitas

maksimum untuk campuran kompleks dapat menjadi sangat terlibat seperti yang ditunjukkan

oleh pemisahan beberapa polutan prioritas digambarkan dalam gambar 40.Pemisahan ini

dilakukan pada kolom panjang 25 cm, 4,6 mm dan dikemas dengan C18 fase terbalik.Fase gerak

diprogram dari asetonitril 93%, 7% air sampai 99% asetonitril, 1% air selama 30 menit.Gradien

linier dan laju alir 1,3 ml / menit.

Courtesy dari Perkin Elmer Korporasi

1 naftalena 9 Chrysene

2 acenaphthene 10 Benzo (b) fluoranthen

3 Fluorene 11 Benzo (k) fluoranthen

4 Phenanthrene 12 Benzo (a) pyrene

5 Anthracene 13 Dibenz (a, h) antrasena

6 fluoranthen 14 Benzo (ghi) perylene

7 Pyrene 15 Indeno (123-cd) pyrene

8Benz(a) antrasena

Waktu (detik)Panjang gelombang dari Eksitasi

Cahaya

Panjang gelombang cahaya yang

dipancarkan

0 280 nm 340 nm

220 290 nm 320 nm

340 250 nm 385 nm

510 260 nm 420 nm

720 265 nm 380 nm

1050 290 nm 430 nm

1620 300 nm 500 nm

Gambar 40. Pemisahan Seri Polutan Prioritas dengan Programmed Fluorescence Detection

Pemisahan menggambarkan pandai menggunakan pemrograman panjang gelombang

untuk mendapatkan sensitivitas maksimum.Selama pembangunan kedua panjang gelombang

cahaya eksitasi dan cahaya emisi diubah untuk memberikan sensitivitas maksimum untuk zat

terlarut tertentu. 

Detektor dapat memberikan fluoresensi atau spektrum eksitasi dengan menangkap aliran

fase gerak ketika zat terlarut berada dalam sel mendeteksi dan pemindaian baik eksitasi atau

lampu neon.(Ini adalah teknik yang sama seperti yang digunakan untuk menyediakan spektrum

UV dengan panjang gelombang variabel detektor UV).Akibatnya, adalah mungkin untuk

mendapatkan spektrum eksitasi pada setiap panjang gelombang neon dipilih atau spektrum neon

pada setiap panjang gelombang eksitasi yang dipilih. Jadi, bahkan dengan resolusi spektroskopi

relatif miskin ratusan spektrum dapat diproduksi, salah satu atau semua yang (meskipun banyak

spektrum yang sangat mirip) dapat digunakan untuk mengkonfirmasi mengidentifikasi senyawa.

3. The Multiwave Fluorescence Detector

Instrumen baru yang digunakan gangguan filter dalam upaya untuk memberikan

Multiwave Fluoresensi deteksi tanpa menggunakan monokromator.

Logam λ Optimum

Perangsangan(Nm)

λ optimum emisi (nm)

Seng (135 pmol) 393 506

Kadmium (33 pmol) 387 522

Magnesium (135 pmol) 393 506

Kalsium (20 nmol) 393 506

Gambar 13.Pemisahan Beberapa Logam Chelate Mempekerjakan Fluorescence Deteksi pada

Optimum Eksitasi dan Emisi Panjang gelombang

Perangkat dioperasikan pada empat panjang gelombang yang berbeda dan diagram peralatan

mereka ditunjukkan pada Gambar 14.

Cahaya eksitasi dari 200 w Xenon lampu busur pertama kali tercermin oleh cermin UV (90%

reflektansi rata-rata untuk cahaya antara 325 dan 475 nm) untuk meminimalkan panas dan

menghapus sebagian besar Terlihat cahaya.Lampu eksitasi kemudian dilewatkan melalui filter

interferensi, yang dapat mengirimkan cahaya pada 320 ± 2 nm, 360 ± 2 nm dan 400 ± 2 nm, dan

kemudian fokus ke ujung bulat berbentuk bundel serat optik kuarsa.Bundel serat ini diarahkan

cahaya ke modul detektor, yang terdiri dari tabung kuarsa persegi dipasang pada dudukan sel

Teflon hitam.

Gambar 14.Diagram Skema Modul Detector

Fluoresensi sinyal diamati melalui jendela samping dalam sel. Dua detektor, masing-masing

terdiri dari sensor cahaya dan filter gangguan, yang dipasang di pemegang kuningan di kedua sisi

sel.Akibatnya cahaya emisi di empat panjang gelombang yang berbeda dapat diukur secara

bersamaan.Filter yang berbeda digunakan untuk frekuensi cahaya eksitasi yang berbeda,

misalnya, dengan cahaya eksitasi panjang gelombang dari 400 nm, filter dalam empat unit

sensor, dipilih untuk mengirimkan cahaya pada 420 ± 2 nm, 440 ± 2 nm, 460 ± 2 nm dan 500 ± 2

nm masing-masing.Output dari sensor diakuisisi oleh komputer dan data yang

disimpan.Pemisahan, dipantau oleh salah satu dari Fluoresensi saluran, kemudian bisa

direkonstruksi.

Sebuah contoh dari penggunaan peralatan untuk menyelesaikan puncak berbelit-belit yang

mengandung dua zat terlarut ditunjukkan pada Gambar 15.

Gambar 15.Resolusi Convoluted kromatografi Peaks

Panjang gelombang cahaya eksitasi adalah 400 nm dan cahaya emisi dimonitor pada 420 nm,

440 nm, 460 nm dan 500 nm. Kromatogram direkonstruksi dari output sama sekali empat

panjang gelombang, dan kromatogram gabungan termasuk dalam angka 15.Hal ini terlihat

bahwa dua komponen yang jelas dibedakan oleh multi-channel Fluoresensi deteksi, sedangkan

sifat ganda dari puncak berbelit-belit adalah tak dpt dibedakan dengan deteksi non-

selektif.Meskipun alat ini lebih sederhana, dan mungkin lebih murah daripada membuat

Fluoresensi spektrometer, kinerjanya juga sangat terbatas dibandingkan.

DAFTAR PUSTAKA

1. http://www.analyticalspectroscopy.net/ap2-15.htm

2. http://www.chromatography-online.org/5/contents.html

3. http://www.chromatography-online.org/HPLC-Detectors/Transport/rs63.html

4. http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_flur.html

5. http://id.wikipedia.org/wiki/Fluoresens