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Determinação da captação de iodo por células
tumorais da tiróide por µ-AMS e deteção gama
Ana Sofia Gusmão Gomes
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Tecnologias Biomédicas
Orientadores: Doutora Maria de Lurdes Gano
Doutor Hélio Fernandes Luís
Júri
Presidente: Professora Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo
Orientador: Doutor Hélio Fernandes Luís
Vogal: Professora Maria Micaela Leal da Fonseca
Novembro de 2016
2
Abstract:
Compared with the normal thyroid cells, thyroid cancer cells have a reduced iodine uptake.
Nevertheless, radioactive iodine is the principal treatment for thyroid cancer.
The aim of this dissertation is to evaluate the possibility of the use of µ-AMS as an alternative to gamma
counting techniques in studies of iodine uptake in thyroid cells.
For the determination of the precision and accuracy of the gamma counter used in bioassay laboratory
of radiopharmaceutical group in CTN, 3 tubes with 125I solution and an activity of 0,9 µCi were prepared.
These were used for the determination of the geometric effect, the reproducibility of the measurements,
detection efficiency and the detection limit for 125I.
In order to determine the detection limit for 129I with LATR/CTN µ-AMS system, an AgI pellet was made
and measured. Another pellet, using carcinoma cells, was made to mimic the extraction of 129I by thyroid.
The study allowed us to conclude that, the Berthold LB2111 can detect a minimum of 9,6x107 125I
particles (4%uncertainity) compared with 2,8x105 127I particles (1% uncertainty) by µ-AMS.
Since cancer cells have a lower iodine uptake than healthy cells, the better detection limit of µ-AMS is
a valuable tool in the study of iodine uptake of thyroid cancer cells.
This study was the first to measure iodine by µ-AMS and demonstrated the possibility of this technique
to decrease the sample mass by 2 orders of magnitude when compared with conventional AMS. This
will compensate the difference in primary beam intensity between the two techniques.
Keywords: thyroid cancer, cells, iodine, µ-AMS, gamma detection
3
Resumo:
Estudos demostraram que o tecido tumoral tiróideu apresenta uma diminuição da captação de iodo
quando comparado com os tecidos saudáveis. O isótopo radioativo 131I, é o tratamento mais comum no
carcinoma da tiróide.
O objetivo desta dissertação consistiu em estudar a possibilidade de utilização do µ-AMS como
alternativa a espectrometria gama em estudos de captação de iodo por células da tiróide.
Para estudar o LB2111 foram preparadas 3 amostras de 125I com 0,9 µCi, foi verificada a
reprodutibilidade nos vários canais do detetor, o efeito geométrico da amostra o limite de deteção e a
eficiência do mesmo.
Para determinar a sensibilidade do µ-AMS para 129I foi preparada e medida uma pastilha de AgI. Foi
efetuada uma pastilha com células de adenocarcinoma humano, para mimetizar o processo de extração
do 129I de células da tiróide.
Concluiu-se que o equipamento de espectrometria gama LB2111 utilizado no laboratório de ensaios
biológicos do grupo de ciências radiofarmacêuticas do CTN pode ser utilizado para amostras de 125I com
mínimo de 9,6x107 partículas (4% incerteza). O µ-AMS do LATR/CTN consegue medir até 2,8x105
partículas (1% incerteza) de 129I.
A técnica de µ-AMS apresenta-se como alternativa ao contador LB2111 apresenta um limite de deteção
até 2 ordens de grandeza superior ao mesmo.
Este estudo foi o primeiro a medir iodo por µ-AMS. Verificou-se a possibilidade de reduzir 2 ordens de
grandeza no tamanho da amostra quando comparada com AMS. Esta redução da massa de 127I vem
reduzir a discrepância entre os limites de deteção das duas técnicas.
Palavras Chave: carcinoma da tiroide, células, iodo, µ-AMS, deteção gama
4
Índice
Abreviaturas ........................................................................................................................................ 6
Lista de tabelas ................................................................................................................................... 8
Lista de figuras ................................................................................................................................... 9
Lista de gráficos ............................................................................................................................... 11
Introdução .......................................................................................................................................... 12
Introdução teórica ............................................................................................................................ 14
2.1 Aplicação de Radioisótopos em Medicina e em Biologia .................................................. 14
2.1.1 Radioisótopos de iodo ..................................................................................................... 17
2.1 Anatomia e fisiologia da tiróide e hormonas tiróideias ................................................. 21
2.2.1 NIS ...................................................................................................................................... 23
2.2 Carcinoma da tiróide .......................................................................................................... 24
2.3.1 NIS – Mutações associadas ao carcinoma da tiróide ................................................. 27
2.3 Terapêutica do carcinoma da tiróide ............................................................................... 27
2.4 Contador gama ................................................................................................................... 31
2.5 µ-AMS ................................................................................................................................... 35
2.6.1 Fonte iónica e câmara de amostras .............................................................................. 37
2.6.2 Sistema de transporte do feixe de baixa energia ........................................................ 40
2.6.3 Acelerador Tandem .......................................................................................................... 42
2.6.4 Sistema de transporte do feixe de alta energia ........................................................... 42
2.6.5 Detetores ............................................................................................................................ 43
2.6.6 Sistema de boucing .......................................................................................................... 45
2.6.7 Programa de controlo ....................................................................................................... 46
2.6.8 Preparação de amostras - Preparação de uma pastilha com base em células
tiróideias captantes de 129I......................................................................................................... 46
Materiais e métodos......................................................................................................................... 47
3.1 Captação de 125I por células tiroideias .................................................................................. 47
3.2 Determinação da atividade de uma amostra 125I no contador gama LB 2111 ............... 47
3.2.1 Determinação do efeito geométrico da amostra na medição da atividade.............. 48
3.2.2 Precisão e exatidão das medições ................................................................................ 48
3.2.3 Linearidade de resposta do contador ............................................................................ 48
3.2.4 Determinação da eficiência do detetor .......................................................................... 49
3.3 Determinação de iodo pela técnica de µ-AMS .................................................................... 49
3.3.1 Preparação de amostras ................................................................................................. 50
5
3.2.2 Medição da pastilha de AgI pela técnica de µ-AMS: Cálculo do limite de deteção
....................................................................................................................................................... 52
Resultados ......................................................................................................................................... 59
4.1 Determinação de 125I pelo contador gama Berthold LB2111 ............................................ 59
4.1.1 Determinação da influência do efeito geométrico da amostra na medição da
atividade ....................................................................................................................................... 60
4.1.2 Precisão e exatidão das medições ................................................................................ 61
4.1.3 Linearidade de resposta do detetor ............................................................................... 61
4.1.4 Determinação da eficiência do detetor .......................................................................... 62
4.2 Determinação de 129I pela técnica de µ-AMS ...................................................................... 64
4.2.1 Medição da pastilha de AgI pela técnica de µ-AMS: Cálculo do limite de deteção
....................................................................................................................................................... 64
Discussão ........................................................................................................................................... 67
Conclusão e perspetivas futuras ................................................................................................. 70
Bibliografia ......................................................................................................................................... 71
6
Abreviaturas
ADN ácido desoxirribonucleico
AMS Espectrometria de massa com acelerador
ATP Adenosina trifosfato
Bq Becquerel
CDT Carcinoma diferenciado da tiróide
Ci Curie
Cpm Contagens por minuto
ESA Electrostatic analyser
FC Faraday cup
HI High energy
ICP-MS Espectrometria de massa por plasma acoplado indutivamente
LE Low energy
NAA Análise por ativação de neutrões
NIS Transportador de iodo/sódio
mRNA RNA mensageiro
PET Tomografia por emissão de positrões
Ppb Parts per billion
RNA Ácido ribonucleico
SPECT Tomografia computorizada por emissão de um único fotão
TC Tomografia computorizada
Tg Tiroglobulina
TGFβ1- Proteína transforming grow factory β1
TRH Tirotropina C
TSH Hormona tiro-estimulante
T3 Tri-iodotironina
T4 Tetra-iodotironina / tiroxina
7
SI Sistema internacional
SIMS Espectrometria de massa de iões secundários
µ-AMS Espectrometria de massa com acelerador e com micro feixe
18F-FDG Fludesoxiglicose
8
Lista de tabelas
Tabela 1 Alguns dos radiofármacos utilizados com fim diagnóstico……………………………………… 15
Tabela 2 Alguns dos radiofármacos utilizados com fim terapêutico……………………………………… 16
Tabela 3 Isótopos de iodo mais utilizados na clinica e respetivas propriedades………………………….17
Tabela 4 Parâmetros que permitiram calcular o campo magnético aplicado ao magneto de baixa
energia para o 127I……………………………………………………………………………………………… 56
Tabela 5 Parâmetros que permitiram calcular o campo magnético aplicado ao magneto de alta energia
para o 127I……………………………………………………………………………………………………….. 57
Tabela 6 Dados relativos a medição das alterações das medições resultantes do efeito geométrico da
amostra…………………………………………………………………………………………………………. 60
Tabela 7 Dados relativos a medição da variabilidade dos 11 canais do contador gama………………. 61
Tabela 8 Dados relativos a medições com sucessivas diluições – estudo do limite de deteção do
contador………………………………………………………………………………………………………… 62
Tabela 9 Dados relativos ao cálculo da eficiência do detetor – relação entre a medição efetuada pelo
contador LB2111 e pelo detetor Camberra 2020…………………………………………………………… 63
9
Lista de figuras
Figura 1 Esquema de decaimento 131I………………………………………………………………………..17
Figura 2 Esquema de decaimento 129I………………………………………………………………………..18
Figura 3 Esquema de decaimento 125I…………………………………………………………………….…19
Figura 4 Esquema de decaimento 123I……………………………………………………………………….20
Figura 5 Anatomia da tiróide – células foliculares e parafoliculares……………………………………….21
Figura 6 Fórmula estrutural das hormonas tiróideias T3 e T4……………………………………………...22
Figura 7 Mecanismo de transporte do NIS – este mecanismo dá-se através do transporte de 2Na+ a favor do gradiente e de I- contra o gradiente………………………………………………………………….23
Figura 8 Esquema de decaimento do 131I – partículas β- apresentam-se uteis na terapêutica e γ no
diagnóstico………………………………………………………………………………………………………28
Figura 9 Contador gama visto de lado e de topo (à esquerda) e esquema representativo da emissão
da amostra (à direita)…………………………………………………………………………………………...31
Figura 10 Esquema representativo do fotomultiplicador – interação dos fotoeletrões com os
dínodos…………………………………………………………………………………………………………. 33
Figura 11 Esquema representativo do contador gama – os fotões resultantes da energia incidente no
material cintilador do detetor vão passar pelo fotomultiplicador formando um pulso proporcional à
mesma…………………………………………………………………………………………………………...34
Figura 12 Esquema representativo do equipamento de SIMS……………………………………………..35
Figura 13 Esquema representativo do equipamento de AMS……………………………………………...36
Figura 14 Processo de sputtering – o feixe primário de Cs+ ao embater na amostra vai causar a injeção
de partículas……………………………………………………………………………………………………..38
Figura 15 Fonte de iões – onde estão localizados o reservatório e o ionizador…………………………..38
Figura 16 Braço metálico que permite a passagem da amostra da câmara de troca amostras para a
câmara de amostras e vice versa [1], camara de troca amostras [2], válvulas que vão permitir manter o
vácuo nas câmaras referidas [3], câmara de amostras [4] e sistema de movimentação de amostras [5]
……………………………………………………………………………………………………………………39
Figura 17 LE ESA [6], FC [7] e magneto de baixa energia………………………………………………….41
Figura 18 LE ESA [6], FC [7] e magneto de baixa energia………………………………………………….43
Figura 19 Hémocitometro - constituído por 9 quadrados grandes (A); cada quadrado grande contém,
16 quadrados médios (B); cada quadrado médio contém 25 quadrados pequenos……………………...51
Figura 20 Controlador da fonte – Permite controlar a temperatura do ionizador e do reservatório assim
como o revolver de colimadores, os 4 pratos cilíndricos defletores e a tensão de extração do feixe……52
Figura 21 Válvulas que controlam o vácuo no
sistema…………………………………………………………………………………………………………..53
Figura 22 Sistema de controlo da posição da amostra na câmara de amostras – permite um controlo
das coordenadas Y, Z e X numa escala de no mínimo meio micrómetro………………………………….54
Figura 23 Câmara de troca amostras sem e com o suporte de amostras e suporte de amostras com a
pastilha de AgI…………………………………………………………………………………………………..54
10
Figura 24 Representação do sistema de baixa energia – permite escolher qual o dispositivo a ajustar
e qual a FC que irá medir a corrente…………………………………………………………………………..55
Figura 25 À semelhança do ocorrido no sistema de transporte de baixa energia o sistema Tandem
permite a escolha do dispositivo a ajustar e qual a FC que mede a corrente do feixe……………………56
Figura 26 Detetores – constituídos por duas câmaras de deteção, a primeira esta em vácuo, assim
como o resto do sistema, é constituída por uma FC, um ETP e um sistema PIPS, a segunda encontra-
se em alta pressão é constituída por um gás que vai permitir a resolução das interferências isobáricas
do sistema……………………………………………………………………………………………………….58
11
Lista de gráficos
Gráfico 1 Incidência do carcinoma da tiroide entre 1992 e 2013…………………………………………..24
Gráfico 2 Incidência do carcinoma da tiroide tendo em conta à faixa etária………………………………25
Gráfico 3 Esquema representativo da emissão de luz pelos átomos – ao receberem energia os eletrões
passam para um estado excitado, ao perderem essa energia, em forma de fotão, voltam ao estado
fundamental……………………………………………………………………………………………………..32
Gráfico 4 Gráfico relativo ao ajuste da corrente na Image Einzel, seleção do pico da corrente medida
pela FC…………………………………………………………………………………………………………..55
Gráfico 5 Gráfico relativo às intensidades dos estados de carga entre 9+ e 3+ do 127I…………………………..57
Gráfico 6 Relação relativa à quantidade de água adicionada à amostra e à atividade medida…………60
Gráfico 7 Relação entre o fator de diluição da amostra e atividade medida………………………………62
12
Capítulo 1
Introdução
A tiróide é o maior órgão endócrino do corpo humano - afetando, através da produção das hormonas
tiróideias tri-iodotironina (T3) e tetra-iodotironina ou tiroxina (T4) o normal funcionamento de quase todo
o organismo humano. Estas hormonas possuem variadíssimas funções e intervêm em processos de
metabolismo, crescimento e desenvolvimento.
A hormona estimuladora da tiroide ou tirotropina (TSH), produzida pela adeno-hipófise, é responsável
pela síntese das referidas hormonas. Para a produção das hormonas tiróideias é essencial a existência
de uma concentração de iodo elevada, que é obtida por inalação ou ingestão. A proteína transportadora
do tipo simporte de sódio e iodo (NIS) é responsável pela captação do iodo para o interior do folículo
tiróideu, local onde ocorre a síntese das hormonas tiróideias.
O carcinoma diferenciado da tiróide (CDT) é a neoplasia mais frequente da tiróide. Nos últimos anos
foi registada uma prevalência mundial crescente desta patologia.
Para além da tiroidectomia, a administração do isótopo radioativo 131I, é a forma de tratamento mais
comum no caso de carcinoma da tiróide. As suas características nucleares, assim como a sua
disponibilidade, constituem as principais razões pelas quais este radioisótopo é amplamente utilizado
no diagnóstico e no tratamento do carcinoma da tiróide.
Apesar do tratamento radioativo com iodo ser considerada a terapêutica mais eficaz no caso de
carcinoma da tiróide, estudos em ratos demostraram que o tecido tumoral tiróideu apresenta uma
diminuição da captação de iodo quando comparado com os tecidos saudáveis adjacentes, sendo
estimado uma captação de 1% do radionuclídeo no tecido normal e 0,1% a 0,01% no tecido tumoral
por grama de tecido.
Alterações a nível da expressão do NIS, provocado pelo cancro da tiróide determinam uma diminuição
de concentração intracelular de iodo. Estas alterações ao diminuírem a captação de iodo afetam a
eficácia desta terapia.
Assim, em diversas situações relacionadas com a caracterização dos tumores e do seu tratamento
torna-se de extrema importância a realização de estudos bioquímicos que permitam determinar a
expressão do NIS, e por consequência a captação de iodo por células tumorais da tiróide. Os protocolos
mais utilizados nesta avaliação implicam a medição da quantidade de iodo-125 (125I) captada pelas
células tumorais. Esta medição é usualmente efetuada em contador gama.
Os contadores gama são constituídos por detetores de iodeto de sódio com impurezas de Tálio (NaI(T)).
Sendo o decaimento radioativo um processo aleatório, a medição da emissão de radiação está sujeita
a uma flutuação estatística, que representa muitas vezes uma fonte de imprecisão ou erro. Para além
13
da incerteza associada a flutuação estatística, os contadores gama são fortemente dependentes de
fatores como o ângulo sólido, tempo morto assim como do material e espessura do detetor.
Por outro lado, o facto do equipamento de espectrometria de massa com acelerador e com micro feixe
(µ-AMS) permitir o estudo de amostras as quais tenham sido administradas doses muito reduzidas, vai
permitir uma análise realista dos efeitos recorrentes das mesmas. Para além disso, uma vez que a
técnica em questão se baseia na medição de razões isotópicas e não no decaimento de radionuclídeos,
esta não vai restringir o estudo a elementos que contenham decaimento gama, nem a radioisótopos
com curtos tempos de desintegração. Desta forma, o estudo pela técnica de µ-AMS permite a utilização
de 129I, como alternativa ao 125I, esta alteração vai sujeitar tanto a amostra como o utilizador da mesma
a uma dose de radiação muito menor que a utilizada pelo contador gama.
Assim, o objetivo desta dissertação consistiu em estudar a possibilidade de utilização da técnica de µ-
AMS como alternativa ao uso do contador gama, de forma a maximizar a sensibilidade dos estudos de
captação de iodo pelas células tumorais da tiróide.
Capítulo 2
14
Introdução teórica
2.1 Aplicação de Radioisótopos em Medicina e em Biologia
A descoberta dos raios-X por William Röentgen, em 1895, permitiu o desenvolvimento da primeira
técnica de imagem e diagnóstico clínico. Pouco tempo depois, Henri Becquerel descobriu à existência
não só dos núcleos atómicos, mas também o fenómeno da radioatividade. Em 1913, George de Hevesy
introduziu o conceito de marcador radioativo. A estas descobertas seguiram-se os estudos de Marie e
Pierre Curie, que incidiram na caracterização das propriedades físico-químicas e na separação de
elementos radioativos. A partir destas descobertas, começaram a surgir tanto os primeiros estudos
sobre os efeitos da radiação em tecidos biológicos como a utilização médica da mesma. No início do
século XX foram descritas as primeiras tentativas de administração de radioisótopos naturais [1].
A utilização de radioisótopos na medicina deu-se pela primeira vez em 1936, com a administração de
flúor-18. Este acontecimento possibilitou uma relação crescente entre as descobertas da física atómica
e nuclear e as suas aplicações na medicina, especialmente nas áreas da imagiologia e do tratamento
do cancro [2].
Em 1938, J. Hamilton mediu a acumulação de 131I na tiróide, demonstrando a possibilidade de detetar
e medir externamente a radiação- emitida pelos radionuclídeos, devido à sua capacidade de
penetração através dos tecidos, princípio básico do diagnóstico clínico em medicina nuclear. Esta
possibilidade de detetar órgãos até então ‘’invisíveis’’ despertou rapidamente interesse clínico.
O desenvolvimento de reatores, geradores e aceleradores em 1940 permitiu a produção artificial dos
primeiros radioisótopos, como o Tc-99m, um dos radionuclídeos mais utilizados nos dias de hoje. De
entre os radionuclídeos produzidos destacou-se inicialmente o 131I, o primeiro radionuclídeo utilizado
em medicina nuclear tanto para diagnóstico como para terapia do hipertiroidismo e do carcinoma da
tiróide, sendo que a sua utilidade clínica é ainda reconhecida.
Radiofármaco é a designação dada a um composto radioativo utilizado em medicina para diagnóstico
ou fins terapêuticos. No campo da medicina nuclear 95% dos radiofármacos são utilizados com um fim
de diagnóstico, sendo então, apenas uma pequena parte aplicada à terapêutica. A aplicação clínica
dos radiofármacos depende essencialmente das propriedades nucleares do radionuclídeo,
nomeadamente da sua natureza, energia da radiação emitida e período de semidesintegração (t1/2)
[15].
Os radionuclídeos são átomos cujo núcleo se encontra num estado de equilíbrio precário
transformando-se espontaneamente em nuclídeos mais estáveis por processos de desintegração
radioativa. Possuem um período de semidesintegração característico, isto é, um intervalo de tempo ao
fim do qual, metade dos núcleos instáveis se transformam em núcleos mais estáveis por emissão de
partículas α, β+, β- e/ou radiação eletromagnética (radiação ou raios-X).
15
Para diagnóstico com radiofármacos, os critérios de seleção dos radioisótopos são, um período de
semidesintegração curto, a emissão de fotões com energia relativamente baixa (mas com capacidade
de penetração suficiente para serem detetadas estruturas profundas), emissão de partículas ionizantes
ausente ou muito reduzida e uma elevada atividade específica, uma vez que a concentração de
recetores é muitas vezes baixa. Assim, são normalmente utilizados em diagnóstico, nuclídeos
emissores de radiação ou β+ (representados pela tabela 1) para a visualização da estrutura
morfológica ou função fisiológica do órgão, sistema de órgãos ou tecido alvo, uma vez que estes emitem
radiação eletromagnética penetrante detetável externamente [15] [16] [17].
O decaimento β+ corresponde a transformação de um protão num neutrão e num anti-leptão. No
decaimento β+ pode ainda verificar-se a captura eletrónica, onde o núcleo capta um eletrão das orbitais
atómicas interiores sendo emitidos um neutrão e um neutrino. Por outro lado, o decaimento resulta
da emissão de um fotão por um átomo excitado [2] [4] [5].
Na terapêutica, os critérios de seleção do radiofármaco consistem, para além de uma elevada atividade
específica e de uma elevada afinidade e especificidade para o tecido alvo, a emissão de partículas
ionizantes. Deste modo, é possível garantir a fixação seletiva de uma elevada dose de radiação nas
células alvo com uma dose mínima para os tecidos envolventes. Para este efeito, são utilizados os
radionuclídeos emissores de partículas α ou β- (representados pela tabela 2) devido ao seu efeito
ionizante, que permite destruir células ou tecidos tumorais. A ação terapêutica resulta da danificação
Tabela 1 – Alguns dos radiofármacos utilizados com fim diagnóstico [15].
16
do ácido desoxirribonucleico (ADN) das células, tumorais e normais, induzida pela radiação ionizante
e por ação dos radicais livres produzidos em simultâneo. Consequentemente, os radiofármacos devem
apresentar uma fixação seletiva no tecido alvo tão favorável quanto possível para evitar efeitos
adversos da irradiação com outros órgãos ou tecidos.
O decaimento β- corresponde a transformação de um neutrão num protão e num leptão, por outro lado
o decaimento α corresponde a emissão de um núcleo de 2 protões e 2 neutrões [2] [4].
As primeiras publicações sobre a utilização de radiofármacos associados ao carcinoma da tiróide datam
de 1940. O desenvolvimento do primeiro protótipo de scanner linear em 1949 por Cassen, constituiu o
primeiro sistema de obtenção de imagem. Durante os anos 60 a medicina nuclear sofreu um rápido
crescimento, resultante dos avanços da tecnologia e da instrumentação, como por exemplo a melhoria
de imagem obtida por tomografia computorizada (TC). Na década de 70 já era possível à medicina
nuclear contribuir para a melhoria das condições de diagnóstico, prognóstico e terapêutica de grande
número de especialidades médicas, nomeadamente oncologia, cardiologia, neurologia, nefrologia,
endocrinologia, entre outras [8].
Em 1971 a medicina nuclear, especialidade médica que utiliza radiofármacos para o estudo, diagnóstico
ou tratamento de doenças, foi reconhecida como especialidade. Nestes últimos anos, tem-se verificado
um rápido crescimento desta especialidade, baseada na ampla utilização da tomografia por emissão
de positrões (PET) e da tomografia computorizada por emissão de um único fotão (SPECT) [8].
Em investigação, mais precisamente em estudos in vitro, e em análises clínicas os radioisótopos são
também amplamente utilizados, pois são facilmente detetados em baixas concentrações. Esta
característica permite que sejam utilizados como marcadores em estudos metabólicos, fisiológicos e
farmacológicos.
Tabela 2 – Alguns dos radiofármacos utilizados com fim terapêutico [15].
17
2.1.1 Radioisótopos de iodo
Existem cerca de 36 isótopos de iodo. Na natureza apenas estão disponíveis o 127I (estável) e o 129I.
A Tabela 3 apresenta os radioisótopos de iodo com maior utilização na área da biomédica.
Radioisótopo Massa atómica
(u)
Período de
semidesintegração
Decaimento Energia
123I 122,9 13,2 horas p/123Te Ce Emáx: 1 MeV
γ Emáx: 159 keV
125I 124,9 59,49 dias p/125Te β- Emáx: 31 keV
γ Emáx: 35 keV
127I 126,9 estável
129I 128,9 1,5x107 anos p/129Xe β- Emáx: 154 keV
γ Emáx: 39 keV
131I 130,9 8,04 dias p/131Xe β- Emáx: 606 keV
γ Emáx: 333 keV
2.1.1.1 Iodo-131
O 131I é caracterizado por um período de semidesintegração de 8,04 dias, pela emissão de partículas
β com uma energia máxima de 606 keV e de radiação na ordem dos 333 keV (representado pela
figura 1). Este radioisótopo é produzido pela fissão do urânio-235 ou por bombardeamento de Telúrio
estável num reator nuclear [16].
Desde o início da década de 40 que o tratamento do hipertiroidismo e de carcinoma da tiróide tem sido
realizado com 131I. Este radionuclídeo apresenta as seguintes características, que o tornam ideal para
Tabela 3 – Isótopos de iodo mais utilizados na clínica e respetivas propriedades.
Figura 1 – Esquema de decaimento 131I.
18
aplicações tanto na área do diagnóstico como da terapia, um período de semidesintegração curto,
captação seletiva pela tiróide e rápida eliminação do organismo [16].
Por outro lado, a libertação de 131I, como resultado de acidentes nucleares, e posterior acumulação do
mesmo na glândula tiroideia provoca um aumento da probabilidade de desenvolver carcinoma da tiróide
na população exposta [5].
2.1.1.2 Iodo-129
O 129I é um radionuclídeo de vida longa, com um tempo médio de vida de 1,57x107 anos. A produção
deste radionuclídeo, pela natureza, efetua-se principalmente através da interação de raios cósmicos
com uma atmosfera de Xe e através da ficção espontânea de 238U e 235U na crosta terrestre. O 129I
produzido na litosfera fica maioritariamente aprisionado nas rochas circundantes, aquele que é
produzido através da interação de partículas cósmicas com Xe representa apenas 1% de 129I livre [8]
[13] [14] [23].
Artificialmente o 129I é gerado pela fissão de 235U e 239Pu em reatores nucleares. Hoje em dia, 99% do
iodo livre resulta de atividades antropogénicas. O início da produção de 129I devido a atividades
desencadeadas pelo homem data de 1945, estando associado principalmente a testes realizados com
armas nucleares, a contaminação por combustíveis irradiados e pelas fugas de instalações nucleares,
como o caso do acidente de Chernobil [13] [14] [23] [24].
O decaimento do 129I dá-se pela emissão de partículas β -, com uma energia máxima de 154,4keV, pela
emissão de raios γ, com uma energia na ordem dos 39 keV e pela emissão de raios-X com uma energia
na ordem dos 20 keV (representado pela figura 2) [14].
A medição de 129I em matrizes biológicas permite recolher informações relativas à exposição de
radioisótopos, sendo a glândula da tiróide um dos indicadores naturais mais sensíveis à concentração
do mesmo. Esta característica faz com que a glândula tiroideia de vários mamíferos seja utilizada não
só na verificação da concentração deste radionuclídeo na biosfera como também no cálculo de
concentrações nocivas para o ser humano [12] [13] [25].
Figura 2 – Esquema de decaimento 129I.
19
O 129I pode ser utilizado de forma a mimetizar a libertação de outros isótopos radioativos, como por
exemplo o 131I. Este isótopo é escolhido para este fim devido ao facto de apresentar um tempo de vida
média superior ao 131I o que se vai traduzir numa menor dose de radiação administrada [23].
O 129I pode ser analisado com base em métodos radiométricos, mas devido ao longo período de
semidesintegração e à sua baixa atividade especifica os métodos em questão são adequados apenas
para amostras com radioatividade elevada, como resíduos nucleares e amostras fortemente
contaminadas por atividades nucleares humanas. Este radioisótopo pode também ser analisado por
espectrometria de massa por plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) porém o limite de deteção deste
método é semelhante ao dos métodos radiométricos, tendo como desvantagem associada uma elevada
interferência do 129Xe. Assim os dois métodos que apresentam uma maior sensibilidade de análise do
129I são a análise por ativação de neutrões (NAA) e a análise por espectrometria de massa com
acelerador, sendo que o primeiro apresenta um limite de deteção de 10-10 para a razão 129I/127I e o
segundo de 10-14, respetivamente [14].
2.1.1.3 Iodo-125
O 125I possui um período de semidesintegração de 59,49 dias. O tempo de semidesintegração e a baixa
energia de emissão deste radioisótopo impedem a sua utilização com o propósito de diagnóstico como
radiofármaco sendo utilizado em ensaios biológicos in vitro ou em terapia (braquiterapia). Este
radionuclídeo é produzido em reatores através do decaimento do 125Xe e do 124Xe [28].
O decaimento do radionuclídeo em questão dá-se por captura eletrónica envolvendo uma emissão de
energia na ordem dos 35 keV e de energia β- num intervalo de energias entre os 4 keV e os 31 keV
(representado pela figura 3) [28].
Apesar de uma elevada absorção pelos tecidos associada à administração de 125I, segundo um estudo
de Riccabona, esta representa um terço da dose aquando comparada com a quantidade de 131I
Figura 3 – Esquema de decaimento 125I.
20
equivalente [16]. Desta forma estudos que pretendem avaliar a absorção de iodo pela tiróide, quando
efetuados com 125I em alternativa ao 131I irão representar uma redução significativa da dose
administrada [27].
Estudos efetuados com 125I apresentam ainda a vantagem de serem mais económicos do que os
realizados com 131I. Como o 125I apresenta um tempo médio de vida superior ao do 131I os estudos
realizados com este radioisótopo vão permitir uma avaliação a longo prazo da retenção do iodo pela
tiróide. O 125I é ainda mais fácil de armazenar e preparar do que o 131I [27].
2.1.1.4 Iodo-123
O radioisótopo 123I (representado pela figura 4) é produzido em ciclotrão e possui um período de
semidesintegração de 13,2 horas [38].
Este radionuclídeo tem sido utilizado em substituição do 131I em estudos cerebrais, renais, cardíacos e
da tiroide devido ao facto de possuir um período de semidesintegração mais curto, e uma emissão mais
reduzida de radiação , o que se traduz numa menor dose de radiação tanto para o doente como para
quem efetua o manuseamento do radioisótopo. Por outro lado, o facto de possuir uma emissão de
radiação muito reduzida e um curto período de semidesintegração dificulta o seu transporte e faz com
que não posso ser utilizado em alguns estudos [3].
Figura 4 – Esquema de decaimento 123I.
21
2.1 Anatomia e fisiologia da tiróide e hormonas tiróideias
A glândula tiróideia, o maior órgão endócrino do corpo humano, apresenta uma forma semelhante à de
uma borboleta. Esta é constituída por dois lóbulos ligados entre si por uma ponte de tecido tiróideu, o
istmo. A tiróide está localizada ao nível das vértebras C5-T1, os seus lóbulos encontram-se dispostos
lateralmente à metade superior da traqueia, imediatamente abaixo da laringe, e o istmo sobre a sua
face anterior [18] [19] [20].
Este órgão é bastante vascularizado sendo suprido pelas artérias tiróideias superior e inferior, e
drenado pelo plexo venoso tiróideu [19].
A glândula tiróideia é constituída por células foliculares e parafoliculares (representado pela figura 5).
As células foliculares delimitam um espaço interno, denominado lúmen que é constituído por uma
substância coloidal. Estas células são polarizadas, contém uma membrana basal próxima dos capilares
e uma membrana apical junto ao lúmen. As células foliculares conjuntamente com o lúmen constituem
o folículo tiróideu, é aqui que ocorre tanto a produção como o armazenamento das hormonas tiróideias.
As células parafoliculares encontram-se dispersas entre os folículos e as células que compõem as
paredes dos folículos, estas células são responsáveis pela segregação da calcitonina [18] [20] [21].
Figura 5 – Anatomia da tiróide – células foliculares e parafoliculares [18][20].
22
As hormonas T3 e T4 (representadas pela figura 6) constituem os principais produtos de secreção da
tiróide, 10% e 90% respetivamente. A TSH, produzida pela adeno-hipófise, é responsável pela síntese
das referidas hormonas [1].
A TSH é controlada pela tirotropina C (TRH), que vai induzir a produção da mesma pelas hormonas
tiróideias que vão inibir a produção tanto da TSH como da TRH. A produção das hormonas tiróideias
exige ainda a presença de um nível de concentração de iodo elevado [1].
O iodo é incorporado no organismo humano por inalação ou ingestão. A incorporação do iodo por
ingestão depende do tipo de alimentação. Após entrar no organismo o iodo é transformado em iodeto
sendo a sua passagem para o meio sistémico efetuada por uma rápida absorção no intestino delgado.
No plasma sanguíneo os iodetos são distribuídos, difundindo-se no interior de algumas células como
as hemácias. Da totalidade do iodo encontrado no sangue, cerca de 30% é captado pela tiróide e os
restantes 70% são eliminados pela urina [2].
O simporte de iodo e sódio NIS vai mediar o transporte de iodo para o interior das células foliculares.
A pedrina, um transportador de membrana apical, tem como função o transporte passivo de iodo para
o lúmen do folículo [1] [2].
Em seguida dá-se a síntese das hormonas tiróideias, com base nos seguintes processos:
Os I- são oxidados, formando iodo. Os átomos de iodo ligam-se a moléculas de tirosina da
tiroglobulina (Tg), o que resulta em Tg com tirosinas iodadas;
No folículo, duas moléculas de di-iodotirosina da tiroglobulina combinam-se para dar origem à
T4 , ou uma molécula de mono-iodo-tirosina combina-se com uma molécula de di-iodo-tirosina
dando origem a T3 [18].
Normalmente as hormonas T3 e T4 são transportadas através do sistema circulatório ligadas a proteínas
plasmáticas, aumentando muito a sua semivida biológica [1].
Figura 6 – Fórmulaestrutural das hormonas tiróideias T3 e T4.
23
As hormonas tiróideias interagem com os seus tecidos alvos através de uma rápida difusão da
membrana celular para o citoplasma. Uma vez no interior das células ligam-se às moléculas recetoras
do núcleo, interatuando com o ADN no núcleo e determinando a síntese de novas proteínas ao nível
dos genes reguladores. As proteínas produzidas nas células alvo vão mediar a resposta das células às
hormonas tiróideias [1].
As hormonas da tiróide afetam quase todos os tecidos do organismo, sendo intervenientes em
processos de metabolismo, crescimento e maturação. Desta forma verifica-se que o metabolismo basal
é influenciado pelo aumento ou diminuição das hormonas tiróideias, aumentando de 60% a 100%
quando o nível de hormonas é elevado e diminuindo quando o nível é baixo. Quando a concentração
é adequada ocorre um aumento do metabolismo da glicose, dos lípidos e das proteínas e consequente
diminuição dos níveis de colesterol. Há também um aumento da atividade da bomba permutadora de
Na+ e K+ que se vai traduzir num aumento da temperatura corporal. Alterações ao nível da produção
das hormonas tiróideias podem também alterar o número de mitocôndrias, assim como a sua atividade,
resultando num aumento de produção de calor e de ATP. O crescimento e maturação dos diversos
órgãos, como os ossos, cabelo, dentes, tecido conjuntivo e tecido nervoso, também dependem da
concentração das hormonas tiróideias [1].
2.2.1 NIS
O NIS (abreviatura do inglês Sodium iodide symporter) é uma glicoproteína com 643 aminoácidos,
localizada na membrana basolateral das células foliculares da tiróide que participa no sistema de
captação de iodo pela tiróide. O mecanismo de transporte deste simporte (representado pela figura 7)
consiste no transporte através da membrana celular de dois iões de sódio, a favor do gradiente, em
troca de um anião de iodo, contra o gradiente. Este mecanismo de troca só é mantido graças a um
transporte ativo secundário, o qual ocorre a favor do gradiente eletroquímico de Na+ gerado pela bomba
de sódio-pótassio Na+/K+ ATPase. Este passo é essencial para a síntese das hormonas tiróideias [23]
[24].
Figura 7 – Mecanismo de transporte do NIS – este mecanismo dá-se através do transporte de 2Na+ a favor do gradiente e de I- contra o gradiente [23].
24
A caracterização do NIS teve início em 1996 por clonagem do gene de rato. Posteriormente procedeu-
se à clonagem do gene humano. O NIS é constituído por 15 exons separados por 14 introns,
codificando, nos humanos um mRNA de 3.9 kb. A TSH estimula o processo de transcrição do NIS,
promovendo um aumento do nível de mRNA desta proteína. Estudos recentes demonstraram que esta
hormona não regula apenas a biossíntese e a transcrição do NIS, também regula a sua atividade pelo
mecanismo de regulação pós transcricional. Assim, na presença da TSH o NIS é ativado e desloca-se
para a membrana basolateral dos folículos, por outro lado, quando ocorre uma diminuição da
concentração de TSH a semivida da proteína NIS decresce deslocando-se da membrana plasmática
para os compartimentos intracelulares [26] [27] [30] [31].
Por outro lado, a TSH pode também ter um papel supressor sobre o NIS, através da diminuição da
transcrição e por uma diminuição da translação do PAX8 para o núcleo. Este comportamento é
autorregulatório, ocorrendo em resposta ao efeito de estimulação da THS sobre o NIS [30].
As citocinas, como por exemplo a proteína TGFβ1 - que controla a proliferação, diferenciação,
mobilidade e apoptose das células, vão reduzir o transporte de iodo, através da restrição da transcrição
da glicoproteína NIS. A Tg também está relacionada com a regulação da expressão de NIS, através da
fosforilação da TSH e da redução da expressão de fatores transcricionais [30] [33].
O iodo, quando se encontra em concentração elevada, também inibe tanto a expressão como a
atividade do NIS. No entanto, estudos demonstram que esta inibição não possui um efeito prolongado,
uma vez que a tiróide cria habituação ao excesso de iodo [33].
Para além dos tecidos tiróideus o NIS está também presente nas glândulas salivares, na mucosa
gástrica e nas glândulas mamárias [31].
2.2 Carcinoma da tiróide
Apesar de constituir apenas 1% das neoplasias malignas o CDT é a neoplasia mais frequente do
sistema endócrino. Nos últimos anos foi registada uma prevalência crescente a nível mundial desta
patologia (representado pelo gráfico 1). Este aumento deve-se principalmente ao avanço da tecnologia
que permitiu um diagnóstico em estádios precoces da doença [16].
Gráfico 1 – Incidência do carcinoma da tiroide entre 1992 e 2013
% de sobreviventes
5 anos
ANO
Nº
PO
R 1
00
,00
0
PE
SS
OA
S
Novos casos
Mortes
25
Em 2013 estimou-se a existência em Portugal de 500 novos casos anuais de CDT o que correspondeu
a cerca de 80 mortes. Um rastreio e diagnóstico correto desta doença têm um elevado impacto na
saúde pública [19].
A patogénese do carcinoma da tiróide relaciona-se com fatores ambientais, como a exposição a
radiação. Em 1990 foi verificado um aumento do número de crianças com cancro da tiróide na Ucrânia,
este aumento está provavelmente relacionado com o acidente de Chernobil. Diversos estudos
epidemiológicos indicam que este facto se deve essencialmente ao aumento da dose de 131I
proveniente do acidente [19] [26].
Estima-se uma necessidade diária de iodo de 100 μg para crianças entre 0 e 10 anos, em 150 μg para
adolescentes e adultos e entre 175 a 200 μg para mulheres grávidas e no período de aleitamento. Uma
dieta com uma baixa concentração de iodo pode induzir a proliferação de carcinoma da tiróide de
origem folicular. Esta doença tem uma maior prevalência nos indivíduos do sexo feminino sendo mais
frequente da 3ª à 7ª década de vida (representada pelo gráfico 2) [16] [19] [22].
Outra das causas envolvidas na génese dos carcinomas da tiróide são as mutações a nível do ADN.
Estas mutações ocorrem a nível dos oncogenes, genes responsáveis pelo crescimento e diferenciação
celular que promovem o crescimento e diferenciação das células cancerígenas. O carcinoma pode
promover alterações a nível dos genes supressores do tumor [28].
A CDT deriva normalmente do epitélio folicular, tendo apenas uma pequena percentagem de casos
origem nas células parafoliculares [19].
Gráfico 2 – Incidência do carcinoma da tiroide tendo em conta à faixa etária
26
Os carcinomas diferenciados da tiróide podem ser divididos em: papilares que correspondem
aproximadamente a 80% dos carcinomas da tiróide, foliculares que correspondem a 11% e carcinomas
do tipo Hurthle que correspondem a 3% [15] [23].
O carcinoma papilar é a neoplasia maligna mais frequente da tiróide. Pode ser classificado na sua
forma clássica, por uma forma papilar associada a pequenas calcificações concêntricas, corpos
psamomatosos. Mutações genéticas a nível de BRAF, RAS, RET/PTC e TRK estão associadas ao
carcinoma papilar [5].
A mutação de BRAF é a alteração genética mais comum neste tipo de carcinomas, tendo sido
identificado em 29% a 83% dos mesmos. Esta mutação caracteriza-se pela substituição da tirosina da
posição 1799 por adenina, o que vai resultar na substituição da valina por glutamato no resíduo 600
[38].
O carcinoma papilar é frequentemente multifocal e metastiza por via linfática para os gânglios regionais
cervicais e por via hematogénea para os pulmões, ossos e sistema nervoso central [5].
O carcinoma folicular caracteriza-se por uma arquitetura folicular, é encapsulado e pode apresentar
uma invasão da capsula ou dos vasos. Podem ocorrer mutações a nível de RAS, PAX8/PPAR-γ,
PIK3CA e PTEN [5].
O carcinoma folicular metastiza exclusivamente por via hematológica, para os ossos, pulmões e
sistema nervoso central, atingindo excecionalmente os gânglios linfáticos. A incidência desta patologia
tem diminuído, devido ao aumento de quantidade de iodo disponível [5].
A classificação do tumor de células de Hurthle é controversa. Alguns autores classificam-no como uma
variação do carcinoma folicular clássico mas outros consideram-no um tumor independente, com
padrões e comportamentos patológicos próprios [5] [28].
O carcinoma pouco diferenciado e o carcinoma anaplásico são os dois tipos mais raros de carcinoma
da tiróide. O carcinoma pouco diferenciado é caracterizado por uma situação intermédia entre as fases
mais diferenciadas, papilar e folicular, e a agressividade do carcinoma neoplásico. Por outro lado o
carcinoma neoplásico é extremamente agressivo e resulta da perda de diferenciação do carcinoma
diferenciado. Este carcinoma não possui os marcadores habituais da tiróide, nomeadamente
tiroglobulina ou fatores de transcrição da tiróide (TTF-1). Pode metastizar por via linfática ou
hematológica [5].
Por fim os carcinomas, bem diferenciado, bem diferenciado de potencial maligno incerto e folicular de
potencial maligno incerto são tumores que apresentam encapsulamento de arquitetura folicular mas
também apresentam células cujos núcleos possuem algumas características dos tumores papilares [5].
Estudos realizados em ratos demostraram que o tecido tumoral tiróideu apresenta uma diminuição da
captação de iodo quando comparado com os tecidos saudáveis adjacentes, tendo sido estimada uma
captação de 1% no tecido normal e 0,1% a 0,01% no tecido tumoral por grama de tecido [5] [13].
27
A recidiva do CDT pode ser dividida em: local, no leito tiróideu, loco-regional, relacionada com os
diversos compartimentos ganglionares envolvidos na drenagem linfática da glândula tiroideia, tecidos
moles do pescoço e vísceras do compartimento cervical, e sistémica ou à distância, que atinge
normalmente os pulmões, ossos e cérebro [5].
A incidência dos diversos tipos de recorrências dependem de fatores tais como: tipo de tratamento
realizado, variantes histológicas, grau de diferenciação e idade dos pacientes. A recidiva loco regional
é mais comum nos carcinomas papilares e a sistemática ocorre numa maior percentagem nos
carcinomas foliculares [5].
Nos casos de metastização à distância, após 10 anos, a taxa de sobrevivência é de 25 a 40 %, enquanto
para os doentes com carcinoma da tiróide em geral, após o mesmo período de tempo é de,
aproximadamente 85% [34].
Devido à elevada capacidade de armazenamento de iodo do CDT, face aos restantes carcinomas, este
apresenta uma capacidade de sobrevivência de 90% superior [3].
2.3.1 NIS – Mutações associadas ao carcinoma da tiróide
As alterações a nível da expressão do NIS, devido a uma diminuição de concentração de iodo
provocado pelo cancro da tiróide vão alterar a sua atividade.
Segundo a literatura a expressão do RNA mensageiro (RNAm) de NIS é reduzida nos tecidos tumorais
da tiróide quando comparados com tecidos saudáveis. Isto evidencia uma possível mutação a nível da
expressão genética que se vai manifestar através de uma alteração da transcrição do RNAm [32]
A alteração da expressão genética descrita está relacionada com a metilação do DNA. Este processo
dá-se através da ligação covalente de um grupo metil (CH3) ao carbono de posição 5 da citosina de
um dinucleotídeo CpG que se vai transformar em 5-metilcitosina [32]
O CpG, promotor da transcrição, ao sofrer uma metilação anula a expressão genética [36]
Alguns estudos demonstraram que em cerca 70% a 80% dos carcinomas da tiróide não existe uma
diminuição da expressão de NIS mas é alterada a sua localização, da membrana basolateral para o
citoplasma, inibindo a sua função de transportador [37]
Estas alterações de expressão e funcionamento do simporte provocam uma diminuição da captação
de iodo na terapia do carcinoma da tiróide [7].
2.3 Terapêutica do carcinoma da tiróide
Apesar de ser consensual que o tratamento do CDT se inicia pela tiroidectomia, existe ainda alguma
controvérsia. Desde 1982 que é debatida a vantagem da realização de tiroidectomia total, versus
formas menos extensas de tiroidectomia. Alguns estudos demonstram menores taxas de recorrência e
intervalos livres de doença mais longos em doentes que realizaram tiróidectomia total relativamente
28
aos que realizaram hemitiroidectomia. A tiroidectomia total permite ainda uma maior especificidade no
seguimento pelo doseamento de Tg [5] [39] [40].
A cirurgia dos gânglios, nos casos em que não se detetam adenopatias, também não é consensual. No
entanto é recomendado o esvaziamento ganglionar do compartimento central por rotina nos doentes
com carcinoma papilar da tiróide, pois a metastização destes gânglios é frequente e a sua deteção
clínica muitas vezes difícil. Quando existem metástases ganglionares nas cadeias jugulo-carotídeas
deve ser realizado um esvaziamento ganglionar cervical lateral [39].
O uso do iodo radioativo na terapia do cancro da tiróide representa um dos tratamentos mais eficazes
[17]. O 131I é o isótopo radioativo mais utilizado para esse efeito. As suas propriedades nucleares
(representadas pela figura 8), assim como a sua disponibilidade, são algumas das razões pelas quais
este composto é amplamente utilizado no diagnóstico (rastreio da concentração de tiroxina e avaliação
da curva latente de absorção do iodo) e no tratamento do carcinoma da tiróide. O 123I e o 124I, com
períodos de semidesintegração mais curtos, provocam menos efeitos colaterais em diagnóstico, mas
devido às suas propriedades nucleares não são adequados para tratamento [4] [5].
O facto do tratamento com iodo radioativo ser considerado a terapêutica mais eficaz do carcinoma da
tiróide, prende-se com o pressuposto de as células da tiróideias serem sensíveis aos efeitos da
radiação. Este pressuposto advém do facto dos tecidos da tiróide serem dos tecidos com maior
probabilidade de desenvolverem carcinoma radio induzido. Porém o conceito de radiossensibilidade e
a capacidade de causar morte celular pela exposição à radiação são distintos. O emprego do 131I na
terapia do carcinoma da tiróide baseia-se ainda no fato da maioria das células neoplásicas manterem,
pelo menos parcialmente, a capacidade de captarem iodo através do NIS [6] [25].
A utilização e eficácia da terapia com 131I depende do maior ou menor grau de diferenciação do tumor
e da histologia do mesmo, uma vez que a terapia em questão está relacionada com capacidade de
retenção e organificação do iodo pelas células neoplásicas. Os carcinomas foliculares apresentam uma
maior sensibilidade ao 131I face aos carcinomas papilares. Os carcinomas de Hurthle, por sua vez, não
apresentam sensibilidade ao iodo [5].
Figura 8 – Esquema de decaimento do 131I – as partículas β- são uteis para terapêutica e a radiação γ no diagnóstico.
29
A administração de 131I pode ser efetuada como:
principal método de tratamento, quando o objetivo é, através da administração do iodo
radioativo destruir a doença macroscópica ativa. Este tipo de tratamento visa um pequeno
número de pacientes, que representa maioritariamente a pequena fração de doentes que
morrem devido à doença.
ablação, que vai permitir a eliminação de focos neoplásicos microscópicos que não foram
recetáveis pela cirurgia, vai facilitar a deteção de recidiva local pela cintigrafia com iodo (uma
vez que eliminados os restos tiróideus, qualquer nova fixação representa recidiva)
aumentando a especificidade do seguimento com Tg. Este tipo de tratamento é realizado pela
maioria dos doentes, nestes casos, a razão risco/beneficio nem sempre é fácil de definir.
Existindo inclusivamente estudos que indicam que a terapia de ablação não aumenta a
esperança de vida de doentes com baixo risco [17] [26] [39].
Segundo American Thyroid Association não são indicados para terapia de ablação os pacientes com
carcinomas de pequenas dimensões (papilares <1 cm e foliculares ou de células Hurthle <2cm),
carcinomas intratiroidais sem evidência de nódulos, invasão vascular ou com um nível de tiroglubolina
pós cirúrgica baixa, ou papilomas multifocais sem outros fatores de risco. Apesar desta guideline, existe
um grande grupo de doentes para os quais não é clara, a indicação ou não de terapia com iodo
radioativo [17] [26].
Apesar da maioria dos tumores manter alguma capacidade de concentrar iodo, a sua captação, como
já foi referida, é diminuta, quando comparada as células tiróideias saudáveis. A eficácia desta terapia
depende assim, entre outros fatores, do nível da TSH, sendo mais eficaz para níveis mais elevados da
hormona. Valores ≥ 30 mU/L aumentam a expressão da glicoproteína NIS, otimizando assim a terapia
radioativa [18] [24] [36].
A literatura define um período de 4 a 6 semanas após a tiroidectomia para que seja atingido o valor
máximo de TSH. Porém, um estudo de Grigsby et al, demonstrou que este valor pode ser atingido num
período de 2 a 3 semanas. Em casos de insuficiência hipofisária é por vezes administrada rh TSH [5]
[18] [23] [39].
Se o doente estiver a realizar medicação com levotiroxina, esta deve ser suspensa antes da cintigrafia
ou tratamento com 131I, de forma a permitir a subida dos níveis de TSH e consequentemente a fixação
do iodo pelo tecido tiróideu. Em mulheres em idade fértil é necessário excluir a gravidez antes da
administração de iodo radioativo, assim como o aleitamento. Aconselha-se ainda a instituição de uma
dieta pobre em iodo antes da administração do radiofármaco. A administração de laxantes permite
acelerar o trânsito intestinal, o que diminui a dose de radiação administrada e simplifica a interpretação
da imagem, a ingestão de volumes elevados de líquidos e as micções frequentes reduzem a radiação
vesical [25] [39].
A radiação administrada produz um efeito radiotóxico podendo induzir efeitos colaterais como, náuseas,
vómitos, sialoadenite, xerostomia, perda de paladar, depressão transitória de medula óssea, e
neoplasias secundárias, como linfomas, leucemias ou sarcomas [5] [39] [43].
30
As abordagens para o cálculo da dose de iodo a administrar são variadas, porém o objetivo é minimizar
a toxicidade mantendo uma taxa razoável de sucesso da terapêutica [17].
Normalmente os tecidos cancerígenos mantem alguma capacidade de absorção de iodo. Porém 15 a
20% dos casos perde esta propriedade em consequência de uma diminuição da expressão genética
envolvida no metabolismo do iodo. Assim, mesmo maximizando a concentração de 131I alguns doentes
não conseguem efetuar o controlo do tumor através de terapia com iodo radioativo. Diz-se que estes
doentes sofrem de doença refratária ao iodo.
Tradicionalmente realiza-se uma cintigrafia com 131I cerca de 6 a 12 meses após a administração da
dose ablativa de iodo para confirmar a eliminação de restos tiróideus. Após a obtenção de uma
cintigrafia radioativa negativa e Tg indoseável, não é necessário efetuar mais cintigrafias, se não houver
novos indícios de desenvolvimento da doença [39].
A ecografia cervical tem uma importância significativa no seguimento de doentes. O diagnóstico de
adenopatias metastáticas ganglionares muitas vezes não é conseguido por cintigrafia dada a baixa
concentração de iodo e as reduzidas dimensões desses gânglios. Assim sendo, o método de eleição
para o diagnóstico das recidivas adenopáticas cervicais é a ecografia, pois permite a distinção dos
gânglios com poucos milímetros de diâmetro [5] [39].
As metástases pulmonares não são frequentemente detetadas através da radiografia ao tórax. Nestes
casos as metástases poderão ser pesquisadas com auxílio da tomografia computorizada ou da
ressonância magnética [39].
Estudos demonstram que a utilização de 18FDG conjuntamente com 131I permitem uma deteção de
metástases ou de recidiva de carcinoma da tiróide com uma sensibilidade de 95% [42].
Em caso de persistência de doença ou recidiva o tratamento de eleição é a cirurgia. Quando esta não
é possível e existe tecido fixante de iodo radioativo é aconselhada a sua administração. Se não for
possível a fixação de iodo pode ser realizada radioterapia [39].
31
2.4 Contador gama
Os contadores gama permitem contabilizar a atividade de uma determinada amostra com base nas
suas propriedades radioativas. A atividade de uma amostra (A) depende da probabilidade por unidade
de tempo de um dado nuclídeo decair, constante de decaimento (λ) e do número de nuclídeos
radioativos na amostra (N), assim
A constante de decaimento, depende, por sua vez do período de semidesintegração (𝑡1 2⁄ ) que é
definido como o tempo necessário para o decaimento de metade dos átomos radioativos presentes na
amostra.
𝑡1 2⁄ =𝐿𝑛[2]
𝜆
(2)
Cada radioisótopo, isótopo que apresenta um núcleo atómico instável e que emite energia quando se
transforma num isótopo estável, possui um tempo de semidesintegração característico [41].
O contador utilizado nesta dissertação é designado em algumas publicações como contador Well
(representado pela figura 9), devido a sua forma que se assemelha a um poço. Estes contadores
altamente sensíveis, são comumente utilizados na contagem de amostras radioativas como sangue e
urina, permitindo que seja efetuada a contagem de várias amostras em simultâneo [43].
Os contadores em questão são constituídos não só por um detetor de cintilação, mas também por um
fotomultiplicador, por um pré-amplificador, um amplificador, um pulse height analyzer e por um
temporizador (representado pela figura 11). Este sistema está ainda ligado a um computador que vai
possibilitar a visualização dos resultados referentes as medições efetuadas [44] [45].
Os detetores de cintilação destes contadores são constituídos por materiais inorgânicos, mais
especificamente sólidos cristalinos de halogénio, NaI, aos quais são acrescentados impurezas,
normalmente de tálio. Os detetores por cintilação caracterizam-se pela sua capacidade de converter a
𝐴 = λN
(1)
Figura 9 – Contador gama visto de lado e de topo (à esquerda) e esquema representativo da emissão da amostra (à direita) [44].
32
energia das partículas incidentes no detetor em energia luminosa, fotões. A adição de impurezas a NaI
vai aumentar a probabilidade de emissão de fotões e reduzir a auto absorção da luz [44] [45].
Ao darem entrada no contador os fotões vão sofrer um grande número de interações com o material
do detetor, o que vai resultar na excitação dos átomos que o constituem. A radiação vai interagir com
a material através do efeito fotoelétrico, efeito de Compton e produção de pares [45].
No efeito fotoelétrico toda a energia do fotão incidente (hv) é transferida para um eletrão que se
encontre perto do núcleo do átomo, normalmente nas orbitais K e L. O eletrão em questão vai então
ser ejetado com uma energia cinética (E),
𝐸 = ℎ𝑣 − 𝐼
(3)
que corresponde à energia do fotão incidente (ℎ𝑣) menos a energia necessária para quebrar a ligação
entre o eletrão e o átomo (I) [45].
Se o fotão incidente possuir uma energia inferior à necessária para quebrar a ligação entre o eletrão e
o átomo não vai ocorrer efeito fotoelétrico. Por outro lado quanto mais elevado Z maior a probabilidade
de ocorrência do referido efeito [44] [45].
O efeito de Compton pode ser descrito como a transferência de energia de apenas uma parte do fotão
ao eletrão. A restante energia transforma-se num novo fotão , com uma energia inferior ao primeiro. A
probabilidade de ocorrência do efeito de Compton aumenta com o aumento de Z e diminui com o
aumento da energia incidente [45].
O efeito de produção de pares descreve a transformação de um fotão num eletrão e num positrão
[45].
Os átomos excitados vão emitir luz visível, em forma de fotão, quando a perda de energia do eletrão
(representado pelo gráfico 3).
Gráfico 3 – Esquema representativo da emissão de luz pelos átomos – ao receberem energia os eletrões passam para um estado excitado, ao perderem essa energia, em forma de fotão, voltam ao estado fundamental [45].
33
A energia resultante desta emissão, que se traduz em forma de fotão, vai passar pelo fotomultiplicador
que é constituído por um fotocátodo, por vários dínodos e por um ânodo (representado pela figura 10).
A função do fotomultiplicador é a multiplicação do número de eletrões produzidos [45].
No fotocátodo os fotões resultantes da interação da radiação com a matéria vão ser primeiramente
transformados em fotoeletrões por meio do efeito fotoelétrico, sendo posteriormente acelerados, devido
a uma alta tensão, aproximadamente de 1000 V, aplicada repartidamente pelos dínodos, entre o
fotocátodo e o ânodo. O fotoeletrão incidente no primeiro dínodo vai possibilitar a emissão de vários
eletrões secundários, que vão sofrer posteriormente, acelerações e multiplicações ao longo dos vários
dínodos. Este processo vai permitir a produção de um pulso com uma intensidade que varia entre 105
a 108 eletrões, que vão ser encaminhados para o cátodo. A amplitude do pulso é proporcional ao
número de fotões recebidos pelo fotocátodo e por consequência à energia de radiação incidente no
detetor [38] [46] [47].
O pulso gerado no fotomultiplicador possui uma pequena amplitude. Assim a energia criada pela
interação da radiação com o detetor vai ser captada e amplificada pelo pré-amplificador. Este
dispositivo vai permitir estabelecer a ligação entre a alta impedância do detetor e a baixa impedância
associada aos subsequentes circuitos [38] [45].
Posteriormente o sinal vai passar pelo amplificador linear, que vai estabelecer a ligação entre o pré
amplificador e o pulse height analyzer. A amplificação do pulso vai ser então determinada pelo ganho
do amplificador A, sendo expressa pela proporção entre o sinal de saída vi(t), e o sinal de entrada v0(t).
Figura 10 – Esquema representativo do fotomultiplicador – interação dos fotoeletrões com os dínodos [45].
34
A intensidade do sinal resultante é o proporcional aos fotões incidentes. O pulse height analyzer é o
dispositivo que vai pré selecionar um intervalo de tensão, contando apenas os impulsos que se
encontram dentro do intervalo selecionado [38].
As medições efetuadas pelos contadores gama são expressas em contagens por minuto (cpm), cada
contagem representa a interação de um raio com os cristais do detetor [48].
Os contadores em questão foram desenhados de forma a que os detetores envolvam a fonte quase
por completo. Esta configuração vai permitir maximizar a eficiência da deteção. Apesar disto, se a
amostra não for colocada corretamente no detetor a eficiência global irá diminuir significativamente,
assim o volume da amostra vai influenciar a eficiência da deteção na medida que, quanto maior o
volume da mesma menor a percentagem de radiação emitida que interage com o detetor. Isto ocorre
devido ao ângulo sólido, que se relaciona com a quantidade de fotões emitidos que vão ser detetados
pelo detetor, o que é determinado pela distância entre a fonte e o detetor [38] [49].
Desta forma, uma vez que as medições efetuadas pelo contador são fortemente dependentes da
geometria da amostra, as mesmas devem ser efetuadas tendo em conta um volume de 1 mL [50].
Uma vez que as amostras que são medidas por estes contadores possuem uma baixa atividade, de
forma a reduzir o fundo, os contadores são revestido por chumbo, o que vai limitar a deteção de raios
Figura 11 – Esquema representativo do contador gama – os fotões resultantes da energia incidente no material cintilador do detetor vão passar pelo fotomultiplicador formando um pulso proporcional à mesma [45].
35
cósmicos, radioatividade natural, ou radiação da sala de trabalho. Outra forma utilizada para limitar o
mesmo é efetuar medições de apenas 1 minuto [34]
Devido a sua alta sensibilidade esta técnica deve ser usada em contagens apenas até cerca de 37 kBq,
sendo que para valores mais elevados as medições se tornam imprecisas devido ao aumento do tempo
morto. O tempo morto pode ser definido como o tempo que cada detetor demora a processar a
informação respetiva a contagem, durante este tempo de processamento do mesmo, o detetor
permanece como “insensível’’, desta forma a radiação incidente durante este período não irá ser
contabilizada [49] [51].
2.5 µ-AMS
A técnica de µ-AMS advém da junção das técnicas espectrometria de massa de iões secundários
(SIMS) e espectrometria de massa com acelerador (AMS), e tem como objetivo a combinação das
vantagens das duas técnicas pré-existentes [35].
A técnica de SIMS (representada pela figura 12) baseia-se no bombardeamento com um feixe primário,
constituído por iões negativos, como no caso do oxigénio, ou positivos, como no caso do césio, na
superfície de um determinado material. Da interação do feixe primário com a amostra, vai resultar um
feixe secundário que vai ser acelerado, a uma energia entre 1 keV a 10 keV. Este feixe sofre
posteriormente uma analise electroestática e magnética, o que vai permitir uma focagem e uma
deflexão do mesmo, assim como, uma separação das partículas com base na sua massa, carga e
energia. Por fim, o feixe chega ao detetor que vai efetuar uma medição de massa [35].
Esta técnica possibilita uma analise não só da superfície da amostra, mas também em profundidade,
conseguida através da penetração do feixe primário na mesma. Esta caracteriza-se por uma
Figura 12 – Esquema representativo do equipamento de SIMS.
36
capacidade de focagem do feixe secundário até aos nanômetros e por um limite de deteção na escala
de sub-ppb (parts per billion) [52].
Porém, uma vez que a análise efetuada se prende com a massa das partículas, quando estas possuem
a mesma energia, a mesma carga e a mesma massa, o sistema não possui a capacidade de as
destrinçar. Estas interferências de massa prendem-se ou com o facto de existirem duas moléculas
diferentes com a mesma massa, ou um ião e uma molécula com a mesma massa, ou com a existência
de isóbaros, isótopos que pertencem a elementos diferentes, mas que possuem a mesma massa. A
técnica de AMS (representada pela figura 13) vem então permitir resolver estas interferências, através
do uso de um acelerador [35].
No sistema de AMS um feixe de iões primários positivos vai provocar a emissão de um feixe de iões
secundários, estes vão sofrer posteriormente, à semelhança do que ocorre na técnica de SIMS, uma
análise electroestática e magnética. Após este processo o feixe vai então ser injetado num acelerador,
que contém no seu centro um canal, canal de stripping, este está preenchido por um gás, normalmente
árgon. Ao darem entrada nesse canal, os iões vão interagirem com o gás, perdendo os eletrões das
orbitais externas o que vai provocar uma alteração de polaridade do feixe. Este processo vai permitir
ainda a desagregação de moléculas existentes no feixe, resolvendo assim as interferências
moleculares do mesmo. Posteriormente o feixe positivo é então acelerado e encaminhado até um
sistema de detetores que vai permitir resolver as interferências isobáricas [35].
O limite de deteção desta técnica pode ser definido como a razão isotópica mínima entre um elemento
abundante e o elemento traço na amostra. No caso do 129I/127I é apresentado na literatura limites de
deteção variantes entre 10-11 a 10-14 [2] [11] [10].
Assim, devido à sua elevada sensibilidade, o equipamento de AMS permite, por oposição por exemplo
ao contador gama, o estudo de amostras muito pequenas e a administração de doses muito reduzidas
Figura 13 – Esquema representativo do equipamento de AMS [35].
37
as mesmas, evitando assim efeitos nocivos para as entidades biológicas e permitindo uma análise
realista dos efeitos recorrentes das mesmas. No caso de necessidade de recolha de amostras
biológicas, permite, muitas vezes, que estas sejam recolhidas a partir de procedimentos não invasivos,
uma vez que é necessário muito menos material [11] [57].
Para além disso, uma vez que a técnica em questão se baseia na medição de razões isotópicas e não
no decaimento de radionuclídeos, esta não vai restringir o estudo a elementos que contenham
decaimento gama, nem a radioisótopos com curtos tempos de desintegração. Estas características vão
sujeitar tanto a amostra como o utilizador da mesma, a uma dose de radiação muito menor que a
utilizada por exemplo pelo contador gama.
Apesar destas vantagens a técnica de AMS não pode ser usada para análises espaciais e em
profundidade, pois, de forma a otimizar a corrente do feixe, este vai ser mais largo sendo portanto
menos penetrante que o obtido pela técnica SIMS, e a amostra é sujeita a um tratamento complexo, o
que vai destruir a sua matriz original [35] [55].
A técnica de µ-AMS através da junção de uma câmara de amostras de SIMS a uma linha de AMS, veio
então, por um lado permitir a análise da amostra em profundidade, com pouco ou nenhum tratamento
da mesma, e por outro resolver os limites de deteção associados as interferências inerentes ao sistema
SIMS [35] [55].
A diferença entre as técnicas de AMS e µ-AMS reside então no facto de a técnica de µ-AMS possuir
uma capacidade maior de focagem do feixe, o que se traduz numa corrente secundária menos intensa
e consequentemente numa menor sensibilidade de deteção, inferior até 3 ordens de magnitude. E no
tratamento necessário à amostra, que é muito menor, ou mesmo nulo, quando utilizada a técnica de µ-
AMS [35] [55].
A técnica de µ-AMS é constituída por várias componentes, sendo que os mesmos se encontram em
alto vácuo:
uma fonte de iões;
uma câmara de amostras;
por um sistema de transporte do feixe, constituído por dois magnetos, e por alguns
componentes eletromagnéticos de focagem e deflexão. Este sistema tem cerca de 30m
e divide-se em sistema de baixa energia, antes da passagem do feixe pelo acelerador,
uma vez que a ordem de energias é de 10keV e sistema de alta energia, após a
passagem do feixe pelo acelerador;
um acelerador Tandem;
uma câmara de detetores [35].
Os elementos referidos apresentam-se descritos abaixo.
2.6.1 Fonte iónica e câmara de amostras
38
A análise de µ-AMS inicia-se com a produção de um feixe negativo a partir da amostra em estudo, este
feixe é criado pelo processo de sputtering. O sputtering, na técnica de µ-AMS (representado pela figura
14), consiste no bombardeamento da amostra, com um feixe de iões, normalmente de Cs, que vai
produzir uma cascata de colisões com os átomos da estrutura a analisar, causando a ejeção de
partículas [40].
O feixe de iões de Cs é produzido através de Cs metálico. Este é armazenado num reservatório
(representado pela figura 15), dando-se a sua gaseificação quando é aquecido a uma temperatura de
aproximadamente 220ºC. Posteriormente o Cs dá entrada no tubo de ionização (representado pela
figura 15) onde vai ser aquecido até 1100ºC, sofrendo consequentemente ionização. O Cs é extraído
a uma tensão de -5,6 kV [16].
Figura 14 – Processo de sputtering – o feixe primário de Cs+ ao embater na amostra vai causar a injeção de partículas.
Figura 15 – Fonte de iões – onde estão localizados o reservatório e o ionizador.
39
Assim, o feixe de Cs carregado positivamente, após sofrer um ajustamento de trajetória por 4 pratos
semicilíndricos deflectores, de ser sujeito a um dos 12 colimadores do revólver de colimação e de ser
focado por um sistema de lentes, vai dar entrada na câmara de amostras, onde ocorre o sputtering [35].
A câmara de amostras (representada pelo nº4 da figura 16) é constituída pelo bloco extrator e pelo
suporte de amostras. O suporte de amostras está ligado a um sistema que vai permitir movimentar a
amostra em 3 dimensões espaciais, numa escala de no mínimo meio micrómetro (representado pelo
nº1 e 5 da figura 16). Esta câmara está ainda conectada a um sistema de vácuo, este é constituído por
um conjunto de válvulas (representadas pelo nº 3 da figura 16) que vão assegurar a presença do
mesmo no sistema e por uma câmara que vai permitir uma rápida troca das amostras (representada
pelo nº 2 da figura 16) sem a perda significativa do mesmo. A pressão nesta câmara é de 10-2mbar
enquanto que na câmara de amostras é normalmente 3x10-7mbar e 1x10-6mbar aquando a sua
utilização [35].
O bloco extrator é constituído por dois pequenos cilindros, o primeiro, por onde dá entrada o feixe
primário, contém a lente de Einzel primária que vai efetuar uma focagem do feixe, o segundo, que se
encontra colocado com um ângulo de 45º relativamente ao primeiro, funciona como canal de saída do
feixe secundário. O alvo encontra-se no ponto geométrico onde estes dois tubos se intersectam [35].
O alvo é polarizado com uma tensão de -10kV, o que vai permitir acelerar o feixe secundário no sentido
do sistema, conferindo ainda ao feixe uma energia de 10keV [35].
O processo de sputtering depende da energia dos iões incidentes, do ângulo de incidência e do material
do alvo. Este fenómeno de bombardeamento engloba dois tipos de processos: nucleares e eletrónicos.
O processo nuclear relaciona-se com a interação elástica entre os iões injetados e os átomos da
amostra e o processo eletrónico envolve excitação, aceleração e transferência de carga. O sputtering
1 2
3
3
4 5
Figura 16 – Braço metálico que permite a passagem da amostra da câmara de troca amostras para a câmara de amostras e vice versa (1), camara de troca amostras (2), válvulas que vão permitir manter o vácuo nas câmaras referidas (3), câmara de
amostras (4) e sistema de movimentação de amostras (5).
40
pela técnica µ-AMS, efetua-se normalmente mediante uma energia de partículas incidentes na ordem
dos 10keV, sendo então predominante o processo nuclear [18] [5] [35].
O processo nuclear está intimamente ligado ao conceito de colisão em cascata. Este fenómeno envolve
a transferência de energia e do momento das partículas incidentes para o material da amostra, através
de consecutivas colisões energéticas binárias. A emissão das partículas à superfície acontece quando
a energia recebida, através das colisões em cascata, pelas partículas da sua vizinhança, é suficiente
para quebrar a energia de ligação à superfície [35].
As partículas ejetadas com uma carga negativa são denominadas como iões secundários e vão, após
saírem do segundo cilindro do bloco extrator, formar o feixe que vai ser analisado durante todo o
sistema [52].
2.6.2 Sistema de transporte do feixe de baixa energia
Após ser gerado no alvo, o feixe de iões secundários dá entrada no sistema de transporte de baixa
energia. Este sistema efetua o transporte do feixe com uma energia de cerca de 10 keV, desde a
câmara de amostras até ao acelerador Tandem [35].
Durante este processo o feixe sofre uma análise magnética e electroestática, conseguida através da
passagem por vários dispositivos, que se apresentam descritos abaixo. O ajuste dos mesmos vai
permitir uma otimização do feixe.
Ao dar entrada no sistema o feixe vai passar pela lente Einzel secundária, esta encontra-se
imediatamente a seguir ao bloco extrator e vai efetuar a focagem do feixe. Posteriormente o mesmo
vai ser medido por um conjunto de Faraday Cups (FC’s) e “slits”. As FC’s e “slits” aparecem sempre
acopladas, estas efetuam a medição da corrente das partículas carregadas, até um mínimo de 3 pA,
através da colisão com uma estrutura metálica em forma de copo. Estes dispositivos vão permitir
verificar os ajustes efetuados no feixe, através da otimização dos dispositivos de focagem e deflexão.
As FC’s e as slits são introduzidas não só no sistema de baixa energia, mas também no de alta energia.
No sistema de baixa energia pode verificar-se a existência das mesmas após a lente Einzel secundária,
após a LE ESA e à saída do magneto [35].
Após ser medido pela FC o feixe é encaminhado para a LE ESA (representada pelo nº6 da figura 17).
Esta pode ser descrita como um tubo com uma curvatura de 45º que contém dois pratos curvos, por
dentro dos quais passa o feixe. A ESA vai permite tanto uma focagem, na horizontal e na vertical, como
uma deflexão do feixe. Este dispositivo possui ainda a particularidade de permitir a separação dos iões
com base na sua energia. O funcionamento das ESAs dá-se devido à criação de um campo eletrostático
𝜀 entre os dois pratos constituintes do dispositivo, que estão separados entre si por uma distância d.
Através da aplicação de uma tensão com polaridade oposta a ambos os pratos é criada uma diferença
de potencial ∆𝑉.
Assim um ião que passe pelo campo eletrostático criado irá possuir uma força centrípeta �⃗� a agir sobre
o mesmo
41
𝐹 = 𝑞𝜀
(4)
onde,
𝑞𝜀 = 2 𝐸 𝑟.⁄
(5)
Sendo a trajetória circular do ião no interior da ESA dada através do raio 𝑟 da mesma pela seguinte
expressão
𝑅 =2𝐸𝑑
𝑞∆𝑉=
𝐸
𝑞
2𝑑
∆𝑉
(6)
Os iões com o mesmo valor de 𝐸 𝑞⁄ seguem trajetórias concêntricos no interior da ESA enquanto que
iões com diferentes valores irão consequentemente seguir trajetórias com r diferentes [35].
Após sofrer uma focagem e uma deflexão pela ESA, o feixe é novamente medido por uma FC
(representada pelo nº7 da figura 17) seguindo posteriormente até aos pratos deflectores X e Y que vão
permitir uma nova deflexão do feixe. Posteriormente o feixe é então encaminhado para um magneto de
90º (representado pelo nº8 da figura 17), este possui 30 cm de raio e vai exercer um campo magnético
de forma a efetuar uma seleção de massa [35].
Após a uma nova medição do feixe, as partículas negativas que sofram de interferências quer
isobáricas quer moleculares vão sofrer uma injeção no acelerador Tandem [35] [53].
6
7 8
Figura 17 – LE ESA (6), FC (7) e magneto de baixa energia (8).
42
No caso do estudo da razão 129I/ 127I, a corrente de 127I vai ser medida pela FC que se encontra a seguir
ao magneto. O feixe de 127I, uma vez que o 129I só vai ser medido no detetor, vai ser utilizado de forma
a otimizar o sistema [11].
2.6.3 Acelerador Tandem
O sistema de µ-AMS em questão é composto por um acelerador Tandem de 3 MV [35].
Ao dar entrada no acelerador o feixe de iões vai sofrer uma mudança de polaridade, sendo
posteriormente acelerado. O acelerador Tandem só permite a aceleração de feixes negativos, o que
pode ser considerado uma desvantagem inerente à técnica de µ-AMS uma vez que não permite o
estudo de elementos que não formem iões negativos. Porém, esta característica está associada
também a algumas vantagens, como no caso do estudo do 129I, uma vez que o único isótopo estável
com massa 129 é o 129Xe, como este isótopo não forma iões negativos, não existem interferências
isobáricas no estudo do 129I [35] [8] [40].
A mudança de polaridade do feixe ocorre através de um processo denominado por stripping, este é o
processo físico pelo qual os eletrões das orbitais externas dos iões são removidos, alterando a sua
polaridade. Este processo resulta da interação dos iões do feixe secundário com árgon, num canal no
centro do acelerador, canal de stripping [35].
Esta mudança de polaridade vai ainda alterar a energia das partículas, assim a energia das partículas
após sofrerem o processo de stripping é dada pela seguinte fórmula,
𝐸 = 𝐸𝑖 + (𝑞 + 1)𝑉𝑡
(7)
onde E corresponde à energia das partículas à saída do acelerador, 𝐸𝑖 corresponde à energia das
partículas antes do acelerador, 10 kV, q corresponde a carga das partículas e Vt corresponde a tensão
aplicada pelo acelerador, 3 MV.
O estado de carga dos iões após o canal de stripping depende do tipo de gás e da pressão e tensão
terminal do acelerador. Outra particularidade desde processo é o facto de provocar instabilidade
molecular, permitindo a dissociação das moléculas e consequentemente a resolução deste tipo de
interferências, apresentando-se como uma vantagem relativamente a técnica de SIMS.
2.6.4 Sistema de transporte do feixe de alta energia
Após passar pelo acelerador o feixe de iões é monoatómico, com estados de carga positivos [35] [53].
Posteriormente à ação do acelerador, o feixe vai ser sujeito a uma nova análise electroestática e
magnética, conseguida através da passagem por vários dispositivos, à semelhança do que aconteceu
no sistema de baixa energia [2].
Assim, ao dar entrada no sistema o feixe vai em primeiro lugar sofrer uma medição através de uma FC
(representado pelo nº9 da figura 18), sendo posteriormente encaminhado para o magneto
43
(representado pelo nº10 da figura 18). O magneto de alta energia possui um raio de 1,3 m, este vai
efetuar uma seleção não só de massa, mas também de energia. Esta seleção pode ser demostrada
através das seguintes equações
𝐸𝑐 = 1
2𝑚𝑣2
(8)
𝐵 =𝑚𝑣
𝑞𝑟
(9)
onde E representa a energia das partículas, m representa a massa das partículas, 𝑣 a velocidade, B
representa o campo magnético imposto, q a carga, e r o raio do magneto.
Posteriormente o feixe irá ser sujeito a duas FCs, uma delas, designada por fora-de-eixo, precisamente
por estar fora do eixo do feixe, vai medir o isótopo com a corrente mais intensa, ou seja o elemento
mais abundante, neste caso o 127I. Este elemento não será medido no detetor de partículas, pois iria
causar a destruição do mesmo. A FC onde vai ser medido o 129I, encontra-se na câmara de detetores
e possui a particularidade de ser constituída por um anel polarizado que irá permitir a minimização da
perda de eletrões secundários [35].
Após a passagem pelas FCs o feixe irá passar então por um par de ESAs (representado pelo nº11da
figura 18) com 3 m de raio e com uma curvatura de 22,5º, cujo funcionamento é semelhante às que se
encontram no sistema de baixa energia. De forma a corrigir pequenos desalinhamentos do feixe são
colocados quadruples eletrostáticos entre o conjunto de ESAs [35].
2.6.5 Detetores
O sistema de transporte de alta energia vai encaminhar o feixe até ao sistema de deteção, que é
constituído por duas câmaras distintas [35].
Figura 18 – FC (9), magneto de alta energia (10) e ESAs (11).
44
A primeira câmara encontra-se em vácuo, assim como o resto do sistema, e é constituída por uma FC,
um ETP, utilizado se a corrente do feixe for inferior a 1pA, e um detetor de partículas PIPs que permite
não só a contagem como também a medição da energia das partículas. O feixe quando dá entrada no
sistema de detetores pode então seguir para cada um destes dispositivos ou seguir em frente para a
segunda câmara. Quando não existem interferências isobáricas é usada apenas a primeira câmara.
Neste caso, como já foi descrito, o único isóbaro do 129I é o 129Xe e uma vez que este não forma iões
negativos pelo processo de sputtering não vão existir interferências isobáricas na amostra, o que faz
com que o 129I possa ser contabilizado pelo sistema PIPS [35].
A segunda câmara, denominada por detetor E, ΔE, é uma câmara de ionização constituída por três
ânodos, por um cátodo e por um detetor PIPS, o seu interior é preenchido pela mistura de dois gases,
árgon e metano, encontrando-se assim à pressão entre 100 e 1000 mbar. Esta câmara vai permitir
resolver tanto as interferências moleculares que não foram eliminadas pelo canal de stripping, como as
interferências isobáricas que foram seguindo por todo o sistema. A impossibilidade da resolução das
interferências isobáricas pelo sistema reside no facto das partículas em questão possuírem a mesma
massa, o mesmo estado de carga e a mesma energia o que explica que estas não sejam diferenciadas
nem pelas ESAs, nem pelo magneto, nem pelo detetor PIPS [35].
Assim, no caso do feixe em questão ser constituído por partículas que permitam a existência de
interferências isobáricas, este vai dar entrada, com uma determinada energia cinética, na segunda
câmara através da passagem por uma placa de nitreto de silício com 300 nm. Quando as partículas
carregadas dão entrada na câmara vão interagir com uma mistura de gases que estão no seu interior,
normalmente Árgon e Metano, estas interações vão fazer com que os eletrões constituintes do gás
fiquem num estado excitado, podendo mesmo ser removidos do átomo. A energia adquirida por esses
eletrões vai ser subtraída a energia inicial das partículas incidentes, o resultado das consecutivas
interações sofridas pelos eletrões/partículas é a perda de energia pelas partículas, o que faz com que
estas acabem por parar [35].
O poder de paragem de uma partícula carregada, S traduz-se na perda de energia da mesma, dE, ao
longo de um percurso dx. Esta pode ser dada pela seguinte expressão,
𝑆 =𝑑𝐸
𝑑𝑥=
4𝜋𝑒4 𝑧2
𝑚0𝑣2 𝑁𝐵,
(10)
na qual,
𝐵 = 𝑍 ⌊𝑙𝑛 (2𝑚0𝑣2
𝐼) = ln (1 −
𝑣2
𝑐2) −
𝑣2
𝑐2⌋,
(11)
onde m0 representa a massa do eletrão em repouso, e a carga do eletrão, z o número atómico da
partícula em questão, 𝑣 a velocidade da partícula, N a densidade do número de átomos do gás e Z o
seu número atómico, I representa o potencial médio de excitação e ionização do gás [35].
45
Uma vez que os isóbaros diferem no número de protões, estes vão percorrer distâncias diferentes até
parar. Este processo de paragem vai provocar ionização no gás circundante criando assim uma
descarga de eletrões proporcional a energia perdida pela partícula, estes vão ser capturadas pelos
ânodos. Posteriormente é possível associar o sinal do ião nos três ânodos ao sinal do detetor PIPS.
Uma vez que os isóbaros possuem um diferente tempo de paragem, vão produzir sinais elétricos com
diferentes intensidades, o que os vai tornar distinguíveis.
O fator de separação SA,B dos isóbaros do A e B no detetor E, ΔE pode ser definido pela seguinte
expressão,
𝑆𝐴,𝐵 =[𝐸𝐴 (𝑥) = 𝐸𝑛(𝑥)]
√12
[𝜎𝐴2(𝑥) + 𝜎𝐵
2(𝑥)]
,
(12)
onde EA(x) e EB(x) representam a energia residual dos iões A e B após passarem pela placa de nitreto
de silício, com uma espessura x, e pelo gás contido na câmara, e σA(x) e σB(x) representam o intervalo
de dispersão de energias das respetivas partículas. Uma das limitações desta técnica reside no facto
do fator SA,B diminuir com o aumento da massa dos isóbaros, aumentando apenas se existir uma
aumento de energia, desta forma quanto maior for a tensão do terminal do acelerador maior será a
capacidade do sistema de AMS de diferenciar partículas mais pesadas [35].
2.6.6 Sistema de boucing
O sistema de boucing permite uma rápida alternância entre isótopos na medição de uma razão
isotópica. Este mecanismo vai reduzir os erros relacionados com a instabilidade do feixe no tempo
através da contagem quase simultânea de isótopos [35].
O sistema de boucing divide-se em dois subsistemas, de baixa e alta energia. Ambos os sub-sistemas
vão efetuar uma seleção de massa dos isótopos através da imposição de um campo elétrico variável
ao longo de um campo magnético estável, evitando desta forma a lentidão e a histerese inerentes a
alternância de campos magnéticos. O campo elétrico é, porém, aplicado de diferente maneira nos dois
subsistemas [35].
No caso do sistema de baixa energia, o campo elétrico é aplicado diretamente à caixa do magneto. Por
outro lado no sistema de alta energia o campo elétrico é aplicado a dois pares de pratos verticais
dispostos à entrada e à saída na caixa do magneto de alta energia. O ajuste da tensão à entrada e à
saída é conseguida através dos pratos defletores que permitem uma rápida alternância na medição da
corrente dos isótopos, mantendo fixo o campo magnético [35].
O sistema de bouncer é um programa que calcula em tempo real, as razões isotópicas. O programa
em questão permite então selecionar o número de isótopos de uma análise, o tempo por ciclo e o
número de ciclos [35].
46
2.6.7 Programa de controlo
O Tandem Control Program é o programa de controlo computorizado do sistema de µ-AMS, este é
composto por vários subprogramas, entre os quais, o scan device, o scan bouncer, o scan sample
stage, e o scan mass [35].
O programa scan device vai permitir ajustar as tensões dos vários dispositivos de focagem e deflexão
que constituem tanto o sistema de baixa como de alta energia, maximizando assim a corrente do feixe
[35].
O scan sample stage vai permitir controlar o suporte da amostra, permitindo assim o movimento em
três dimensões da mesma.
O scan mass vai efetuar o controlo dos magnetos de baixa e alta energia.
O scan bouncer vai efetuar o controlo do sistema de bouncing, tanto de alta com de baixa energia [35].
2.6.8 Preparação de amostras - Preparação de uma pastilha com base em células tiróideias captantes de 129I
Como descrito anteriormente, o prognóstico do carcinoma diferenciado da tiróide depende da
capacidade das células tiróideias captarem iodo radioativo. Esta propriedade está associada ao grau
de diferenciação do tumor [30].
A literatura refere que a incorporação de radioiodo pelas células da tiróide pode ser comprovada pela
determinação de dois parâmetros: a atividade radioativa presente e a quantificação do nível de proteína
Tg presente nas mesmas [16] [30] [40].
Na preparação das células para a captação do 129I, em estudos in vitro, é importante ter em atenção
que o iodeto só vai ser incorporado na mesma se o NIS se apresentar funcional e na membrana celular.
O normal funcionamento do NIS é mantido à custa de 2 Na+ em troca de 1 I-, assim de forma a induzir
a captação de 129I deve ser usada uma solução radioativa de Na129I. O Na vai, assim, induzir o
funcionamento do NIS, não interferindo com a radioatividade do iodo [16].
É importante ter em consideração alguns tópicos, na preparação de amostras de 129I para AMS:
É necessário no mínimo 1 mg de AgI para efetuar medições pela técnica referida;
Não devem ser utilizadas amostras com razões isotópicas superiores a 10-9, de forma
a serem evitadas contaminações;
É necessário a adição de 127I a amostra – carrier;
A técnica em questão mede razões isotópicas [16].
A preparação de amostras depende do tipo de amostra que queremos analisar (geológica, ambiental
ou biológica), uma vez que o modo de extração do iodo tem que ser adaptado as mesmas.
47
Capítulo 3
Materiais e métodos
Tendo em consideração o objetivo definido no projeto da presente tese, avaliação da viabilidade de
utilizar a técnica de µ-AMS como alternativa à deteção do 125I em contador gama para determinação
da captação de iodo por células tiróideias de natureza tumoral ou não, efetuaram-se estudos de
medição de iodo de modo a caracterizar a sensibilidade de cada uma das técnicas.
3.1 Captação de 125I por células tiroideias
A medição do 125I captado por células da tiroide no contador gama é efetuada segundo o seguinte
protocolo:
Remover o meio de cultura de um frasco de células em cultura, lavar com PBS a pH 7.2 e incubar com
tripsina-EDTA. Quantificar as células e plaquear (3x10 células por poço em 2 ml de meio, placa de 6
poços). Após incubação de 24h a 37ºC, retirar o meio de cultura, lavar as células 1x com tampão HBSS
a 37ºC, colocar 990µL de tampão HBSS em cada poço (nos poços com KClO4 colocar 990µL de HBSS
com 10µM de KClO4), acrescentar 10µL de 125I (100.000 a 150.000cpm) devidamente diluído em
tampão HBSS com 100µM de NaI (iodo frio). Incubar 45 minutos na estufa a 37ºC, retirar o tampão e
lavar com HBSS gelado. Lisar as células com 0,1mol/L de NaOH, raspar e transferir os lisados celulares
para os tubos. Medição da radioatividade em contador gama relativamente a um padrão
correspondente à atividade total adicionada a cada poço.
3.2 Determinação da atividade de uma amostra 125I no contador gama
LB 2111
As amostras de 125I foram medidas no contador gama multicanal, modelo LB 2111 (Berthold, Alemanha)
que permite a medição simultânea de 12 amostras colocadas em porta-amostras perfeitamente
ajustados aos poços dos detetores contendo cristais de NaI, adequados à medição da atividade de
radionuclídeos emissores gama com energias até 500 keV. Cada detetor está rodeado por uma barreira
de chumbo de modo a prevenir a interferência entre amostras. As contagens são apresentadas em cpm
(contagens por minuto). A atividade em cada amostra não deve ultrapassar 106cpm.
Para estudar a precisão e a exatidão das medições de atividade efetuadas no contador gama foram
preparadas 3 amostras de 125I em tubos diferentes contendo 274 µL de uma solução com uma
concentração radioativa de 7,3 µCi/ 2 mL, num volume total de 500 µL de solução aquosa. Assim, cada
um dos 3 tubos continha uma solução com uma atividade de aproximadamente 0,9 µCi por tubo. A
atividade total da solução mãe foi medida em câmara de ionização do tipo poço, Aloka, modelo
Curiemeter IGC-3. Este tipo de câmara de ionização é usualmente utilizada na medição de fontes
radioativas não seladas e na determinação da atividade de radiofármacos em clínicas de medicina
48
nuclear. A forma como a câmara está montada cria uma condição de eficiência de aproximadamente
100%.
O tubo 1 foi utilizado para estudar o efeito geométrico da amostra na medição da atividade, o tubo 2 foi
usado no estudo da reprodutibilidade das medições nos vários canais do detetor, e o tubo 3 foi utilizado
no estudo da linearidade de resposta do detetor. Por fim foi calculada a eficiência do contador e o limite
de deteção do mesmo para 125I.
3.2.1 Determinação do efeito geométrico da amostra na medição da atividade
Com o objetivo de determinar a influência do volume da amostra nas medições de atividade mediu-se
a atividade do tubo 1 no contador gama e registou-se o valor. De seguida adicionou-se sucessivamente
pequenos volumes de água destilada à amostra do tubo 1 perfazendo os seguintes volumes: 500 µL,
750 µL, 1000 µL,1500 µL, 2000 µL, 2500 µL e 3000 µL.
Após cada adição a atividade no tubo foi medida 20 vezes para cada volume e os valores registados.
A colocação do tubo nos canais foi aleatória.
3.2.2 Precisão e exatidão das medições
De forma a avaliar a reprodutibilidade das medições nos vários canais do contador multicanal, ou seja
a concordância dos resultados obtidos nos diferentes canais, foi efetuada a medição da atividade do
tubo nos diferentes canais do detetor.
A precisão do contador gama LB 2111 Berthold para medir a atividade de amostras de 125I, ou seja o
grau de concordância dos resultados de várias medições entre si foi determinada através de 20
medições sucessivas da mesma amostra no mesmo canal.
Os resultados foram registados e expressos pelo desvio padrão relativamente à média. A exatidão que
permite determinar a concordância com o valor de referência foi também calculada através do cálculo
do erro.
3.2.3 Linearidade de resposta do contador
Com o objetivo de determinar eventuais erros de medição entre atividades mais ou menos elevadas e
garantir uma gama de atividades na qual as medições dão resultados consistentes, foram efetuadas
diluições sucessivas a partir de uma amostra mantendo sempre o mesmo volume. Assim, foram
efetuadas diluições com os seguintes fatores de diluição 1, 1/2, 1/4, 1/10, 1/50,1/100, 1/500, 1/1000,
1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/10000 e 1/20000.
As soluções com fatores de diluição 1/2, 1/4 e 1/10, provieram da solução do tubo 3, tendo sido retirados
os volumes de 137µL, 68,5 µL, 27,4 µL à mesma e colocados juntamente com 363 µL, 431,5 µL e 472,6
µL de água destilada respetivamente.
49
Por sua vez, as soluções com fatores de diluição de 1/50 e 1/100 foram efetuadas a partir da solução
com fator 1/10, tendo sido retirados os volumes de 100 µL e 50 µL a esta solução e acrescentados os
volumes de água destilada de 400 µL e 450 µL respetivamente.
A solução de 1/100 serviu como base as soluções com fatores de diluição de 1/500, 1/1000, 1/2000 e
1/3000. A solução de 1/500 foi assim formada através da junção de 100 µL da solução com fator de
diluição 1/100 e 400 µL de água. A solução de 1/1000 foi formada através da junção de 50 µL da
solução de 1/100 e 450 µL de água. A de solução de 1/2000 foi formada através da junção de 25 µL da
solução de 1/100 e 475 µL de água e por fim a de 1/3000 foi formada por 12,5 µL da solução de 1/100
e 487,5 µL de água.
A solução de 1/1000 serviu, por sua vez, de base as soluções com fatores de diluição de 1/4000,
1/5000, 1/10000 e 1/20000, sendo a de 1/4000 formada através de 125 µL da referida solução e por
375 µL de água, a de 1/5000 formada através de 100 µL da solução e 400 µL de água e as de 1/10000
e 1/20000 por 50 µL e 25 µL da solução e 450 µL e 475 µL de água respetivamente.
Posteriormente as 14 soluções referidas foram medidas, 20 vezes cada uma no detetor multicanal. A
colocação das soluções nos canais foi aleatória e variável.
A linearidade da medição da atividade em função da diluição foi representada graficamente e o
coeficiente de regressão linear calculado.
3.2.4 Determinação da eficiência do detetor
Por fim, foi determinada a eficiência do detetor. Para esse efeito, foi preparada uma fonte de 125I sobre
um suporte de papel num contentor adequado e a sua actividade absoluta foi medida por
espectrometria gama usando um detector de germânio e lítio, Camberra 2020. Como referência foi
utilizada uma fonte padrão de 133Ba.
Seis dias depois a mesma fonte foi medida 20 vezes pelo contador gama Berthold LB2111.
Uma vez que a fonte não foi medida no mesmo dia pelos dois detetores, foi calculada, atráves da
fórmula indicada abaixo (fórmula 13), a atividade da fonte de 125I, no sexto dia tendo em conta o valor
medido pelo Camberra 2020.
𝑁 = 𝑁0𝑒−𝜆𝑡, (13)
N representa a atividade da amostra após um tempo t, N0 representa a atividade num tempo t0, λ a
constante de decaimento para o 125I e t representa o intervalo de tempo entre N e N0.
A eficiência do detetor foi calculada através da razão entre o valor obtido pela expressão acima e a
média dos valores medidos pelo detetor.
3.3 Determinação de iodo pela técnica de µ-AMS
50
Com o objetivo de determinar a sensibilidade da técnica de µ-AMS para amostras com radioatividade
resultante da atividade do iodo foi tido em consideração o 129I, devido ao facto da técnica em questão
ser indicada para amostras com uma substância traço e uma substância abundante.
Desta forma foi então preparada uma pastilha de AgI, tendo sido posteriormente efetuada a medição
da mesma pela referida técnica. Posteriormente foi efetuada uma pastilha com células tumorais de
adenocarcinoma humano, de forma a mimetizar o processo de extração do 129I numa amostra de células
da tiróide.
3.3.1 Preparação de amostras
3.3.1.1 Pastilha de AgI
De forma a testar a sensibilidade do equipamento de µ-AMS do LATR/CTN para 129I, assim como, o
tamanho da amostra a utilizar, foi preparada uma pastilha de Iodeto de Prata (AgI).
A pastilha foi preparada a partir do precipitado obtido por reação das soluções de nitrato de prata
(AgNO3) e Iodeto de Sódio (NaI):
𝐴𝑔𝑁𝑂3 + 𝑁𝑎𝐼 → 𝑁𝑎𝑁𝑂3 + 𝐴𝑔𝐼 (14)
Assim, misturou-se 0,350g de AgNO3 em 9,5mL de água destilada e 0,308g de NaI em 217,5mL de
água destilada. Posteriormente juntaram-se as duas soluções. Esta nova solução foi deixada em
repouso durante 15 minutos. Em seguida a solução foi decantada e o precipitado filtrado. Por fim o
precipitado foi colocado a secar na estufa durante 24 horas a uma temperatura de 40º C. O pó resultante
foi colocado no molde de amostras tendo sido pressionado a 1 tonelada pela prensa Specac.
3.3.1.2 Extração de iodo de uma amostra de células tumorais para formação de uma
pastilha para medição pela técnica de µ-AMS
As condições experimentais de preparação de amostras foram otimizadas utilizando a linha celular
humana de adenocarcinoma da mama, MDA MB-231 adquirida na American Type Culture Collection
(ATCC, Barcelona, Espanha).
A linha celular foi cultivada em condições de assepsia no meio de cultura DMEM GlutaMaxI (Gibco,
Invitrogen Life- Technologies, Reino Unido) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS) da
Gibco (Invitrogen Life- Technologies, Reino Unido) inativado pelo calor e 1% (v/v) de solução de
antibióticos de Penicilina (100U/mL)/Estreptomicina (10µg/mL). As células foram mantidas numa
incubadora em atmosfera húmida com 95% de ar e 5% de CO2 a 37ºC (Heraeus, Germany). O meio
de cultura foi mudado de 2 em 2 dias.
O número de células para preparação da pastilha foi quantificado por microscopia ótica, num
hemocitómetro (representado pela figura 19). Para esse efeito, o meio de cultura foi removido e as
células lavadas com PBS a pH 7.2. Em seguida incubaram-se as células com 1 mL de tripsina-EDTA
51
(Gibco) até que se destacassem do frasco adicionando-se depois 3 mL de meio de cultura para inativar
a ação da tripsina.
A contagem das células e a viabilidade celular foi determinada em simultâneo pelo método de exclusão
com corante azul de tripano. A 30 µL de suspensão celular adicionou-se um volume igual de azul de
tripano 0,4% (Sigma Chemical, St Louis, EUA). A suspensão corada foi colocada num hemocitómetro
e observada num microscópico ótico. O principio deste método baseia-se na entrada do corante apenas
nas células não viáveis cuja membrana se encontra danificada. Assim, enquanto as células não viáveis
coram de azul as viáveis permanecem não coradas.
As células foram contadas nos quatro quadrantes dos cantos do hemocitómetro.
Posteriormente o número de células foi calculado de acordo com a seguinte expressão:
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑚 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 × 104 (15)
Os resultados foram expressos em nº de células/mL de suspensão celular.
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 𝑛º 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 (16)
A pastilha de células foi preparada, com 8,7x106 células, através da otimização dos protocolos de
Bidarra, Negri et al e de Marchetti et al [28] [29] [49].
Numa ampola de decantação foi preparada uma solução ácida constituída por 40 mL de água destilada,
2 mL de pentan-3-one 4%, 4 mL de H2SO4 95% e 2 mL de H2O2 [28] [29] [49].
Posteriormente foram colocadas, 8,7x106 células num volume de 11 mL num tubo estéril e
centrifugadas a 2000rpm durante 5 minutos.
Figura 19 – Hémocitometro - constituído por 9 quadrados grandes (A); cada quadrado grande contém, 16 quadrados médios (B); cada quadrado médio contém 25 quadrados pequenos.
52
Após a centrifugação da suspensão celular aspirou-se o meio de cultura e adicionou-se ao sedimento
celular 12 mL da solução ácida. Agitou-se em vortex seguido de agitação num banho ultrassónico
durante 5 minutos.
Posteriormente adicionou-se 1 mL de KIO3 (1000µg/mL) para funcionar como carrier, permitindo
também a transformação de iodato em iodeto, que possibilita a ligação do iodo (I-) a Ag+; 0,5 mL de
HNO3; que baixa o pH da solução e é útil na formação do precipitado, evitando ainda a adesão do
mesmo à superfície do tubo de ensaio e 200 µL de AgNO3 na concentração de 5% (m/v) que despoleta
a formação de precipitado de Iodeto de Prata AgIO3 [29]. A solução foi então deixada 18 horas num
local escuro para formar o precipitado de AgIO3.
Por fim, a solução foi centrifugada a 2000 rpm durante 5 minutos para separar o supernadante. O tubo
com o precipitado foi ainda colocado numa estufa à uma temperatura de 70ºC durante 2 horas, e
posteriormente colocados à temperatura ambiente durante 48 horas.
O precipitado foi removido por raspagem e posteriormente pesado numa balança analítica. Foi pesada
a mesma quantidade de prata em pó e misturaram-se os componentes. Estes foram por fim
pressionados num suporte específico para análise em AMS [28].
3.2.2 Medição da pastilha de AgI pela técnica de µ-AMS: Cálculo do limite de deteção
De forma a calcular o limite de deteção da técnica de µ-AMS para o 129I efetuou-se a medição da
pastilha de AgI.
Começou por ser criado o feixe primário, através da ligação do ionizador e do aumento da tensão do
mesmo, até ser atingida uma temperatura de cerca de 1000º C. Posteriormente procedeu-se ao
aumento da temperatura do reservatório até 200º C. Estes passos foram efetuados através da
manipulação do controlador da fonte (representado pela figura 20).
Figura 20 – Controlador da fonte – Permite controlar a temperatura do ionizador e do reservatório assim como o revolver de colimadores, os 4 pratos cilíndricos defletores e a tensão de extração do feixe.
53
Em seguida foi ligado o acelerador Tandem, tendo sido efetuada lentamente o aumento da tensão do
mesmo, até 1600 kV.
Paralelamente, procedeu-se à colocação da pastilha na câmara de amostras. O procedimento de
colocação da pastilha na câmara deve assegurar o vacúo no sistema, e a não continaminação do
mesmo. Desta forma, a pastilha foi então primeiramente colocada na câmara que antecede a câmara
de amostras, designada por câmara de troca amostras, que é o local onde esta troca vai ocorrer.
Assim, de forma a assegurar o vácuo na câmara de amostras, foi colocada primeiramente em vácuo a
câmara de troca de amostras, através da rotação da válvula amarela (representada pelo nº1 da figura
21), posteriomente esta foi fechada e foi permitido o contacto entre câmaras, atráves da válvula preta
(representada pelo nº2 da figura 21). A válvula amarela está ligada a uma bomba rotatória e a preta a
uma bomba rotatória e a uma turbomolecular, o que vai permitir manter o vácuo nas duas câmaras.
De seguida, o suporte de amostras foi então deslocado da câmara de amostras até a câmara de troca
amostras, esta deslocação foi possivel primeiramente atráves da colocação do mesmo num conjunto
de coordenadas específicas, conseguida graças ao sistema controlo de movimentação de amostras
(representado pela figura 22), e seguidamente através de um braço metálico, que permitu puxar o
suporte até a câmara em questão.
Figura 21 – Válvulas que controlam o vácuo no sistema.
1
3
2
54
Posteriormente a válvula que controla a separação entre as duas câmaras foi fechada, voltando então
as câmaras a ficarem separadas. Foi colocado, através da rotação da válvula de cor verde
(representada pelo nº3 da figura 21), ar dentro da câmara de troca amostras, de forma a ser possível
abrir a mesma e retirar o sistema de porta amostras.
O porta amostras foi então retirado tendo sido colocada a pastilha (representada pelo nº4 da figura 23)
sobre o mesmo, com o auxílio de uma fita de carbono.
Figura 22 – Sistema de controlo da posição da amostra na câmara de amostras – permite um controlo das coordenadas Y, Z e X numa escala de no mínimo meio micrómetro.
Figura 23 – Câmara de troca amostras sem e com o suporte de amostras e suporte de amostras com a pastilha de AgI.
4
55
Posteriormente, o porta amostras foi recolocado na câmara de troca amostras. A câmara foi então
fechada e recolocada em vácuo. Em seguida, procedeu-se à passagem do porta amostras para a
câmara de amostras.
Seguidamente procedeu-se ao ajusto do feixe através da aplicação Scan Device do programa Tandem
Control Program (representado pela figura 24), foram selecionados isoladamente os diversos
dispositivos constituintes do sistema de baixa energia tendo sido efetuado o ajuste dos mesmos, com
base no valor de corrente medido pela FC selecionada. O Gráfico 4 representa o ajuste da corrente na
Image Einzel.
Gráfico 4 – Gráfico relativo ao ajuste da corrente na Image Einzel, seleção do pico da corrente medida pela FC.
Figura 24 – Representação do sistema de baixa energia – permite escolher qual o dispositivo a ajustar e qual a FC que irá medir a corrente
56
Em seguida aplicou-se um campo magnético de 0,54 T ao magneto de baixa energia. O valor aplicado
foi calculado com base nos parâmetros apresentados abaixo (tabela 4).
Energia 1,6x10-15J
Carga 1
Massa 2x10-25 kg
Velocidade 1,2x105 m/s
Raio do magneto 0,3 m
Posteriormente, à semelhança do que sucedeu no sistema de baixa energia, procedeu-se ao ajuste
dos vários dispositivos do sistema de alta energia (representado pela figura 25). O valor de corrente
utilizado para o cálculo do limite de deteção foi medido na FC a seguir ao acelerador.
Figura 25 – A semelhança do ocorrido no sistema de transporte de baixa energia o sistema Tandem permite a escolha do dispositivo a ajustar e qual a FC que mede a corrente do feixe.
Tabela 4 – Parâmetros que permitiram calcular o campo magnético aplicado ao magneto de baixa energia para o 127I.
57
Posteriormente a imposição de um campo magnético variável permitiu identificar os diversos estados
de carga do 127I (representados pelo gráfico 5).
Foi então aplicado, ao magneto de alta energia um campo magnético de 0,84 T, calculado com base
nos valores que se seguem (tabela 5), de forma a selecionar o 127I3+.
Por fim, de forma a confirmar que o feixe não sofria interferências isobáricas, conduziu-se o mesmo até
a primeira câmara do detetor (representada na figura 26). Procedeu-se então a seleção dos parâmetros
utilizados para a medição de 129I, desta forma, uma vez que a amostra em questão não continha o
radioisótopo referido, a medição de sinal pelo detetor indicaria a presença de 129Xe, um sinal nulo
indicaria que o feixe em questão não sofria de interferências isobáricas.
Energia 1,28x10-12 J
Carga 3
Massa 2x10-25 kg
Velocidade 3,6x106 m/s
Raio do magneto 1,3m
Gráfico 5 – Gráfico relativo as intensidades dos estados de carga entre 127I9+ e 127I3+
Tabela 5 – Parâmetros que permitiram calcular o campo magnético aplicado ao magneto de alta energia para o 127I.
58
Figura 26 – Câmara de detetores – constituídos por duas câmaras de deteção, a primeira esta em vácuo, assim como o resto do sistema, é constituída por uma FC, um ETP e um sistema PIPS, a segunda encontra-se em alta pressão é
constituída por um gás que vai permitir a resolução das interferências isobáricas do sistema.
59
Capítulo 4
Resultados
Os ensaios de captação de iodo por células tiróideias (procedimento descrito em 3.1) são usualmente
efetuados com recurso a isótopos radioativos, nomeadamente 125I devido à elevada sensibilidade de
deteção. A atividade captada pelas células é medida em detetores de radiação gama adequados para
medição de atividades baixas. Sendo este o procedimento de referência, o trabalho realizado ao longo
desta tese iniciou-se com o estudo das características das medições efetuadas com um contador gama
adequado para o efeito, Berthold LB2111.
Sendo o decaimento radioativo um processo aleatório, a medição da emissão de radiação está sujeita
a uma flutuação estatística, que representa uma fonte de imprecisão ou erro. Estas flutuações podem
porém ser quantificadas e comparadas com as previsões de modelos estatísticos. Se por sua vez estas
não forem consistentes com as previsões dos modelos podemos concluir que existe uma anomalia no
sistema de contagem.
Posteriormente foi avaliada a capacidade da técnica µ-AMS detetar iodo radioativo, mais
especificamente 129I.
4.1 Determinação de 125I pelo contador gama Berthold LB2111
Relativamente ao contador gama multicanal da Berthold, modelo LB2111, frequentemente utilizado em
estudos biológicos e em análises clínicas, foi estudada a variabilidade da medição entre os diferentes
canais para avaliar a reprodutibilidade dos resultados, a influência da variação geométrica da amostra
e a linearidade de resposta do detetor. Por fim foi ainda determinada a eficiência do contador
relativamente a uma fonte de atividade absoluta conhecida e determinado o limite de deteção do
mesmo para 125I.
Em ensaios biológicos deste tipo as flutuações no valor das medições efetuadas pelo contador não
devem exceder os ±5% quando considerada a incerteza da medida, ou seja quando se pretende
determinar a precisão da mesma. Por sua vez na análise da exatidão da medição o erro associado não
deve exceder os ± 10% [9].
A incerteza apresentada foi calculada através da razão entre o desvio padrão e a média das medições
efetuadas e apresentada em percentagem. O erro, por sua vez foi calculado através da razão entre a
diferença do valor medido e o valor esperado pelo valor esperado, é expresso em percentagem. O valor
esperado foi considerado o primeiro valor medido.
Foi desprezada a diferença devida ao decaimento do radionuclídeo uma vez que o período de
semidesintegração é relativamente longo quando comparado com o tempo da operação e medição.
60
4.1.1 Determinação da influência do efeito geométrico da amostra na medição da atividade
Relativamente ao estudo da influência da geometria da amostra no valor da medição, o objetivo do
mesmo foi determinar qual a gama de volumes de amostra suscetíveis de utilizar nos estudos
posteriores, de modo a minimizar erros associados a variações na geometria da amostra. Para esse
efeito efetuaram-se medições sucessivas do mesmo tubo contendo uma solução concentrada com uma
atividade fixa à qual se foram adicionando sucessivamente volumes variáveis de água destilada.
As medições efetuadas apresentaram um erro superior a ± 10% na adição de um volume de água, igual
ou superior a 1500 µL (apresentadas na tabela 6). Assim considerou-se que as medições pelo contador
gama possuem uma exatidão aceitável até volumes de 1000 µL. Para volumes superiores constata-se
uma medição distorcida, uma vez que é afetada por um erro superior a 20%. Esta distorção prende-se
com o fenómeno do ângulo sólido, que se traduz num aumento da proporção de radiação que não é
medida pelo detetor.
No gráfico apresentado abaixo (gráfico 6) podemos verificar a relação existente entre o volume total de
amostra, representada através da água adicionada à solução e a atividade medida.
Volume da amostra (µL) Atividade (cpm) Erro (%)
250 1 088 095,2 -1,5
500 1 068 742,6 -3,3
750 1 040 947,6 5,8
1000 996 480,4 -9,8
1500 860 882,4 -22,1
2000 719 294,0 -34,9
2500 606 103,8 -45,1
3000 512 244,2 -53,6
y = -225,45x + 1E+06R² = 0,9878
400 000,0
500 000,0
600 000,0
700 000,0
800 000,0
900 000,0
1 000 000,0
1 100 000,0
1 200 000,0
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250
ativid
ad
e (
cp
m)
água adicionada (µL)
Geométria (cpm/µL)
Tabela 6 – Dados relativos a medição de uma amostra de 125I com atividade fixa em função do volume para determinação do erro associado ao efeito geométrico da amostra.
Gráfico 6 – Relação relativa entre quantidade de água adicionada à amostra e à atividade medida.
61
O valor R, permitiu-nos constatar a existência de uma correlação forte (r2>9,5) entre a atividade medida
e o volume da amostra em questão, tendo sido verificado que à medida que é aumentado o volume da
amostra, o valor de atividade medida determinado pelo detetor diminui. Tendo em consideração os
resultados deste estudo em todas as medições seguintes o volume total das amostras estudadas foi
de 500 µL.
4.1.2 Precisão e exatidão das medições
Relativamente à análise da reprodutibilidade das medições entre os diferentes canais do contador gama
utilizado neste estudo (apresentados na tabela 7) podemos considerar que este possui uma precisão e
uma exatidão aceitável, uma vez que tanto a incerteza (0,45%) como o erro (-0,9%) associado a estas
se encontram abaixo dos parâmetros referidos anteriormente como aceitáveis nestes ensaios, ±5% e
±10% respetivamente.
Pode então considerar-se que existe uma boa reprodutibilidade das medições ao longo dos diferentes
canais e consequentemente uma precisão e a exatidão das medições.
4.1.3 Linearidade de resposta do detetor
Relativamente ao limite de deteção do detetor, o objetivo do estudo foi avaliar a existência de eventuais
erros associados à medição de diferentes valores de atividade, assegurando uma gama de atividades
em que o contador pode ser utilizado com uma margem de erro aceitável. Ou seja, pretendia-se
determinar abaixo de que número de contagens é que as medições deixam de ser fiáveis.
Média (cpm) 1096012,4
Desvio Padrão (cpm) 4999,9
Incerteza (%) 0,45
Erro (%) - 0,9
Fator de diluição
Primeiro valor medido (cpm)
Média (cpm)
Desvio Padrão (cpm)
Incerteza (%)
Erro (%)
1 1134655 1021444,3 913,2 0,1 0,1
1/2 567327,5 515312,3 776,8 0,2 5,82E-05
1/4 283663,7 251391,6 530,3 0,2 0,2
1/10 113465,5 100713,3 376,6 0,4 0,1
1/50 22693,1 21664,6 204,8 0,9 -1,3
1/100 11346,6 10659,7 134,5 1,2 3,6
1/500 2269,3 2107,9 40,9 1,9 2,4
1/1000 1134,7 1027,9 37,7 3,6 -0,1
Tabela 7 – Análise dos dados relativos às medições da atividade de uma amostra de 125I nos diferentes canais do contador gama.
62
Assim, tendo em conta os valores das medições (apresentadas na tabela 8) verificou-se que apenas
para fatores de diluição de 1/5000, 1/10000 e 1/20000 com valores médios de atividade muito baixos,
200,5 cpm, 90,2 cpm e 34,5 cmp respetivamente, apresentam uma percentagem de erro superior a ±
10%. Relativamente ao valor da incerteza, verificou-se que os valores compreendidos no intervalo de
diluições de 1/3000 a 1/2000, ou seja de 253,5cpm a 34,1cpm, apresentam um valor de incerteza acima
do desejado, ou seja superior a ± 5%. Assim sendo, o valor mínimo de contagens aceitável corresponde
ao valor de 513,5cpm que apresenta uma incerteza de 4,4% e um erro de 1,9%.
Da análise do gráfico acima (gráfico 7), que representa a correlação entre as medições de actividade
em função dos fatores de diluição de 1 a 1/4000 inclusive, podemos verificar a existência de uma
resposta linear para as diluições mencionadas.
Os fatores em questão apresentam uma correlação de 1, como r2>9,5 podemos concluir que existe
uma correlação forte entre o fator de diluição e a atividade da amostra.
4.1.4 Determinação da eficiência do detetor
1/2000 567,3 513,5 22,9 4,4 1,9
1/3000 378,2 253,5 14,9 5,8 1,4
1/4000 283,7 240,5 15,5 6,4 -3,3
1/5000 226,9 200,5 125,8 62,5 -15,8
1/10000 113,5 90,2 16,1 17,8 -21,6
1/20000 56 34,1 11,2
33,1 -40,3
Gráfico 7 – Relação entre o fator de diluição da amostra e atividade medida.
y = 1E+06x - 102,18R² = 1
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0,00000 0,10000 0,20000 0,30000 0,40000 0,50000 0,60000 0,70000 0,80000 0,90000 1,00000
ativid
ad
e (
cp
m)
fator de diluição
Limite de deteção (cpm/factor de diluição)
Tabela 8 – Dados relativos à medições de diluições sucessivas de uma solução de 125I com sucessivas diluições num volume constante de amostra – estudo da linearidade de resposta e do limite de deteção do contador.
63
O valor absoluto da atividade da fonte de 125I foi determinado, no dia 1, por espectrometria gama
utilizando um detector de germânio e lítio, modelo Camberra 2020 do grupo de análise por activação
do CTN. A actividade foi determinada usando como referência uma fonte padrão de 133Ba. A actividade
absoluta foi de 6,8 µCi, correspondente a 15115349 cpm (apresentado na tabela 9).
A eficiência do detetor foi então calculada atráves da razão entre a média dos valores das medições
efectuadas no contador gama LB2111 e o valor da actividade absoluta determinado para a fonte de 125I
por espectrometria gama no espectrómetro Camberra 2020
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖ê𝑛𝑐𝑖𝑎 =943111
1414390× 100% = 66,6 % (17)
Dos cálculos efetuados podemos constatar que a eficiência do contador gama para a fonte de 125I é de
66,6 %.
Tendo em conta este valor de eficiência, constatamos que o número de contagens que obtivemos no
ponto 4.1.3 corresponde apenas a 66% do valor da atividade da amostra. Assim, sabendo que 513,5
cpm correspondem apenas a 66,6% do valor emitido pela amostra, sabemos que a amostra tem uma
atividade de 12,9 Bq.
A fórmula abaixo (fórmula 18) foi utilizada de forma a verificar o número de partículas existentes
numa atividade de 12,9 Bq,
𝐴 = 𝜆𝑁 (18)
onde, 𝜆, é dada por
𝑡1 2⁄ =𝐿𝑛[2]
𝜆 (19)
considerando então que A=12,9Bq e λ=1,34x10-7 podemos afirmar que o valor real mínimo de partículas
de 125I detetado pelo contador LB2111 é 9,6x107.
Atividade absoluta
Camberra 2020
dia 1 (cpm)
Atividade
absoluta
dia 6
(cpm)
Contador LB2111 dia 6
Média
(cmp)
Desvio
padrão
(cpm)
Incerteza(%) Erro
(%)
1515349 1414390 943111 4809,4 0,5 -0,28
Tabela 9 – Dados relativos à determinação da eficiência do detetor – medição no contador gama de uma fonte de 125I com atividade absoluta determinada por espectrometria gama.
64
4.2 Determinação de 129I pela técnica de µ-AMS
4.2.1 Medição da pastilha de AgI pela técnica de µ-AMS: Cálculo do limite de deteção
Através da variação do campo magnético no magneto de alta energia foi possível obter um espectro
com os diversos estados de carga do 127I (representado pelo gráfico 5 do ponto 3.2.2). Assim observou-
se uma corrente de 3,6x10-10 A para o estado de carga 127I3+, 2,5x10-10 A para o estado de carga 127I4+,
1,8x10-10 A para o estado de carga 127I5+, 8,5x10-11 A para o estado de carga 127I6+ e 3x10-12 A para o
estado de carga 127I7+.
Uma vez que o estado de carga 127I3+ foi o estado que apresentou uma maior corrente, este foi o
escolhido para calcular o limite de deteção da técnica referida. Assim, após ajustes do feixe, este foi
medido na FC da câmara de deteção, obtendo-se uma corrente 5,1x10-10 A.
De forma a calcularmos o limite de deteção foi necessário calcular o número de partículas/segundo que
chegaram a FC referida, este cálculo foi conseguido através da seguinte fórmula (fórmula 20),
𝐼 =𝑄
𝑡=
𝑁𝑞𝑒
𝑡 (20)
onde I representa a intensidade da corrente, Q representa a carga da partícula (sendo que e
representa a carga do eletrão e q o estado de carga em questão, neste caso 3+) e t por sua vez
representa o tempo.
5,1 × 10−10 = 3 × 1,6 × 10−19 × N (127I) (21)
N (127I) =5,1×10−10
3×1.6×10−19 = 1,06𝑥109𝑝𝑎𝑟𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜 (22)
Este dado permitiu-nos extrapolar qual o limite de deteção da técnica descrita para o 129I. Como se
espera um número de contagens muito baixo deste radioisótopo a sua deteção terá que ser efetuada
pelo detetor de partículas tipo PIPS, que nos irá dar informação não só do número de partículas, mas
também da sua energia. A sensibilidade da técnica de µ-AMS esta relacionada com o tempo de
contagem e com o tamanho da amostra a analisar, assim sendo para o cálculo do limite de deteção
foram tidos em conta estes dois parâmetros.
Relativamente ao tempo de contagem, um maior tempo de contagem indica por um lado a contagem
de um maior número de partículas, mas por outro uma maior instabilidade do feixe, o que se vai traduzir
numa maior incerteza associada as contagens efetuadas. Tendo então em conta esta dualidade, foi
considerada como mínimo razoável uma incerteza estatística de 1% (incerteza associada apenas a
acumulação do espectro). Através da multiplicação da incerteza pela raiz quadrada da incerteza vezes
o número de contagens, obtém-se o número de contagens necessárias, que neste caso corresponde a
65
104 contagens. Uma vez que foi considerado a contagem de uma partícula por segundo, o que nos
pareceu considerável tendo em conta a instabilidade do feixe, estamos perante um tempo de contagem
de 104 segundos.
Considerando então a contagem de 1x109 partículas/segundo de 127I e a medição de uma partícula por
segundo de 129I, podemos definir o nosso limite de deteção através da seguinte equação (fórmula 23),
R= n(129I)/ n(127I) (23)
onde,
𝑅 =1
1𝑥10−9= 1 × 10−9
(24)
Relativamente ao tamanho da amostra a estudar, uma vez que a sua massa é definida pela quantidade
de 127I e pela quantidade de Ag presentes na amostra, quanto menor for a quantidade de 127I adicionada
a amostra maior é a razão isotópica entre o elemento traço e o elemento abundante.
Assim considerando mais uma vez um feixe de 1x109 partículas/segundo de 127I, a quantidade de
partículas com estado de carga 3+ arrancadas pelo processo de sputtering que foram medidas pela FC,
podemos verificar qual o tamanho mínimo da amostra, e consequentemente a quantidade mínima de
127I necessária para conseguirmos efetuar a medição. Para efetuar este cálculo foi considerado, uma
medição de 104 segundos, uma eficiência de ionização de 8%, e o facto de as partículas
correspondentes a um estado de carga 3+ representarem apenas a 45% do feixe [55]. Tendo em conta
então estes fatores foi possível concluir que serão necessárias 2,8x1014 partículas de 127I na pastilha,
ou seja, 6x10-8 g.
Uma vez que a quantidade de Ag e de I se apresentam por uma razão estequiométrica de 1 para 1,
tendo em conta a massa atómica dos dois elementos, a quantidade de Ag necessária será 4x10-8 g
perfazendo então a pastilha uma massa de 1x10-7 g.
Multiplicando o valor R, pelo número mínimo de partículas de 127I constituintes da amostra,
conseguimos saber que 2,8x105 é o número mínimo de partículas de 129I numa dada amostra detetado
pelo sistema.
Para além da massa da pastilha e do tempo de medição, o volume da amostra é também um fator
importante quando estamos perante a técnica de µ-AMS. É importante ter em consideração este fator,
uma vez que não é aconselhável que haja uma predominância da profundidade do sputtering
relativamente a sua dimensão lateral. Desta forma a raiz quadrada do volume da amostra deve
representar a dimensão lateral do feixe.
Com base na menor massa necessária para a realização da pastilha conseguimos saber também o
volume da mesma, assim sendo a pastilha em questão necessitaria de ter no mínimo 1,6x104 µm3.
Desta forma, com base na relação descrita a cima, conclui-se que o feixe deverá ser focado até 25 µm.
66
Uma vez que a técnica de µ-AMS possui uma capacidade de focagem do feixe até 30 µm, o volume e
consequentemente a massa da pastilha em questão, tornam a técnica exequível tendo em conta a
dimensão lateral do feixe.
Porém o valor de 1,6x104 µm3, torna do ponto de vista experimental impossível o manuseamento da
amostra. Assim, tendo em conta a necessidade de manuseamento da mesma, foi considerado um
volume de 9x10-3 mm3, o qual corresponde a uma massa de 5,1x10-5 g.
Por fim verificou se ainda a existência de interferências isobáricas no feixe. Para tal, após a introdução
dos parâmetros de transporte de feixe para o 129I (estes parâmetros foram extrapolados a partir dos
parâmetros experimentais do 127I), o detetor foi deixado a medir durante 15 minutos. Foram
contabilizados zero eventos o que confirma a ausência da contaminação 129Xe.
67
Capítulo 5
Discussão
O objetivo definido para o trabalho apresentado nesta tese consistiu em estudar a possibilidade de
utilizar a técnica de µ-AMS para determinar a captação de iodo por diferentes células da tiróide, como
alternativa ao método de referência que utiliza detetores de poço contendo cristais de NaI, para medir
a atividade de radionuclídeos emissores de radiação gama. Pretendia-se avaliar e comparar a
sensibilidade de deteção de cada uma das técnicas para esta aplicação biomédica.
Assim, na primeira parte do trabalho estudaram-se as características de um contador gama multicanal,
marca Berthold, modelo LB2111, contendo diversos detetores de NaI especialmente concebido para
medição de atividades relativamente baixas e usualmente utilizado em ensaios in vitro e análises
clínicas. Devido à aplicação e às reduzidas concentrações em causa torna-se essencial conhecer as
características do detetor utilizado para garantir a reprodutibilidade, precisão, exatidão e linearidade
das medições efetuadas e consequentemente a validade e o rigor das análises biomédicas.
Através do estudo de reprodutibilidade, precisão e exatidão podemos considerar que este contador
multicanal apresenta um elevado grau de concordância dos resultados obtidos nos diferentes canais.
Entre si os resultados apresentam um grau de incerteza de 0,45% e um erro de -0,9% o que garante,
para o mesmo volume de amostra radioativa, uma boa precisão e exatidão.
Relativamente ao estudo da geometria da amostra podemos constatar que o contador permite uma
contagem eficaz de 125I até volumes de 1 mL, sendo que a partir deste valor é verificada uma distorção
dos valores do radionuclídeo medido. Esta distorção deve-se ao aumento da distância entre a amostra
e o detetor, e consequentemente à diminuição do ângulo sólido.
O estudo de linearidade de resposta dos detetores permitiu-nos assegurar que até valores de medição
na ordem dos 500 cpm a incerteza e o erro da resposta é inferior a 4,4% e 1,9%, respetivamente.
A eficiência do detetor foi calculada relativamente a uma fonte de 125I com atividade absoluta
determinada em detetor de germânio e lítio sendo aproximadamente 66,6%.
Tendo em consideração a eficiência do contador gama e a atividade para o qual os detetores
respondem de forma linear calculou-se o limite de deteção do contador. Assim observou-se que este
permite uma medição para este tipo de ensaio até ao valor mínimo de 9,6x107 partículas de 125I na
amostra, com uma incerteza de 4%.
Relativamente a técnica de µ-AMS, verificou-se que esta consegue medir até 2,8x105 partículas de 129I
considerando uma incerteza estatística de acumulação do espectro de 1%.
Pode então verificar-se uma sensibilidade de deteção muito superior da técnica de µ-AMS face ao
contador gama, para iodo radioativo. Uma vez que as células tumorais da tiróide possuem um nível de
captação inferior de iodo face as células saudáveis, a técnica de µ-AMS pode ser útil na deteção da
dose mínima de iodo absorvido pelas mesmas.
68
A técnica de µ-AMS apresenta-se vantajosa para deteção de um número inferior a 9,6x107partículas, e
até a um limite de 2,8x105 permitindo assim uma sensibilidade superior para iodo radioativo que a
técnica utilizada pelo contador gama LB2111. Outra vantagem da técnica de µ-AMS face ao contador
gama consiste no facto desta detetar 129I, em alternativa ao 125I, apresentando assim um risco menor
para o utilizador do ponto de vista da proteção radiológica, uma vez que o vai expor a uma menor dose
de radiação. Para além do risco de exposição para o utilizador de 125I, também as instalações onde
este radioisótopo é manipulado carecem de condições adequadas devido a sua volatilidade e
radiotoxicidade e de licenciamento pela entidade reguladora DGS.
Apesar destas vantagens a técnica apresenta como principais desvantagens o facto da medição ser
mais demorada e complexa do que a medição no contador gama. Para além disso, antes de proceder
à medição é necessário fazer um procedimento de preparação de cada uma das amostras que é
também moroso e relativamente complexo. Por outro lado, contrariamente à deteção no contador gama,
o processo de preparação da pastilha para medir no µ-AMS requer a extração do iodo das células
impossibilitando a sua utilização em estudos posteriores (e.g quantificação proteica), por vezes
necessários nos ensaios biomédicos. É importante ainda referir que o resultado da sensibilidade
apresentada se refere a um valor ótimo, uma vez que tem em conta apenas as incertezas estatísticas
da acumulação do espectro. Importa então assim ressalvar que a medição da pastilha efetuada a partir
de células da tiroide captantes de 129I, irá ter associada incertezas relacionadas com a instabilidade do
feixe, o que poderá resultar num aumento da incerteza. No entanto este aumento de incerteza
expectável não deverá exceder os 4% de incerteza associados a medição do 125I no contador gama.
Relativamente a uma futura medição da pastilha realizada a partir de células captantes de 129I será
importante também determinar qual a quantidade de 127I inerente as células a utilizar, uma vez que a o
limite de deteção dado pelo µ-AMS esta relacionado com a razão isotópica 129I/127I.
O estudo apresentado foi o primeiro a ser realizado para a deteção de iodo pela técnica de µ-AMS.
Podemos comparar as técnicas µ-AMS com a de AMS tendo em conta a intensidade do feixe e o
tamanho da amostra. Se por um lado um feixe de maior diâmetro resultante da técnica de AMS vai
permitir a formação de um feixe secundário mais intenso, por outro vai fazer com que a amostra a
utilizar tenha que ter um maior volume que a utilizar por µ-AMS, uma vez que para produzir o feixe mais
intenso vão ter que ser arrancadas mais partículas da amostra.
Assim, relativamente à intensidade do feixe a técnica de AMS apresenta um limite de deteção cerca de
3 ordens de grandeza superior ao µ-AMS para a razão 127I/129I [35]. Por outro lado, relativamente à
massa a literatura define uma massa mínima de 1mg para as amostras medidas em AMS. O estudo
realizado nesta tese permitiu concluir que para a medição por µ-AMS esta necessitaria de ter apenas
uma massa de 1x10-7g, este valor corresponde a um volume de 1,6x104µm3. Do ponto de vista
experimental este valor torna impossível o manuseamento da amostra, assim, tendo em conta a
necessidade de manuseamento da mesma, foi considerado um volume de 9x10-3mm3, o qual
corresponde a uma massa de 5,1x10-5 g. Podemos então verificar que existe a possibilidade de reduzir
até 2 ordens de grandeza o tamanho da amostra, e consequentemente a quantidade de 127I,
denominado de carrier denominado à amostra, quando utilizada a técnica de µ-AMS em alternativa a
69
AMS. Esta redução da massa de 127I vem então reduzir a discrepância entre os limites de deteção das
duas técnicas.
70
Capítulo 6
Conclusão e perspetivas futuras
A tiróide afeta, através da produção das hormonas tiróideias, quase todos os tecidos do organismo
humano. A produção destas hormonas exige uma concentração elevada de iodo no folículo tiróideu. O
NIS é o responsável pelo transporte do iodo para o interior do folículo.
Estudos demostraram que o tecido tumoral tiróideu apresenta uma diminuição da captação de iodo
quando comparado com os tecidos saudáveis adjacentes. Alterações ao nível da expressão do NIS,
devido a uma diminuição de concentração de iodo provocado pela tiróide vão alterar a atividade
promotora do mesmo. Apesar destas alterações na captação de iodo por parte das células tumorais da
tiróide, para além da tiroidectomia, a terapêutica com 131I continua a ser a terapêutica mais utilizada
nos casos de carcinoma diferenciado da tiróide. Assim, de forma a estudar a eficácia do tratamento
com iodo, é de extrema importância perceber qual o valor a partir do qual as células começam a captar
o mesmo.
O contador gama é o método mais utilizado no estudo da captação de iodo por parte das células
tumorais da tiroide. Este método baseia-se nas propriedades radioativas do 125I. O estudo realizado
permitiu constatar que este método se torna preciso apenas até um mínimo de 9,6x107 partículas de
125I na amostra.
Uma vez que a tiróide não tem a capacidade de diferenciar os diversos isótopos de iodo, a técnica de
µ-AMS, através da medição de 129I, apresenta-se como uma alternativa ao contador comumente
utilizado. Esta técnica vai permitir através da aceleração de um feixe de 129I/127I determinar até 2,7x105
partículas de 129I presentes na amostra. Assim, esta apresenta-se vantajosa no estudo de captação de
iodo por parte das células tumorais da tiroide, uma vez que permite determinar o número de partículas
de iodo, com um limite de deteção até 2 ordens de grandeza superior ao contador gama LB2111.
Desta forma a aplicação da técnica de µ-AMS será vantajosa nos estudos de captação das células
tumorais da tiróide pois vai permitir detetar, para valores inferiores aos detetados pelo contador LB2111,
se o sistema de captação de iodo destas células, é ou não viável. Esta possibilidade de comprovar a
viabilidade de captação irá permitir também possibilitar a corroborar ou não o tratamento através da
utilização do radionuclídeo de iodo.
Assim, considera-se que foi efetuado todo o trabalho possível, tendo em conta que não nos foi possível
a aquisição de 129I. Como perspetivas futuras, torna-se então importante a realização de pastilhas de
AgI com 129I extraído com base no protocolo utilizado e a medição da mesma pela técnica de µ-AMS,
com vista a otimização de parâmetros e a confirmação da sensibilidade calculada. É importante ainda
comparar as técnicas de AMS e µ-AMS para o referido estudo.
71
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