1

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y LA

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS PÉTALOS DE

Caléndula officinalis L. (Caléndula), AREQUIPA-2018”

PRESENTADA POR:

BACH. YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

ASESOR:

MG. CELIA CHOQUENAIRA QUISPE

AREQUIPA – PERÚ

2019

2

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y LA

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS PÉTALOS DE

Caléndula officinalis L. (Caléndula), AREQUIPA-2018”

PRESENTADA POR:

BACH. YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO

FARMACÉUTICO

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO Mg. Ing. Antonieta Calizaya Chiri

PRIMER MIEMBRO DEL JURADO Mg. Elvis G.Gonzales Condori

SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO Qf. Carlos A. Herrera Cáceres

I

DEDICATORIA

A Dios, por ser el inspirador y darme la fuerza para continuar en

este proceso de obtener uno de mis anhelos más deseados.

A mi madre, por su amor y sacrificio en todos estos años, gracias

a ella he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo que soy.

A mis hermanas(os) por estar siempre presentes, acompañándome

y por el apoyo incondicional, y también a mi hermanito que desde

el cielo me guía.

También al Qf. Rafael que aprendí muchas cosas buenas.

A mis asesores y docentes que me apoyaron y han hecho que el

trabajo se realice con éxito en especial a aquellos que me abrieron

las puertas y compartieron sus enseñanzas y conocimientos.

YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA.

II

AGRADECIMIENTO

A Dios por bendecirme la vida, por guiarme a lo largo de mi

existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de

dificultad y de debilidad en este camino.

Gracias a mi madre: Susana Hermelinda, por educarme y por

convertirme en una persona de bien, integra y honesta.

A mis hermanos por sus enseñanzas y su apoyo incondicional.

A Q.f Rafael por confiar en mí.

Agradezco a mis asesores docentes de la escuela de ciencias de la

salud de la universidad privada autónoma del sur, por haber

compartido sus conocimientos a lo largo de la preparatoria de mi

preparación profesional.

YADIRA ELY ÁLVAREZ BUSTINZA.

III

RESUMEN

Los radicales libres generados de forma exógena o endógena dentro del

cuerpo han sido implicados en la causalidad de varias enfermedades Estos

radicales libres o especies reactivas de oxígeno (ROS), son átomos o

moléculas que tienen uno o más electrones desapareados en su orbital más

externo, estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser

humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión

superóxido y al radical hidroxilo los cuales podrían desencadenar en

enfermedades en función del tiempo, por lo expuesto la presente investigación

tuvo por objetivo determinar los fenoles totales y la capacidad antioxidante de

los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula), en tal sentido, para la

extracción de principios activos se diseñó y construyó el percolador utilizando

etanol y propilenglicol como solventes, se identificó la presencia de taninos con

la aparición de una coloración verdosa tras la adición de cloruro de hierro(III) al

5% y flavonoides por el método Shinoda, en relación a la identificación de

quercetina,esta se realizó mediante cromatografía en capa fina utilizando dos

fases móviles compuestos por Tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico

(5:4:1)obteniéndose un RF de 0.82 en el extracto etanólico y un RF de 0.84 en

el extracto con propilenglycol. La cuantificación de fenoles totales se realizó por

el método de Folin Ciucalteu hallándose 4.935±0.043 y 5.410±0.025mg/Kg

equivalente a ácido gálico en el extracto etanólico y con propilenglicol

respectivamente. Además, este último metabolito fue analizado por el

Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de

Santa María determinándose 55 mg/kg de ácido tánico que expresado en ácido

gálico dio como resultado 5.51 mg de ácido gálico por Kg de caléndula, dicho

resultado no difiere significativamente con el resultado hallado en el laboratorio

hallado en la Universidad Privada Autónoma del Sur.

Finalmente, la capacidad antioxidante de la Caléndula officinalis L. (Caléndula)

fue 71.27 mmol de trolox/kg por el método de CUPRAC

Palabra clave: ROS, antioxidantes, caléndula officinalis, trolox.

IV

ABSTRACT

Free radicals generated exogenously or endogenously within the body have

been implicated in the causation of several diseases. These free radicals or

reactive oxygen species (ROS) are atoms or molecules that have one or more

unpaired electrons in their outermost orbital, these compounds are generated

during normal metabolism in humans, especially in the respiratory chain, and

include the superoxide anion and the hydroxyl radical, which could trigger

diseases as a function of time. Therefore, the present investigation aimed to

determine the total phenols and the antioxidant capacity of the petals of

Caléndula officinalis L. (Caléndula), in this sense, for the extraction of active

principles was designed and built the percolator using ethanol and propylene

glycol as solvents, the presence of tannins was identified with the appearance

of a greenish coloration after the addition of iron (III) chloride to l 5% and

flavonoids by the Shinoda method, in relation to the identification of quercetin,

this was done by thin layer chromatography using two mobile phases composed

of Toluene: ethyl acetate: formic acid (5: 4: 1) obtaining an RF of 0.82 in the

ethanol extract and an RF of 0.84 in the extract with propylene glycol.

Quantification of total phenols was carried out by the Folin Ciucalteu method,

finding 4,935 ± 0.043 and 5.410 ± 0.025mg / Kg equivalent to gallic acid in the

ethanolic extract and with propylene glycol, respectively. In addition, this last

metabolite was analyzed by the Laboratory of Testing and Quality Control of the

Catholic University of Santa Maria, determining 55 mg / kg of tannic acid that

expressed in gallic acid resulted in 5.51 mg of gallic acid per Kg of Caléndula,

said The result does not differ significantly with the result found in the laboratory

found at the Universidad Privada Autónoma del Sur.

Finally, the antioxidant capacity of the Caléndula officinalis L. (Caléndula) was

71.27 mmol of trolox / kg by the CUPRAC method

Keyword: ROS, antioxidants, Caléndula officinalis, trolox.

INDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA I

AGRADECIMIENTO II

RESUMEN III

ABSTRACT IV

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1.- Descripción de la realidad problemática 1

1.2.- Formulación del problema 2

1.2.1.- Problema principal 2

1.2.2.- Problemas secundarios 2

1.3.- Objetivos 2

1.3.1.- Objetivo general 2

1.3.2.- Objetivos específicos 2

1.4.- Justificación 3

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1.- Antecedentes de investigación 5

2.1.1.- A nivel internacional 5

2.1.2.- A nivel nacional 8

2.1.3.- A nivel local 8

2.2.- Base Teórica 9

2.2.1.- Caléndula (Caléndula Officinalis) 9

2.2.2.- Compuestos fenólicos 15

2.2.3.- Radicales libres 15

2.2.4.- Capacidad antioxidante 16

2.2.5.- Espectrofotometría 17

2.2.6.- Espectrofotómetro 17

2.3.- Hipótesis 18

2.3.1.- Hipótesis principal 18

2.3.2.- Hipótesis secundarias 18

2.4.- Variables 18

2.4.1.- Identificación de variables 18

2.4.2.- Definición conceptual de variables 19

2.4.3.- Operacionalización de variables 20

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1.- Tipo y nivel de investigación 21

3.1.1.- Nivel de la investigación 21

3.1.2.- Tipo de investigación 21

3.1.3.- Diseño de la investigación 21

3.2.- Descripción del ámbito de la investigación 21

3.2.1.- Ubicación espacial 21

3.2.2.- Ubicación temporal 22

3.3.- Población, muestra y muestreo 22

3.3.1.- Población de estudio 22

3.3.2.- Muestra 22

3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 22

3.4.1.- Materiales, equipos y reactivos 22

3.4.2.- Obtención de los pétalos de C. officinalis (caléndula) 23

3.4.3.- Clasificación taxonómica 25

3.4.4.- Preparación de la muestra 25

3.4.5.- Obtención de extractos por percolación 25

3.4.6.- Identificación de taninos 26

3.4.7.- Identificación de Flavonoides 26

3.4.8.- Identificación de Quercetina 27

3.4.9.- Determinación de Fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu 27

3.4.10.- Linealidad 29

3.4.11.- Sensibilidad 29

3.4.12.- Determinación de la capacidad oxidante por el método de Cuprac 30

3.4.13.- Estrategia de recolección de datos 31

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1.- Identificación de C. officinalis 32

4.2.- Percolación 32

4.3.- Identificación de Flavonoides y Taninos 33

4.3.1.- Identificación de taninos 33

4.3.2.- Identificación de flavonoides 34

4.4.- Identificación de Quercetina 34

4.5.- Determinación de fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu 36

4.5.1.- Soluciones patrón de calibración 36

4.5.2.- Linealidad 36

4.5.3.- Sensibilidad 37

4.5.4.- Cuantificación de fenoles totales 39

4.5.5.- Comparación estadística de fenoles totales en extractos etanólicos y con

propilenglicol 39

4.5.6.- Comparación del método de cuantificación de fenoles totales con

Laboratorio Acreditado 41

4.5.7.- Determinación de la capacidad antioxidante de Caléndula officinalis L.

(Caléndula) por el método de CUPRAC 42

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN 44

CONCLUSIONES 48

SUGERENCIAS 49

BIBLIOGRAFÍA 50

APÉNDICES 53

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Operacionalización de variables 20

Tabla 2 Clasificación taxonómica por el Hervarium Areqvipense de la

Universidad Nacional de San Agustín 32

Tabla 3 Se presentan los resultados de las lecturas obtenidas luego de leer

el espectrofotómetro concentraciones 36

Tabla 4 Valores de las variables implicadas en la determinación de los

límites de cuantificación y límites de detección 38

Tabla 5 Gastos obtenidos en el análisis de una muestra (6 repeticiones) 39

Tabla 6 Prueba F para varianza de dos muestras 40

Tabla 7 Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas homogéneas 40

Tabla 8 Cuantificación de Fenoles totales por el método Folin ciucalteu 41

Tabla 9 Valores del gráfico de calibración de concentración promedio de

Trolox vs absorbancia promedio 42

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Caléndula officinalis 10

Figura 2 Triterpenos tetracíclicos presentes en C. officinalis L 11

Figura 3 Triterpenos pentacíclicos presentes en C. officinalis L 12

Figura 4 Carotenos presentes en C. officinalis L 13

Figura 5 Flavonoides presentes en C. officinalis 14

Figura 6 Flores de Caléndula officinalis L.provenientes del distrito de Pisac,

provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado) 23

Figura 7 Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color

anaranjado intenso en los pétalos. 24

Figura 8 Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color

anaranjado intenso en los pétalos. 24

Figura 9 Sistema de percolación que involucra recipiente que contiene la

muestra 25

Figura 10 Prueba de Shinoda 26

Figura 11 Reacción de reducción del reactivo de Cuprac en presencia de

antioxidantes (AOX) 31

Figura 12 Sistema de percolación de pétalos de C. officinalis L usada en la

investigación 33

Figura 13 Identificación de taninos con cloruro férrico al 5 %. Coloración

verde (positivo) 33

Figura 14 Identificación de flavonoides por el método de Shinoda Coloración

Rojo magneta (positivo para flavonoles) 34

Figura 15 Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina

usando una fase móvil de tolueno 35

Figura 16 Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina

usando una fase móvil de acetato de etilo 35

Figura 17 Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L)

y absorbancias promedio 37

Figura 18 Ecuación de la recta entre concentración de ácido gálico (mg/L) y

desviación estándar de las absorbancias 38

Figura 19 Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L)

y absorbancias promedio emitido por el Laboratorio de Ensayo y

Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa María. 41

Figura 20 Gráfico de calibración para la determinación de la capacidad

antioxidante por el método de Cuprac 43

ÍNDICE DE APÉNDICES

Apéndice 1. Constancia de identificación taxonómica 54

Apéndice 2. Resultados de la Universidad Católica Santa María 55

Apéndice 3. Reconocimiento de la muestra Caléndula oficinales l 56

IX

INTRODUCCIÓN

“En las últimas décadas los polifenoles han sido sometidos a numerosas

investigaciones debido a su actividad antioxidante, capacidad de neutralización

de los radicales libres y otros beneficios para la salud. Muchos de ellos también

han sido implicados en la protección contra enfermedades como el cáncer y

patologías cardiovasculares, mientras que algunos se ha visto que presentan

una protección potencial contra la enfermedad de Alzheimer”. (1)

“Diversos estudios han demostrado que existe relación entre la composición

fenólica y la capacidad antioxidante” (1). “Se ha determinado que la actividad

antioxidante en especies vegetales tales como la caléndula se deben a la

presencia de los compuestos fenólicos, ácido ascórbico y los compuestos

carotenoides en el caso del sistema antioxidante químico”. (2)

“Las especies vegetales se someten una serie de cambios bioquímicos debido

a la maduración, la cosecha, el procesamiento y el almacenamiento. Estos

cambios son ocasionados por varios factores, incluyendo reacciones de pardea

miento, deterioro microbiano y autoxidación de lípidos, viéndose afectadas sus

propiedades antioxidantes, funcionales y nutricionales”.(2)

Tradicionalmente para la determinación de los compuestos fenólicos se utilizan

distintos tipos de métodos espectrofotométricos, alguno de los cuales están

basados en el aumento de intensidad de color sufrido por disoluciones de ellos

Por lo que, en el presente trabajo de investigación se buscó cuantificar los fenoles

totales y determinar la capacidad antioxidante de pétalos de C. officinalis L los

cuales fueron obtenidos de abono orgánico, en el mes de septiembre del año

2018del distrito de Pisac, provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle

Sagrado).

1

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1.- Descripción de la realidad problemática

“Los radicales libres generados de forma exógena o endógena dentro del cuerpo

han sido implicados en la causalidad de varias enfermedades como la cirrosis

hepática(3), inflamación, aterosclerosis” (4), “diabetes, cáncer”(5), “enfermedad

neurodegenerativa” (6), etc. “Estos radicales libres o especies reactivas de

oxígeno (ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones

desapareados en su orbital más externo, estos compuestos se generan durante el

metabolismo normal en el ser humano, especialmente en la cadena respiratoria, y

comprende al anión superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(7), por lo cual

dichos radicales libres pueden desencadenar enfermedades en función del

tiempo.

“El vínculo entre los radicales libres y los procesos de la enfermedad ha llevado a

una considerable investigación sobre fármacos no tóxicos que pueden eliminar los

radicales libres. Se ha demostrado que varios extractos y productos vegetales

poseen un potencial antioxidante significativo” (8). Caléndula officinalis L.”Es

empleada en la medicina tradicional y se ha informado que tiene varias

actividades farmacológicas. Se encontró que la aplicación tópica de extracto de

Caléndula officinalis L. posee una actividad antiinflamatoria significativa“ (9).

“También poseía actividades cicatrizantes”(8).

“En ensayos clínicos, se encontró que el extracto de Caléndula officinalis L.posee

actividad preventiva contra la dermatitis aguda durante la irradiación”(10). “Se

informó que el extracto de flor de Caléndula officinalis L. posee un efecto antígeno

tóxico”(11).

“Hoy en día existen muy pocos informes sobre la actividad antioxidante del

extracto, por otro lado, estudios demuestran que las diferentes condiciones de

cultivo, humedad tipos de fertilizantes y época del año influyendo en la

composición de fenoles totales y capacidad antioxidante, considerando las

mejores fechas agosto y setiembre” (12).

2

1.2.- Formulación del problema

1.2.1.- Problema principal

¿Cuál es el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante de

pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?

1.2.2.- Problemas secundarios

¿Cuál es el resultado del ensayo de identificación de taninos y flavonoides

por el método del cloruro férrico y Shinoda respectivamente?

¿Cuál es el resultado de identificar Quercetina por cromatografía en capa

fina?

¿Cuál es la concentración de fenoles totales deextractos etanólicos y con

propilenglicol de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?

¿Cuál es el resultado de comparar los fenoles totales en losextractos

etanólicos y propilenglicol pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)?

¿Cuál es lacapacidad antioxidante depétalos de Caléndula officinalis L.

(Caléndula) por espectrofotometría utilizando el método de Cuprac?

1.3.- Objetivos

1.3.1.- Objetivo general

Determinar la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante en

pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)

1.3.2.- Objetivos específicos

Identificar taninos y flavonoides por el método del cloruro férrico y Shinoda

respectivamente.

Identificar Quercetina por cromatografía en capa fina

Cuantificar los fenoles totales por espectrofotometría en el extracto

etanólico y con propilenglicol de los pétalos de Caléndula oficinales

(Caléndula)

Comparar el contenido de fenoles totales del extracto etanólico y con

propilenglicol de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula).

3

Determinar la capacidad antioxidante del extracto de pétalos de Caléndula

officinalis L. (Caléndula) con mayor cantidad de polifenoles totales por el

método Cuprac.

1.4.- Justificación

“Los radicales libres o más propiamente “especies reactivas de oxígeno”

(ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones

desapareados en su orbital más externo; este paramagnetismo les confiere una

alta reactividad química y la capacidad de sustraer electrones de otras

moléculas tornando a estas en radicales libres, generando así una reacción en

cadena. Estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser

humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión

superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(2)

Los ROS tienen la propiedad de producir daño oxidativo a los lípidos, proteínas

y ADN, y han sido implicados en la patogenicidad de diversas enfermedades

como: cataratas, diabetes mellitus, cáncer, artritis reumatoide, infarto al

miocardio, etc. Diversos estudios epidemiológicos han mostrado la existencia

de una correlación inversa entre la ingesta de frutas y verduras con el cáncer

gastrointestinal, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, asma, cáncer

de pulmón, Parkinson, Alzheimer; “enfermedades asociadas al efecto de los

radicales libres que se generan en nuestro organismo a través de reacciones

metabólicas, factores ambientales, contaminación, radiaciones ionizantes,

drogas, alcohol, etc”.(2)

El ser humano dispone de un sistema antioxidante constituido por enzimas

como: catalasa,peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un

sistema antioxidante no enzimático que actúan impidiendo la acción nociva de

los ROS como: ácido úrico, vitamina C ,vitamina A, glutatión, vitamina E, etc.

Estos sistemas no son lo suficientemente eficientes para evitar el efecto dañino

que ejercen los ROS, por cuyo motivo, “es necesario ingerir alimentos que

contengan sustancias con efectos antioxidantes”.(7)

4

Diversas especies vegetales constituyen una excelente fuente de compuestos

antioxidantes, como: ácido ascórbico, carotenoides, tocoferoles, flavonoides y

polifenoles; así pues, la Caléndula, es muy usada como antiinflamatorio o

cicatrizante en el país, “ya que posee un alto contenido de polifenoles y otros

componentes que podrían ejercer un eficiente efecto antioxidante”(7). En el

presente trabajo se cuantificarán los fenoles totales y se determinará la

capacidad antioxidante de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)

5

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1.- Antecedentes de investigación

2.1.1.- A nivel internacional

Domínguez(13), en su investigación titulada “Efecto de la aplicación del

extracto hidroalcohólico de flores de caléndula (Caléndula officinalis L)

en la estabilización del color y vida útil en pulpa de frutas realizada en

la Universidad Nacional de Colombia en el año 2012”. Este estudio

surgió debido a que la flor de caléndula tiene importantes propiedades que

pueden ser empleadas en la industria de alimentos. Entre los compuestos de

la caléndula con mayor interés se encuentran los antioxidantes, compuestos

que previenen el deterioro de los alimentos, adicionalmente se han

encontrado sustancias con una alta actividad antibacteriana. Por esta razón

se pretendió aplicar estas propiedades en beneficio de la industria de

alimentos, buscando un remplazo para los antioxidantes y conservantes

químicos que han sido utilizados tradicionalmente.

La caracterización química del extracto mediante ensayo fitoquímico

preliminar dio idea de la posible presencia metabólitos como; taninos,

quinonas, carotenoides y cumarinas. Posteriormente a través del espectro

infrarrojo se determinaron frecuencias características que pueden

relacionarse con grupos funcionales y enlaces químicos específicos que

tienen algunos de los compuestos antioxidantes y antifúngicos presentes en

la flor de caléndula.

La determinación de la capacidad antioxidante del extracto dio como

resultado un 74,33% en porcentaje de decoloración DPPH y 142,8mmol de

trolox/g extracto por ABTS. De esta manera los resultados de caracterización

señalan al extracto de caléndula como un posible antioxidante natural que

como gran valor agregado presenta propiedades terapéuticas beneficiosas

para la salud humana.

La evaluación del extracto como conservante y antioxidante en la pulpa, se

realizó mediante el control de los parámetros: pardeamiento enzimático,

6

calidad microbiológica y calidad sensorial, durante un periodo de 2 meses a

2 temperaturas de almacenamiento. “El extracto fue incluido en dos

concentraciones, el umbral de detección” ([1]) y el umbral de identificación

([2]); 8.26x10-3 y 1,90*10 2g de extracto en 100g de pulpa respectivamente.

Los resultados obtenidos demostraron que el pardeamiento enzimático no se

vio modificado por la adición del extracto en las concentraciones evaluadas.

Las variaciones en el cambio de color solo se vieron influenciadas por la

temperatura de almacenamiento, con menores cambios es el

almacenamiento a temperatura ambiente. En cuanto a la evaluación

microbiológica se concluye que la combinación entre la adición del extracto y

el almacenamiento en refrigeración es una buena opción para la

conservación de la pulpa de arazá en términos de hongos y levaduras, en

este caso los recuentos muestran que la pulpa permanece con una buena

calidad durante todo el periodo de almacenamiento. Por otra parte, la

evaluación sensorial mostró que la adición del extracto disminuye la calidad

en los parámetros sabor y aroma, sin verse modificados los parámetros de

color y textura. “Concluyéndose de esta manera que, aunque el extracto

presenta importantes propiedades para la industria de alimentos debe

emplearse algún tratamiento previo que disminuya el sabor amargo del

mismo, posibilitando el uso de concentraciones más altas y así poder

aprovechar el poder antioxidante y antifúngico de manera más efectiva”.

(13)

En cuanto a la metodología, Espinal (2), en su investigación titulada

“Capacidad Antioxidante y ablandamiento de la Guayaba Palmira ICA I

(Psidium guayava) realizada en la Universidad Nacional de Colombia en

el 2012” desarrolló un estudio con la finalidad de contribuir al

conocimiento de los fenómenos químicos y bioquímicos relacionados con la

capacidad antioxidante y el proceso de ablandamiento de los frutos de

guayaba (Psidium guajava L.) variedad Palmira ICA I a lo largo de su

maduración. Para cumplir con este objetivo, se realizó la cuantificación de la

capacidad antioxidante por métodos hidrofílicos (ABTS, DPPH y FRAP) y

lipofílico (decoloración del βcaroteno) del fruto de guayaba en los estados

de maduración verde, pintón, maduro y senescente. Con el fin de atribuir la

7

capacidad antioxidante química del fruto de guayaba a diferentes

compuestos específicos, se realizó la cuantificación de los compuestos

fenólicos, ácido ascórbico y carotenoides totales. Se identificaron y

cuantificaron por HPLC-DAD los principales compuestos fenólicos y

carotenoides que podrían contribuir significativamente a la capacidad

antioxidante del fruto de guayaba variedad Palmira ICA I.

Para esto, se puso a punto una metodología de extracción y medida de

actividad de estas enzimas y se evaluó su comportamiento en los frutos en

estados verde, pintón, maduro y senescente. El efecto protector de los

compuestos antioxidantes extraídos de la guayaba (carotenoides) en los

estados verde, pintón, maduro y senescente fue evaluado mediante la

medida de la supervivencia de una cepa de levadura (Saccharomyces

cervisiae) sometida a un estrés oxidativo inducido con H2O2(2).

Por otro lado, Domínguez (14),en su investigación titulada “Utilización de

flores de caléndula (Caléndulae flos) en salsa de Carnes realizada en la

Universidad Nacional de Colombia en el 2009” se basó en el desarrollo

de un producto comestible tipo salsa para carnes con la adición de flores de

caléndula con el fin de incluir sus propiedades como antioxidante natural.

Para esto se realizaron análisis químicos y sensoriales, en donde se

determinó la actividad antioxidante de la flor de caléndula, “la salsa estándar

para carnes y la salsa para carnes con adición de flores de caléndula

1%p/p, mediante los métodos FRAP y OXIDACIÓN LINOLEICO-β-

CAROTENO y el contenido total de fenoles, mediante el método de FOLIN-

CIOCALTEU”.(14)

“Sensorialmente se determinó la concentración adecuada de la flor de

caléndula en la salsa para carnes, que sea aceptada por el consumidor.

Mediante pruebas de discriminación o diferencia; prueba triangular,

diferencia del sabor amargo y determinación de umbrales de aceptación;

detección e identificación, pruebas que fueron realizadas con panelistas

semientrenados y entrenados de la Universidad Nacional de Colombia”. (14)

8

2.1.2.- A nivel nacional

En cuestión a la generación de radicales libres para la determinación de la

capacidad antioxidante de Palomino (7), en su investigación titulada

“Propiedades antioxidantes de la guayaba (psidium guajava) publicada

en la revista “Sociedad Química del Perú en el 2009”“evaluó las

propiedades antioxidantes de la variedad amarilla de la guayaba (L.)

Utilizando un sistema generador de radicales hidroxilos constituidos por

ascorbato/Cu-II; asimismo, se ha estudiado el efecto que ejercería la

presencia en el mencionado sistema de antioxidantes como: EDTA, tiourea

y manitol, efecto que decrece cuando se adiciona a los medios de ensayo

tiourea, manitol o EDTA. El efecto inhibitorio que ejerce la guayaba sobre

los radicales hidroxilos generados por el sistema ascorbato/Cu-II, depende

de la concentración de la guayaba”.(7)

2.1.3.- A nivel local

En cuestión al método de extracción y solvente, Morgrovejo (8), en su

investigación titulada “Determinación del efecto cicatrizante de un gel

estandarizado de Caléndula officinalis L (Caléndula) en animales de

experimentación publicada en la Universidad Católica de Santa María en el

año 2014” expone que su trabajo de investigación tuvo como objetivo

principal “evaluar el efecto cicatrizante de un gel estandarizado de

Caléndula officinalis L.(Caléndula) en heridas producidas en animales de

experimentación.”(8)

“Con tal fin, se procedió a la recolección de la planta medicinal en el

departamento de Ayacucho, luego los pétalos fueron extraídos del cáliz, y

cortados en pequeños trozos, se siguió con la elaboración del extracto

mediante el método de percolación, obteniéndose un extracto glicólico al

20% límpido, aromático y de color anaranjado característico. Este extracto

fue estandarizado mediante el análisis cuantitativo del flavonoide quercetina

por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando como fase

móvil metanol: agua (50:50), una longitud de onda de 254 nm con un flujo

de 1.0 mL.min-1, evaluándose los parámetros de linealidad, precisión,

exactitud y límites de detección y de cuantificación, obteniéndose que; para

9

la linealidad del método, usando un estándar con pureza ≥ 99% en un rango

de concentraciones de 0.15 a 1.50 mg.L-1, el coeficiente de correlación fue

de 0.997, para la precisión se determinó por repetibilidad y la precisión

intermedia en la que el resultado de los coeficientes de variación porcentual

no excedía del 8 y el 16%”(8).

2.2.- Base Teórica

2.2.1.- Caléndula (Caléndula Officinalis)

A. Descripción

“La Caléndula officinalis L.es una planta anual de la familia Asteraceae que

se cultiva en todo el mundo, nativa de Europa Central y el Mediterráneo;

creciendo en cantidad en lugares cálidos de Norte América y Europa,

floreciendo entre los meses de mayo y octubre”(15)

B. Nombre Común

“A Caléndula officinalis L.se le distingue con diversos nombres como

azucena, caldo, caléndula, caléndula oficinal, calta, caléndula, clavel, clavel

de huerto, clavelina, clavellinas, clavel silvestre, corona de rey, coronas de

rey, mercadela, mercaderes, mercaderes dorados, mercaderes melados,

mercaderes reales, mercaderes rizados, mexicanas, reineta, reinita, rosa

de muerto, rosa de muertos, tarántula, tudescas, entre otros”(14).

10

Figura 1.Caléndula officinalis L

Fuente.Adaptado de deposiphotos(16)

C. Usos tradicionales

“Curación de heridas, en el tratamiento de las gastritis, úlceras, hepatitis y

otras”

“Enfermedades gastrointestinales; en el tratamiento de la hipertensión,

taquicardia y arritmias; en el tratamiento de diversas afecciones del sistema

urinario, sistema nervioso central y periférico”(15,17,18)

D. Composición química

“C. officinalis presenta en su composición triterpenos tetracíclicos como

campestrol, stigmasterol, sitosterol, sitostanol, isofucosterol, cycloartanol,

24-metilnenocycloartanol, stigmasta-3,6-diona”(19). Ver Figura 2

11

Figura 2.Triterpenos tetracíclicos presentes en C. officinalis; campestrol (1),

stigmasterol (2), sitosterol (3), sitostanol (4), isofucosterol (5), cycloartanol (6),

24-metilnenocycloartanol (11), stigmasta-3,6-diona (17)

Fuente. Adaptado de Bartoszet al.(19)

Por otro lado “C. officinalis presenta triterpenos pentacíclicos como β-

amirin, α-amirenona, , α-amirina, lupeol, ѱ-tazasterol, tazasterol,

friedelinol, friedilina, faradiol, arnidiol, ácido oleanolico metil ester y

ácido 3-acetiloxi oleanolico metil ester como se muestra en la Figura

3”(19).

12

Figura 3. Triterpenos pentacíclicos presentes en C. officinalis; β-amirin

(7), α-amirenona(8), α-amirina (9), lupeol (10), ѱ-tazasterol (12),

tazasterol (13), friedelinol (14), friedilina (15), faradiol (19), arnidiol (20),

ácido oleanolico metil ester (16) y ácido 3-acetiloxi oleanolico metil ester

(18).

Fuente. Adaptado de Bartosz et al.(19)

13

“El contenido de carotenoides comprende flavoxantina, luteina,

rubixantina, β- caroteno, γ-caroteno y licopeno”(20)

Figura 4. Carotenos presentes en C. officinalisflavoxantina (1), luteina

(2). Rubixantina (3). β- Caroteno (4). γ-caroteno (5). y licopeno (6).

Fuente. Elaboración propia segúnPinteaet al.(20)

14

“En cuanto a flavonoides se C. officinalis presenta quercetina, rutina,

isohamnetina y kaempferol”(21), como se observa en la Figura 5.

Figura 5. Flavonoides presentes en C. officinalis quercetina (1), rutina

(2), isohamnetina (3) y kaempferol (4).

Fuente. Elaboración propia según Neukirchet al.(21)

15

2.2.2.- Compuestos fenólicos

“Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos son caracterizados

por un núcleo bencénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos y una cadena

lateral funcional. Por otro lado, los no flavonoides se caracterizan por presentar

solo un anillo de 6 carbonos. Los más importantes corresponden a los ácidos

fenólicos (benzoico y cinámico) y otros derivados fenólicos como los

estilbenos.” (13)

Por otra parte, “los flavonoides se caracterizan por presentar dos anillos de 6

carbonos unidos por un heterociclo central de 3 carbonos (C6-C3-C6). En este

grupo se distinguen los flavonoles, flavonas, antocianos y flavanoles”.(14)

“Los compuestos fenólicos se relacionan fuertemente con la capacidad

antioxidante (CA) de una especie vegetal. No existe un único compuesto

fenólico responsable de la actividad antioxidante, sino que ésta se explica por

el conjunto de todos ellos. Los principales compuestos asociados a la CA son:

derivados de ácidos benzoicos, ácidos cinámicos, estilbenos y flavonoides.

Estos compuestos debido a su estructura química, pueden neutralizar radicales

libres, a través de la donación del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo del

anillo aromático”. (14)

“En la práctica los fenoles totales se analizan principalmente por el método

propuesto por Singleton (1965), el cual utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteu,

que se reduce al oxidar los fenoles formando una coloración azul, lo cual puede

ser medido a una λ onda750 nm. Otro método de análisis de los fenoles totales

(IPT) muy utilizado, simple, rápido y fiable corresponde a la medición de la

absorbancia de 280 nm”.(22)

2.2.3.- Radicales libres

“Los radicales libres o más propiamente “especies reactivas de oxígeno”

(ROS), son átomos o moléculas que tienen uno o más electrones

desapareados en su orbital más externo; este paramagnetismo les confiere una

alta reactividad química y la capacidad de sustraer electrones de otras

moléculas tornando a estas en radicales libres, generando así una reacción en

16

cadena. Estos compuestos se generan durante el metabolismo normal en el ser

humano, especialmente en la cadena respiratoria, y comprende al anión

superóxido y al radical hidroxilo, entre otros”.(7)

“Los ROS tienen la propiedad de producir daño oxidativo a los lípidos,

proteínas y ADN, y han sido implicados en la patogenicidad de diversas

enfermedades

Diversos estudios epidemiológicos han mostrado la existencia de una

correlación inversa entre la ingesta de frutas y verduras y cáncer

gastrointestinal, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, asma, cáncer

de pulmón, Parkinson, Alzheimer; enfermedades asociadas al efecto de los

radicales libres que se generan en nuestro organismo a través de reacciones

metabólicas, factores ambientales, contaminación, radiaciones ionizantes,

drogas, alcohol, etc.”(7)

“El ser humano dispone de un sistema antioxidante constituido por enzimas

como: catalasa,peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y un

sistema antioxidante no enzimático que actúan impidiendo la acción nociva de

los ROS como: ácido úrico, vitamina C, Vitamina A, glutatión, vitamina E, etc.

Estos sistemas no son los Suficientemente eficientes para evitar el efecto

dañino que ejercen los ROS, por cuyo motivo, es necesario ingerir alimentos

que contengan sustancias con efectos antioxidantes”.(7)

2.2.4.- Capacidad antioxidante

“El estudio de la actividad antioxidante en flores, hojas y frutas ha permitido la

identificación de los compuestos fenólicos, carotenoides y vitamina C de los

frutos como los responsables de la protección del fruto contra las sustancias

oxidantes. La actividad química de los polifenoles que definen sus cualidades

antioxidantes es producto de su capacidad de donar electrones y átomos de

hidrógeno, así como su alta estabilidad y baja reactividad química en su forma

oxidada. Anteriormente ya ha sido estudiada la alta capacidad de los

polifenoles de reducir sustancias oxidantes como el radical hidroxilo (OH•),

anión radical superóxido (O2•-), radicales peroxil (ROO•) y peróxido de

17

hidrógeno (H2O2), así como los intermediarios oxidados altamente reactivos”.

(2)

“Los distintos métodos para medir la actividad antioxidante son consecuencia

de la alta capacidad antioxidante que tienen los polifenoles, donde cada

método de medida de actividad antioxidante es sensible a las distintas

características redox del compuesto polifenólico polifenol. Los métodos ABTS y

DPPH actúan sobre polifenoles donores de átomos de hidrógeno a radicales

oxidantes, estabilizándolos y disminuyendo así su poder oxidante, el método

FRAP actúa sobre los polifenoles capaces de donar electrones reduciendo

intermediarios oxidados, mientras que el método de decoloración del β-

caroteno actúa deslocalizando y estabilizando los electrones recibidos de un

radical libre. Entonces, para poder determinar la capacidad antioxidante total de

un fruto, debe medirse la actividad antioxidante con cada uno de los métodos

para poder determinar tanto el efecto de neutralización de radicales libres,

como su capacidad de reducción”.(2)

2.2.5.- Espectrofotometría

“La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se

basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un

compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de

una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz

incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de

la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la

intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede

estar en fase líquida, sólida o gaseosa”. (23)

2.2.6.- Espectrofotómetro

“Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones (la

intensidad de la luz) absorbida por la muestra líquida después de pasar un haz

de luz a través de la solución. Espectrofotómetro UV-visible utiliza luz sobre el

rango de ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) de espectro

de radiación electromagnética”. (24)

18

2.3.- Hipótesis

2.3.1.- Hipótesis principal

Dado que existen referencias bibliográficas que los pétalos de Caléndula

officinalis L. (Caléndula) presenta en su composición química metabolitos como

carotenos, terpenos y flavonoides, es probable determinar la presencia de

fenoles totales y su capacidad antioxidante en los pétalos de Caléndula

officinalis L. (Caléndula).

2.3.2.- Hipótesis secundarias

Es probable identificar taninos y flavonoides por el método del cloruro

férrico y Shinoda respectivamente en los Caléndula officinalis L.

(Caléndula)

Es probable encontrar Quercetina por cromatografía en capa fina en los

extractos de pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula).

Es probable cuantificar fenoles totales por espectrofotometría en extractos

etanólicos y con propilenglicol en los pétalos de Caléndula officinalis L.

(Caléndula).

Es probable comparar el contenido de fenoles totales en extractos

etanólicos y con propilenglicol en los pétalos de Caléndula officinalis L.

(Caléndula).

Es probable determinar la capacidad antioxidante de los pétalos de

Caléndula officinalis L. (Caléndula) por espectrofotometría por el método

de Cuprac.

2.4.- Variables

2.4.1.- Identificación de variables

Variable independiente:

Extracto de pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)

19

Variable dependiente:

Concentración de fenoles totales y /

Capacidad antioxidante

2.4.2.- Definición conceptual de variables

Extracto de pétalos deCaléndula officinalis L. (Caléndula)

Extractos obtenidos por percolación a partir de pétalos de Caléndula

officinalis L. (Caléndula), recolectados en los meses de agosto y

setiembre del 2018.

Concentración de fenoles totales Caléndula officinalis L.

(Caléndula)

Son compuestos bioactivos que pueden estar presentes en pétalos de

Caléndula officinalis L. (Caléndula).

Capacidad antioxidante Caléndula officinalis L. (Caléndula)

“Los antioxidantes previenen daño a moléculas biológicas por parte de

los radicales libres; son fuertes agentes reductores debido a las

propiedades de óxido reducción de sus grupos hidroxilo y las relaciones

estructurales entre diferentes partes de su estructura química. La

capacidad antioxidante de un alimento o especie vegetal depende de la

naturaleza y concentración de los compuestos antioxidantes”.(25)

20

2.4.3.- Operacionalizacion de variables

En la Tabla 1 se observa la Operacionalización de variables

involucradas en la presente investigación

Tabla 1. Operacionalización de variables

VARIABLE

INDEPENDIENTE INDICADOR Subindicador

Pétalos de Caléndula officinalis

L. (Caléndula)

Extracto de

pétalos Porcentaje

VARIABLE DEPENDIENTE INDICADOR Subindicador

Concentración de polifenoles Polifenoles

totales mg de ácido gálico

Capacidad antioxidante Método de

Cuprac

Actividad antioxidante en

mmol /Kg Trolox.

Fuente: Elaboración propia

21

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1.- Tipo y nivel de investigación

3.1.1.- Nivel de la investigación

Experimental

3.1.2.- Tipo de investigación

Según manipulación de variables: Experimental

Según número de mediciones: Transversal

Según la temporalidad: Prospectivo

Enfoque: Cuantitativo

Por el propósito o finalidad: Aplicada

Paradigma: Positivista

3.1.3.- Diseño de la investigación

Experimental

3.2.- Descripción del ámbito de la investigación

3.2.1.- Ubicación espacial

El presente trabajo de investigación se desarrolló en los laboratorios de la

Universidad Privada Autónoma del Sur y los análisis de capacidad

antioxidante se llevó a cabo en el laboratorio de Ensayo y Control de

Calidad de la Universidad Católica de Santa María.

22

3.2.2.- Ubicación temporal

El presente trabajo de investigación fue desarrollado entre los meses de

setiembre de 2018 a Enero del 2019.

3.3.- Población, muestra y muestreo

3.3.1.- Población de estudio

La población corresponde a flores de C. officinalis L (caléndula) del distrito

de Pisac, provincia de Calca del departamento de Cusco.

3.3.2.- Muestra

La muestra consistió en 5 Kg de pétalos de caléndula

3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos

3.4.1.- Materiales, equipos y reactivos

A. Reactivos e insumos

Ácido gálico p.a.

Ácido clorhídrico concentrado p.a.

Carbonato de sodio p.a.

Etanol 96°

Reactivo de Folin Ciucalteu

Propilenglicol

B. Materiales

Algodón

Baguetas

Buretas de 25 mL

Goteros

Matraces de 250 mL

papel filtro

Pipetas de 5, 10 y 20 mL

Tubos de ensayo

23

C. Equipos

Espectrofotómetro

D. Software

El presente estudio se realizó usando diversos softwares como

Microsoft Excel 2016y Minitab 17para el diseño de gráficos y

aplicación de estadística para la comparación de grupos.

3.4.2.- Obtención de los pétalos de C. officinalis L (caléndula)

Las flores de C. officinalis L. (Caléndula) empleadas en el estudio fueron

obtenidas en el mes de septiembre del año 2018 del distrito de Pisac,

provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado) región que

presenta una altitud de 3600 m.s.n.m. y temperatura máxima de 22°C y una

mínima de 6 °C.

Figura 6. Flores de Caléndula officinalis L Provenientes del distrito de Pisac,

provincia de Calca, departamento de Cusco (Valle Sagrado)

Fuente. Elaboración propia

24

Las flores recolectadas exhibían un color naranja fuerte en los pétalos como

se observa en la Figura 7.

Figura 7. Flores de Caléndula officinalis L.recolectadas con un color

anaranjado intenso en los pétalos.

Fuente. Elaboración propia

Una vez recolectadas estas Fueron acondicionadas en papel Kraft para ser

transportadas a los laboratorios de la Universidad Privada Autónoma del Sur

del departamento de Arequipa para su estudio.

Figura 8. Flores de Caléndula officinalis L. recolectadas con un color

anaranjado intenso en los pétalos.

Fuente. Elaboración propia

25

3.4.3.- Clasificación taxonómica

Las flores frescas fueron llevadas a la Universidad Nacional de San Agustín,

facultad de ciencias biológicas, departamento académico de biología al

herbarium areqvipense (HUSA) para su reconocimiento respectivo.

3.4.4.- Preparación de la muestra

Una vez identificada la especie, los pétalos fueron retirados de las flores

cuidadosamente para no dañarlos.

Para la estabilización de la muestra los pétalos estos fueron lavados con

agua y alcohol, posteriormente secados a temperatura ambiente por 20

días. Los cuales fueron almacenados en papel Kraft para estudios

posteriores.

3.4.5.- Obtención de extractos por percolación

Los extractos fueron preparados a partir del método de percolación, dicho

procedimiento se realizó pesando 20 g de pétalos de caléndula triturados

para luego poner en contacto con los solventes (etanol y propilenglicol) en

un sistema de percolación que consistió en un recipiente (Botella) invertido

que contendrá la muestra acondicionado con algodón y papel filtro para

evitar el paso de los pétalos al momento de recuperar el solvente con los

metabolitos a 30 gotas por minuto, el diseño se observa a continuación en

la Figura 9.

Figura 9.Sistema de percolación que involucra recipiente que contiene la

muestra (1), Algodón (2), Colector de extracto (3) con control de flujo (30 gotas

/min) y canicas para evitar que la muestra se suspenda (4).

Fuente. Elaboración propia en ChemScketch

26

3.4.6.- Identificación de taninos

Los taninos fueron identificados realizando el ensayo en tubo por adición

de extracto etanólico obtenido de la extracción por percolación, con 20

gotas de cloruro férrico al 5 %. Resultado positivo cuando se observa un

cambio de coloración a verde.

3.4.7.- Identificación de Flavonoides

A. Fundamento

La reacción de Shinoda es típica para la identificación de flavonoides

que se basa en la oxidación de limadura de magnesio en medio ácido. El

hidrógeno liberado produce por reducción el ion flavilio de color rojo

escarlata que vira de un rosa pálido hasta escarlata. Esta reacción

distingue a todos los flavonoides excepto chalconas, auronas e

isoflavonas(26).

Figura 10.Prueba de Shinoda

Fuente. Barrios y Quispe (26)

B. Procedimiento

En un tubo de ensayo se colocó una cantidad de 0.1ml de extracto de

caléndula y luego una pequeña porción de limaduras de magnesio y dos

gotas ácido clorhídrico concentrado(26).

27

C. Interpretación

La coloración de naranja al rojo indica la presencia de flavonas, la

coloración rojo carmesí, purpura y azul indican presencia de

flavononas, el color amarillo pálido o incoloro indica presencia de

flavonas y flavonoles, finalmente una coloración de amarillo rojizo

indica presencia de isoflavonas (26).

3.4.8.- Identificación de Quercetina

Los extractos se analizarán por cromatografía en capa fina usando una

fase móvil de acetato de etilo: metanol (100:10) v/v y una fase

estacionaria de Sílica gel F 234 siendo el factor de retención esperado de

0.80 según investigaciones realizadas por Toso y Skiliar. (27)

Se probaron otras fases móviles como n-butanol:ácido

acético:agua:ácido fórmico (7:1:1:0.25) estudiadas por Patil et al.(28)Con

un Rf de 0.82, así como, Tolueno:acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1)

estudiadas por Soareset al.(29) Obteniendo un Rf de 0.82 estudiadas

por Goswami y Srivastava(30) con un Rf de 0.84.

3.4.9.- Determinación de Fenoles totales por el método de Folin

Ciucalteu

A. Fundamento del método

“El reactivo está compuesto por una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y

fosfomolíbdico en medio básico, los que sufren reducción al oxidar los

compuestos fenólicos, originando un complejo wolframio-molibdeno de

color azul cuya absorbancia es dependiente de la concentración de los

polifenoles de la muestra y se midió en un espectrofotómetro a 765 nm.

Los resultados se expresan como mg equivalentes de ácido gálico/100 g

de muestra fresca”. (13),(14).

28

B. Procedimiento

“Los compuestos fenólicos libres fueron cuantificados mediante el

método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu. A 750 µL del reactivo de

Folin Ciocalteu diluido al 10% en agua, se le adicionó 100 µL de la

solución de compuestos antioxidantes (patrones de diferentes

concentraciones y muestras) y se incubó a temperatura ambiente

durante 5 min, luego se adicionarán 750 µL de una solución de

carbonato de sodio (Na2CO3) al 6% en agua, se agito y se dejó en

reposo durante 90 min a temperatura ambiente en condiciones de

oscuridad y se midió la absorbancia a 765 nm. La curva de calibración

se realizó con patrones de ácido gálico con concentraciones finales

entre 0 y 6 µg/mL.”(31), (32).

29

3.4.10.- Linealidad

Para la evaluación de la linealidad se midieron en el espectrofotómetro

soluciones de ácido gálico de 1, 2, 3, 4, 5, y 6 mg/L.

“Posteriormente se calculó el valor de R2 que es el coeficiente de

correlación lineal y para ello fue necesario usar la siguiente fórmula”(33)

n

YY

n

XX

n

YXYX

r

ii

ii

ii

ii

2

2

2

2

Ecuación. 1

“El valor r = 1 indica una recta perfectamente lineal, r = -1 una recta

perfectamente lineal de pendiente negativa y r = 0, la no correlación

entre X e Y. En la práctica, r es generalmente mayor de 0,99 y los

valores menores de 0,90 son raros”.(34),(33)

3.4.11.- Sensibilidad

“La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima

cantidad de analito que puede producir un resultado significativo Los

parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método son los

límites de detección y de cuantificación”.(34),(33)

Límite de detección corresponde, “según la USP, a la menor

concentración de analito que puede detectarse, pero no

necesariamente cuantificarse en una muestra, en las condiciones

establecidas”.(34),(33)

Límite de cuantificación corresponde, “según la misma referencia, a

la menor concentración de analito que puede determinarse

con”(34),(33) precisión y exactitud razonables en las condiciones

establecidas.

30

Posteriormente se usaron las siguientes fórmulas

Límite de Detección

'

13

nb

SblYblLD

Ecuación. 2

Límite de Cuantificación

'

110

nb

SYblLC bl

Ecuación. 3

3.4.12.- Determinación de la capacidad oxidante por el método de

Cuprac

El método espectrofotométrico Cuprac fue desarrollado por Apak para

determinar la capacidad total de antioxidantes en alimentos. Se basa en

la medida de la absorbancia del quelato Cobre(II)-Neucuproína

[Cu(Nc)2+] formado como resultado de la reacción Rédox de los

antioxidantes con cadenas rotas junto con el reactivo Cobre(II)-

Neocuproína (CUPRAC), donde la absorbancia se mide a una longitud

de onda de 450 nm.

El método comprende en mezclar la solución antioxidante con cloruro de

cobre (II), neocuproína diluida en metanol y acetato de amonio acuoso a

un pH 7, y medir subsecuentemente la absorbancia a 450 nm después

de 30 min de reacción.

31

Figura 11. Reacción de reducción del reactivo de Cuprac en presencia de

antioxidantes (AOX)

Fuente. Elaboración propia

3.4.13.- Estrategia de recolección de datos

Para el análisis estadístico y estructural se utilizaron diversos softwares

como Microsoft Excel 2016y Minitab 17 para el diseño de gráficos y aplicación

de estadística para la comparación de grupos.

32

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

El presente estudio cuyo objetivo general fue cuantificar los fenoles totales y

determinar la capacidad antioxidante dieron los siguientes resultados.

4.1.- Identificación de C. officinalis

Las flores recolectadas fueron identificadas como C. officinalis L. en el área de

biología de la Universidad Nacional de San Agustín y la clasificación realizada

se presenta en la Tabla 2

Tabla 2. Clasificación taxonómica por el Hervarium Areqvipense de la

Universidad Nacional de San Agustín

REINO Plantae

DIVISIÓN Magnoliphyta

CLASE Magnoliphyta

ORDEN Asterales

FAMILIA Asteraceae

GÉNERO Calédula

ESPECIE Caléndula officinalis L.L.

Fuente. Elaboración propia

Es importante mencionar que tras la estabilización de las flores de caléndula de 5 kilos

de flores frescas, se obtuvo 300gramos de pétalos de caléndula, y con ellos se

realzaron los extractos y ensayos fitoquimicos.

4.2.- Percolación

Se diseñó y construyó el percolador donde se colocaron aproximadamente 50 g

de pétalos de C. officinalis, fue necesario cubrir el sistema con papel aluminio

para evitar el contacto con la luz, luego de 24 horas de contacto con 2

solventes y una extracción a 30 gotas por minuto se obtuvieron 50ml de

extracto etanólico y 50 ml de extracto con propilenglycol. Los extractos

obtenidos se almacenaron en frascos ámbar como se observa en la Figura 12.

33

Figura 12.Sistema de percolación de pétalos de C. officinalis usada en la

investigación

Fuente. Elaboración propi

4.3.- Identificación de Flavonoides y Taninos

4.3.1.- Identificación de taninos

En la Figura 13, tras la adición de cloruro de hierro (III) al 5%, se observa una

coloración verdosa correspondiente a presencia de Taninos.

Figura 13. Identificación de taninos con cloruro férrico al 5 %. Coloración

verde (positivo)

Fuente. Elaboración propia

34

4.3.2.- Identificación de flavonoides

En la Figura 14 se observa el resultado de la identificación de flavonoides el

cual se caracteriza por la aparición de un color rojo magneta característico tras

ser tratado con limaduras de magnesio en medio acido.

Figura 14. Identificación de flavonoides por el método de Shinoda Coloración

Rojo magneta (positivo para flavonoles)

Fuente. Elaboración propia

4.4.- Identificación de Quercetina

Para la identificación de Quercetina se usaron fases móvilesTolueno: acetato

de etilo: ácido fórmico (5:4:1) con un Rf esperado de 0.82.

Luego de realizar los ensayos usando placa de Sílicagel F234y la fase móvil de

Tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1) se obtuvieron los resultados de

la Figura 15 donde se nota la existencia de una banda de color verde con un Rf

de 0.82 dando positivo a la presencia de Quercetina según Oliveira et al.(29).

35

Figura 15. Identificación de Quercetina por Cromatografía en Capa Fina del extracto etanólico.

Fuente. Elaboración propia

Así mismo, usando una fase móvil de acetato de etilo: ácido fórmico: (5:4:1) se

obtuvieron los resultados de la Figura 16 donde se observa una banda de color

con un Rf de 0.84, por lo que es probable que la caléndula officinalis l tenga

Quercetina dando positivo a la presencia de Quercetina en el extracto con

propilenglicol cuyos resultados son iguales a los encontrados .Goswami y

Srivastava (30)

Figura 16. Identificación de Quercetina en el extracto de propilenglycol por

Cromatografía en Capa Fina. Resultado Presencia de Quercetina con un Rf de

0.84.

Fuente. Elaboración propia

36

4.5.- Determinación de fenoles totales por el método de Folin Ciucalteu

4.5.1.- Soluciones patrón de calibración

En la Tabla 3 se observan los resultados de las absorbancias correspondientes

a las concentraciones de ácido gálico de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 mg/L.

Tabla3.Resultados de las lecturas obtenidas luego de leer el espectrofotómetro.

Concentración

de ácido gálico

(mg/L)

Absorbancia

1

Absorbancia

2 �� s DSR (%)

1 0.125 0.119 0.122 0.004 3.48

2 0.275 0.260 0.268 0.011 3.97

3 0.422 0.432 0.427 0.007 1.66

4 0.578 0.565 0.572 0.009 1.61

5 0.718 0.732 0.725 0.010 1.37

6 0.887 0.878 0.883 0.006 0.72

*,��=Absorbancia promedio, s=desviación estándar, DSR=desviación estándar relativa Fuente. Elaboración Propia

4.5.2.- Linealidad

En la Figura 17 se observan el resultado de graficar la Tabla 3 donde se

comparan las concentraciones de ácido gálico (mg/L) versus absorbancias

promedio dando como resultado un coeficiente de correlación lineal R2 de

0.9998 siendo este superior a 0.995 concluyendo que el método para la

cuantificación de fenoles totales es lineal.

Por otro lado, la ecuación de la recta que describe la relación entre

concentraciones de ácido gálico (mg/L) versus absorbancias es:

𝑦 = 0.152 𝑥 − 0.0327

Dicha fórmula fue usada para la cuantificación reemplazando en las variables

como se muestra a continuación:

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0.152 [𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔á𝑙𝑖𝑐𝑜 (𝑚𝑔

𝐿)] − 0.0327

37

1 2 3 4 5 6

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Absorb

ancia

pro

medio

Ácido gálico (mg/L)

y = 0.152 x - 0.0327

R2 = 0.9998

Figura 17.Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L) y

absorbancias promedio

Fuente. Elaboración propia

4.5.3.- Sensibilidad

Para determinar la sensibilidad del método se calculó gráficamente la ecuación

de la recta de la concentración de mg AG/L y la desviación estándar de la

absorbancia de la Tabla 3 dando como resultado la Figura 18 donde se observa

que la ecuación de la recta es

𝑦 = 0.0003𝑥 + 0068

La sensibilidad determinada en términos de límites de detección y

cuantificación expresadas en la ecuación 2 y 3 (Ec. 2y Ec.3) del apartado

3.4.9.2. Reemplazando los siguientes datos de la Tabla 4

38

1 2 3 4 5 6

0.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0.009

0.010

0.011D

esvia

ció

n e

stá

nd

ar

Ácido gálico (mg/L)

y = 0.0003x + 0.0068

Figura 18. Ecuación de la recta entre concentración de ácido gálico (mg/L) y

desviación estándar de las absorbancias

Fuente. Elaboración propia

Tabla 4. Valores de las variables implicadas en la determinación de los límites de cuantificación y límites de detección

Variable Interpretación Fuente Valor

B Pendiente Figura 17 0.152

Ybl Intercepto Figura 17 0.0327

Sbl Intercepto Figura 18 0.0068

N 6

*b=pendiente, Ybl=intercepto, Sbl=desviación estándar del blanco, n=cantidad

de puntos de calibración

Fuente. Elaboración propia

El límite de detección y cuantificación fue de 0.143 mg/L y 0.966 mg/L de

ácido gálico respectivamente.

39

4.5.4.- Cuantificación de fenoles totales

Los resultados de los análisis del extracto con propilenglicol expresados en

equivalente de ácido gálico dieron como resultados promedio de5.410 ± 0.025

mg de AG/ kg de pétalos de caléndula.

En relación al extracto etanólico el promedio fue de 4.935 ± 0.043 mg de AG/

kg de pétalos de caléndula.

Tabla 5. Gastos obtenidos en el análisis de una muestra (6 repeticiones)

N Concentración (EAG

mg/Kg) extracto etanólico

Concentración (EAG

mg/Kg) extracto con

propilenglicol

1 4.930 5.391

2 4.891 5.443

3 5.009 5.417

4 4.904 5.404

5 4.917 5.430

6 4.957 5.376

�� 4.935 5.410

s 0.043 0.025

DSR (%) 0.87 0.46

*��= Promedio, s= Desviación estándar, DSR= Desviación estándar relativa.

Fuente. Elaboración propia

4.5.5.- Comparación estadística de fenoles totales en extractos

etanólicos y con propilenglicol

Se realizó la prueba F para varianzas de dos muestras dando como resultado

que F experimental es menor al F de tablas (2.978>5.05) por lo tanto las

varianzas son homogéneas.

Con dichos resultados, se procedió a realizar una prueba t suponiendo

varianzas iguales o homogéneas.

40

Tabla 6. Prueba F para varianza de dos muestras

Concentración (EAG

mg/Kg) extracto etanólico Concentración (EAG mg/Kg) extracto con propilenglicol

GL 5 5

F 2.978

P una cola 0.1280

Valor crítico para F (una cola)

5.05

*EAG=equivalente a ácido gálico

Fuente. Elaboración propia

Posteriormente aplicando la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas

homogéneas dio como resultado que el estadístico t experimental es mayor al t

de tablas (23.30>2.57) por lo que se concluye que la concentración de fenoles

totales es superior en el extracto de propilenglicol que en el extracto etanólico

al 95 % de confianza.

Tabla 7. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas homogéneas

Concentración (EAG

mg/Kg) extracto etanólico Concentración (EAG mg/Kg) extracto con propilenglicol

GL 10

Estadístico t 23.30

p dos colas 4.43 x 10-10

Valor crítico de t (dos colas)

2.228

*EAG= equivalente a ácido gálico

Fuente. Elaboración propia

Dicha conclusión se corrobora con la probabilidad p de 4.43 x 10-10 que es

menor a 0.05 lo cual indica que la concentración de fenoles totales es diferente

al usar ambos solventes en tal sentido para la presente investigación se utilizó

el extracto con propilenglicol para la determinación de su capacidad

antioxidante.

41

4.5.6.- Comparación del método de cuantificación de fenoles totales

con Laboratorio Acreditado

En la Tabla 8 se muestran los resultados del análisis de fenoles totales

realizados en el Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad

Católica de Santa María.

Tabla 8. Cuantificación de Fenoles totales por el método Folin ciucalteu

N Concentración ácido

gálico (ppm) Absorbancia

1 0.625 0.050

2 1.250 0.093

3 1.875 0.156

4 2.500 0.219

5 3.125 0.277

Fuente. Adaptado del informe del Laboratorio de Ensayo y Control de Calidad

de la Universidad Católica de Santa María.

El resultado de graficar los valores de la Tabla 8 da como resultado la Figura

19 donde se observa que el coeficiente R2 es de 0.9962 Lo que indica que el

método es lineal al igual que el método realizado en la presente investigación.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

0.1

0.2

0.3

Abso

rbanci

a

Concentración (ácido gálico) (mg/L)

y = 0.0928 x - 0.015

R2 = 0.9962

Figura 19. Gráfico de calibración entre concentración de ácido gálico (mg/L) y

absorbancias promedio emitido por el Laboratorio de Ensayo y Control de

Calidad de la Universidad Católica de Santa María.

Fuente. Elaboración propia.

42

La cantidad de fenoles totales cuantificado por el Laboratorio de Ensayo y

Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa Maríadio como

resultado 55 mg/kg de ácido tánico que expresado en ácido gálico da como

resultado 5.51 mg de AG por Kg de caléndula, dicho resultado no difiere

significativamente con el resultado hallado en el laboratorio hallado en la

UPADS.

4.5.7.- Determinación de la capacidad antioxidante de Caléndula

officinalis L. (Caléndula) por el método de CUPRAC

En la Tabla 9 se observan los resultados de lectura de diferentes

concentraciones de Trolox 0.06, 0.1, 0.2, 0.03 y 0.4 mmol/L siendo sus

absorbancias resultantes de 0.010, 0.015, 0.026, 0.037 y 0.049nm.

Tabla 9. Valores del gráfico de calibración de concentración promedio de Trolox vs absorbancia promedio

Trolox (mg/L) Trolox (mmol/L) Absorbancia

15 0.06 0.010

25 0.1 0.015

50 0.2 0.026

75 0.3 0.037

100 0.4 0.049

Fuente. Elaboración Propia

Posteriormente graficando los datos de la Tabla 9 se obtiene la Figura 20

donde se observa un coeficiente R2 de 0.9997, el cual es mayor a 0.995,

siendo por lo tanto el método lineal.

43

0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45

0.02

0.04

Absorb

ancia

y = 0.1137 x + 0.0033

R2 = 0.9997

Trolox (mmol/L)

Figura 20. Gráfico de calibración para la determinación de la capacidad

antioxidante por el método de Cuprac

Fuente. Elaboración propia

El laboratorio de Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de

Santa María, según el método Cuprac determinó que la capacidad antioxidante

es de 71.27 mmol /kg trolox.

44

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN

La presente investigación tuvo por objetivo determinar los fenoles totales y la

capacidad antioxidante en pétalos de C. officinalis L. dado que existen reportes

sobre los efectos benéficos para la salud de diversos extractos metanólicos y

etanólicos, los cuales podrían atribuirse a los metabolitos secundarios de dicha

flor.

El ensayo de identificación de taninos por el método del cloruro férrico dio

como resultado positivo tras observarse el viraje de color verde, por otro lado,

la determinación de flavonoides por el método de Shinoda, dio positivo al

tornarse de color rojo magneta característico de flavonoles. Kumar,et al.(35),

realizó pruebas de Shinoda y Pew que resultaron positivas por la aparición del

color verde lo que indica que dichos resultados confirman que el compuesto

aislado es un flavonoide, además al igual que la presente investigación, Kumas

buscó identificar quercetina por ser uno de los flavonoles conocidos presentes

en C. officinalis L.

En cuanto a la identificación de quercetina por Cromatografía en Capa Fina

(CCF) Kumar,et al.(35), desarrolla una metodología de identificación de

quercetina usando marcadores o estándares de referenciaevaluando solventes

como n-butanol: ácido acético: agua (BAW - 4: 1: 5) y cloroformo: ácido acético:

agua (CAW-10: 9: 1) obteniendo Rf de 0.856 y 0.88 respetivamente,

En la presente tesis se identificaron bandas correspondientes a quercetina con

Rf de 0,82 y 0,84utilizando fases móviles de Tolueno: acetato de etilo: ácido

fórmico (5:4:1).

Por Soareset al. (29), Quienes realizaron ensayos de identificación con

estándares auténticos de quercetina (Rf = 0,82) ycanferol (Rf = 0,89) usando

como fase móvil acetato de etilo: metanol (100:10), así mismo, Tolueno:

acetato de etilo: ácido fórmico (5: 4: 1), Por otro lado Patil, et al.(28)Probaron

diferentes fases móviles y se confirmó la fase móvil que comprende n-butanol:

ácido acético: agua: ácido fórmico (7: 1: 1: 0,25) para la estimación simultánea

45

de rutina, quercetina y liquiritina. Logrando una migración de puntos con

valores de Rf entre 0,47, 0,63 y 0,82 respectivamente.

En la extracción asistida con propilenglicol dio como resultado que el extracto

de Caléndula officinalis L.presenta una concentración de fenoles totales de

5.410 ± 0.025 mg de ácido gálico/ kg de pétalos de caléndula yde 4.935 ±

0.043 mg de ácido gálico/ kg de pétalos de caléndula en el extracto etanólico.

Los valores hallados fueron comparados con los resultados del Laboratorio de

Ensayo y Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa María que dio

como resultado para la misma muestra 55 mg/kg de ácido tánico que

expresado en ácido gálico da como resultado 5.51 mg de ácido gálico por Kg

de caléndula, Siendo los resultados similares a los obtenidos, se concluye que

el método empleado en la presente investigación fue comparable a los de un

laboratorio acreditado. Por otro lado, se pudo determinar que la concentración

de fenoles totales es superior en el extracto con propilenglicol que en el

extracto etanólico al 95 % de confianza ya que el t experimental es mayor al t

de tablas (23.30>2.57).

En relación a la determinación de la capacidad antioxidante de los pétalos de

caléndula, es importante mencionar que Kundu y Surth (36), expone que, los

flavonoides y carotenoides son potentes antioxidantesa muy

bajasconcentraciones. En general, se cree que las propiedades

quimiopreventivasde los flavonoides reflejan su capacidad para eliminar las

ROS (Especies Reactivas de Oxigeno) endógenas, así mismoMatysiket al.

(37)Describe que al inhibir o estimular varias vías de señalización, los

flavonoides a bajaconcentración podrían afectar la función celular. Se ha

informado que laCaléndula officinalis L.contiene cumarinas, flavonoides que

incluyen quercetina, ácido protocatechuic, etc., triterpenoids-faradiol, ácido

oleanólico, beta-amirina, Calénduladiol, etc. y la narcisina alcaloide, en tal

sentido ,para el análisis de la capacidad antioxidante, se trabajó con el extracto

de pétalos de caléndula en propilenglycol obteniéndose 71,27 mmol /kg trolox,

estos resultados difieren con lo reportado por Domínguez en cuyo trabajo de

investigación se menciona que el extracto hidroalcohólico de las flores de

caléndula presenta una capacidad antioxidante de 148,8 mmol /de trolox (13)

46

esta diferencia se puede atribuir a diferentes factores como al tipo de solvente

que se utilizó para la extracción de los metabolitos secundarios, a la

procedencia de las flores de caléndula ya que según investigaciones el tipo de

suelo ,las condiciones climáticas ,las diferentes especies y el método de

recolección podrían afectar la producción y por lo tanto la concentración de los

metabolitos secundarios en una especie vegetal.

Otros investigadores comoKishimotoet al.(38), explica que las flores también

son ricas en carotenoides, de los cuales se ha informado que la flavoxantina

está presente en el 28,5% del total de carotenoides seguidos de la

luteoxantina. Nishinoet al.(39), indican -que los ingredientes de C. officinalis

como la luteína poseen un potencial quimiopreventivo y Bohm et al.(40),

comentan que se ha informado que el caroteno bloquea las especies reactivas

de oxígeno, además Herzog et al.(41), da como resultado que el licopeno

reduce constantemente los niveles de transcripción de las citoquinas

proinflamatorias. Por lo tanto,Korengathet al. (9), explica que la acción

combinada de los ingredientes activos presentes en C. officinalis a través de su

eliminación de radicales libres y la inhibición de los mediadores de la

inflamación, especialmente las citoquinas y prostaglandinas, puede ejercer la

actividad antiinflamatoria.

Preethi et al. (42), indica, queen su estudio el extracto de Caléndula officinalis

L.eliminó eficazmente los radicales superóxido, hidroxilo y óxido nítrico in vitro,

dichas afirmaciones refuerzan el cumplimientode nuestra hipótesis y los

resultados hallados en el laboratorio por el consumo de caléndula para la

eliminación de radicales libres los cuales se generan dentro del cuerpo durante

el metabolismo normal o en presencia de xenobióticos, sería una buena

alternativa.

Finalmente es importante mencionar que podría existir diferencia de resultados

en la misma especie de caléndula debido a las condiciones geográficas, el

abono y tipo de suelo, tal como lo expone Onofrei et al. (12)En su estudio,

donde encontró diferencia en general en cuanto a la producción de compuestos

fenólicos y de flavonoides comparando plantas fertilizadas con las no

fertilizadas, de manera consistente durante dos años consecutivos,

47

encontrando que la capacidad de eliminación de radicales libres de los

extractos de caléndula se incrementó como resultado de la fertilización

ecológica. Los fertilizantes más efectivos contenían altas cantidades de

nitrógeno, pero también bio humus y aceites vegetales que actúan como

bioestimulantes. Por lo tanto, la fertilización ecológica es la recomendada para

el cultivo de plantas de caléndula con un mayor valor de producto y

propiedades Fito-medicinales potenciales.

48

CONCLUSIONES

Primera: En los extractos de Caléndula officinalis L.se ha identificado

taninos, lo cual se evidencia con una coloración verde al reaccionar con el

FeCl3 al 5% y flavonoides al dar coloración rojo magneta con la prueba de

Shinoda.

Segunda: A través de la Cromatografía en capa fina, se identificó

quercetina con un Rfs de 0.82 (extracto etanólico) y 0.84 (extracto con

propilenglicol) usando como fase móvil tolueno: acetato de etilo: ácido

fórmico (5:4:1).

Tercera: La concentración de fenoles totales en Caléndula officinalis L Fue

de 5.410 ± 0.025 mg de AG/L de pétalos de caléndula en el extracto con

propilenglicol y de 4.935 ± 0.043 mg de AG/ L de pétalos de caléndula en el

extracto etanólico.

Cuarta: El extracto de propileglicol presentó mayor concentración de

fenoles totales en comparación con el extracto etanólico al 95 % de

confianza.

Quinta: La capacidad antioxidante del extracto con propileglicol de

Caléndula officinalis L.fue de 71.27 mmol/kg trolox.

49

SUGERENCIAS

Realizar estudios de la capacidad antioxidante de la Caléndula officinalis L.

(caléndula) utilizando otras partes de la planta (raíz, tallo, hoja, etc.)

Realizar estudios para identificar otras propiedades benéficas de los pétalos

Caléndula officinalis L. (Caléndula).

50

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53

APÉNDICES

54

Apéndice 1. Constancia de identificación taxonómica

55

Apéndice 2. Resultados de la Universidad Católica Santa María

56

Apéndice 3. Reconocimiento de la muestra Caléndula oficinales

Una vez que se clasifico taxonómicamente se prepara la muestra

estabilizando con agua y etanol, para posteriormente utilizarlos.

Una vez bien secados los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula)

se tritura para obtener un mayor rendimiento del soluto en el solvente.

57

Peso de los pétalos triturados de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en

balanza analítica

Extracción de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en

etanol y propilenglicol

58

Filtración de los pétalos de Caléndula officinalis L. (Caléndula) en etanol

30 gts por min.

Protección de la muestra Caléndula officinalis L. (Caléndula) de la luz.