Determinacion de Antocianinas2

8/13/2019 Determinacion de Antocianinas2

1/10

CAPTULO 6

6.1MATERIALES Y MTODOS

6.1.1 Materia prima

En esta investigacin se emple como materia prima, zarzamora (Rubus fructicosus)

cosechada en Huachinango, Puebla. La muestra se mantuvo en congelacin (-42C) hasta el

momento de su anlisis.

6.1.2 Caracterizacin fisicoqumica de materia primaLas zarzamoras se seleccionaron, evitando que tuvieran magulladuras o porciones

en descomposicin. Para todas las pruebas realizadas, la materia prima se descongel,

limpi y moli en una licuadora.

pH. Se determin con la ayuda de un potencimetro digital marca Beckham por

inmersin directa del electrodo previamente calibrado con buffers 4 y 7.

Dimensiones. Se utiliz un vernier para medir el largo y ancho de la zarzamora.

Determinacin de humedad. Se determin por diferencia de peso en una estufa de 100-

150C por 16 horas segn mtodo 950.46 (A.O.A.C., 2000).

Slidos solubles. Se realiz por medio de un refractmetro digital d de 0 a 32Brix,

ATAGO (Japn) a 25C, los resultados son expresados como Brix.

Acidez Total. Se realiz por titulacin con NaOH 0.1N usando un potencimetro para

la determinacin del punto final segn el mtodo 22.065 (A.O.A.C., 1984). Los

resultados son expresados en mg cido glico/100g de muestra.


2/10

ndice de madurez. Para obtener este valor se utiliz u clculo el cual consisti en

realizar el cociente de Brix/acidez.

6.1.3 Extraccin de antocianinasPara la extraccin de antocianinas se utilizaron distintos sistemas de extraccin:agua,

etanol (96%), mezcla de etanol-agua (70:30), mezcla de etanol-agua (50:50), mezcla de

etanol:agua acidificados, etanol 96%:HCl 1.5N(85:15).

Se pesaron 60g de la fruta, se molieron en una licuadora marca Oster, se colocaron en

un matraz, previamente cubierto con papel aluminio para evitar el paso de luz, y se

aforaron a 100mL del disolvente. Se cerr hermticamente y se mantuvo en agitacin a

25C, 30 y 35C por 2h. Transcurridas las 2h, al extracto se filtro tres veces, la primera con

manto de cielo, la segunda filtracin se llev a cabo, haciendo pasar el extracto por papel

Whatman del No. 4 y posteriormente se realiz una tercera filtracin con papel Whatman

del No.1 con embudo Buchner. En los extractos obtenidos se determin la cantidad de

antocianinas monomricas totales, fenoles totales, capacidad colorante, capacidad

antioxidante y antocianinas por cromatografa (HPLC) (Figura 7).

Para las extracciones realizadas a 30 y 35C, se utilizaron baos de agua y se control

la temperatura con un termmetro para evitar que la temperatura cambiara. Esto con el fin

de no degradar los compuestos fenlicos presentes en la zarzamora.


3/10

Pesar 60g zarzamora(Rubus fructicosus)

Moler zarzamora enlicuadora

AguaEtanol (96%)Etanol-agua(50:50, 70/30)Etanol acido

Agitar por 2hA 25, 20 y 35C

Cerrar hermticamente ycubrir del sol

Colocar agitadormagntico

Verter en matraz

Erlenmeyer

Aforar con disolvente a100mL

Verter en matraz aforado

Extracto

Filtrar con papelwhatman no. 4 y no. 1

Figura 7. Diagrama de flujo para extraccin


4/10

6.1.4 Determinacin antocianinas totales (AT)Para determinar la cantidad de antocianinas monomricas totales(AT) se utiliz el

mtodo del pH diferencial. Este mtodo permite la estimacin alternativa del contenido de

antocianinas totales. Se determin el contenido total de antocianinas aplicando la

metodologa descrita por Guisti (2001). Se utilizaron dos sistemas tampn: cloruro de

potasio(KCl) 0.0025M a pH 1.0 y acetato de sodio (CH3COONa) 0.4M apH 4.5. A 200L de

extracto (para conseguir una absorbancia en el rango de 0.10-1.20 a 510nm) se aadieron

7mL de la correspondiente solucin tampn y se midi la absorbancia frente a un blanco a

510 y 700nm con un espectrofotmetro Cary 100(Figura 7). Se calcul la absorbancia finala partir de la ecuacin 1:

A = (Amax. vis A700 nm)pH1.0- (Amax vis A700 nm)pH4.5EC.1

Para conocer la concentracin de AT se utiliz la ecuacin 2:

Antocianinas monomricos (mg/100g) = A*PM*FD*100/(*1) EC. 2

Donde:

A = Absorbancia; PM = peso molecular, FD = Factor de dilucin; = absortividad molar

La concentracin final de antocianinas (mg/100 g de fruta) se calcula en base al

volumen de extracto y peso de muestra. Como la antocianina predominante en la zarzamora

es cianidina-3-glucsido, se utiliz su peso molecular (PM) de 449.20 y absortividad molar

() de 26,900. Los valores de FD variaron dependiendo de la cantidad de muestra diluida.

6.1.5 Determinacin de fenoles totales (FT)El mtodo espectrofotomtrico desarrollado por Folin y Ciocalteau, para la

determinacin de fenoles totales, se fundamenta en su carcter reductor y es el ms

empleado (Singleton). Se colocaron 200L de extracto (para conseguir una absorbancia en
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbonohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Carbonohttp://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sodiohttp://es.wikipedia.org/wiki/Sodiohttp://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Carbonohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Carbono


5/10

el rango de 0.100-1.200 a max=765nm) en un matraz aforado y se aadieron 2.5mL de

reactivo de Folin, se dej reposar por un lapso de tiempo de 3minutos. Se agregaron 5mL

de carbonato de sodio (Na2CO3al 20%p/v) y se aforo a 50mL. La mezcla se dejo reposar

por 30minutos; una vez transcurrido este tiempo se midi la absorbancia a 765nm con un

espectrofotmetro Cary 100 (Figura 6). Para conocer la concentracin del extracto se

prepar una curva estndar de cido glico con diferentes concentraciones (Tabla 8).

Tabla 8.Datos para curva estndar de cido glico

Concentracin

(ppm)

Absorbancia

(max=765nm)1000 0.9245

750 0.8166500 0.4275

250 0.1716

100 0.0477

50 0.0173

Se hizo la regresin lineal de la curva y se obtuvo la ecuacin:

0682.01126.0 = xy EC.3

Para conocer la concentracin de los extractos se despejo la ecuacin 1 obteniendo:

1126.0

0682.0+=

yx EC.4

Dondey es el valor de la absorbancia y x es la concentracin. Los resultados se expresan en

mg de cido glico por 100g de pulpa de fruta.


6/10

Volumen de extracto 200-500L

Leer enespectrofotmetro a

max=765nm

2.5mL reactivo de Foulin

5mL NaCO3(20%p/v)

Aforar con agua destilada a 50mL

3min

30min

Figura 8.Diagrama de flujo para determinacin de fenoles totales presentes en zarzamora

6.1.6 Determinacin de capacidad antioxidante por mtodo ABTS

Segn la metodologa desarrollada por RE y descrita por Kuskoski (2005), el

radical ABTS+

se obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM) con persulfato potsico (2.45mM) incubados a temperatura ambiente (25C) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez

formado el radical ABTS+ se diluy con etanol absoluto hasta obtener un valor de

absorbancia(A) comprendido entre 0.700.02 a la longitud de mxima absorcin 754nm.

Cada extracto se diluy con 2mL de etanol absoluto. A 20L de esta solucin se

aadieron 980L de dilucin del radical ABTS+y se midi la absorbancia del blanco y del

extracto al minuto 1 y minuto 7. Para conocer la capacidad antioxidante de los extractos se

elaboraron curvas estndar de cido ascrbico y de antioxidante sinttico de referencia. El

antioxidante sinttico de referencia, Trolox, se ensay a una concentracin de 0-15 M

(concentracin final) en etanol, bajo las mismas condiciones, lo que se hizo tambin con

cido ascrbico (0-20 mg/100mL).


7/10

Para las curvas obtenidas se calcul la regresin lineal de ambas curvas y se

obtuvieron las ecuaciones para Trolox y cido ascrbico respectivamente:

3627.2779.15 += xy EC.5

En el caso de cido ascrbico se obtuvo:

3798.05.281 += xy EC.6

Los resultados se expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) y

en VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C), en este ltimo caso por

tratarse de alimentos.

6.1.7 Determinacin de color de antocianinas

Se colocaron 20ml de extracto en una celda BYK-Gardner para colormetro en

modo transmitancia, se obtuvieron las coordenadas colorimtricas (L*, a* y b*).

Donde L* representa claridad, a* componente de color rojo/verde y b* componente de

color amarillo/azul.

6.1.8 Determinacin de antocianinas por HPLCSe realiz un anlisis cualitativo de los extractos, este anlisis se llev a cabo

mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en un cromatgrafo Waters con

detector de multidiodos siguiendo la metodologa descrita por (Wrolstad et al., 1994). La

adquisicin y procesamiento de la informacin cromatogrfica se llev a cabo con el

sistema Empower. La separacin de los compuestos se realiz en una columna C-18 de fase

reversa de 10 cm de longitud, de 3.5 m de tamao de partcula, a un flujo de 1.0 mL/ min.

El volumen de la muestra inyectada fue de 50 L y el anlisis se realiz a temperatura

ambiente. La separacin se desarroll en gradiente utilizando una mezcla de acetonitrilo y

cido fsfrico al 4.5% (Tabla 9).


8/10

Tabla 9. Condiciones de anlisis para la separacin de antocianinas por HPLC.

Tiempo (min) % Acetonitrilo % cido fosfrico 4.0%

0 0 1005 0 10020 20 8025 40 6030 0 100

Con las condiciones descritas con anterioridad se obtuvieron los cromatogramas

para conocer las antocianinas presentes en los extractos.

Previo a la inyeccin de la muestra en el cromatgrafo, el extracto se purific. Para

llevar a cabo la purificacin se sigui la metodologa utilizada por Rodrguez- Saona;

Wrolstad, R. (2001).

En la Figura 9 se muestra el diagrama de flujo en el cual se describe el proceso de

purificacin al cual fue sometido el extracto para poder ser inyectado en el equipo. Es

importante mencionar que en la purificacin del extracto se puso especial atencin cuando

se inyect el extracto en el cartucho, el volumen aplicado a los cartuchos dependiprincipalmente de la cantidad de muestras si al pasar el extracto por el cartucho sala el

pigmento por el lado contrario al cual fue inyectado se disminuy la cantidad de extracto

inyectado.


9/10

Pasar 3 volmenes de aguaacidificada

Eluir pigmento con metanolacidificado

Recoger en matraz bola

Disolver con agua acidificada

Eliminar metanol en rotavapora 40C

Inyectar en el cromatgrafo un

volumen de 50L

Pasar extracto a travs delcartucho

Pasar 2 volmenes de metanola travs de resina

Figura 9. Diagrama de flujo para purificacin de extracto


10/10

6.1.9 Estabilidad

En la Tabla 10 se muestran las condiciones de almacenamiento a las cuales fueron

sometidos los extractos del sistema con mejor rendimiento.

Tabla 10. Condiciones de almacenamiento

Temperatura Luz

Refrigeracin (4C) Ausencia y presencia

Ambiente (25C) Ausencia y presencia

A los extractos almacenados se les determin: AT, FT, capacidad antioxidante y

color cada cinco das por un lapso de 30 das.

Documents

Determinacion de Antocianinas2