Determinación de células formadoras de anticuerpos

Laboratorio de inmunología 2011

Objetivo: Poner de manifiesto en un cultivo in vitro la existencia de células que producen anticuerpos en un animal inmunizado.

Célula formadora de anticuerpo

Las células plasmáticas  pertenecen al sistema inmunitario y su papel consiste en la secreción de grandes cantidades de anticuerpos.

Se diferencian a partir de los linfocitos B gracias a la estimulación de los linfocitos CD4+

Las células plasmáticas se originan en la médula ósea, posteriormente se desplazan al bazo o a los nódulos linfáticos para secretar anticuerpos (aproximadamente 10 000 por segundo)

Célula Th

Célula B

Célula plasmáticaAnticuerpos secretados

Método de Jerne

El método de placas hemolíticas da la idea del número de células formadoras de anticuerpo en una población.

Las placas hemolíticas fueron desarrolladas por Niels Jerne, en 1963.

Estas células se denominan células formadoras de placa (CFP).

Demostrar, en forma experimental, la sensibilización previa de una animal

frente a un antígeno, estudiando in-vitro la capacidad de los linfocitos B para producir anticuerpos, y analizando el

fenómeno de la interacción celular requerida tanto durante la presentación

del antígeno como en el proceso de activación de la célula B por la célula T

Medida cuantitativa de las células productoras de anticuerpo contra un antígeno.

Las placas que se obtienen directamente, representan principalmente células que producen IgM, pues este anticuerpo tiene una alta eficiencia

hemolítica.

Para demostrar células que sintetizan IgG

(placas indirectas)

Recubrir la superficie del

eritrocito

Favorecer la unión del complemento al complejo eritrocito- anticuerpo IgG, añadiendo antes suero anti-IgG

Identificar distintas células, que fabriquen anticuerpos pertenecientes a diferentes subclases,

suponiendo que se posea los antisueros apropiados.

Modificaciones de la técnica de Jerne

Golub, Mishell y Dutton: Esta modificación emplea toxoide de difteria, con la finalidad de obtener una mayor cantidad de anticuerpos.

Schwartz Braun: Es una prueba con bacterina, emplea E.coli muertas por calor. Se lleva a cabo con células del bazo + E. colì viva + agar+MEM. Se le adiciona complemento y permite la lisis

Nossal, Warner y Lewis: Inmuniza a conejo con Salmonella typhi; emplea Células de ganglios linfáticos, Sangra al conejo a los 5 días y un segundo conejo a los 21 días Observa una primera respuesta que es IgM (respuesta primaria) y IgG (respuesta secundaria).

Cunningham y Szemberg: Emplea portaobjetos en lugar de placas, no utiliza agarosa. Emplea células+GRG+MEM

Metodología

2-3 días previo a la práctica

0.1 mL de GRC al 10 %

Organza sobre un vaso de precipitados

Sacrificar. dislocación cervical

Extraer el bazo

La solución salina balanceada de Hank es un medio de cultivo estándar utilizado para la conservación celular.Ph de 7.2

5 mL Sol. Hank.Macerar

Dejar reposar5 min.

Metodología

Metodología

Dilución 1:5Sol. Hank

43°C 2 mL. agar al 0.8%

GRC0.15 mL

S. Celular0.1 mL

Incubar 37°C45 min.

El anticuerpo secretado por una célula se difundirá a

través del agar, reaccionara con los eritrocitos, y

formara un complejo

localizado, antígeno-

anticuerpo.

1.5 mL. Suero de cobayo1:10

Incubar 37°C. 30 min.

Cuando se añade complemento a la capa de eritrocito-linfocito, solo aquellos eritrocitos que han reaccionado con el anticuerpo se fijarán el complemento y se consumara su lisis, estos producen zonas localizadas de

hemolisis.

Células en el bazo

Colorante de Türk.Solución de violeta de genciana ácido

acético.Para conteo de leucocitos en Cámara de

NeubauerEl acido acetico contenido en la

solución hemoliza los eritrocitos y el colorante contenido tiñe los leucocitos

Dilución 1:5Colorante Türk

Resultados

# Promedio de UFA

# leucocitos/0.1 mL bazo

CFA/10^6 células de bazo

1 577.33 18.9^6 30.54

2 267 16.25*10^6 164.3

3 350.33 8.85*^6 39.58

4 301.3 1.97*10^6 152.94

5 25 40.5*10^4 62.18

6 344-3 1.0 75*10^6 319.7

Memoria de calculo

Referencias