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“Determinación de patrones de inducción de lacasas en
el hongo Trametes sp. EUM1”
T E S I S Que para obtener el grado de Especialización en Biotecnología
P R E S E N T A
I.B.I. Angel Eduardo Márquez Ortega
Director de Tesis
Dr. Octavio Loera Corral
Asesores
Dra. Ainhoa Arana Cuenca
Dr. Gustavo Viniegra González
México, D.F. Marzo 2004
AGRADECIMIENTOS Al Dr. Gustavo Viniegra González por la oportunidad que me brindo para la realización de esta especialización en su grupo de trabajo. También por el apoyo económico proporcionado mientras duro el postgrado. Al Dr. Octavio Loera Corral por su amistad, su confianza, su asesoría y dirección de tesis durante la realización de la especialización. A la Dra. Ainhoa Arana Cuenca por su amistad, su asesoría y paciencia, en la realización de este proyecto. A los compañeros de laboratorio: Javier, Francisco, Myrna, Marisol, Víctor, Alejandro, Cesar, Diana , Ruth por brindarme su amistad y apoyo. A Juan, Leticia, Juan Manuel, Ivonne, Pablo, Omar, Jessica, Sufro, Vianey, Gustavo, Fernando y a los profesores Francisco Cruz Sosa y José Angel Lechuga Corchado. A todos ellos les agradezco su amistad, apoyo y confianza que me han brindado durante el tiempo que tengo de conocerlos. Agradezco también a mi familia por el apoyo que me brindaron al tomar la decisión de continuar mis estudios con la realización de este postgrado. A todos los compañeros y amigos que tuvieron la confianza de apoyarme en todo este tiempo de conocerlos.
RESUMEN Las lacasas son polifenoloxidasas (p difenol oxidasas), producidas por plantas, bacterias y
hongos. Participan en procesos biológicos, tales como producción de pigmento y
degradación de lignina, entre otros. Se utilizan en la industria para la degradación de
compuestos fenólicos y lignina o en eliminación de compuestos tóxicos. Algunas lacasas
son inducibles, ya que utilizan compuestos con estructuras muy similares a los sustratos de
la enzima y que sirven como señal a la célula para que se produzcan. Se han extraído a
partir de cultivos de microorganismos realizados en medios líquido y sólido. Los hongos
del género Trametes, son considerados como parásitos de los bosques y algunos de ellos
crecen en forma de laminas horizontales sobre la madera. En la presente investigación, se
propago la cepa de Trametes sp. EUM1, en medio Kirk (medio definido) sólido con 2,2´
Azino-bis(ácido 3-etilbenzo-tiazolino-6-sulfónico) (ABTS) como sustrato para verificar la
presencia de la enzima. En la determinación de la actividad Enzimática por halos de
oxidación, se observó que la edad del micelio y el método de inoculación tienen efecto
sobre la detección de las lacasas, teniendo mejores resultados con el micelio maduro y la
inoculación con pellet. El crecimiento radial del hongo tuvo una velocidad radial
aproximada de 0.1783 mm/h en el medio Kirk sin inductores. Los compuestos probados
como posibles inductores fueron: alcohol veratrílico, ácido ferúlico, catecol, ácido tánico,
ácido 3,4-dimetoxibenzoico o ácido verátrico, 2,6 dimetoxifenol, D-fenilalanina, ácido
gálico, el sulfato de cobre a una concentración de 0.37 mM y sirigaldazina a concentración
de 0.037 mM; se obtuvo que el sulfato de cobre y el alcohol veratrílico no tuvieron
capacidad para inducir la actividad lacasa del hongo; mientras que el ácido tánico y el
catecol inhibieron la producción de las lacasas; por otro lado, el ácido ferúlico y el ácido
verátrico fueron los inductores más potentes y que no afectaron la velocidad radial de
crecimiento. Estos dos compuestos se utilizaron en fermentación líquida sin agitación para
ver el efecto de inducción en una cinética. Los resultados mostraron que al combinar la
temperatura (39°C), un pH controlado (4.7-5.4) y con el ácido ferúlico, se obtuvieron
extractos que mantienen el 85% de la actividad después de incubarse a 60°C durante una
hora, debido a la producción de lacasas termotolerantes. Confirmando así que la producción
de las lacasas cambian durante el proceso de crecimiento y los compuestos inductores
tienen efectos distintos según la especie analizada.
Índice General INDICE GENERAL INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
ANTECEDENTES ................................................................................................. 3
Características del genero Trametes sp. ................................................................ 5
Degradación de lignina .......................................................................................... 7
Microorganismos Termofílicos ............................................................................. 10
Enzimas Ligninolíticas ........................................................................................... 12
Las lacasas ............................................................................................................... 13
Inducción de lacasas .............................................................................................. 14
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 17
HIPÓTESIS .......................................................................................................... 18
OBJETIVO GENERAL ......................................................................................... 18
OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................ 18
MATERIALES Y METODOS .............................................................................. 19
Microorganismo .................................................................................................. 19
Medio de Cultivo ................................................................................................... 19
Propagación de la cepa ........................................................................................ 20
Compuestos para los ensayos ................................................................................ 20
Ensayos Cualitativos en Placa ............................................................................. 22
Ensayo de Fermentación Líquida sin agitación ..................................................... 24
Determinaciones analíticas ................................................................................... 24
i
Índice General
RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................................................... 27
Propagación de la cepa .......................................................................................... 27
Efecto de la edad del micelio sobre la detección de las lacasas ............................ 27
Crecimiento del micelio a 28°C .......................................................................... 29
Halos de oxidación ................................................................................................. 31
Índice de potencia ................................................................................................ 35
Efecto de la temperatura en el micelio sobre la detección de la s lacasas ........... 37
Fermentación líquida sin agitación ..................................................................... 43
RESUMEN DE LOS RESULTADOS........................................................................ 52 CONCLUSIONES .............................................................................................. 54
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 55
ii
Introducción
INTRODUCCION Uno de los grandes problemas que enfrentan las ciudades, es la contaminación, debido a la
explosión demográfica y nos ha llevado hacia la contaminación del agua, el aire y el suelo.
Por lo que en los últimos años, los investigadores se han enfocado a descubrir o
perfeccionar procesos que puedan disminuir la contaminación. Dentro de esta remediación
se encuentran los procesos físicos y químicos, que tienen la desventaja de resolver un
problema y crean otro. Estos procesos pueden eliminar un tipo de contaminación, pero
crear algún otro tipo de contaminación (Aburto y Quintero, 2001).
Entre los problemas más frecuentes de contaminación, en las corrientes de origen industrial
se encuentran los productos de tipo aromático, es decir que están formados de anillos con
dobles ligaduras resonantes. Por ejemplo: los colorantes derivados de las industria textil y
los polifenoles presentes en los licores negros de la industria de la celulosa y el papel.
La oxidación de esos compuestos pueden realizarse con facilidad usando hipoclorito de
sodio pero la reacción produce cloro-bencenos que son cancerigenos y por tanto, peores
contaminantes que los compuestos aromáticos originales.
Otra alternativa es usar el peroxido de hidrogeno como oxidante que no genera
contaminación pero tiene un cierto costo pues se va como reactante no catalítico.
Una tercera alternativa es usar enzimas oxidasas que utilizan el oxigeno como aceptor de
hidrógenos y genera peróxidos y superóxidos de cobre en los sitios de esas enzimas. A su
vez estos superóxidos pueden oxidar compuestos orgánicos como los poli-fenoles o
también, las peroxidasas pueden oxidar compuestos mediadores, que al elevarse su
concentración pueden oxidar compuestos que no son oxidados por el sitio activo de la
enzima según el esquema siguiente (Thurston, 1994):
1
Introducción
Enzima
Cu
Cu
O
O
OH
CH3
H+ Enzima
Cu
Cu
O
CH3
OHH
O
CH3
Enzima
Cu
Cu
O2
Compuesto inestable
Quinona
+ + + +
En este trabajo se pretende caracterizar la capacidad de producción de un hongo del genero
Trametes sp., aislado en la Mérida, Yucatán por Medina (2003) y productor de activados de
lacasas, resistentes a temperaturas mayores de 60°C. Para ello se realizó un estudio de
crecimiento del basidiomiceto y del efecto de diversos inductores de las enzimas lacasas
bajo condiciones de laboratorio.
En particular se pretende seleccionar un compuesto inductor de la síntesis de lacasas por
una cepa de Trametes sp.
2
Antecedentes
ANTECEDENTES Desde el tiempo de Aristóteles se habían clasificado a los hongos dentro del reino vegetal,
ya que para los biólogos era más fácil clasificar a los seres vivos solo en dos reinos (animal
y vegetal). Sin embargo, en 1969 Whittaker ( Herrera y Ulloa, 1998 ), fundamentó el nivel
de organización celular y el tipo de nutrición de los seres vivos, sirviendo así al sistema
sostenido por Nolan y Margoliash (1968), en el cual se contemplaban los cinco reinos en
los que se clasificarían los seres vivos (Monera, Protista, Fungi, Plantae y Animalia), en
donde los hongos fueron colocados en el reino Fungi porque sus características
morfológicas, fisiológicas y taxonómicas son diferentes a las contempladas en el reino
vegetal y animal.
Por otro lado, los hongos se encuentran ampliamente distribuidos por toda la tierra y viven
en cualquier sitio que presente materia orgánica, agua y temperaturas apropiadas,
comprendidas generalmente entre 4 y 60°C ( Herrera y Ulloa, 1998 ).
Los hongo se encuentran clasificados como saprobios, parásitos y simbiontes. Los
saprobios utilizan sustancias orgánicas inertes, muchas de ellas en descomposición, que
pueden ser reservas de otros organismos, productos de excreción y excrementos de los
mismos, o restos de vegetales y animales. Los hongos parásitos se desarrollan en otros
organismos vivos en los cuales son sus huéspedes y se nutren de las sustancias que hay en
sus células vivas. Por ultimó, los simbiontes se asocian con otros seres, prestándose mutua
ayuda en sus funciones ( Herrera y Ulloa, 1998 ).
En la clasificación más simple de los hongos se divide en micromicetos y macromicetos,
estos últimos se diferencian de los micromicetes por presentar cuerpos fructíferos. Los
hongos producen micelio, los cuales están formados por un conjunto de hifas o filamento
que son la estructura fundamental y pueden ser de tipo cenocítico, si no presenta
tabicaciones o septos, o puede ser micelio con tabicaciones, como se muestra en la figura 1
(Castillo, 1987 ).
3
Antecedentes
Figura 1. a) Estructura plasmodial de hongos inferiores dentro de una célula hospedera.
b) hifas conocíticas. c) Hifas septadas o tabicadas.
La clase de los basidiomicetos pertenecen a la división Eucomycota (hongos verdaderos
con pared) en el reino Fungí (Singer y Harris, 1987), estos incluyen a las setas y los
hongos, que forman cuerpos fructíferos en forma de repisas sobre la madera; estas
características también incluyen producción de esporas sexuales en una célula especial
llamada basidio y la reproducción asexual se realiza por conidios o esporas cuando existen
estos dos tipos de estructuras (Deacon, 1993). Los basidiomicetos a su vez se dividen en
los siguientes ordenes: Auriculariales, Aphyllophorales, Agaricales y Gasteromicetos
(Guzmán y col., 1993).
El hongo Trametes sp., en la actualidad se le adscribe dentro de esta clase de los
basidiomicetos en el orden Aphyllophorales y la familia Polyporacea.
Una de las propiedades de los hongos del genero Trametes, es la degradación de la lignina
para facilitar la digestión de la celulosa (Henzkill y col., 1998) y entre las enzimas que
emplean estos hongos para ese fin se encuentran las llamadas lacasas. Porque tienen la
capacidad de oxidar a la lignina por medio de la acción de diversos mediadores(Young y
col., 1995).
4
Antecedentes
Características del genero Trametes sp.
Este hongo pertenece al orden de los Aphylophorales superiores, se encuentran dentro de
los macromicetes, y como todos los de su orden goza de una mala reputación, ya que son
considerados como hongos parásitos o patogénicos de los bosques; crecen atacando a varias
especies de árboles. Son imputrescible, conservando su integridad y algunos de ellos crecen
en forma laminar sobre la madera, por lo cual son conocidos como repisas de la madera. En
el género Trametes frecuentemente su receptáculo es estacionario, la trama espesa y clara;
los tubos huecos son de dimensiones considerables, frecuentemente lameloides, separados
por tabiques algo espesos. Sus esporas son hialinas, lisas y sin cistides. Se pueden clasificar
este genero según el color de su trama:
- Rojo, siendo característico Trametes cinnabarium con los poros rojo bermellón,
produce una podredumbre blanca sobre numerosos árboles frondosos.
- Leonado, de olor anisado, principalmente el Trametes odorata, cuyo sombrero
velloso, rojizo, pardo y con un margen de color vivo, este es de podredumbre parda,
el cual destruye abetos y alerces de la montaña.
- Pardo-ocre, inodoro, involucra al Trametes trabea, con sombrero abollado y
fomentoso, leonado con himenio color gamuza común sobre todos los bosques
muertos.
- Blanco, este se encuentra en numerosas especies, entre las cuales se encuentran:
Trametes hispida (figura 2), con sombrero gris pardo, erizado, leonado, propio de
bosques frondosos. Trametes gibosa, muy común, el cual tiene sombrero
pubescente, con zonas blanquecinas, poros frecuentemente alargados.
5
Antecedentes
- Trametes rubescens que tiene su sombrero menos espeso y oscuro, lo que permite
que se distinga menos, se identifica bien por el color y la forma plana del sombrero
con poros encarnados rosas o rojizos propiamente se encuentran sobre sauces y
alisos.
- Los Lenzites son otro tipo de hongos que pertenecen a la familia de los
polyporaceae y tienen la apariencia muy semejante a Trametes sp.; Lenzites tricolor
se encuentran sobre los cerezos, los poros son alargados, con desviaciones
lameloides lineares, su sombrero es pardo púrpura, frecuentemente con franjas más
claras y triple carácter (hymenia, pileique y estacional) que lo distingue del
Trametes rubescens, pero que muestra la proximidad estrecha al genero Trametes.
- Lenzites sapiaria (figura 2) cosmopolita y fuerte se encuentra comúnmente en los
bosques de confieras, producen una podredumbre parda y ceniza se reconoce por su
bello color azafranado o leonado, marrón y su sombrero erizado con algunas zonas
desnudas, en sus laminas rígidas, aserradas, dentadas, estriadas a lo ancho,
azafranadas, su carne es herrumbrosa, la distingue de su especie vecina L. abietina
en las fructificaciones por otras partes menos vivas y coloreadas, por la ausencia de
cistides emergentes y al parecer espesas que es lo último que revela.
- El Trametes del roble (T. quercina) es una de los poliforos más comunes en los
robledales de Europa pero no daña los postes de las casas y los bosques. Son
propios de los bosques muertos y los castaños, es reconocido por sus almohadillas
espesas, distones ramificados y sus diversas formas, se puede colocar, ya sea en los
Trametes o en los Lenzites.
- Lenzites del abedules muestra con las laminas bien dibujadas, blanquecinas, el
sombrero espeso, de un gris pálido uniforme fomentoso ( Heim, 1957).
6
Antecedentes
Figura 2.
A: Trametes hispida
B: (a) y (b): Lenzites saepiara. A
peine réd.
Degradación de lignina
La lignina es un polímero aromático complejo, no es lineal, heterogéneo y es un compuesto
no estéreoregular compuesto por unidades de fenilpropano y es constituyente de muchas
fibras vegetales. Los hongo de podredumbre blanca son organismos capaces de degradar
completamente la lignina a CO2 y H2O. En la figura 3, se presenta la lignina que comprende
16 unidades de fenilpropano unidas en forma de C-O o en forma de C-C (López, 2001).
Uno de los hongos que degradan lignina y que han sido más estudiados es el hongo
Phanerochaete chrysosporium, siendo este trabajo ampliamente revisado (Buswell y Odier,
1987; Alic y Gold, 1991; Kuan y col., 1991; Cullen y Kersten, 1992, 1996).
7
Antecedentes
El sistema ligninolítico de Phanerochaete chrysosporium no es inducido por la lignina
pero aparece dentro del metabolismo secundario, es decir, cuando el crecimiento primario
cesa por el consumo de algunos nutrientes (Kirk y col., 1978). El metabolismo secundario
es activado por el nitrógeno, carbono y limitaciones de sulfato pero no por limitaciones de
fosfato (Jeffries y col.,1981). Aparentemente, la regulación del metabolismo secundario,
incluyendo la degradación de la lignina, es conectada con el metabolismo del glutamato
(Kirk, 1981). Estos medios se pueden ver afectados por la limitación del nitrógeno, para
que ocurra la degradación de la lignina. Por lo cual, Kirk y Fenn (1982) especulan que la
degradación de la lignina es un evento del metabolismo secundario por el contenido muy
bajo de nitrógeno de la madera (Merrill y Crowling, 1966). Después de que el hongo invade
la madera, el nitrógeno es limitante para el metabolismo secundario, incluyendo la
degradación de la lignina.
A través del ayuno del nitrógeno, se produce el estimulo para la degradación de la lignina
en los hongos de podredumbre blanca es común, pero no siempre es una regla (Leatham y
Kirk, 1983). Algo que sí es cierto cuando se adiciona nitrógeno al medio donde crece el
hongo, éste puede incrementar la eficiencia para degradar la lignina o compuestos
relacionados con la lignina sirviendo para muchas de las aplicaciones en biotecnología.
Otro aspecto importante en la degradación de la lignina es la temperatura, ya que se ha
observado que por ser un polímero la lignina es muy difícil de degradar y se ha encontrado
que grupos de microorganismos mesófilos y termófilos muestran la capacidad de degradar
ampliamente a la lignina (Rosenberg, 1978).
8
Antecedentes
Figura 3. Modelo estructural de la lignina en la madera (Leowonicz y col., 1999).
9
Antecedentes
Microorganismos Termofílicos
Los microorganismos pueden ser clasificados de acuerdo a la óptima temperatura de su
crecimiento y su temperatura máxima. Pero, la clasificación de los termofílicos no es muy
precisa y depende de los diferentes grupos de microorganismos (Kristjansson, 1989). La
temperatura de crecimiento de estos microorganismos está en un intervalo de 45 a 80°C
(Madigan y Martinko, 1998).
Por más de un siglo se ha tenido la interrogante del origen de los microorganismos
termofílicos. Dos hipótesis han sido propuestas: i) los primeros microorganismos se
originaron en medios ambientes a altas temperaturas, y a partir de éstos subsecuentemente
se derivaron otros microorganismos y ii) los primeros microorganismos no fueron
termofílicos pero se fueron adaptando a condiciones de temperatura moderada, y se
originaron secundariamente a partir de los tipos psicrofílicos y mesofílicos (Brock, 1985).
La aplicación de microorganismos termofílicos en procesos biotecnológicos tiene varias
ventajas (Weigel y Ljunghdal, 1984), las cuales son necesarias para procesos a distintas
temperaturas y no precisamente a altas temperaturas:
- Aumenta la velocidad de formación de producto por su alta actividad metabólica. - Disminuye la contaminación del cultivo, debido a que la temperatura limita el
crecimiento de otros microorganismos.
- Se eliminan o disminuyen los sistemas de enfriamiento durante el cultivo.
- Para detener el cultivo no es necesario enfriar por debajo de 20°C.
- Incrementan las velocidades de difusión, ionización y solubilidad de químicos.
- Disminuye la densidad, la tensión superficial y la viscosidad del cultivo.
10
Antecedentes
- Fácil recuperación de productos volátiles directamente desde el cultivo y durante el
proceso de fermentación.
- Producción de proteínas termoestables.
- Baja producción de biomasa pero alta velocidad de conversión de sustrato a producto.
Los hongos termofílicos juegan un papel importante en el composteo de la materia
orgánica. Estos organismos crecen óptimamente a temperaturas de más de 40°C. Las
temperaturas optimas de muchas especies están entre 45 y 50 °C, y la máxima temperatura
es observada a los 60°C para casi todas las especies, a través de esporas pueden sobrevivir a
altas temperaturas. Los hongos termofílicos crecen masivamente durante la última fase del
proceso de composteo, para que las esporas que sobreviven al proceso de pasteurización;
esto eleva la calidad de la composta. Por lo tanto estos tipos de microorganismos son
utilizados ampliamente en la producción (Wiegant, 1992).
Todos los seres vivos llevan acabo su metabolismo mediante los procesos enzimáticos, y
los microorganismos termofílicos no son la excepción, ya que estos producen enzimas y
algunas de ellas resisten temperaturas relativamente altas llamadas enzimas termoestables.
La termoestabilidad es una propiedad buscada en estas nuevas enzimas debido a que
presentan las siguientes ventajas en procesos industriales: a) algunas de estas enzimas son
estables a altas temperaturas(60°C); b) se almacenan fácilmente; c) tienen un alto número
de recambio que es estable cuando se aplican altas temperaturas, (Weigel y Ljunghdal,
1984); la velocidad de reacción aproximadamente se duplica al incrementar la temperatura
10°C, (Zamost y col. 1991); al incrementar la temperatura se evita la contaminación del
sistema de reacción y aumenta la resistencia a los agentes desnaturalizantes (Kristjansson,
1989). Otro aspecto que se ha observado es que algunas de estas enzimas tienen la
capacidad de degradar a la lignina, por esto a estas enzimas termofílicas se les llama
enzimas ligninolíticas (Rosenberg, 1978).
11
Antecedentes
Enzimas Ligninolíticas
Las enzimas ligninolíticas, son enzimas que tienen la capacidad de degradar la lignina. En
la actualidad, existen dos teorías que tratan de explicar su modo de acción. La primera
teoría fue planteada por Cullen (1997) la cual sostiene que el conjunto de enzimas
ligninolíticas está formado por aquellas que están involucradas directamente en la
degradación de la madera: diferentes tipos de oxidasas y enzimas productoras de peróxido
de hidrógeno. En cambio, Leonowickz y colaboradores (1999) y proponen que el conjunto
de enzimas ligninolíticas está formado por enzimas que actúan directamente sobre la
madera (tanto sobre la lignina como sobre la celulosa y la hemicelulosa); y cooperan con
las del primer grupo, pero que no atacan directamente a la madera por sí solas y, por último,
enzimas de retroalimentación que enlazan las diferentes vías metabólicas durante la
biodegradación de la madera (Arana y col., 2003).
Entre las enzimas que juegan un papel importante en la despolimerización de la lignina, se
incluyen dos peroxidasas extracelulares: la lignino peroxidasa (LiP) y la manganeso
peroxidasa (MnP) generando así H2O2 en el sistema. Por otra parte, existen hongos que
secretan una combinación de peroxidasas y oxidasas (Peri y Gold, 1991). Dentro de las
oxidasas que se producen en estos hongos se encuentra las lacasas que no necesitan de
H2O2 para su acción. Trametes versicolor y Phlebia radiata que producen una o mas
lacasas junto con LiP y MnP (Fahreaus y Reinhammar, 1967; Niku-Paavola y col., 1988) y
así se pueden enumerar muchos más hongo de podredumbre blanca que secretan tanto
oxidasas como peroxidasas para degradar a la lignina. Un componente esencial para el
sistema ligninolítico es la fuente de H2O2. Las enzimas productoras de H2O2 a partir de O2
donde NADH, NADPH o el glutation están presentes y la glioxal oxidasa (GLOX) la cual,
se produce durante el metabolismo secundario en Phanerochaete chrysosporium y es
activada por LiP más alcohol veratrílico (Kersten, 1990). Las lacasas han sido
caracterizadas como enzimas de baja especificidad de sustrato, que reducen el oxígeno
molecular a agua y son capaces de oxidar monofenoles, difenoles, polifenoles,
aminofenoles y diaminas (Arana y col., 2003).
12
Antecedentes
Las lacasas
Las lacasas son polifenoloxidasas (p difenol oxidasas), que generalmente están distribuidas
en plantas, bacterias y hongos. Estas enzimas se pueden encontrar en distintos procesos
biológicos tales como: la esporulación, la producción de pigmento, la formación de
rizomorfos, y la degradación de la lignina. Estas enzimas se han utilizado en la industria
para la degradación de los altos contenidos de compuestos fenólicos en sus efluentes, para
la degradación de la lignina o la eliminación de compuestos tóxicos (Temp y Eggert, 1999).
Como biosensores para la detección de compuestos aromáticos que tienen afinidad
importante por dichas enzimas. Recientemente, se han encontrado sitios de mutagenesis
que ejecutan o modulan la actividad y el potencial redox de las lacasas, permitiendo así,
que se pueda manipular genéticamente la capacidad catalitica de las lacasas (Koroleva y
col., 2001).
La reducción del oxígeno al agua por esta enzima, está acompañada por la oxidación típica
de un sustrato fenólico. La reacción que lleva acabo la lacasa incluye la oxidación de un
compuesto fenólico generando un radical libre; y que es generalmente inestable. También,
puede experimentar una segunda oxidación por catálisis enzimática para formar quinonas, o
puede ocurrir una reacción no enzimática tal como una hidratación o desprotonación, y/o
podría participar en una reacción de polimerización, dando un compuesto amorfo insoluble
como la melanina (Thurston, 1994). Ademas, pueden oxidar a sustratos no fenólicos en
presencia de mediadores apropiados. Estas enzimas tienen una amplia especificidad de
sustrato así como de mediadores redox (Johannes, 2000)
Las reacciones oxidativas que pueden llevar acabo las lacasas para despolimerizar la lignina
incluyen: rompimiento entre enlaces Cα- Cβ, hidroxilación, rompimiento de estructuras
aromáticas y desmetilación (Sariaslani, 1989).
13
Antecedentes
Algunas lacasas de hongos basidiomicetes muestran una remarcada termoestabilidad
cercana a los 70°C (Coll y col., 1994); existe ya en el mercado una lacasa que fue patentada
y es producida por la industria de Novo Nordisk (Berka y col., 1997). Otra de las lacasas
termotolerantes es la producida en la planta Japanese Lacquer-tréeque, la cual tolera
temperaturas cercana a los 50°C. También se ha observado que algunas lacasas de hongos
puede ser activada térmicamente por pre-incubación a temperatura de 60°C (Coll y col.,
1993).
Inducción de lacasas
Las lacasas fúngicas pueden ser constitutivas o inducibles y también, intracelulares o
extracelulares (Sariaslani, 1989). Estas enzimas han sido detectadas y purificadas de
distintas especies de hongos, y se ha observado que se producen múltiples isoenzimas
(Palmieri y col., 2000). Varias lacasas encontradas son extracelulares y se asocian al
crecimiento, por lo cual, se han controlado las condiciones de crecimiento de las especies
de hongos utilizados y después, se ha buscado promover la producción de las enzimas
mediante la utilización de inductores. Estos son usualmente compuestos que tienen
estructuras muy similares o análogas a los sustratos de la enzima y sirven como una señal a
la célula para que produzcan alguna enzima especifica (López, 2001).
En la actualidad, se han estudiado compuestos que tienen la capacidad de funcionar como
inductores para la síntesis de lacasas en varias especies de hongos. Por ejemplo: el hongo
Coriolus hirsutus, ha sido inducido para la síntesis de lacasas extracelulares con un sustrato
de la lacasa como es la siringaldazina a una concentración de 0.11 µM, teniendo un
aumento cercano al 1000%. Obteniéndose así, dos isoformas de la enzima; las cuales son I1
e I2 con pesos moleculares de 69+ 2 y 67+2 kDa, con puntos isoeléctricos de cada
isoenzima de 3.5 y 4.2, respectivamente. Con un rango de pH óptimo entre 4.4 – 4.6, a una
temperatura optima de 50°C, siendo así isoenzimas termoestables (Koroljova-
Skorovogat´ko y col., 1998; Gorbatova y col., 2000).
14
Antecedentes
En 1980, Gigi y colaboradores, obtuvieron resultados de producción y excreción máxima
de lacasas en el hongo Botritis cinerea, al adicionarle ácido gálico al medio de cultivo, ya
que al probar otros inductores reportados fueron inefectivos. Marbach y colaboradores
(1983), encontraron que al adicionarle ácido cumarico al mismo hongo, generó una acción
de inducción a parte del ácido gálico y el jugo de uva, los cuales ya estaban reportados
como inductores; por lo cual, sugirió que el hongo se adaptó a diferentes medios excretando
así distintas lacasas.
Para el hongo de podredumbre blanca Pycnoporus cinnabarium, ocurrió un efecto de
inducción al adicionarle 2,5 xilidina, para una isoenzima que tuvo una masa molecular por
cromatografía de filtración en gel de aproximadamente de 81 kDa con un contenido de
carbohidratos de 9%. El punto isoeléctrico fue de 3.7; siendo está enzima típica de este
hongo (Eggert y col., 1996).
Los compuestos aromáticos varían en su estructura principalmente por la disposición de los
sustituyentes en el anillo aromático como lo menciona González (2001) en su trabajo, el
cual consistió, en realiza un estudio con el hongo Trametes sp. I-62, en donde se aplican
distintos compuestos aromáticos para inducir la síntesis de lacasas por el hongo, obteniendo
en sus resultados que los isómeros del alcohol veratrílico (alcohol 3,4 – dimetoxibencílico),
el alcohol 2,5- dimetoxibencílico y el alcohol 3,5- dimetoxibencílico (diferentes isómeros
de un compuesto) tienen diferentes capacidades de inducción de la actividad de las lacasas.
Otros dos compuestos, el ácido p-metoxifenol y el guayacol provocan también un máximo
de inducción, pero éste varía en el momento en que éste ocurre y también sobre el
crecimiento del hongo.
15
Antecedentes
Por otro lado, se ha observado que al adicionar un exceso de cobre al medio de cultivo se
provoca un efecto de inducción para la producción de lacasas (Hubert y Lerch, 1987).
Como ocurrió con el hongo Phanerochaete chrysosporium, al cual se le agregó una
cantidad de 0.4 mM de CuSO4 en el medio, generando así un aumento en su actividad
lacasa dentro de los días 2 y 3; tanto de lacasas intracelulares y extracelulares, se separaron
en una columna de intercambio iónico. Al realizarles el análisis en una columna de
filtración en gel, se obtuvo una lacasa extracelular con un peso aproximado de 100kDa
(Dittmer y col., 1997).
En el hongo de Neurospora crassa se utilizó como inductor a la D-fenilalanina para
producir lacasa, por medio del estudio de su ARNm. Se observó también su regulación de
la transcripción. El resultado en los niveles de proteína de la actividad lacasa se
incrementaron después de 30 horas, por lo que la D-fenilalanina actuó como inductor
(Linden y col., 1991).
El cobre en Pleurotus ostreatus promueve la expresión de las isoenzimas POXA1b
regulando así el nivel de la transcripción del gen; siendo el poxa1b ARNm el más
abundante en la transcripción inducida a todos los tiempos de crecimiento analizados
(Palmieri y col., 2000).
Sonden y Dobson (2001) utilizan varios compuestos (ácido ferúlico, ácido veratrico, 2,5
xilidina, e hidroxibenzotriazole) como inductores para el hongo Pleurotus sajor-caju y con
la adición de cobre para la expresión de la secuencia de los genes Psc lac 1, 2, 3 y 4. Los
resultados fueron: que con el ácido ferúlico y 2,5 xilidina se tuvo un nivel alto en la
transcripción de los genes Psc lac 1,2 y 4, y el Psc lac 3, fue expresado constitutivamente
16
Justificación
JUSTIFICACIÓN
Por la gran importancia que tiene la aplicación de las lacasas en la industria para la
oxidación de los compuestos aromáticos policíclicos encontrados, tanto en los efluentes,
como en el suelo contaminado por estas industrias; se busca la manera de que estas enzimas
se produzcan en mayor cantidad y por lo tanto, tengan una mayor aplicabilidad en muchos
de los procesos biotecnológicos. También un factor que favorece para su actividad de las
enzimas utilizadas es su termoestabilidad, ya que al aumentar su temperatura permite que
su actividad aumente y así se reduce la cantidad de enzima a utilizar en el proceso
(Kristjansson, 1989).
También se ha observado que las lacasas de los hongos basidiomicetos muestran una
remarcada termoestabilidad (temperaturas cercanas a 70°C) comparadas con las lacasas de
las plantas y la enzima puede ser activadas térmicamente por preincubación a elevadas
temperaturas (arriba de 60°C). Se ha observado que estos hongos al aumentar la
temperatura de crecimiento entre los 25°C y los 60°C, tienen un inusual incremento de la
actividad enzimática (Koroleva y col., 2001).
Por último, en el hongo Trametes sp. EUM1 se han realizado estudios recientemente en la
purificación, actividad enzimática y su estabilidad de las lacasas al incrementar su
temperatura, su afinidad por algún sustrato, su energía de activación y determinación de
parámetros cinéticos (Medina, 2003).
Por estas razones, se buscará inducir en el hongo Trametes sp. EUM1 una mayor cantidad
de lacasas, utilizando varios compuestos que puedan aumentar los niveles de esta enzima,
con las condiciones requeridas y conservando su termotolerancia.
17
Hipótesis y Objetivos
HIPÓTESIS
Es posible identificar los compuestos que favorecen la producción de lacasas
termotolerantes en el hongo Trametes sp. EUM1 mediante estudios en placas de agar.
OBJETIVO GENERAL
Seleccionar, al menos, un compuesto aromático que tenga la capacidad de inducir la
síntesis de las lacasas en el hongo Trametes sp. EUM1 (Medina, 2003) y evaluar la
termotolerancia de las isoenzimas.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Propagar la cepa Trametes sp. EUM1.
• Inducir la producción de lacasas con los distintos compuestos reportados.
• Seleccionar los mejores inductores por análisis en placa y medio definido.
• Analizar el efecto de la temperatura en la producción de las lacasas.
• Obtención de lacasas en FL sin agitación.
• Determinación de las variables (pH, Actividad Enzimática, Proteínas), durante la
fermentación.
• Evaluar la producción de las lacasas termotolerantes a lo largo de la fermentación.
18
Materiales y Métodos
MATERIALES Y METODOS
Microorganismo
La cepa utilizada del hongo Trametes sp. EUM1, pertenece a la colección de la Universidad
Autónoma – Iztapalapa y fue aislada por Medina (2003).
Medio de Cultivo
Medio de Extracto de malta. Este medio es un medio complejo, el cual contiene:
Medio Sólido Medio Líquido Extracto de malta 20.00 g Extracto de malta 20.00 g Agar Bacteriológico 20.00 g Agua Destilada Hasta 1L Agua Destilada Hasta 1L Medio Kirk (Kirk et al., 1986). Este es un medio definido, limitado en nitrógeno, el cual contiene: Solución de elementos traza Ácido nitriloacético 1.50 g MnSO4 * H2O 0.50 g NaCl 1.00 g Glucosa 10.00 g FeSO4 * 7H2O 0.10 g Tartrato de Amonio 0.20 g CoCl2 0.10 g MgSO4 * 7H2O 0.50 g ZnSO4 * 7H2O 0.10 g KH2PO4 2.00 g CuSO4 * 5H2O 0.01 g CaCl2 0.10 g AlKSO4 * 12H2O 0.01 g Tiamina * HCl 1.0 mg H3BO3 0.01 g Sol. de Elementos Traza 10.0 mL NaMO4 * 2H2O 0.01 g Agar Bacteriológico* 20.00 g H2O Destilada Hasta 1L Agua destilada Hasta 1L * Solo para medio Kirk sólido.
19
Materiales y Métodos
Propagación de la cepa
La propagación de la cepa, se realizó teniendo un cultivo inicial del cual se tomó un trozo
de agar (aprox. 6mm de diámetro), que se colocó en el medio de extracto de malta sólido y
se dejó en incubación a 28°C hasta su crecimiento. En este proceso se realizaron
mediciones, cada 24 horas de los radios del micelio para conocer su velocidad radial.
Compuestos para los ensayos
Para el estudio de inducción de la actividad de las lacasas en el hongo Trametes sp. EUM1
se utilizaron los siguientes 11 compuestos, ya reportados como inductores de actividad
lacasa para otro microorganismos (véase la Tabla 1): alcohol veratrílico (Rodríguez y col.,
2002); ácido ferúlico (Collins y Dobson, 1997; Soden y Dobson, 2001), catecol, ácido
tánico, ácido 3,4-dimetoxibenzoico o ácido verátrico (Soden y Dobson, 2001; Collins y
Dobson, 1997), 2,6 dimetoxifenol, D-fenilalanina (Linden y col., 1991), ácido gálico
(Galhaup y col., 2002), sirigaldazina (Koroljova-Skorobogal-ko y col., 1998; Gorvatova y
col., 2000), xilano, xilosa y además de estos compuestos aromáticos el sulfato de cobre
(Collins y Dobson, 1997; Palmieri y col., 2000). Los compuestos se agregaron a los medios
a una concentración final de 0.37 mM (excepto la siringaldazina, ya que es poco soluble en
agua y se agregó a la concentración de 0.037mM).
20
Materiales y Métodos
Compuesto Estructura Ácido Ferúlico
CH
OH
OMe
CHCOOH
Ácido Gálico
OHOH
OH
COOH
Ácido Tánico OH
OMeMeO Ácido Verátrico COOH
OMeOMe
Alcohol Veratrílico OH
OMeMeO Catecol OH
OMeMeO 2,6-Dimetoxifenol OH
OMeMeO
Fenilalanina C
H2
NH2
HHOOC
Siringaldazina
OH CH
N N CH
OH
MeO
MeO
OMe
OMe Sulfato de Cobre
SO
OOCu
O Xilano
O
OHOH
OH OH
n
Xilosa O
OHOH
OH OH
Tabla 1. Estructuras químicas de los compuestos utilizados para los ensayos cuantitativos en placas.
21
Materiales y Métodos
Ensayos Cualitativos en Placa.
Método. Se realizaron pruebas por triplicado para los distintos compuestos en cajas Petri,
utilizando el medio de cultivo Kirk; además del testigo, sin compuesto alguno. A este
medio de cultivo se les agregó ABTS (2,2´ Azino-bis(ácido 3-etilbenzo-tiazolino-6-
sulfónico, P.M. 548.7 g/mol) a una concentración final de 1 mM, el cual se utilizó para
observar halos de oxidación debido a la actividad de las lacasas. Las placas fueron
inoculadas en la zona central con discos de agar o pellet, en los cuales había crecido, el
micelio del hongo Trametes sp. EUM1.
Las condiciones de incubación en las que se mantuvo el ensayo, fueron a una temperatura
de 28°C y 39°C. Se le realizaron mediciones de los radios de crecimiento para determinar
su velocidad radial, así como los halos de coloración como consecuencia de la actividad
lacasa.
Preparación del pre-inóculo. Para la preparación del inoculo se utilizó agua estéril a la que
se le agregó micelio que previame creció en un medio de extracto de malta en cajas de
Petri, en trozos de aproximadamente de 2 cm2. Este se dejó incubar a 28°C a 300 rpm
durante 3 días con el fin de que el micelio se separara del agar.
Obtención del Pellet (Pelotitas de micelio). El medio de cultivo líquido para la producción
del pellet utilizado, fue el medio de extracto de malta, realizándolo en matraces Erlenmeyer
de 250 mL. A este medio se le agregó el 10% de pre-inóculo, incubándose a 28°C con
agitación, durante 5 días hasta la formación de los pellets. Después de formado los pellets
se enjuagaron con agua destilada estéril para eliminar la enzima producida que pudiera
contener el medio de extracto de malta; y se colocaron en las placas para los ensayos.
22
Materiales y Métodos
Obtención del disco de agar. El medio de cultivo sólido para la producción del disco de
agar fue el medio Kirk sólido, el cual se realizó en cajas Petri. A este medio se le agregó un
trozo de micelio (el micelio se creció en medio de extracto de malta sólido), incubándose a
28°C, durante 10 días. Después de crecido el micelio se cortaron los discos de agar de
aproximadamente 1cm de diámetro y se colocaron en las placas para los ensayos.
Medición de los radios de crecimiento y los halos de oxidación. Para estas mediciones se
utilizó un Vernier, tomándose los radios de crecimiento de las colonias formadas, así como
los diámetros de coloración formados de cada una de las placas de los ensayos. Las
mediciones se realizaron cada 24 horas.
Velocidad radial. La velocidad radial es la pendiente que se obtiene al realizar una
regresión lineal; la cual se determina, al graficar el crecimiento radial del micelio en cada
tiempo de la medición y llegar a la ecuación lineal:
y = Vr* t + b
en donde
Vr = velocidad radial de crecimiento (mm/ h).
y = radio de la colonia para cada tiempo (mm).
t = tiempo al que se realizó la medición (h).
Índice de Potencia. El índice de potencia (IP) se calculó dividiendo el diámetro del halo de
oxidación entre el diámetro de crecimiento del micelio, indicándonos así, la relación del
halo de oxidación con respecto al crecimiento del microorganismo a un tiempo
determinado.
23
Materiales y Métodos
Ensayo de Fermentación Líquida en Estado Estacionario.
Método. Se realizaron pruebas por duplicado para los distintos compuestos en matraces
Erlenmeyer de 500mL, utilizando el medio de cultivo Kirk suplementado con los
compuestos ensayados a la concentración ya mencionada; además del testigo, sin
compuesto alguno. A este medio, se le agregó un pre-inóculo el cual contenía el micelio del
hongo Trametes sp. EUM1 del 10% del volumen total del medio de cultivo. Las
condiciones de incubación en las que se mantuvo el ensayo, fueron: a una temperatura de
28°C ó 39°C, sin agitación, durante 32 días. Se tomaron muestras de 5mL cada 24 horas
para determinar en ellas, las variables de pH, proteínas y la actividad enzimática de las
lacasas durante la fermentación.
Determinaciones analíticas
A continuación se presentan las metodologías para determinar las variables de pH,
proteínas y actividad enzimática. Las muestras que se tomaron fueron de 5mL por cada uno
de los matraces
Determinación del pH. Una vez que se extrajo la muestra de cada uno de los matraces, se
filtró y se midió el pH con un potenciómetro, el cual fue previamente calibrado.
Proteínas. Se uso el método de Bradford (Método de micro-ensayo); el cual, se basa en el
acoplamiento del colorante azul de coomasie con la proteína y se determina
colorimetricamente, existiendo así, una relación directa entre el desarrollo del color y la
concentración de las proteínas (Bradford, 1976).
24
Materiales y Métodos
Para la determinación de proteína en las muestras, se agregaron 800 µl del extracto de cada
muestra en tubos de ensayo de 10 mL de capacidad, por duplicado. Se adicionaron a cada
tubo 200 µl de reactivo de Bradford (Sigma). Posteriormente, se agitaron con un vórtex y
después de 5 min, se leyeron en un espectrofotómetro a 595 nm. Para el cálculo de la
cantidad de proteína, se tomó como base una curva estándar con solución de seroalbúmina
bovina de 5, 10, 15, 20 y 25 µg/mL.
Curva Estándar. Se preparó una solución patrón de seroalbúmina bovina de 1 mg/mL, a
partir de esta solución se tomaron las muestras para preparar los estándares de referencia.
Con ellos se construyó la curva de referencia o curva estándar, la cual tiene valores
conocidos y con los que se compararon las muestras experimentales para determinar en ella
la concentración de proteína total. A continuación, se presenta la curva estándar con sero
albúmina bovina (Tabla 2):
No. de Muestras BSA* (µL)
Buffer o H2O desionizada (µL)
Reactivo de Bradford (µL)
Blanco 0 800 200 1 5 795 200 2 10 790 200 3 15 785 200 4 20 780 200 5 25 775 200
Tabla 2. Curva estándar de seroalbúmina bovina para el método Bradford
La formula de regresión obtenida a partir de la curva patrón fue:
y = 0.0506x + 0.4682
con un coeficiente de correlación (R2) de: 0.9953
la cual se utilizó para calcular la cantidad de proteína obtenida durante la cinética en la
fermentación líquida sin agitación.
25
Materiales y Métodos
Actividad Enzimática. Se determinó usando ABTS 5mM como sustrato en 100 mM de
buffer de acetato de sodio (pH= 4.5) a temperatura ambiente. La medida de absorbancia se
realizó a una longitud de onda de 436 nm, durante 1 minuto. El coeficiente de extinción
molar del producto (radical catiónico del ABTS) es EMAX = 2.93 X104 M-1cm-1 (Wolfenden,
1982); una unidad enzimática se define, como la cantidad de enzima que forma 1.0 µmol de
producto por minuto bajo condiciones ensayadas.
Determinación de la termotolerancia. Se extrajeron muestras de 15 mL cada cinco días de
cada uno de los matraces y se filtraron para eliminar el micelio presente. Después de la
filtración, se tomó una muestra de 5mL de cada una de las muestras originales, la cual se
colocó en tubos de ensayo con rosca y en un baño María con temperatura controlada de
60°C y se sumergieron los tubos durante una hora.
Luego de haber transcurrido el tiempo, se sacaron las muestras del baño María y se
enfriaron a temperatura ambiente. Por último, se determinó el pH, proteínas y actividad
enzimática, tanto las muestras que se sometieron a temperatura de 60°C durante una hora,
como a las muestras originales. Esto sirvió para obtener el porcentaje de la enzima que
conserva su actividad enzimática y si existe un cambio de pH al someterla a la temperatura
elevada (60°C).
26
Resultados y Discusiones
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Propagación de la cepa. En los experimentos realizados para la propagación del hongo
Trametes sp. EUM1 con las condiciones de incubación a 28°C, su crecimiento fue a una
velocidad radial de 0.1783 mm/h. En la Figura 4, se muestra el crecimiento del hongo
Trametes sp. EUM1 después de 14 días de incubación.
Figura 4. Crecimiento de hongo Trametes sp. EUM1 después de 14 dias de incubación a 28°C.
Efecto de la edad del micelio sobre la detección de las lacasas. En la figura 5, se
muestran cuatro placas inoculadas con micelio de diferentes edades; las cuales se tomaron a
partir del centro de la placa a diferentes distancias de la misma colonia; la coloración del
ABTS lo cual corresponde, probablemente, a la actividad lacasa es más intensa en la placa
D que es la placa que contiene el micelio con una edad mayor; mientras que la placa A
tiene una coloración débil y corresponde al micelio de menor edad, la observación se
realizó el mismo día de crecimiento.
27
Resultados y Discusiones
La edad del micelio es un factor que se debe de considerar para la producción de las lacasas
en el hongo Trametes sp. EUM1; ya que la edad influye sobre la detección de las lacasas
cuando se toman discos de agar con micelio, este resultado concuerda con lo obtenido por
López (2001), el cual observó que la máxima actividad enzimática (actividad lacasa) en dos
cepas de Pleurotus, se mostró en el micelio que se encontraba en la etapa de madurez; por
lo tanto, al hacer el análisis en placa, el micelio debe ser aproximadamente de la misma
edad para que no exista interferencia alguna en los resultados y una opción es utilizar
pellets.
Figura 5. Efecto de la edad del micelio en la producción de actividad lacasa. A Micelio de 24 a 48 h; B y C Micelio de 5 a 7 días; D Micelio de 12 a 14 días a temperatura de 28°C.
28
Resultados y Discusiones
Crecimiento del micelio a 28°C. Para el crecimiento del micelio se tomaron mediciones
con un Vernier de los radios producidos en cada una de las placas con los distintos
compuestos tanto para los inoculados con el disco de agar como para los inoculados con el
pellet teniendo como resultados los que se muestran en las Gráficas 1 y 2. Como se observa
en las gráficas, las colonias que crecieron más con respecto al testigo (sin compuesto)
fueron las suplementadas con ácido tánico y ácido gálico, por lo tanto, podemos decir que
estos compuestos promueven de cierta manera el crecimiento. Por otro lado, las colonias
con menor crecimiento fueron las que contenían cobre y ácido ferúlico, por lo cual
podríamos mencionar que estos compuestos pueden tener un efecto tóxico o de inhibición
para el crecimiento del micelio. Las diferencias entre el crecimiento con disco de agar y
pellet no fueron muy notables, ya que el crecimiento del micelio fue muy parecido en las
dos metodologías.
Gráfica 1. Crecimiento del micelio, del ensayo con los distintos compuestos donde se utilizó disco de agar como inóculo a 28°C..
29
Resultados y Discusiones
Gráfica 2. Crecimiento del micelio con los distintos compuestos y usando pellet como inóculo a 28°C..
En la tabla 3, se presentan las velocidades radiales de crecimiento con los distintos
compuestos utilizados para este ensayo; donde se observa claramente las diferencias de
crecimiento del micelio, con respecto al testigo.
30
Resultados y Discusiones
Tabla 3. Valores de velocidades radiales en los ensayos con los distintos compuestos a 28°C y sus respectivos coeficientes de correlación.
* la velocidad radial esta expresada en mm/h. Halos de oxidación. Los halos de oxidación son los halos de coloración que se forman
cuando las lacasas reaccionan con el ABTS y éste es oxidado. En la tabla 4, se observa que
el ácido tánico y el catecol no produjeron halos de oxidación; mientras que algunos otros
como el ácido ferúlico, el alcohol veratrílico, la siringaldazina, el 2,6-dimetoxifenol y la D-
fenilalanina tuvieron una coloración tardía en comparación con el testigo, aunque su
coloración fue mayor excepto con D-fenilalanina.
31
Resultados y Discusiones
Tabla 4. Diámetros de los halos de oxidación con los distintos compuestos. Los diámetros están dados en mm y el método utilizado fue con discos de agar.
32
Resultados y Discusiones
A continuación se presentan las gráficas obtenidas de los halos de oxidación con los
distintos compuestos y con las dos metodologías ( discos de agar y pellet).
Gráfica 3. Halos de oxidación con respecto al tiempo con los 12 compuestos utilizados para la inducción en el método en el que se utilizó el disco de agar como inóculo.
33
Resultados y Discusiones
Gráfica 4. Halos de oxidación a distintos tiempos de los compuestos utilizados con el método donde se utilizó el pellet como inóculo.
Como se puede observar en las gráficas 3 y 4 a los 11 días de haber comenzado el ensayo,
el ácido verátrico tuvo halos de oxidación que fueron de 78% y 131 % mayor con respecto
al testigo, usando discos de agar y pellet como inóculo, respectivamente. Mientras que para
el caso de los medios con ácido ferúlico, el aumento de los halos de oxidación fueron de
58% para los inoculados con disco de agar y del 131% para los inoculados con pellet siendo
comparados con el testigo. Por otra parte, algunos compuestos como es el caso del sulfato
de cobre y el alcohol veratrílico sus halos de oxidación se mantuvieron por debajo del
testigo, siendo que Collins y Dobson (1997), reportaron que el sulfato de cobre a una
concentración de 400µM fue capaz de inducir la producción de las lacasas en el hongo
Trametes versicolor; por otro lado, Rodríguez y colaboradores (2002), utilizaron el alcohol
veratrílico a una concentración de 2mM para causar el mismo efecto en el hongo Trametes
versicolor.
34
Resultados y Discusiones
En nuestro caso, la concentración adicionada de los compuestos, fue 0.37 mM, con esto se
controló que no hubiese algún tipo de interferencia con el sustrato ABTS para la detección
de la actividad lacasa; la misma concentración fue utilizada con anterioridad por González
(2001) para el hongo Trametes sp. I-62, para algunos de los compuestos utilizados en el
presente estudio.
Índice de potencia. Para el cálculo del índice de potencia se utilizaron los valores
obtenidos en el crecimiento de micelio y los halos de oxidación, a los 11 días de
incubación, teniendo como resultado, que para el caso de los medios con ácido verátrico,
los índices de potencia fueron de 66% y 49%, mayores que el testigo, usando discos de agar
y pellet como inóculos, respectivamente. Por otro lado para el caso de los medios con ácido
ferúlico, el incremento en los índices de potencia fue de 105% para los medios inoculados
con disco de agar y 52% para la inoculación con pellet en comparación con el testigo. Al
comparar estos resultados se observa que existen diferencias entre el disco de agar y el
pellet, lo cual podría deberse a la edad del micelio, ya que al estar en la etapa de
maduración tiene una mayor actividad enzimática como ya se mencionó, provocando así,
una interferencia en los resultados y por efecto, el aumento del índice de potencia; por otra
parte, al tener estos índices mayores al testigo, se puede mencionar que se indujo una
producción de enzima extracelular en el medio.
Tabla 5. Valores del índice de potencia de los distintos compuestos a los 11 días de haber comenzado los ensayos.
35
Resultados y Discusiones
Como se muestra en la tabla 5, los compuestos que tienen mayor índice de potencia son: el
ácido verátrico y el ácido ferúlico. Manteniéndose, con pocas variaciones entre las dos
metodologías utilizadas, lo cual concuerda así con algunos autores (Collins y Dobson,
1997; Soden y Dobson, 2001),que utilizan a estos compuestos como inductores, y realizan
sus ensayos en medio sólido y en placa con inóculos de disco de agar; mientras, que el
sulfato de cobre y el alcohol veratrílico se mantienen con valores por debajo del testigo, por
lo tanto estos compuestos no tienen la capacidad de inducir al hongo Trametes sp. EUM1
para la producción de lacasas. Esto concuerda con la literatura, ya que se ha demostrado
que el poder de inducción de cada compuesto depende del microorganismo en estudio
(Collins y Dobson, 1997; Palmieri y col., 2000; Rodríguez y col., 2002).
Con respecto a la forma de inoculación de las placas, se observaron diferencias entre la
inoculación con disco de agar a la inoculación con pellet. Las placas inoculadas con disco
de agar , tuvieron interferencias en los resultados obtenidos, debido a que el disco lleva una
cierta concentración de enzima dentro de éste y el micelio es de diversas edades
dependiendo la distancia a la que se tome el disco a partir del centro de la placa. Por otro
lado, en las placas los inoculadas con el pellet se controlaron más los factores antes
mencionados, ya que al tomar los pellets se controló la edad del micelio por ser del mismo
tamaño y al lavar el pellet con agua destilada estéril, se evitó la influencia de la enzima,
estuviera arrastrada con el micelio. Por otra parte, se observó que hay compuestos que se
comportan de la misma manera, tanto al inocularlos con discos de agar y en pellet, estos
compuestos fueron el ácido ferúlico y el ácido verátrico. Por lo tanto, estos dos compuestos
se utilizaron para realizar los ensayos del efecto de la temperatura sobre la producción o
detección de lacasas en placas, así como en fermentación líquida sin agitación.
36
Resultados y Discusiones
Efecto de la temperatura en el micelio sobre la detección de las lacasas. Otro factor a
considerar es el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de micelio y sobre los halos
de oxidación producidos por las lacasas de hongo Trametes sp. EUM1. Por lo cual, se
realizaron los ensayos en placa tanto a 28°C como a 39°C y solamente con el ácido ferúlico
y el ácido verátrico, los cuales fueron seleccionados a partir de una lista de compuestos con
los que se realizaron ensayos previos.
Figura 6. Ensayo para estudiar el efecto de la temperatura en el micelio y la producción de lacasas del hongo Trametes sp. EUM1 a temperaturas de 28°C y 39°C. El orden de las placas es como se presenta a continuación: 1. Placa con medio kirk (placa testigo), 2. Placa con medio kirk y ácido verátrico y 3. Placa con medio kirk y ácido ferúlico. Mientras que A es el Crecimiento radial del hongo y B son los Halos de oxidación. Fueron tomadas a los 2 días de haber comenzado el ensayo. Como se observa en la figura 6, la temperatura es un factor importante a considerar durante
los ensayos, ya que a temperatura de 39°C, el crecimiento del micelio fue mayor que a
temperatura de 28°C; así como también los halos de oxidación fueron mayores viéndose
reflejada en la coloración de la placa y su diámetro producido. A continuación se realizó un
análisis más detallado del efecto de la temperatura en el micelio sobre la detección de las
lacasas.
37
Resultados y Discusiones
En las gráficas 5 y 6, se observa el crecimiento del micelio a 28°C y 39°C. Para la
obtención de estas graficas se utilizó un Vernier, con el cual se determinaron los radios para
el crecimiento del micelio en cada una de las placas con los compuestos seleccionados
(ácido verátrico y ácido ferúlico) y la placa testigo, siendo estas mediciones cada 24 horas.
Gráfica 5. Crecimiento del micelio en placa a 28°C, de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico), usando pellet como inóculo.
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Resultados y Discusiones
Gráfica 6. Crecimiento del micelio en placa a 39°C, de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico), usando pellet como inoculo.
En las gráficas de crecimiento de micelio se observa el mismo comportamiento en cada una
de ellas, tanto a 28°C como a 39°C, ya que a partir de los 2 días de haberse comenzado el
ensayo, el hongo comienza su crecimiento tanto en las placas con los compuestos así como
en la placa testigo. Ahora bien, la temperatura no fue un factor que influyera mucho en el
crecimiento de micelio del hongo como se observa en la tabla 6, en la cual se tienen las
velocidades radiales a las distintas temperaturas y con los compuestos seleccionados (ácido
ferúlico y ácido verátrico), teniendo valores muy similares en las dos temperaturas
utilizadas.
39
Resultados y Discusiones
Tabla 6. Valores de la velocidad radial con los compuestos seleccionados (ácido ferúlico y ácido verátrico) a distintas temperaturas y sus respectivos coeficientes de correlación.
* la velocidad radial esta expresada en mm/h.
Ahora bien con respecto a los halos de oxidación a distintas temperaturas el efecto que se
observó fue muy notable, ya que en las gráficas 9 y 10 se representa la formación de estos
halos con cada una de las placas de los compuestos, así como también de las placas testigo.
Gráfica 7. Halos de oxidación en placa a 28°C, de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico), usando pellet como inóculo.
40
Resultados y Discusiones
En la gráfica 7, se tiene que a 28°C los halos de oxidación producidos por el testigo y el
ácido verátrico son muy similares, ya que tienen un comportamiento inicial parecido,
mientras que el halo de oxidación del ácido ferúlico comienza después del cuarto día de
haberse comenzado el ensayo. Se observó una gran diferencia de la producción de los halos
de oxidación con respecto al testigo, siendo mayor con los compuestos seleccionados muy
notablemente a partir del día 7.
Gráfica 8. Halos de oxidación en placa a 39°C, de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico), usando pellet como inóculo.
41
Resultados y Discusiones
Realizando el análisis correspondiente de los halos de oxidación en las placas a 39°C como
se muestra en la gráfica 8, el comportamiento es distinto para cada uno de los compuestos y
el testigo, ya que el ácido verátrico tiene un efecto en la formación del halo desde el
comienzo del ensayo, el testigo lo hace a partir del primer día de haberse comenzado el
ensayo y con el ácido ferúlico, se observó su halo de oxidación después del segundo día y
mantienen un comportamiento muy similar después del cuarto día de haberse comenzado el
ensayo.
Analizando lo anterior se tiene que las placas que conservaron su comportamiento tanto a
28°C como a 39°C, fueron las que contenían el ácido verátrico, mientras que las placas
testigo tuvieron modificaciones en la producción de sus halos, así como también el ácido
ferúlico. Al finalizar los ensayos se obtuvieron los halos de oxidación representados en la
tabla 7, en la cual se puede observar que a 39°C, los halos fueron mayores (en el testigo se
obtuvo un 172%, en el ácido ferúlico un 52% y el ácido verátrico un 32% más, con respecto
a la temperatura de 28°C) y para el ácido ferúlico su halo de oxidación fue 8% mayor a
39°C con respecto al testigo; mientras que para el ácido verátrico su halo de oxidación
estuvo un 2.5% por debajo del testigo.
Tabla 7. Halos de oxidación con los compuestos ácido ferúlico, ácido verátrico) y el testigo a las distintas temperaturas, después del día 9.
* los halos de oxidación están expresados en mm.
42
Resultados y Discusiones Teniendo todo lo anterior, se calculó el índice de potencia de las placas testigo y las placas
de los compuestos seleccionados para el ultimó tiempo medido; representándose en la tabla
8, en la cual se tiene que el ácido verátrico tuvo valores mayores de 51% y de 65% en el
índice de potencia con respecto al blanco, tanto a 28°C como a 39°C respectivamente;
mientras que el ácido ferúlico solo tuvo este índice de potencia mayor con respecto al
testigo a temperatura de 28°C el cual fue 19%, ya que a 39 °C se observó un valor del 9%
por debajo del testigo.
Tabla 8. Índices de potencia con los compuestos ácido ferúlico, ácido veratrico y el testigo a las distintas temperaturas, después del día 9.
Fermentación líquida sin agitación. En está fermentación se obtuvieron los resultados
correspondientes a la actividad enzimática volumétrica mencionadas en la metodología,
cuando se suplemento el medio Kirk con ácido verátrico y ácido ferúlico a dos
temperaturas diferentes (28°C y 39°C), teniendo un medio testigo.
43
Resultados y Discusiones
Gráfica 9. Actividad volumétrica obtenida a los 28°C, con cada uno de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico) y el testigo, en la fermentación líquida sin agitación En la gráfica 9, se encuentran los valores de las actividades volumétricas de cada una de las
fermentaciones líquidas realizadas a una temperatura de 28°C. En esta se observa que el
ácido verátrico mantiene una actividad mayor al testigo durante los primeros 8 días de la
cinética y luego disminuye. Con respecto al ácido ferúlico se tiene que su actividad se
mantiene por encima del testigo durante un tiempo de 18 días. Por otra parte, las
actividades volumétricas presentadas en la grafica 10 que corresponde a las fermentaciones
realizadas a 39°C; tenemos que el ácido verátrico mantiene su actividad por arriba del
testigo en los primeros 4 días de la cinética; mientras que la actividad de la fermentación
que contenía el ácido ferúlico se mantuvo por un periodo de 13 días por encima del testigo.
44
Resultados y Discusiones
Gráfica 10. Actividad volumétrica por mililitro obtenida a 39°C, con cada uno de los compuestos seleccionados (ácido verátrico y ácido ferúlico) y el testigo, en la fermentación líquida sin agitación
Comparando la actividades volumétricas a las dos temperaturas, observamos que a la
temperatura de 39°C, existe una actividades volumétricas de aproximadamente 10 veces
mayor a las que se obtuvieron en las fermentaciones llevadas acabo a 28°C como se
observa en las gráficas; por lo que algunos autores (López, 2001) relacionan la actividad de
las lacasas con el crecimiento del microorganismo y viceversa, ya que al colocar a los
microorganismos termófilos que al crecer a su temperatura óptima ( Brock, 1967) degradan
con mayor facilidad a la lignina y por consiguiente se puede regular la síntesis de enzima a
partir de la variación de la temperatura.
45
Resultados y Discusiones
Coll y colaboradores(1993, 1994) obtuvieron una lacasa de un hongo, la cual llamó PM1 y
era activada cuando se pre-incubaba a una temperatura de 60°C y mostraba un moderado
incremento de su actividad de cerca del 10-20% entre las temperaturas de 25°C y 60°C; lo
mismo ocurrió con Gianfreda y colaboradores (1998), el cual observó que la actividad de la
lacasa se incrementaba gradualmente conforme se aumentaba la temperatura de 20°C a
70°C, por tanto, obtuvieron que la actividad de la lacasa dependía de la temperatura. Estos
resultados son favorables, ya que lo que se busca en el presente trabajo es obtener la
termotolerancia de las lacasas presentes.
A partir de los resultados obtenidos con anterioridad, se seleccionó la temperatura de 39°C
para la producción de la lacasa y el ácido ferúlico, el cual presentó una mayor actividad
enzimática al inicio de la cinética en las fermentaciones líquidas sin agitación. La
temperatura se seleccionó debido a que se produjo una mayor actividad lacasa en
comparación a la que se produjo en la temperatura de 28°C, correspondiendo con una
temperatura más cercana a la temperatura a la cual se aisló el hongo Trametes sp. EUM1 en
la naturaleza (Medina, 2003). Por otro lado, se selecciono al ácido ferúlico, ya que otros
autores lo han utilizado como inductor de algunas especies de hongos termófilos, como es
el caso de Sonden y Dobson (2001), ellos probaron varios compuestos como el ácido
ferúlico, 2,5- xilidina, el ácido verátrico, entre otros, en el hongo Pleurotus sajor-caju y
observaron que el ácido ferúlico y la 2,5 xilidina provocaroron una mayor transcripción del
gen y por tanto una mayor inducción.
Otros autores como Lenowicz y Trojanovsky (1975) también estudiaron el efecto del ácido
ferúlico como inductor sobre el hongo Pleurotus ostreatus, obteniendo así isoenzimas
especificas de lacasa y por último, Galhaup y colaboradores (2002) que también lo
utilizaron, para inducir la producción de lacasas en Trametes pubescence.
46
Resultados y Discusiones
Después de haber seleccionado al ácido ferúlico. Se realizó una nueva cinética donde se
valoró actividad, pH, proteína y termotolerancia. En la gráfica 11, se tiene el
comportamiento de su pH durante la cinética a 39°C; se observa que el pH del medio con
ácido ferúlico mantiene una semejanza con respecto al pH del medio testigo.
Gráfica 11. Resultados del pH en la fermentación líquida sin agitación a 39°C para los medios testigo y con ácido ferúrico.
47
Resultados y Discusiones
Por lo tanto, al comparar los valores obtenidos a la temperatura de 39°C, se observa que la
variación debida al pH es mínima y que se mantiene dentro de los valores reportados por
algunos autores, tales como Gorbatova y col.(2000) que obtuvieron isoenzimas de lacasa en
los valores de pH 4.4. y 4.6 con el hongo Botritys cinerea; otro trabajo desarrollado por
Kanunfre y Zanca (1998) para obtener exolacasas en el hongo Thelephora terrestris señala
que se tienen distintos valores de pH dependiendo del inductor que se le agrega al medio y
los valores finales de pH que obtuvieron 5.0 cuando se usó siringaldazina, en el guayacol su
pH fue de 4.8 y el pH del ABTS fue 3.4; por lo que mencionan que depende mucho del
inductor que se utilice, para poder definir a qué pH se tendrá la mayor actividad de la
enzima; por último, Gianfreda y colaboradores (1998), encontraron que conforme se va
alcalinizando el medio (rango de pH entre 5.0-7.0) la actividad lacasa disminuye
dependiendo mucho del sustrato y el microorganismo con el cual se trabaje. Por lo que,
podemos decir, que el pH de los medios probados en el presente estudio, se encuentra
dentro del rango reportado para la producción de lacasas
Por otra parte se midió la producción de proteína total cuyo resultado se representa en la
gráfica 12. El comportamiento de la proteína dentro de estás fermentaciones es distinta, ya
que el ácido ferúlico se mantuvo con una mayor producción de proteínas con respecto al
testigo a lo largo de toda la cinética.
48
Resultados y Discusiones
Gráfica 12. Contenido de proteína por mililitro obtenida a los 39°C, con el medio suplementado con ácido ferúlico y el testigo, en la fermentación líquida sin agitación. Al comparar la producción de proteínas totales solubles en las fermentaciones líquidas a la
temperatura de 39°C, se observa que el ácido ferúlico se comportó de una forma muy
similar pero con una mayor producción de proteínas totales con respecto al testigo.
Con respecto a la gráfica 13 se observa la termotolerancia, la cual se realizó al colocar la
muestra de medio que contenía la enzima en baño Maria con temperatura controlada a 60°C
durante 1 hora.
49
Resultados y Discusiones
Gráfica 13. Comparación de la actividad original y la actividad remanente luego de una incubación a 60°C por 1h, usando extractos obtenidos en la fermentación líquida sin agitación que se mantuvo a 39°C con ácido ferúlico y el testigo. A partir de esta gráfica, se observa que se tiene un comportamiento similar con el ácido
ferúlico así como el testigo en comparación a la cinética mostrada en la gráfica 10. Por otra
parte al someterla a la prueba de termotolerancia, la actividad enzimática en el medio que
contiene ácido ferúlico se mantiene durante casi toda la cinética entre el 75 y 90% del
valor medido a 39°C (temperatura de la cinética); por lo que concuerda con Kanunfre y
Zanca (1998), los cuales encontraron que la exolacasa de T. terrestris fue estable durante 3
horas a 60°C e inactivada después de 40 minutos al exponerla a 70°C; Gianfreda y col.
(1997), que sometieron a temperaturas elevadas a la lacasa de T. versicolor, observando que
entre los 50 y 85°C, la actividad fue cercana a 85% del valor medido a su temperatura
óptima de 70°C.
50
Resultados y Discusiones
Eggert y colaboradores (1996), mostraron que la lacasa de P. cinnabarinus fue muy estable
a 50°C, mientras que a 70°C la enzima perdió su actividad a los 60 minutos y a 80°C se
inactivó completamente; Tinoco y colaboradores (2001), observaron que las lacasas de los
hongos Trametes y Coriolopsis mostraron una actividad máxima a los 50°C y una actividad
significativa a 70°C. Este fenómeno no ocurrió con los ensayos de estabilidad realizados
por Muñoz y colaboradores (1996), los cuales sometieron a las lacasas de Pleurotus eryngii
a la termotolerancia y observaron que a 25 y 55°C la enzima conservaba su actividad,
mientras que al someterla a 60°C, se inactivaba por completo. Esto nos lleva a que en el
hongo Trametes sp. EUM1 pueden existir diferentes lacasas, dentro de las cuales por lo
menos una es termotolerante a 60°C. Por ultimó, la mayor actividad mostrada durante la
cinética fue con ácido ferúlico que se mantuvo un 33% de actividad por encima del testigo
en los primeros días de haber comenzado la cinética.
51
Resumen de los resultados
RESUMEN DE LOS RESULTADOS
La edad del micelio tuvo un efecto sobre la inducción de las lacasas, medidas en
cajas Petri, por lo que se recomienda el micelio maduro.
El método de inoculación tiene efecto en la medición de los halos de oxidación, por
lo que se recomienda inocular con Pellet.
El sulfato de cobre y el alcohol veratrílico no tienen capacidad de inducción de
actividad lacasa del hongo Trametes sp. EUM1 bajo las condiciones ensayadas.
El ácido tánico y el catecol inhiben la producción de las lacasas en el hongo
Trametes sp. EUM1 bajo las condiciones ensayadas.
Los compuestos con los que se obtuvo mayor índice de potencia fueron el ácido
ferúlico y el ácido verátrico.
La temperatura tiene un efecto sobre la producción de las lacasas en Trametes sp.
EUM1, teniendo un efecto favorable a los 39°C.
La variación en la actividad lacasa responden a las diferencias en temperatura y a
variaciones de los valores de pH.
El efecto de inducción en Fermentación Líquida (FL) sin agitación se presenta en
los primeros días de la cinética, aunque en los medios de ácido ferúlico se
mantienen los valores de la actividad siempre por encima del testigo.
Los compuestos con mayor índice de potencia y que se mantuvieron en las dos
metodologías por encima del testigo (sin compuesto), fueron el ácido ferúlico y el
ácido verátrico.
52
Resumen de los resultados
La combinación de la temperatura (39ºC) y el ácido ferúlico como inductor permitió
obtener extractos que mantienen el 85% de la actividad después de incubarse a 60°C
durante una hora.
Se tienen las condiciones de producción de enzimas lacasas termotolerantes por
Trametes sp. EUM1.
53
Conclusiones
CONCLUSIONES
Por lo anterior, podemos concluir que el ácido ferúlico favoreció la producción de lacasas
en el hongo Trametes sp. EUM1 y por lo menos una es termotolerante a 60°C, teniendo
encuenta, algunas condiciones como el pH (4.7-5.4), la temperatura (39°C), la edad del
micelio ( micelio maduro) y el medio de cultivo (medio Kirk) siendo este ultimó, un medio
definido.
54
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