1. Efectuar el aislamiento de ADN de hgado de ratn.

2. Evidenciar algunas propiedades fsicas de los cidos nucleicos, tales como viscosidad, absorcin de luz ultravioleta, efecto hipercrmico.

3. Evidenciar mediante reacciones qumicas los diferentes constituyentes de la molcula de ADN. 4. Determinar cuantitativamente el contenido de ADN por gramo de hgado, en base a su capacidad de absorber luz en la regin ultravioleta del espectro electromagntico.

Figura 2: Micrografa electrnica de parte del genoma de la E. Coli

CIDOS NUCLEICOS

Los cidos nucleicos son los componentes fundamentales de la clula viva. Estos, son las nicas sustancias biolgicas que tienen la capacidad de la autoduplicacin y act-an como depositarios y transmisores de la informacin gentica de cada clula, tejido y organismo. Existen dos tipos de cidos nucleicos: el cido desorribonucleico (ADN) y el ci-do ribonucleico (ARN); siendo el primero la molcula donde se encuentran codificados to-dos los genes (genoma) que una clula puede expresar, mientras que la segunda se involu-cra en los procesos de transcripcin y traduccin de la informacin gentica.

Los cidos nucleicos son polmeros de elevado peso molecular cuya unidad mono-

merica es el nucletido, el cual consiste en una base nitrogenada prica o primdica, un grupo fosfato y un azcar de cinco carbonos, ribosa para el ARN y desoxiribosa para el ADN. La conexin entre las sucesivas unidades monomricas se realiza mediante el resi-duo de fosfato unido entre el hidroxilo del carbono 5 de una unidad de azcar al hidroxilo 3 de la siguiente. Los residuos de azcar unidos mediante enlace fosfodiester constituyen el armazn de la molcula de cido nucleico. El grupo fosfato es un cido fuerte, con un valor de pKa de aproximadamente 1 haciendo que a pH fisiolgico cada residuo de ADN o ARN estn cargados negativamente.

En cuanto a su localizacin, el ADN se encuentra siempre en el ncleo de las clulas

eucariotas, asociados con protenas bsicas especificas llamadas histonas constituyendo nucleoprotenas que se conocen como cromosomas. En clulas procariotas, que contienen solo un cromosoma, se hallan esencialmente presente en forma de una sola hlice que for-man crculos covalentemente cerrados. Por su parte el ARN se encuentra mayoritariamen-te en el citoplasma, (ARNr) constituyendo partculas ribonucleoproteicas, los llamados ribosomas. Otros tipos de ARN se encuentran formando ribonucleoprotenas solubles en el citoplasma (ARMm) o prcticamente desprovistas de protenas (ARNt).

OBJETIVOS

Figura 1: Izquierda supe-rior: Micrografa electrni-ca de barrido de un cromo-soma mittico. Izquierda inferior: regin prxima al extremo de un cromosoma mittico tpico. Derecha. Cromosoma metafsico humano despus de sufrir una desorganizacin dirigi-da que ha liberado el DNA de su entramado de mante-nimiento proteico.

El ADN y el ARN son polmeros lineales, llamados cidos nucleicos que estn constitui-dos por la unin de numerosos nucletidos. Cada nucletido esta formado por una nucelsido y un grupo fosfato (cido); el nuclesido a su vez esta formado por una pentosa (ribosa o desosi-rribosa) y una base nitrogenada (purina o pirimidina). La unin mediante el enlace fosfodister entre el nuclesido y el cido fosfrico da lugar al nucletido.

COMPONENTES DE LOS CIDOS NUCLEICOS Fosfato: proporciona el carcter eminentemente cido del ADN y el ARN. Los 5 enlaces

del ortofosfafato estn en resonancia, de manera que la distribucin espacial es equivalente a una molcula tetradrica. Cuando el fosfato se encuentra sustituido por algn radical, solo se tiene los dos primeros pKa, mientras que cuando se esta bisustituido solo queda el pK1.

Los difosfatos o pirofosfatos se presentan a pH fisiolgico como un trianin, siendo estables en disolucin a pH neutro o alcalino. Sin embargo, en el medio intracelular son muy inestables y accesibles a las pirofosfatasas, enzimas que los descomponen en dos monofosfatos. Los trifosfatos siempre forman parte de un nucletido, nunca estn libres.

El enlace que une los dos tomos de fsforo a travs de un tomo de oxgeno

es un enlace anhdrido del tipo fosfoanhidro (no se debe confundir los enlaces fosfo-anhidro entre dos cidos con el enlace fosfoster entre un alcohol y un cido que es mucho menos energtico). La hidrlisis de estos enlaces es altamente exerg-nica (G' = 31 kJ/mol). Parte de esta alta energa se debe a restricciones en la es-tructura resonante, y parte a la repulsin electrosttica entre las cargas negativas. Entre el cido (fosfato) y alcohol (OH de la ribosa) se establece un enlace ster de tipo fosfoster, mucho menos energtico (G' = 14 kJ/mol).

Pentosas: son los componentes neutros (glucdico), y slo hay dos en los cidos nu-

cleicos: la ribosa y la 2-desoxirribosa. Su nombre deriva del Rockefeller Institute of Biochemis-try donde Levene las aisl por primera vez en 1908, y de osa (que era como se llamaban los monosacridos para entonces. La primera (-D-ribofuranosa) es uno de los constituyentes del ARN, mientras que la -D-2-desoxirribofuranosa forma parte del cido desoxirribonucleico (ADN). La nica diferencia consiste en que en la posicin 2 de la pentosa, un grupo OH ha sido sustituido por un H. La presencia del grupo hidroxilo en la posicin 2 en el ARN lo hace suscep-tible a la hidrolisis alcalina, mientras que el ADN es resistente a la misma. Sin embargo, tanto el ADN como el ARN son hidrolizados en medio cido.

MARCO TEORICO

Figura 3: Nucletido. (Zona sombreada nuclesido)

Figura 4: Diferencia en-tre el enlace fosfoster y

fosfoanhidro

Figura 5: Estructura de las pentosas presentes en los cidos nucleicos.

CIDOS NUCLEICOS

Bases Nitrogenadas: se encargan de darle especificidad a los cidos nucleicos. Deri-van del anillo heterocclico de pirimidina o del doble de purina. Las bases pricas que se en-cuentran en los cidos nucleicos (tanto ADN y ARN) son la adenina y la guanina. Por su parte las bases pirimidnicas que aparecen en el ADN son la timina y la citosina, mientras que en el ARN la timina es reemplazada por el uracilo. En el ADN se cumple la ley de Chargaff, la cual establece que la cantidad de (A) es igual a la de (T) y la de (C) igual a (G), es decir, el nmero total de bases pricas es igual al nmero total de bases pirimidnicas (A+G = C+T).

Derivado cclico 2,3-monofosfato

ARN acortado ARN

Mezcla de derivados 2- y 3-monofosfatos

Figura 6: Hidrlisis del ARN en condiciones alcalina. El 2 hidroxi acta como nuclefilo en un desplazamiento intramolecu-lar. El dericado cicliclo 2-3-monofosfato es nuevamente hidrolizado a una mezcla de 2- y 3-monofosfato. El ADN (sin el 2-hidroxi) es estable en condi-ciones similares.

Timina (T) Citisina (C) Uracilo (U)

Adenina(A) Guanina (G)

Figura 7: Estructura de las bases nitrogenadas presentes en los cidos nucleicos.

PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS Los polinucletidos de ADN y ARN son hidrfilos debido a que se pueden formar puen-

tes de hidrgeno entre el agua y los fosfatos, o el agua y los OH de la pentosa. Por tanto, son ms solubles que las bases que los forman. A pH fisiolgico, los grupos fosfato presentan dos cargas negativas, por lo que los polinucletidos son de naturaleza cida. Debido a que los poli-nucletidos son molculas muy largas en relacin a su dimetro, proporcionan soluciones vis-cosas. Qumicamente son muy estables, especialmente en el caso del ADN por carecer del 2-OH. Es precisamente este radical el que proporciona las principales diferencias entre ambos cidos nucleicos, adems de ser el principal responsable de la actividad cataltica de las ribozi-mas.

Los cidos nucleicos absorben luz ultravioleta debido a la presencia de electrones

deslocalizados en los anillos aromticos de las bases nitrogenadas a lo largo de las cadenas de ADN. La absorcin de luz UV en el ADN es una caracterstica de la molcula, que es usada para determinar eficientemente su concentracin. Cada una de las bases tiene su propio y nico es-pectro de absorcin (desde los 249,5 nm para G hasta los 276 nm para C) y por lo tanto contri-buye de manera diferente a la propiedad total de absorcin de UV de una molcula de ADN.

Hay que tener en cuenta que los valores de comentados ms arriba slo son vlidos para las bases sueltas, ya que cuando forman parte de los cidos nucleicos entra en juego el efecto hipercrmico que los hace variar.

Factores que determinan la estructura del ADN: La estructura helicoidal del ADN se

mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones hidrofbicas entre stas, y por otro lado, cada base est unida a su pareja mediante puentes de hidrgeno; adems de la hidrata-cin de los grupos polares del esqueleto azcar-fosfato con el entorno acuoso que tambin con-tribuyen a estabilizar la estructura. La energa libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal del ADN no es muy superior a la energa de los movimientos trmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible desestabilizar la estructura tridimen-sional del DNA mediante un simple aumento de la temperatura.

Figura 8: Espectro de absor-cin de los nucletidos ms comunes. El espectro muestra la variacin en el coeficiente de extincin molar con la longitud de onda. El coeficiente de extin-cin molar a 260 nm y pH 7.0 (260) se encuentra en la tabla. Los espectros correspondiente a los ribonucletidos y desoribo-nucletidos, as como de los nu-clesidos son esencialmente idnticos.

CIDOS NUCLEICOS

Las bases tienen tomos muy electronegativos (N y O) dentro y fuera del anillo arom-tico, por lo que existe una atraccin asimtrica de los electrones de la molcula y, por tanto, se forman dipolos que permiten formar puentes de hidrgeno. De todos los posibles, los ms im-portantes son los puentes de hidrgeno de Watson y Crick que permiten formar el ADN bicate-nario a pH 7 (dos enlaces entre A-T y tres entre C-G). A diferente pH, la estructura se debilita al cambiar la disposicin electrnica de las bases: por protonacin a pH cido, o por desprotona-cin a pH bsico.

Por otra parte, el apilamiento de las bases fue descubierto por Wilkins y Atsbury en

1941 al tratar de validar el modelo del tetranucletido. En esta disposicin, las bases de una misma hebra exhiben la tendencia a apilarse unas sobre otras con una orientacin ms o me-nos perpendicular al eje de la hlice, de forma que las interacciones de las nubes electrnicas de los orbitales (interacciones hidrfobas) entre las bases apiladas contribuye a la estabiliza-cin de la doble hlice. De esta manera se minimiza las interacciones de los anillos hidrofbicos de las bases con el agua, disminuyendo la tensin superficial del sistema. Al disponerse el agua por fuera del polinucletido de una manera ordenada, ste tiende an ms a agregarse, por lo que se genera una especie de cavidad estable en el agua. Aunque ambos factores tienden clara-mente a disminuir la entropa (aumenta el orden) del sistema (S < 0), la estabilidad que se gana por la disminucin de la tensin superficial (H ms negativa) es suficiente para estabili-zar la situacin y que el G sea negativo (0 > G = H TS). El apilamiento se puede detectar mediante el efecto hipercrmico

DESNATURALIZACIN DEL ADN Las hebras de ADN que forman la hlice tienen orientaciones opuestas. La ruptura de

los puentes de hidrgeno por calor, lcali o compuestos qumicos producen la separacin fsica de las dos hebras de ADN y se denomina desnaturalizacin. Por tanto, el ADN desnaturalizado es de una sola hebra. La desnaturalizacin por calor es total a los 90 C y por lcali, a pH supe-riores de 11,3. En ambos casos el proceso es reversible, y al desaparecer el agente desnaturali-zante el ADN monocatenario (desnaturalizado), puede volver a formar el ADN nativo (de doble hebra), este proceso recibe el nombre de renaturalizacin.

Figura 10: Efecto hiper-crmico. A medida que se apilan ms las bases, va disminuyendo el coefi-ciente de extincin mo-lar, y tambin disminuye (pero mucho menos per-ceptiblemente) la longi-tud de onda del mximo de absorbancia.

Figura 9: Variacin en la formacin de puentes de hidrgenos entre las bases del ADN a dife-rentes valores de pH.

El ADN desnaturalizado absorbe un 37% ms de luz UV que su forma helicoidal o apareada. Los anillos heterocclico de las bases del ADN absorben ms cantidad de luz cuando no estn apiladas debido a que no forman puen-tes de hidrgeno en el interior de la doble hlice. Este efecto hipercrmico se debe a interacciones entre los sistemas de electrones de las bases, en don-de los enlaces de hidrogeno en la doble hlice limita el comportamiento de resonancia del anillo aromtico de las bases nitrogenadas que se traduce en una disminucin de la absorbancia.

La forma ms corriente de desnaturalizar el ADN es por calentamien-

to y se debe a que al aumentar la temperatura se debilitan los enlaces de hidrgeno que mantienen unidas a la dos hebras del ADN haciendo que a una determinada temperatura ocurra una completa separacin entre las hebras. Este comportamiento se estudia mediante una grfica llamada curva de fu-sin del ADN, donde se representa el porcentaje de desnaturalizacin (estimado a partir de las medidas de absorbancia a 260 nm, A260) en funcin de la temperatura. Esta curva presenta las siguientes caractersticas:

1.- La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por enci-

ma de las fisiolgicas. En este intervalo, la molcula est como doble hebra. 2.- El aumento de absorbancia tiene lugar en un estrecho rango de

temperaturas (6-8 C). La Absorbancia empieza a aumentar cuando comien-zan a romperse las uniones entre las bases en varios segmentos de la molcu-la. El nmero de pares de bases (PB) que se rompen aumenta con la tempera-tura, y con ella la A260. Al final del tramo ascendente, las dos hebras se man-tienen juntas por unos cuantos PB.

3.- La A260 mxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y corresponde al estado en que las dos hebras estn completamente separadas.

Un parmetro muy til para caracterizar la evo-lucin de la fusin es la temperatura a la que el aumento de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusin del ADN (Tm). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el conte-nido de G+C. Como el par de bases G-C est unido por tres puentes de hidrgeno (a diferencia del par A-T que slo pre-senta 2) se requiere una temperatura ms alta para desnaturalizarlo.

Figura 11: Estructura del ADN.

Figura 12: Curva de fusin del ADN.

CIDOS NUCLEICOS

TCNICAS DE EXTRACCIN Y AISLAMIENTO DE ADN

Existen diferentes tcnicas para la extraccin del ADN, aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos. Los mtodos de extraccin de ADN pueden clasificar-se de diversas maneras, segn:

En trminos generales la separacin del ADN de los componentes celulares puede ser dividida en cuatro etapas: A) Disrupcin celular (ruptura de la bicapa lipdica de las membranas celulares). B) Remocin de protenas y contaminantes. C) Recuperacin del DNA (precipitacin con alcoholes). D) Lavado y resuspensin. El primer paso en cualquier protocolo de separacin es la ruptura de las clulas, ya sean de origen bacteriano, vegetal o animal; y suspensin de los ncleos en un buffer estabili-zante. Los mtodos de lisis pueden ser mecnicos, qumicos o enzimticos. Es una etapa crtica, porque el rendimiento final puede verse reducido si no se rompen bien las clulas, o si no se protege el ADN durante el proceso. El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesa-ria para romper el material de inicio (clulas o tejidos) y la delicadeza requerida para para pre-servar las molculas de inters. Generalmente se efectan mtodos fsicos como la homogenizacin (con mortero, tala-dro, torno, o vrtex) y que tiene por objeto romper el tejido y molerlo a un grado muy fino. Entre los mtodos qumicos se encuentran el uso de detergentes, mientras que en los enzimti-cos destacan el uso de lisozima que rompe los enlaces -1,4 entre el cido N-acetilmurmico y la N-acetil-glucoamina del peptidoglucano de la pared celular en bacterias gram positivas o el uso lyticasa que rompe enlaces -1,3 del glucano en levaduras. Es muy importante en esta fase proteger al ADN de la accin de las nucleasas endge-nas (que normalmente se encuentran fuera del ncleo, pero que pueden entrar en contacto con el ADN durante la ruptura de las clulas), y evitar la oxidacin de polifenoles, ya que sus pro-ductos desestabilizan al ADN. Para ello se trabaja de diferentes maneras: - Molienda del tejido previamente congelado en freezer (-20 C) o nitrgeno lquido (< -70 C). Una vez que est bien molido, y antes que se descongele se agrega el buffer de extraccin. - Liofilizacin del tejido (deshidratacin en vaco). Puede mantenerse a temperatura ambiente indefinidamente hasta efectuar la extraccin. - Efectuar directamente la molienda del tejido fresco sumergido en el buffer de extraccin.

Figura 13: Lisis celular. La cantidad y calidad del ADN obtenido es propor-cional al grado de ruptu-ra del tejido tratado.

A) Tipo de ADN a extraer: genmico, cloroplstico, mitocondrial. B) Cantidad de material inicial: mini-prep (0,01-0,2 g de material fresco (MF)), midi-prep (0,3-2 g MF) y maxi-prep (5-20 g MF). C) Tipo de detergente utilizado en el buffer de extraccin: bromuro de cetilmetil amo-nio (CTAB), dodecil sulfato de sodio (SDS), etc.

Figura 13: Izquierda: estructura del CETAB. Derecha: estructura del SDS.

La segunda etapa consiste en la accin de agentes que producen la lisis de membranas que separan el ADN de los otros componentes celulares (protenas, carbohidratos, membranas y paredes celulares), y lo liberan en la solucin. En esta etapa debe lograrse que el ADN se dis-ocie completamente de las protenas y otros contaminantes que pueden coextraerse y por lo tanto interferir con los anlisis subsiguientes. Tambin debe evitarse perder una cantidad sig-nificativa de ADN junto con los restos celulares. En general se usan soluciones buffers de ex-traccin que contienen diversos agentes qumicos: - Detergentes fuertes, que disocian las protenas del ADN y actan simultneamente como in-hibidores de las nucleasas endgenas que podran degradarlo. Los ms comunes: SDS y CTAB. - El cido etilendiamintetraactico (EDTA) o alguna de sus sales, que actan como quelantes del Mg+2. Este in puede producir la agregacin de los cidos nucleicos entre s, o con protenas, por lo tanto al ser secuestrado por el EDTA, el ADN se mantiene en solucin. - Mercaptoetanol, que se utiliza para inhibir la oxidacin de polifenoles. La concentracin de polifenoles se incrementa con la edad, por ello es importante utilizar tejidos jvenes.

El paso final consiste en la purificacin del ADN mediante precipitaciones y resuspen-siones sucesivas aumentando su concentracin. Como el principal contaminante del ADN son protenas se recurre a un proceso de desproteinizacin, el cual se lleva a cabo con un solvente orgnico (fenol o alternativamente cloroformo) que sirve como desnaturalizador activo de pro-tenas que suprime la solubilidad de las mismas en la preparacin y las precipita. Puesto que el solvente orgnico y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifu-gar la suspensin para separar las fases, permaneciendo el ADN ( y el ARN) en la solucin de la fase acuosa y la protena presente como un precipitado concentrado en la interface. Se extrae la fase acuosa y se somete a ciclos repetidos de agitacin con el solvente y centrifugacin hasta agotar toda la protena en la solucin.

Aadiendo alcohol frio, como etanol o isopropanol, se forma una capa arriba de solu-

cin acuosa del ADN donde el mismo precipita. En lneas generales, la precipitacin se produce cuando se trata la solucin de ADN con una sal en presencia de un alcohol, trabajando a bajas temperaturas (-20 C o menor). En estas condiciones se forma un precipitado, que son las sales de los cidos nucleicos. Este precipitado (que se visualiza como un flculo o "nube" que flota en la suspensin y consta de la aglomeracin de miles de molculas de ADN) se sedimenta me-diante centrifugacin. Luego se elimina el sobrenadante, y el pellet de ADN se resuspende en agua o en un buffer apropiado. Estos buffers generalmente poseen EDTA para quelar los iones de metales pesados (requeridos por las DNAasas para actuar), y poseen un pH de 8 para mini-mizar la interaccin ADN-protena. Se pueden efectuar tantos ciclos de precipitacin-resuspensin como sean necesarios. Este proceso tambin se utiliza para concentrar el ADN de una muestra en la que est muy diluido.

Existen otros mtodos de purificacin de cidos nucleicos en los que destaca la cromatografa en columna que ha demostrado ser una herramienta muy til ya que dispone de varios mecanismos de separacin como la cro-matografa de permabilidad en gel, de intercambio ionico y de adsorcin. Otra tcnica fundamental es la electroforesis en gel de agarosa que permite separar los cidos nucleicos en funcin de su tamao. Aunque esta tcnica se emplea fun-damentalemte con propsitos analticos puede ser usada como una poderosa herrmaienta preparativa en la purifica-cin de cidos nucleicos.

Figura 15: Electroforesis de ADN. Se emplean sustancias fluorescentes como el bromuro de etidio para detectar las molculas de ADN al irra-diar luz UV sobre el gel de agarosa.

Figura 15: Tris(hidroxi- metil)aminopentano.

CIDOS NUCLEICOS

CUANTIFICACIN DE ADN

Una vez se ha realizado la extraccin de ADN o ARN, es necesario para muchas aplica-ciones, conocer la cantidad y la calidad del cido nucleico obtenido. Generalmente, se realiza mediante la medicin de la cantidad de irradiacin ultravioleta absorbida por las bases o por la intensidad de fluorescencia por bromuro de etidio. Mtodo espectrofotomtrico: la cuantificacin por este mtodo se basa en la absor-bancia de los cidos nucleicos en la regin UV del espectro, por lo que la medicin a 260 nm permite determinar la concentracin de cidos nucleicos en una muestra. La relacin de absor-bancias a 260 y 280 nm es usado como un parmetro de pureza del ADN y ARN y se le conoce como densidad ptica O.D. y se basa en el hecho de que los aminocidos aromticos como triptfano, tirosina y fenilalanina, que se encuentran en todas las protenas absorben fuerte-mente radiacin UV a 280 nm. De manera que para que una muestra sea aceptada como pura la relacin de A260/A280 debe ser igual o mayor de 1,8 en el caso del ADN y de 2,0 para el ARN. Si hay contaminacin con protenas o fenol u otras soluciones empleadas durante la ex-traccin, el valor de la proporcin es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera precisa el ADN. Se toma como referencia que una O.D. medida a 260 nm, corresponde aproximadamen-te a: 1) 50 g/mL de ADN de doble cadena, 2) 40 g/mL de ARN o de ADN de cadena sencilla 3) 20 g/mL cuando se trata de oligonucleotidos. Mtodo de fluorescencia: si no es posible cuantificarlo por este mtodo por la poca cantidad de ADN obtenido (

La purificacin de ADN es una tcnica importante en los laboratorios modernos de bioqumica. La purificacin de ADN ya sea genmico o plsmido, es usado en un gran nmero de aplicaciones, especialmente en biologa molecular donde es necesario un ADN de elevada pureza para llevar a cabo estudios de clonacin, PCR o de biotecnologa. En este laboratorio se purificar ADN genmico de hgado de ratn comn (Mus musculus). Para purificar el ADN genmico se necesita un medio para lisar las clulas y una estrategia para proteger el ADN de la degradacin y separarlo de otras biomolculas contaminantes de las clulas eucariotas. Para lisar las clulas se usarn mtodos mecnicos y SDS, mientras que con una mezcla de fenol-cloroformo se limitar la solubilidad de las protenas contaminantes hacindolas precipitar, permitiendo usar etanol para precipitar el ADN libre de protenas.

METODOLOGA EXPERIMENTAL

REACTIVOS - Buffer TES: Tris, HCl 25 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, NaCl 0,1 M. - Dodecilsulfato de sodio 10% p/v (SDS). - Mezcla de cloroformo-fenol 1:1 (mCF). - Sacarosa 0,2 M. - NaCl 0,9 p/v. - Etanol. - H2SO4 30% v/v. - H2O2 30 p/v. - Molibdato de amonio 2,5% p/v. - Reactivo de Bial: 0,3 g de Orcinol, 100 mL de HCl concentrado y 0,5 mL de FeCl3 10% p/v.

MATERIAL BIOLGICO - Un ratn. MATERIALES Y EQUIPOS - Homogenizador de tejidos. - Centrifuga clnica. - Espectrofotmetro UV-Visble. - Equipo de diseccin. - Gasa, papel de filtro.

PROTOCOLO 1. Desnuque un ratn, presionndolo firmemente por el cuello a la altura de las orejas con las pinzas de diseccin, mientras se jala fuer-temente la cola. 2. Utilizando tijeras y pinzas, se abre el abdomen y se retira el hgado, colocndolo en un vaso de precipitados con unos 5 mL de NaCl al 0,9%. 3. Trate de eliminar la mayor cantidad de sangre, decantando el lqui-do. Lavar con otra porcin de solucin fisiolgica de NaCl. 4. Coloque el hgado sobre un papel de filtro para eliminar el exceso de liquido. Pesar el rgano el cual debe ser de al menos de 2 g. 5. Cortar el hgado en un mortero tan finamente como sea posible. Con el mazo del mortero presionarlo hasta formar una papilla, 6. Agregue 10 mL de tampn TES y agite. Transfiera porciones de esta suspensin a un homogenizador de tejidos y efecte de 8-10 pa-ses con el embolo de tefln. 7. Filtre la solucin (Homogenato H) a travs de gasa y mida el volu-men obtenido. Completar el volumen a 50 mL con buffer TES. 8. En un tubo de centrifuga, colocar 3 mL de solucin de sacarosa 0,2 M y agregar suavemente 9 mL del homogenato con el fin de formar una interfase entre ambas soluciones.

Figura 17: Mus musculus. Como fuente biolgica de ADN

Figura 18: Anatoma de un ratn

CIDOS NUCLEICOS

.

9. Centrifugue a 3000 rpm por 10 minutos. 10. Con una pipeta Pasteur, retirar el sobrenadante (Fraccin citoplasmtica C) pardo rojizo. Decante cuidadosamente el resto de la solucin del tubo de centrfuga y conserve el precipitado (Fraccin nuclear N). 11. Resuspenda los ncleos en 4 mL de tampn TES. Adicione 1 mL de SDS al 10% y observe la viscosidad. 12. Agregue 7 mL mCF, agite por rotacin y luego en vortex por 5 minutos. 13. Centrifugue por 10 minutos a 3000 rpm. Retire la capa superior acuosa y descarte la inferior orgnica. 14. Reextraiga la fase acuosa con 5 mL de mCF y centrifugue de nuevo. Retire la fase acuosa y adicione 2 volmenes de etanol frio. 15. Agite con una varila de vidrio y trate de enrollar el material fibroso de ADN que se ha formado en la interfase agua-etanol. 16. Presione el material recogido en la varilla contra el recipiente para eliminar el eta-nol. 17. Disuelva el material en 6 mL de NaCl 0,9%, acelerando el proceso por agitacin con un vortex. Esta solucin constituye la fraccin de ADN concentrado.

CARACTERIZACIN DE LA MOLCULAS AISLADAS 1) Absorcin de luz UV y pureza del ADN Diluya 1 mL de la solucin de ADN, con 5 mL de solucin fisiolgica y determine la ab-sorbancia a 260 con un espectrofotmetro UV-Visible. En caso de ser necesario ajuste la absorbancia a 1-2 unidades/mL, diluyendo la muestra preparando un volumen minimo de 6 mL. Luego determine la absorbancia a 280 nm. 2) Efecto Hipercrmico Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 3 mL de la disolucin diluida de ADN prepara-da anteriomrmente. Caliente por 10 minutos en agua hirviente y determine la absorban-cia a 260 nm.

3) Determinacin cualitativa de ribosa Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 0,5 mL de la solucin concentrada de ADN y adicione 2,5 mL de reactivo de Bial. Caliente en agua hirviente por 10 minutos.

La prueba de identificacin se basa en la deshidratacin que sufren las pentosas en presencia de cido fuerte para producir furfural. El furfural posteriormente reacciona con orci-nol, produciendo un complejo de color azul con el hierro presente. 4) Determinacin cualitativa de fosfato En un tubo de ensayo adicione 0,5 mL de la solucin diluida de ADN y 1 mL de H2SO4 30% ca-lentando vigorosamente con un mechero. Observe el oscurecimiento de la solucin. Adicione 4-5 gotas de H2O2 al 30% y continue calentando hasta que la solucin se torne incolora. Adicione 1 mL de molibdato de amonio al 2,5% y observe la coloracin amarilla que se produce (fosfomolibdato de amonio)

HPO4-2 + 3NH4

+ + 12MoO4 + 23H

+ (NH4)3[P(Mo3O10)4] + 12H2O Primero ocurre una digestin de la materia organica por parte del cido sulfrico y el perxido permitiendo que los iones fosfatos puedan reaccionar con el molibdato formando un precipitado de fosfomolibadato de color amarillo. Este ltimo por reduccin origina un com-puesto cuya estructura exacta se desconoce, denominado azul de molibdeno. Como reducto-res se pueden utilizar muchos compuestos, de los cuales el sulfohidrato de hidrazina, el cloruro estaoso, el cido 1,2,4-aminonaftosulfnico y el cido ascrbico son los ms empleados.

METODOLOGA EXPERIMENTAL

Figura 19: Prueba del Bial: Negativa (izquierda y centro) positiva (derecha)

Calcule: 1) Contenido de ADN (mg) por gramo de higado. 2) Nmero mximo de clulas por gramo de higado. 3) Peso de una clula heptica.

RESULTADOS Tomando en consideracin: 1) Masa del higado extraido. 2) Volumen (mL) de homogenato procesado. 3) Diluciones efectuadas. 4) Absorbancia determinanda

Figura 20: Precipitado de fosfomolibdato de

amonio.