Embed Size (px)
Citation preview
0
PSU Grant Report_2013 (1.2) รปแบบรายงานวจยฉบบสมบรณ แบบท 1 (ส าหรบโครงการวจยเดยวหรอโครงการวจยยอย)
สวนท 1 หนาปก
รายงานวจยฉบบสมบรณ
การพฒนาสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ โดยบรรจในอนพนธของไขมน
เพอเตรยมเปนยาผงแหงส าหรบฉดและพนละอองฝอย
Development of amphotericin B incorporated in lipid derivatives as a reconstituted powder for injection and nebulization
คณะนกวจย นายเอกวฒน ทวทอง หวหนาโครงการ
นางวไลพร บวทอง ผรวมวจยโครงการ นายวกรม ชางสาน ผรวมวจยโครงการ รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ ผรวมวจยโครงการ
โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากเงนรายไดมหาวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร ประจ าปงบประมาณ 2556 รหสโครงการ PHA560308S
1
ชอโครงการ (ภาษาไทย): การพฒนาสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ โดยบรรจในอนพนธของไขมน เพอเตรยมเปน
ยาผงแหงส าหรบฉดและพนละอองฝอย
(ภาษาองกฤษ): Development of amphotericin B incorporated in lipid derivatives as a reconstituted powder for injection and nebulization.
คณะนกวจยและหนวยงานตนสงกด (คณะ/ภาควชาหรอหนวยงาน) หวหนาโครงการ
นายเอกวฒน ทวทอง สถานวจยความเปนเลศระบบน าสงยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112
โทรศพท 0-7428-8971, โทรสาร 0-7428-8979 E-mail: [email protected]
ผรวมวจยโครงการ
นางวไลพร บวทอง สถานวจยความเปนเลศระบบน าสงยา
คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112 โทรศพท 0-7428-8971, โทรสาร 0-7428-8979
E-mail: [email protected]
นายวกรม ชางสาน สถานวจยความเปนเลศระบบน าสงยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112
โทรศพท 0-7428-8971, โทรสาร 0-7428-8979 E-mail: [email protected]
2
รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ ภาควชาเทคโนโลยเภสชกรรม
คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา 90112
โทรศพท 0-7428-8909, โทรสาร 0-7428-8979 E-mail: [email protected]
3
สารบญ หนา
รายการตาราง 4 รายการรป 5 กตตกรรมประกาศ 7 บทคดยอ 8 Abstract 9 บทน า 10 วตถประสงค 11 การตรวจเอกสาร 11 วธการทดลอง 16 ผลการทดลอง 24 สรปผลการทดลอง 43 เอกสารอางอง 46 ขอคดเหนและขอเสนอแนะส าหรบการวจยตอไป 48 ภาคผนวก ประกอบดวย 49
1. นพนธตนฉบบทพรอมสงตพมพ (Manuscript) จ านวน 1 เรอง 2. สทธบตร จ านวน 1 เรอง
4
รายการตาราง หนา
ตารางท 1 คาเคมคลชฟต (chemical shift) ของสญญาณโปรตอนของสารทไดจากการสงเคราะห 27 ตารางท 2 ลกษณะของยาแอมโฟเทอรซน บ และอนพนธของไขมนชนดตางๆ กอนและหลงใหความรอน โดยใช Hot stage polarized light microscope (PLM)
31
ตารางท 3 ขนาดอนภาค และคาศกยซตา ของสตรต ารบยางผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของ ไขมนชนดตางๆ ทระยะเวลาเกบตางๆ
33
ตารางท 4 ขนาดอนภาค คาศกยซตา และปรมาณยาของต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบ อนพนธของไขมน หลงจากเกบไวนาน 6 เดอน
34
ตารางท 5 คณสมบตทางแอโรโซลของสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ทละลายดวย น ากลน
35
ตารางท 6 ความแรงของยา ความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเช อรา (MIC) และความเขมขนต าสด ในการฆาเช อ (MFC) ของต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต ต ารบทมใชในปจจบน และยามาตรฐาน C. neoformans, C. albicans และ S. cerevisiae
43
5
รายการรป หนา
รปท 1 โครงสรางทางเคมของยาแอมโฟเทอรซน บ 12 รปท 2 โครงสรางทางเคมของอนพนธของไขมน 15 รปท 3 โครงสรางทางเคมของสารต งตน (กรดดออกซโคลค) (1) และผลตภณฑทไดจากการสงเคราะห อนพนธของไขมน (เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร (Methyl deoxycholate ester) (2), ดออกซ โคลคแอลกอฮอล (Deoxycholic alcohol) (3) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate) (4))
24
รปท 4 IR spectrum ของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต 25 รปท 5 FT-IR spectrum ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (A), โคลคเอซด (CA) (B), โซเดยมโคเลต (SC) (C), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมโคเลต (AmB-SC) (D), โพแทสเซยมโคเลต (KC) (E) และสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยมโคเลต (AmB-KC) (F)
26
รปท 6 FT-IR spectrum ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (A), ดออกซโคลคเอซด (DCA) (B), โพแทสเซยมดออกซโคเลต (KDC) (C), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยม ดออกซโคเลต (AmB-KDC) (D), โซเดยมดออกซโคเลต (SDC) (E), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (AmB-SDC) (F), โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) (G) และสตรต ารบ ยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (AmB-SDS) (H)
26
รปท 7 ภาพถายจากกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM) ทก าลงขยาย 500, 3500 และ 10000 เทา ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (รปท 7 A-C), SDC (รปท 7 D-F), SDC-AmB (รปท 7 G-I) SDS (รปท 7 J-L) และ SDS-AmB (รปท 7 M-O)
28
รปท 8 DSC thermograms ของต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ SDC-AmB (A) และ SDS-AmB (B) ยาแอมโฟเทอรซน บ (C) และอนพนธของไขมน SDC (D) และ SDS (E)
30
รปท 9 ขนาดอนภาค และคาศกยซตาของสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) และสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC- AmB)
32
รปท 10 คาการดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ และอนพนธของไขมน (SDC- AmB คอ คอลมนดานซาย และ SDS-AmB คอ คอลมนดานขวา) ทละลายดวยตวท าละลายตางๆ ((A) ละลายดวย DW (B) ละลายดวย 5% DEX (C) ละลายดวย NSS และ (D) ละลายดวย Diluted NSS)
38
6
รายการรป (ตอ) หนา
รปท 11 การรอดชวตของเซลล AMs NR8383 (A), A549 (B), Calu-3 (C) และ 293T/17 (D) หลงจาก บมเซลลกบตวพาโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) ท 37 °C, 5% CO2 เปนเวลา 24 ชวโมง
39
รปท 12 การรอดชวตของเซลล AMs NR8383 (A), A549 (B), Calu-3 (C) และ 293T/17 (D) หลงจาก บมเซลลกบต ารบยาผงแหง SDS-AmB และต ารบ SDC-AmB ท 37 °C, 5% CO2 เปนเวลา 24 ชวโมง
40
รปท 13 การแตกของเมดเลอดแดงของคนในหลอดทดลองเมอบมกบตวพาโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) (A) และเมอบมกบต ารบยาผงแหง SDS-AmB, SDC-AmB และยาแอมโฟเทอรซน บ เดยวๆ (AmB) (B) เปนเวลา 24 ชวโมง
41
7
กตตกรรมประกาศ
งานวจยฉบบน ส าเรจลลวงไดดวยด คณะผวจยขอขอบพระคณสถานวจยความเปนเลศระบบน าสงยา ทไดอ านวยความสะดวกในดานสถานท รวมท งเครองมอ และอปกรณตางๆ ทใชในการวจย
ขอขอบคณมหาวทยาลยสงขลานครนทร ทไดอนมตเงนอดหนนการวจย ประเภททวไป ประจ าปงบประมาณ 2556 สญญาเลขท PHA560308S
นอกจากน ตองขอขอบคณ คณกรกมล เพชรยอด ทไดชวยประสานงานดานเอกสาร ขอบคณคณทตยพวลย นาคเพง คณกตตยา ถนพนธ และคณคาจราม อาดคาร (นกศกษาปรญญาเอก) ทไดใหค าปรกษาในสวนของการศกษาและทดสอบฤทธการยบย งและฆาเช อรา และความเปนพษของสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ
สดทายตองขอขอบคณสมาชกสถานวจยความเปนเลศระบบน าสงยาทกทาน ทไดใหก าลงใจตลอดการท างานวจยในคร งน
คณะนกวจย
เอกวฒน ทวทอง วไลพร บวทอง วกรม ชางสาน ธระพล ศรชนะ
8
บทคดยอ
งานวจยน ไดสงเคราะหอนพนธของไขมน คอ โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) โดยใชกรดดออกซโคลคเปนสารต งตน พรอมท งน าไปใสในสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บกบอนพนธของไขมน เพอเตรยมเปนยาผงแหงส าหรบฉดและพนละอองฝอย ในอตราสวนโมลของยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน เทากบ 2:1 ซงผานกระบวนการท าแหงแบบเยอกแขง และศกษาคณสมบตของสตรต ารบโดยใชเทคนค fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), nuclear magnetic resonance (NMR), scaning electron microscopy (SEM), differential scanning calorimetry (DSC) และ UV Spectrophotometer (UV) ผลการศกษาพบวาทกสตรต ารบมความคงตวท งทางเคมกายภาพด มความคงตวหลงจากเกบไวนาน 6 เดอน และเหมาะกบการน าไปพฒนาเพอใชเตรยมเปนยาผงแหงส าหรบฉดและพนละอองฝอย นอกจากน ทกสตรต ารบ (SDS-AmB และ SDC-AmB) ไดน ามาศกษาคณสมบตทางแอโรโซลของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน โดยใช jet-nebulizer ตอกบ Andersen cascade impactor (ACI) จากน นค านวณคา mass median aerodynamic diameter (MMAD) และ fine particle fraction (FPF) มคา MMAD ของสตรต ารบอยในชวง 1.70-2.05 ไมครอน และมคา FPF อยในชวง 70-80% ผลการทดสอบความเปนพษของสตรต ารบ ในชวงความเขมขน 1-8 ไมโครกรมตอมลลลตร ตอเซลลมาโครฟาจ เซลลปอด และเซลลไต มคามากกวา 85 เปอรเซนต พบวายาผงแหงทกสตรต ารบไมมความเปนพษตอเซลล มคาการแตกของเมดเลอดแดงนอยกวายาแอมโฟเทอรซน บ เดยว และมคาความแรงของสตรต ารบกบเช อ C. neoformans, C. albicans และ S. cerevisiae พบวาสตรต ารบมความแรงอยในชวง 100-103 เปอรเซนต สตรต ารบยาผงแหง SDS-AmB และ SDC-AmB มคาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราตอเช อ C. neorformans เทากบ 0.16 และ 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร คาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราของต ารบ SDC-AmB ตอเช อ C. albicans เทากบ 0.16 และ 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร สวนต ารบ SDS-AmB มคาเทากบยาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธเทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร
9
Abstract
Sodium deoxycholate sulfate (SDS) was synthesized from deoxycholic acid in house laboratory for this research work. Amphotericin B incorporated in lipid derivatives as a reconstituted powder for injection and nebulization with mole ratio 2:1 (lipid derivatives : AmB) were prepared by freeze drying. The characterization of these formulations were characterized by using fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), nuclear magnetic resonance (NMR), scaning electron microscopy (SEM), differential scanning calorimetry (DSC) and UV Spectrophotometer (UV). All formulations were stable within the storage period of 6 months and provided a desirable feature for their use in dry powder drug delivery systems. For all formulations (SDS-AmB and SDC-AmB) were evaluated for content uniformity and delivery efficiency to lower airways by jet nebulizer using aerosol sampling apparatus and Andersen cascade impactor (ACI), respectively. The results were calculated as the mass median aerodynamic diameter (MMAD) and fine particle fraction (FPF). MMAD and FPF of all AmB dry powder formulations were obtained between 1.7-2.05 m and 70-80%, respectively. All AmB-lipid derivative formulations (1-8 µg/ml of concentrations) were not toxic to human red blood cells and respiratory cell lines including small airway epithelial and alveolar macrophage cell lines. AmB-lipid derivative formulations against C. neoformans, C. albicans and S. cerevisiae gave equivalent potency to that of standard AmB (100%). Minimum inhibitory concentration (MICs) and minimum fungicidal concentration (MFCs) of both SDS-AmB and SDC-AmB against C. neoformans was 0.16 and 0.32 µg/ml respectively. SDC-AmB has higher potency than SDS-AmB against C. albicans which MICs and MFCs of SDC-AmB was 0.16 and 0.32 µg/ml while MICs and MFCs of SDS-AmB against C. albicans was 0.32 and 0.63 µg/ml similar to pure amphotericin B.
10
บทน า
ยาแอมโฟเทอรซน บ เปนยาปฏชวนะในกลม polyene ทนยมใชกนอยางกวางขวางมานานกวา 45 ป ในการรกษาการตดเช อราในรางกาย (Czub และคณะ, 2009) จดอยใน Biopharmaceutical classification system (BSC) class IV ถงแมวาตวยาจะมความเปนพษตอรางกาย แตยาแอมโฟเทอรซน บ เปนยาทถกเลอกใชเปนอนดบแรกในการรกษาการตดเช อราชนดทแพรกระจายทวรางกายในผปวยทมภมคมกนบกพรอง เชน ผปวยมะเรง (cancer) ผปวยทมการเปลยนถายอวยวะ (transplants) และผปวยเอดส (AIDS) เปนตน เนองจากยาแอมโฟเทอรซน บ มขอจ ากดในดานการละลายและการดดซม สงผลใหยามชวประสทธผล (bioavailability) ในการรบประทานต า (Ibrahim และคณะ, 2012) สตรต ารบยาทมไขมนเปนองคประกอบอาจมประโยชนในการน าสงยา โดยชวยเพมความสามารถในการสะสมของยาทปอด และท าใหยาอย ในเน อเยอปอดไดนานข น นอกจากน ระบบน าสงยาทมไขมนเปนองคประกอบยงสามารถชวยลดผลขางเคยงทเปนพษของยาได ระบบน าสงยาดงกลาวทรจกกนโดยทวกน คอ liposome โดยมชอทางการคาวา Ambisome® และ phospholipid complex ทมชอการคาคอ Abelcet® ระบบน าสงยาสปอดของแอมโฟเทอรซนบถกพจารณาน ามาใชในการรกษา pulmonary aspergillosis สาเหตการเกดโรคเกดจากการสดเช อ Aspergillus conidia เขาไปในรางกาย ซงน าไปสการเสยชวตในผปวยทภมคมกนบกพรอง การน าสงยาสเปาหมายทปอดโดยตรงยงมประโยชนในการลดผลขางเคยงทรายแรงทวรางกายอนเนองจากยา ซงยาจะอยในกระแสเลอดไดต า ท าใหผปวยทนตอการใชยาโดยไมพบอาการของความเปนพษจากยา (Nasr และคณะ, 2012)
รปแบบยาในอดมคตควรเปนยาทน าสงโดยตรงสเปาหมาย ทท าใหอวยวะเปาหมายมยาสะสมในระดบ
ความเขมขนทมประสทธภาพในการรกษา และไมเปนพษตอรางกายหรออวยวะสวนอน ส าหรบการตดเช อราใน
ปอด เสนทางการน าสงยาคอ การน าสงยาไปยงปอดโดยผานการพนแบบละอองฝอย (nebulizer) (Kuiper และ
Ruijgrok, 2009) ระบบน าสงยาสปอดจะใหการรกษาเกดข นบรเวณทตดเช อ และลดความเปนพษตอไตจากระดบ
ความเขมขนของแอมโฟเทอรซนบทสง
เพอแกไขขอจ ากดในดานการละลายน าของยาแอมโฟเทอรซน บ เปาหมายหลกของงานวจยน คอ พฒนา
สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทมไขมนเปนองคประกอบแบบยาผงชนดผสมน ากอนใชส าหรบฉดและสดพนแบบ
ละอองฝอยทละลายน าไดดและมความคงตว โดยใชกระบวนการท าใหแหงแบบเยอกแขง (freeze drying)
นอกจากน ท าการประเมนความเปนพษและฤทธในการตานเช อราของยาแอมโฟเทอรซน บ ทกกเกบในอนภาค
ไขมนระดบไมโครเมตร เพอความปลอดภยในการน าไปใชกบผปวย
11
วตถประสงค
1. เตรยมสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ โดยบรรจในอนพนธของไขมน เพอเตรยมเปนยาผงแหงส าหรบฉดและพนละอองฝอย
2. เพอศกษาคณสมบตทางเคมกายภาพและอนตรกรยาของยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน
3. เพอศกษาฤทธการยบย งและฆาเช อรา และความเปนพษของสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทบรรจในอนพนธของไขมน การตรวจเอกสาร การน าสงยาทางปอดโดยทวไปท าได 3 วธ คอ 1) การใชเครองพนละอองฝอย (Nebulizer) หรอการสราง
ละอองโดยใชเครองอดอากาศหรอออกซเจน วธน มกจะใชในโรงพยาบาล 2) ยาสดพนอดไอก าหนดขนาด
(pressurized metered-dose inhaler; pMDI) ซงไดรบความนยมเนองจากอปกรณมขนาดเลก ตองอาศยสารขบ
ดน (propellant) ในการท าใหเกดละออง และพนยาผานวาลวทสามารถก าหนดขนาดยาได โดยในการใชงาน
pMDI ผปวยจะตองไดรบการฝกฝนเพอใหหายใจเขาไดสมพนธกบการกดพนยา เพอใหไดรบยาครบขนาด และ 3)
ยาผงแหงสดพนสทางเดนหายใจ (Dry powder inhalers; DPI) มขอด คอไมตองอาศยสารขบดนในต ารบ ตางกบ
ยาสดพนอดไอก าหนดขนาด (pMDI) และสามารถน าสงยาไดในขนาดสง ผปวยสามารถบรหารยาเองไดงาย และ
ต ารบอยในรปแบบผงแหงจงมความคงตวสง การปลดปลอยตวยาอาศยเพยงกระแสอากาศจากลมหายใจเขา ท าให
ผงยาเกดการฟงกระจายและเคลอนทเขาสทางเดนหายใจ (Misra และคณะ, 2011) ในปจจบนมอปกรณทใช
ส าหรบบรหารยา DPIs มากกวา 20 ชนด และก าลงไดรบการพฒนาอกหลายชนด เพอใหเหมาะกบการน าสงยา
ชนดตางๆ (Muttil และคณะ, 2009)
เภสชจลนศาสตร (pharmacokinetics; PK) ของยาสดพนสทางเดนหายใจ ข นอยกบคณสมบตของ
อนภาคยาเปนหลก โดยขนาดทางอากาศพลศาสตร (aerodynamic diameter) มความส าคญมากกวาขนาดทาง
กายภาพ ทจะสงผลตอต าแหนงทอนภาคยาจะไปถง กลาวคออนภาคยาทมขนาดทางอากาศพลศาสตรเหมาะสม
เทาน นทจะไปถงปอดสวนลาง สวนอนภาคยาทมขนาดไมเหมาะสมจะคางอยภายในชองปาก หรอทางเดนหายใจ
สวนตน หรอสญเสยไปพรอมกบลมหายใจออก (Misra และคณะ, 2011) โดยขนาดทางอากาศพลศาสตรท
เหมาะสม อยในชวง 1 – 5 ไมครอน (Pilcer และ Amighi, 2010) และคา “fine particle fraction” (FPF) ซง
บงช ถง % ของอนภาคทมขนาดเลกกวา 5 ไมครอน สามารถน ามาท านายประสทธภาพในการน าสงไปสปอดได
12
ยาทน ามาใชในการวจยน คอ ยาแอมโฟเทอรซน บ ซงเปนยาปฏชวนะกลม polyenes ทนยมใชกนอยางกวางขวาง และยาวนานกวา 45 ป เพอใชในการรกษาการตดเช อรา (Czub และคณะ, 2009) ถงแมวาตวยาจะมความเปนพษตอรางกาย แตยาแอมโฟเทอรซน บ เปนยาทถกเลอกใชเปนอนดบแรกในการรกษาการตดเช อราชนดทแพรกระจายทวรางกายในผปวยทมภมคมกนบกพรอง ฤทธในการรกษาและพษของยามความสมพนธกบโครงสรางของยา (รปท 1) ความสามารถในการเกดอนตรกรยาระหวางตวยากบตวยา และระหวางตวยากบไขมน โดยยาแอมโฟเทอรซน บ ประกอบดวย macrolide ring ซงม heptane chromophore หม ester และม lactone สวนทเปน hydroxyl hydrophilic ในโมเลกลยงประกอบดวยหม carboxyl และ amino sugar ซงตออยกบ macrolide ring โดยพนธะ glycosidic ความสามารถในการรกษาของยาแอมโฟเทอรซน บ และยาฆาเช อราในกลม polyene ข นอยกบความชอบในการจบกบ cholesterol และ ergosterol ซงเปนสารในกลม sterol ซงอยในเยอหมเซลลของเซลลสตว และเช อรา ความจ าเพาะเจาะจงของยากบ sterol เหลาน ข นอยกบรปแบบในการจบตวกนของยาแอมโฟเทอรซน บ monomeric จบกบ sterol ทเยอหมเซลลของเช อรา ในขณะท self-associated AmB สามารถสรางรในเย อหมทประกอบดวย cholesterol ซงน ามาสการเกดความเปนพษตอเซลลมนษย (Larabi และคณะ, 2004)
รปท 1 โครงสรางทางเคมของยาแอมโฟเทอรซน บ
สตรต ารบยาด งเดมของยาแอมโฟเทอรซน บ ไดแก ฟงจโซน (Fungizone®) ถกใชในการรกษาการตด
เช อราภายในรางกายเปนเวลามากกวา 40 ป ซง Fungizone® (ยาแอมโฟเทอรซน บ ส าหรบฉด) ในแตละหลอด
ของ Fungizone® (Bristol-Myers Squibb Company, USA) ประกอบดวย ยาแอมโฟเทอรซน บ 50 มลลกรม
โดยมโซเดยม ดออกซคอเลท 38.8 มลลกรม และโซเดยมฟอสเฟต 20.2 มลลกรม เปนสารบฟเฟอร โดยสตรต ารบ
น สามารถเกดผลขางเคยงได เชน หลอดเลอดด าอกเสบบรเวณทฉด เปนไข หนาวสน ภาวะไมสมดลของเกลอแร
และพษตอไต ท าใหการใชยาในการรกษาโรคในระยะยาวเปนไปไดยาก โดยการเกดพษแบบฉบพลนของยาเกดจาก
13
การทยาละลายน าไดยากและตกตะกอนไดงาย พษตอไตของยาจงเปนผลขางเคยงทรายแรงทพบไดมากทสด และ
เปนตวก าหนดขนาดยา
ระบบน าสงยาแอมโฟเทอรซน บ แบบใหม ลดการเกดการอกเสบของหลอดเลอดและพษตอไตได
เนองมาจากอตราการเกดพษทสงของยาแอมโฟเทอรซน บ ยาแอมโฟเทอรซน บ ทกระจายตวแบบคอลลอยด
(AmB colloid dispersion; ABCD) จงถกพฒนามาเพอลดความเปนพษตอไต ในการศกษาเปรยบเทยบยาท งสอง
ชนดน พบวาอบตการณในการเกดพษตอไตเปน 25% ในยาแอมโฟเทอรซน บ ทกระจายตวแบบคอลลอยด และ
49% ในยาแอมโฟเทอรซน บ (Bowden และ Chanderseker, 2002) แตอยางไรกตามในการศกษาหนงพบวายา
แอมโฟเทอรซน บ ชนดลโพโซม (L-AmB) พบอาการแขงเกรงและหนาวสนนอยกวายาในรปแบบสตรต ารบทเปน
ไขมน (AmB lipid complex (ABLC)) อยางมนยส าคญ (24.5% และ 79.5% ตามล าดบ P<0.001) ความเปนพษ
ตอไต นยามจาก serum creatinine ทเพมข นจากเรมตนมากกวา 3 เทา โดยเกดข นกบ L-AmB นอยกวา
ประมาณ 20% เมอเทยบกบ ABLC (P<0.001) (Wingard และคณะ, 2000) สตรต ารบทเปนไขมนของยาแอมโฟ
เทอรซน บ ลดความเปนพษตอไตไดโดยกลไกทไมทราบแนชด สตรต ารบทเปนลโพโซมสามารถลดความเปนพษ
และเพมระยะเวลาทอยในกระแสเลอดไดนานข นโดยการท า pegylation ซงจะเหนยวน าช น hydrodynamic บน
พ นผวของอนภาคลอมรอบลโพโซม การถกจบกนโดย phagocyte ลดนอยลง ท าใหอนภาคอยในกระแสเลอดได
นานข น (Torrado และคณะ, 2008) สตรต ารบทเปนไขมนเหลาน มอตราการก าจดยาออกทต า และขนาดยาท
เพมข นของยาแอมโฟเทอรซน บ อาจท าใหเกดการสะสมยาในรางกาย แมวาสตรต ารบทเปนไขมนถกรายงานวาม
ความปลอดภยและมประสทธภาพ แตคาใชจายในการรกษาจะสงมากเมอเปรยบเทยบกบ AmB-deoxycholate
(Herbrecht และคณะ, 2003)
เพอแกไขขอดอยของผลตภณฑทมการออกจ าหนายแลว ในงานวจยจงไดท าการสงเคราะหอนพนธของไขมน 3 ชนด คอ sodium deoxycholate sulfate (SDS), potassium cholate (KC), potassium deoxycholate (KDC) และเปรยบเทยบกบอนพนธของไขมนทมการออกจ าหนายแลวอก 2 ชนด คอ sodium cholate (SC) และ sodium deoxycholate (SDC) โดยโครงสรางทางเคมของอนพนธของไขมน ไดแสดงดงรปท 2 ซงท งหมดน ถกเลอกใหเปนสารตวพาในการต งสตรต ารบแอมโฟเทอรซนบชนดผงแหงส าหรบการรกษาการตดเช อราในปอดเปนรปแบบยาสดพนชนด nebulizer และยาฉด
ผวจยไดเลอกอนพนธของไขมน 5 ชนดในการศกษาสวนประกอบของโครงสราง โดยไขมนทมหม hydroxyl 2 หม (DCS, KDC, SDC) เปรยบเทยบกบ ไขมนทมหม hydroxyl 3 หม (KC, SC) ซงสารเหลาน จะสามารถสรางพนธะไฮโดรเจนกบแอมโฟเทอรซน บ แตกตางกน SDC ถกใชเปนกลมควบคม และ sodium ion ถกแทนทดวย potassium ion ใน potassium deoxycholate หม carboxylic acid ของ deoxycholic acid ถก
14
แทนทโดยหม sulfonate ใน DCS ซงในการศกษาการเปลยนแปลงของโครงสรางทางเคมเหลาน จะมผลตอคณสมบตทางเคมกายภาพของไขมน
โดยการต งสมมตฐานวา อนพนธของไขมนในสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ จะเพมประสทธภาพและความปลอดภยของแอมโฟเทอรซน บ โดยประสทธภาพจะท าการศกษาโดยการวด bioactivity ของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ เปรยบเทยบกบยาแอมโฟเทอรซน บ เดยว ความปลอดภยของแอมโฟเทอรซนบทมอนพนธของไขมนของยาผงชนดผสมน ากอนใช จะถกทดสอบเพอใหมนใจวาผลตภณฑจะไมเหนยวน าใหเกดการปลดปลอยสารทกอใหเกดการอกเสบในทางเดนหายใจและจะไมเหนยวน าใหเกดความเปนพษตอเซลลในทางเดนหายใจทเกยวของ
เนองจากขอจ ากดในการละลายน าและความคงตวของแอมโฟเทอรซนบ เปาหมายหลกในงานวจย คอ
พฒนาสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมไขมนเปนองคประกอบแบบยาผงแหงชนดผสมน ากอนใช ส าหรบ
ฉดและสดพนแบบละอองฝอย (nebulizer) ทละลายน าไดดและมความคงตว ใชกระบวนการท าใหแหงแบบเยอก
แขง (freeze dry) นอกจากน ท าการประเมนความเปนพษและฤทธในการตานเช อราของแอมโฟเทอรซน บ ทกก
เกบในอนภาคไขมนระดบนาโนเมตร ซงถาการพฒนาแอมโฟเทอรซน บ ทกกเกบในอนภาคไขมนระดบนาโนเมตร
เสรจสมบรณ จะเปนประโยชนตอประเทศทมสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมความปลอดภยและราคา
ถก
15
Cholic acid Deoxycholic acid (A) (B)
Sodium cholate Sodium deoxycholate (C) (D)
Potassium cholate Potassium deoxycholate (E) (F)
Sodium deoxy cholate sulfate (G)
รปท 2 โครงสรางทางเคมของอนพนธของไขมน
16
วธการทดลอง 1. การสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate) ละลายกรดดออกซโคลค 3 กรม ในสารละลายกรดซลฟรกเขมขน (0.6 มลลลตร) ทละลายอยใน เมทานอล (50 มลลลตร) หลงจากน นท าการรฟลกซ (reflux) ทอณหภม 65 °C เปนเวลา 4 ชวโมง หลงจากปฏกรยาเกดสมบรณ น าสารตวอยางไปลางดวยน ากลนจนมคา pH เทากบ 7 และท าการสกดดวยเอทลอะซเตต จากน นน าช นของเอทลอะซเตตทมสารตวอยางผสมอยมาเตมโซเดยมซลเฟตแอนไฮดรส (sodium sulphate anhydrous) และกรองดวยส าล แลวก าจดเอทลอะซเตตออกโดยใชเครองกลนระเหยสารแบบหมน ( rotary evaporator) ซงจะไดผลตภณฑเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร (methyl deoxycholate ester) เปนของเหลวหนดสเหลองใส น าเมทลดออกซโคเลตเอสเทอรไปท าปฏกรยาตอในข นตอไป โดยเรมจากละลายโซเดยมโบโรไฮไดรด 1.2 กรม ในเตตระไฮโดรฟแรน 10 มลลลตร พรอมท งกวนทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท หลงจากน นคอยๆ หยดเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร 2.5 กรม ทละลายอยในเตตระไฮโดรฟแรน 30 มลลลตร เปนเวลา 10 นาท และ รฟลกซทอณหภมประมาณ 65°C เปนเวลา 30 นาท ภายใตบรรยากาศของแกสไนโตรเจน จากน นปลอยใหปฏกรยาเยนตวลงทอณหภมหองกอนหยด เมทานอล 30 มลลลตร ลงไปในปฏกรยาอยางชาๆ และท าการรฟลกซตอทอณหภมประมาณ 65°C เปนเวลา 8 ชวโมง หลงจากปฏกรยาเกดอยางสมบรณแลวท าการหยดปฏกรยาดวย 2N HCl ปรมาณ 5 มลลลตร พรอมท งกวนทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท น าผลตภณฑทไดไปสกดดวยเอทล อะซเตต และเตมโซเดยมซลเฟตแอนไฮดรส ลงไปเพอชวยในการก าจดน าและความช นทเหลอ น าสารตวอยางไปท าใหแหงโดยใชเครองกลนระเหยสารแบบหมน ไดผลตภณฑเปนสารผสมดออกซโคลคแอลกอฮอล (deoxycholic alcohol) เปนของแขงสขาวนวล น าสารผสมดออกซโคลคแอลกอฮอลไปท าปฏกรยาในข นตอไป (ซงเปนข นตอนสดทาย) โดยน าสารผสมดออกซโคลคแอลกอฮอล 0.68 กรม ไปละลายในสารละลายผสมไดเมทลฟอรมามายด (DMF) 4 มลลลตร และไดคลอโรมเทน (DCM) 2 มลลลตร พรอมท งกวนทอณหภม 0°C เปนเวลา 10 นาท จากน นคอยๆ เตมซลเฟอรไตรออกไซดไพรดนคอมเพลกซ (sulfur trioxide pyridine complex) 0.42 กรม ท าปฏกรยาตอทอณหภม 0°C เปนเวลาอก 1 ชวโมง หลงจากปฏกรยาเกดสมบรณ ใหเตมโซเดยมไบคารบอเนตอมตว 15 มลลลตร ลงในปฏกรยา และท าการรฟลกซตอ เปนเวลา 2 ชวโมง แลวก าจดตวท าละลายออกโดยใชเครองกลนระเหยสารแบบหมน ซงจะไดผลตภณฑโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟตเปนของแขงสขาวนวล 2. การสงเคราะหโพแทสเซยมโคเลต (Potassium cholate) ละลายโพแทสเซยมไฮดรอกไซดในน ากลนพรอมท งกวนจนไดสารละลายใส คอยๆ ใสกรดโคลคลงไปพรอมท งกวนอยางตอเนองจนกระทงปฏกรยาเกดอยางสมบรณ น าไปใสกรวยแยกเพอน าสวนทเปนสารละลายใสไปกรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมครอน และน าไปปนเหวยงดวยความเรวรอบ 4,500 รอบตอนาท เปน
17
เวลา 10 นาท แบงใสหลอดพลาสตกเพอน าไปท าใหแหงดวยวธการท าแหงแบบเยอกแขง (freeze dry) น าผลตภณฑทไดไปทดสอบดวยเทคนค FT-IR, NMR, DSC และ MS 3. การสงเคราะหโพแทสเซยมดออกซโคเลต (Potassium deoxycholate) ละลายโพแทสเซยมไฮดรอกไซดในน ากลนพรอมท งกวนจนไดสารละลายใส คอยๆ ใสกรดดออกซ โคลคลงไปพรอมท งกวนอยางตอเนองจนกระทงปฏกรยาเกดอยางสมบรณ น าไปใสกรวยแยกเพอน าสวนทเปนสารละลายใสไปกรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมครอน และน าไปปนเหวยงดวยความเรวรอบ 4,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท แบงใสหลอดพลาสตกเพอน าไปท าใหแหงดวยวธการท าแหงแบบเยอกแขง (freeze dry) น าผลตภณฑทไดไปทดสอบดวยเทคนค FT-IR, NMR, DSC และ MS 4. การเตรยมต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS - AmB dry powder)
ชงน าหนกโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และผงยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) อยางถกตองแมนย าในอตราสวนโมล 2:1 โดยละลายโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟตในน ากลน 30 มลลลตร ทมโซเดยมไฮดรอกไซด (0.2 โมลาร) ผสมอย 2.7 มลลลตร เมอโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟตละลายอยางสมบรณ จงคอยๆ โปรยยาแอมโฟเทอรซน บ ลงไปอยางชาๆ และคนตลอดเวลาดวยเครองกวนสารละลายจนไดสารละลายใส จงปรบความเปนกรด เบส เทากบ 7.4 ดวยกรดฟอสฟอรก ความเขมขน 0.2 โมลาร จากน นจงปรบปรมาตรเปน 50 มลลลตร ดวยน ากลนในข นตอนสดทาย และแบงใสภาชนะเพอใชส าหรบการท าสารใหแหงดวยวธการท าแหงแบบเยอกแขง (Freeze dryer) จะไดต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS - AmB) สวนต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC - AmB) น นกเตรยมเชนเดยวกนในอตราสวนเทากนกบสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต
5. การประเมนลกษณะของยาผงแหงของต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน
5.1 Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) ศกษาการเกดอนตรกรยาระหวางยาแอมโฟเทอรซน บ อนพนธของไขมนชนดตางๆ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมนชนดตางๆ ทไดจากการท าใหแหงแบบเยอกแขง (Freeze dryer) เตรยมตวอยางโดยบดตวอยางปรมาณเลกนอย (0.5-1.0 mg) ใหละเอยด ผสมกบ KBr ประมาณ 100 mg ในโกรงบดสาร และบดสารใหละเอยดโดยใหมการกระจายตวอยางสม าเสมอ ใสตวอยางทบดแลวลงในแมพมพ และน าไปอดดวยเครองอดไฮดรอลกความดนประมาณ 10 ตน นาน 30 วนาท จะไดตวอยางเปนแผนวงกลมใส น าตวอยางเขาเครอง FT-IR วดอนฟราเรดสเปกตรมในชวงความถ 4000 – 400 cm-1
18
5.2 Nuclear magnetic resonance (NMR) ศกษาการเกดอนตรกรยาของสารทไดจากการสงเคราะห คอ เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร, ดออกซโคลค แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต เตรยมตวอยางโดยละลายสารตวอยางดวย deuterated Dimethyl sulfoxide (Dimethyl sulfoxide-D6) ดดสารตวอยางใสในหลอด NMR ทสะอาด ประมาณ 0.7 มลลลตร ปดฝาแลวพนดวยพาราฟน 2 รอบ 5.3 กลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (Scaning Electron Microscope, SEM) ศกษาลกษณะพ นผวอนภาคของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) โซเดยมดออกซโคเลต (SDC) สตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC - AmB) โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS - AmB) ทเตรยมได โดยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM), Quanta 400, FEI, Czech Republic โดยโปรยตวอยางใหแผบาง ๆ เปนช นเดยวบน stub ทองเหลองซงปดดวยเทปกาวสองหนา แลวเคลอบผวอนภาคดวยทองค า หนาประมาณ 15-20 nm กอนท าการสองดขนาดและการจดเรยงตวของอนภาคทก าลงขยาย 300, 1,000 และ 10,000 เทา 5.4 ศกษาคณสมบตทางความรอน ดวยเครอง Differential scanning calorimetry (DSC) ศกษาคณสมบตทางความรอน (thermal behavior) ของผงยา และต ารบยาสตรตางๆ โดยชงน าหนกผงยาประมาณ 2 มลลกรม บรรจใน aluminium pan พรอมท งปดฝาใหสนท วดการเปลยนแปลงพลงงานความรอนทอณหภมตางๆ ในชวง 25 °C – 250 °C ใช Heating rate 10°C/min ดวยเครอง Differential scanning calorimetry (DSC)
5.5. ศกษาคณสมบตทางแอโรโซลของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ละลายสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน (SDS-AmB และ SDC-AmB)
50 มลลกรม (มตวยาแอมโฟเทอรซน บ 25 มลลกรม) ดวยน ากลน (ผานการกรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมครอน) 6 มลลลตร จะไดความเขมขนของยาแอมโฟเทอรซน บ เทากบ 4 mg/mL เพอน าไปใชในการท าเนบไลเซอร (Nebulization) โดยน าสารละลายทได 6 มลลลตร ใสลงใน jet-nebulizer (Westmed Inc., Arizona, USA) ทตออยกบถงแกสไนโตรเจน พรอมท งปลอยแกสไนโตรเจนดวยอตราการไหล 8 ลตร/นาท เปนเวลา 1 นาท จากน นจงน า jet-nebulizer ไปตอกบ Andersen Cascade Impactor (ACI), (Atlanta, GA, USA) (ในการทดลองน ไดใช ACI ท งหมด 8 ช น คอ stage -0, stage 1, stage 2, stage 3, stage 4, stage 5, stage 6 และ stage 7) โดยความเรวลมทใชในการวด เทากบ 28.3 ลตร/นาท เปนเวลา 2 นาท ค านวณขนาดอนภาคทวดไดในขณะทอนภาคเคลอนทในตวกลางทเปนอากาศ (Mass Median Aerodynamic Diameter, MMAD) (แตละสตร
19
ต ารบไดท าการทดลองซ า 3 คร ง) ชะผงยาทคางบนแตละสวนของ ACI ดวยสารละลายไดเมทลซลฟอกไซดและ เมทานอล ในอตราสวน 1:9 ปรมาตร/ปรมาตร ลงใน volumetric flask ขนาด 25 มลลลตร และปรบปรมาตรจนครบ กรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมครอน ใสขวด vial จากน นท าการวเคราะหหาปรมาณยาโดยใชเครอง High performance liquid chromatography (HPLC) โดยก าหนดสภาวะทเหมาะสมของระบบ ดงน
1. HPLC column : microbondapak C18 column (Phenomenex®, USA) (150 x 4.6 mm i.d., 5 µm) 2. Mobile phase : Acetate buffer (20 mM, pH 7.2) : Acetonitrile ในอตราสวน 60:40 v/v 3. Flow rate : 1.0 มลลลตรตอนาท 4. UV wavelength : 405 nm 5. Injection volume : 50 ไมโครลตร
6. การศกษาความคงตวทางกายภาพ (Physical stability) 6.1 ศกษาความคงตวทางกายภาพของยาผงแหงสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ท
ระยะเวลาตางๆ (เกบไวเปนเวลา 7 วน) เตรยมยาผงแหงสตรต ารบตางๆ คอ SC-AmB, SDC-AmB, KC-AmB, KDC-AmB และ SDS –
AmB น าไปวดขนาดอนภาค (Particle size) และคาศกยซตา (Zeta potential) ทระยะเวลาในการเกบ 1, 3, 5 และ 7 วน
6.2 ศกษาความคงตวทางกายภาพของยาผงแหงสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน หลงเกบไวเปนเวลา 6 เดอน
เตรยมยาผงแหงสตรต ารบตางๆ คอ SDS – AmB, SDC – AmB และ KDC – AmB อยางละ 3 ชด โดยชดท 1 วางไวในโถดดความช น ทควบคมอณหภมประมาณ 30 ± 3 °C เปนเวลา 6 เดอน ชดท 2 วางไวในตเยน ทมการควบคมอณหภมท 2-4 °C เปนเวลา 6 เดอนเชนกน และเตรยมชดท 3 เพอน าไปวดขนาดอนภาค (Particle size) และคาศกยซตา (Zeta potential) พรอมท งค านวณปรมาณยา (Drug content, %) เปรยบเทยบกบชดท 1 และ 2 7. การทดสอบความเปนพษตอเซลล 7.1 การเพาะเล ยงเซลล 1) Alveolar macrophage NR8383 cell line, Rat (NR8383) เพาะเล ยงเซลล Alveolar macrophage NR8383 cell line, Rat (NR8383) ในอาหารเล ยงเซลล Ham's F12K medium ซง supplement ดวย 2 mM L-glutamine, 20% fetal bovine serum (FBS),
20
สารละลายยาเพนนซลลน 50 units/mL และสเตรปโตมยซน 50 µg/mL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 และความช น 95% humidity incubator 2) Human lung adenocarcinoma cell line (A549)
เพาะเล ยงเซลล Human lung adenocarcinoma cell line (ATCC CCL-185) ในอาหารเล ยงเซลล F12K ซง supplement ดวย 4 mM L - glutamine, 10% fetal bovine serum (FBS), สารละลายยาเพนนซลลน 50 units/mL และสเตรปโตมยซน 50 µg/mL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 และความช น 95% humidity incubator 3) Human bronchial epitherial cells line (Calu-3) เพาะเล ยงเซลล Human lung adenocarcinoma cell line ( bronchial epitherial cells) (ATCC HTB-55) ในอาหารเล ยงเซลล Minimum essential medium (Eagle) ซงsupplement ดวย 10% fetal bovine serum (FBS) และสารละลายยาเพนนซลลน 50 units/mL และสเตรปโตมยซน 50 µg/mL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 และความช น 95% humidity incubator 4) Human Embryonic Kidney 293 cells line (293T/17) เพาะเล ยงเซลล Human Embryonic Kidney 293 cells line (ATCC CCL-185) ในอาหารเล ยงเซลล Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ซง supplement ดวย 4 mM L - glutamine, 10% fetal bovine serum (FBS), สารละลายยาเพนนซลลน 50 units/mL และสเตรปโตมยซน 50 µg/mL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 และความช น 95% humidity incubator 7.2 การเตรยมความเขมขนของยาและต ารบ
เตรยมยา ต ารบ และตวพา (อนพนธของไขมน) โดยการละลายยากบ DMSO ต ารบและตวพากบน าทปราศจากเช อ แลวกรองดวยตวกรองเสนผานศนยกลางขนาด 0.25 ไมครอน จากน นท าการเจอจางยา ต ารบและตวพา ทดสอบดวยอาหารเล ยงเซลล โดยความเขมขนของตวยาและต ารบทใชในการทดสอบอยในชวง 1-8 ไมโครกรมตอมลลลตร สวนตวพาความเขมขนในการทดสอบอยในชวง 1-8 ไมโครกรมตอมลลลตร 7.3 ทดสอบความเปนพษของสตรต ารบตอเซลลเพาะเล ยง โดยวธ MTT assay 1) เพาะเล ยงเซลล NR8383, A549, Calu-3 และ 293T/17 ใหมความหนาแนน 1 x 105 Cell/mL ปรมาตรหลมละ 100 µL ในถาดเพาะเล ยงเซลลชนด 96 หลม บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 และความช น 95% humidity incubator เปนเวลา 24 ชวโมง
21
2) ดดอาหารเล ยงเซลลในถาดเพาะเล ยงเซลลท ง ลางเซลลดวย phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4) จ านวนหนงคร ง จากน นเตมสารตวอยางทความเขมขนตางๆ ลงไปหลมละ 100 µL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 ไว 24 ชวโมง 3) ดดสารละลายในถาดเพาะเล ยงเซลลท ง ลางเซลลดวย phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4) จ านวนหนงคร ง และเตมอาหารเล ยงเซลลลงไปหลมละ 100 µL แลวเตมสารละลาย MTT ปราศจากเช อทมความเขมขน 5 mg/mL บมทอณหภม 37°C, 5% CO2 ไว 4 ชวโมง 4) ลางเซลลดวย PBS จากน นเตม DMSO ลงไปหลมละ 100 µL น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 570 nm ดวยเครอง microplate reader ภายใน 1 ชวโมง หลงจากเตม DMSO 5) น าคา OD ทได ค านวณเปอรเซนตการรอดชวตของเซลล (%Viability) เทยบกบ untreated control
8. การทดสอบการแตกของเมดเลอดแดง (Hemolysis) 8.1 การเตรยมเซลลเมดเลอดแดง
1) น าเซลลเมดเลอดแดงทไดมาจากมนษยปรมาตร 5 มลลลตร จากน นลางดวยสารละลาย Phosphate Buffer Saline (PBS) ท pH 7.4 ปรมาตร 10 มลลลตร 2) ปนเหวยงเพอแยกเซลลเมดเลอดแดงทความเรวรอบ 1,500 รอบ เปนเวลา 5 นาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส 3) จากน นดดสวนใสท งแลวท าซ าตามขอท 1) และ 2) อก 2 คร ง
8.2 การศกษาการแตกของเซลลเมดเลอดแดง 1) น าสารละลายยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธของไขมน (SDC-AmB และ SDS-AmB) ทความเขมขน 1, 2, 4 และ 8 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 900 ไมโครลตร จากน นเตมเซลลเมดเลอดแดงปรมาตร 100 ไมโครลตร 2) น าตวอยางจากการทดลองขอท 1 บมเพาะทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 0.5, 3, 6 และ 24 ชวโมง หลงจากน นน าไปปนเหวยงเพอแยกเซลลเมดเลอดแดงทความเรวรอบ 3,000 รอบ เปนเวลา 5 นาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ซงในการทดลองน ไดใชสารละลาย PBS ท pH 7.4 เปน negative control และใช 1% Triton X-100 เปน positive control ซงจะเกดการแตกของเซลลเมดเลอดแดง 100 เปอรเซนต 3) ดดสารละลายสวนใสปรมาตร 100 ไมโครลตร ใสใน 96-well plate จากน นน าไปวดการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร
22
4) ค านวณ %Hemolysis ของเซลลเมดเลอดแดง ดงแสดงในสมการดานลาง
%Hemolysis = (Asample - Anegative control)/(Apositive control - Anegative control)
9. การทดสอบฤทธในการยบยงและฆาเชอราโดยวธ Broth dilution method 9.1 เล ยงเช อรา C. neoformans ATCC 90113 และ C. albicans ATCC 90028 ในอาหารเหลว
Sabouraud Dextrose Broth (SDB) จากน นน าไปบมเพาะทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง 9.2 น าเช อราทไดจากขอท 9.1 มาปรบความขนของเช อใหมปรมาณเช อเทากบ 106 CFU/ml ดวย
สารละลาย PBS 9.3 เตมสารละลายยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ (SDC-AmB และ
SDS-AmB) ทความเขมขน 1.25, 0.625, 0.312, 0.156, 0.078 และ 0.039 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 100 ไมโครลตร ลงในจานเพาะเล ยงชนด 96 หลม
9.4 เตมเช อทเตรยมไดจากขอท 2 ปรมาตร 10 ไมโครลตร ลงในจานเพาะเล ยงทเตรยมไวในขอท 9.3 จากน นน าจานเพาะเล ยงเช อดงกลาวบมเพาะท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง
9.5 หาคา MIC (Minimum Inhibition Concentration) ของสารละลายยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ (SDC-AmB และ SDS-AmB)
9.6 หาคา MFC (Minimum Fungicidal Concentration) ของสารละลายยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ (SDC-AmB และ SDS-AmB) โดยเขยเช อทความเขมขนของสารตวอยางมคา MIC ลงไป steak ลงบนอาหารแขง Sabouraud Dextrose Broth (SDA) จากน นน าจานเพาะเล ยงเช อดงกลาวบมเพาะท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง หลงจากบมเพาะความเขมขนของสารตวอยางทนอยทสดทเช อไมสามารถเจรญเตบโตไดเปนคา MFC
10. การศกษาหาคาความแรงของยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน (SDC-AmB และ SDS-AmB)
10.1 วธการเตรยมเช อรา 1) เล ยงเช อรา Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae, ATCC 9763) ในอาหารเหลว
Sabouraud Dextrose Broth (SDB) จากน นน าไปบมเพาะทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง 2) น าเช อทเล ยงไวในขอ 1 ปรบความขนของเช อใหเทากบ 0.5 McFarland ดวย phosphate
buffered saline (PBS, pH 7.4, Difco, USA) ซงไดปรมาณเช อเทากบ 108 CFU/ml จากน นดดเช อ 1
23
เปอรเซนต ของเช อทปรบความขนแลว (10 มลลลตร) ผสมกบอาหารแขง antibiotic medium (100 มลลลตร) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส
3) ดดเช อทผสมกบอาหารคดเปนปรมาณเช อเทากบ 107 CFU/ml ปรมาตร 8 มลลลตร เทลงบนจานเพาะเล ยงเช อทมอาหารแขง SDA เตรยมไว
10.2 วธการเตรยมสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน (SDC-AmB และ SDS-AmB)
1) เตรยมสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ใหไดความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร ใน DMSO แลวน าไปเจอจางตอใหไดความเขมขน 12.8, 16, 20, 25 และ 31.2 ไมโครกรมตอมลลลตร ดวย DMSO จากน นเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 0.64, 0.8, 1, 1.25 และ 1.56 ไมโครกรมตอมลลลตร ดวย 0.2 M Phophate buffer pH 10.5
2) เตรยมสตรต ารบของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตรดวย 0.2 M Phophate buffer pH 10.5
3) การวเคราะห 1. แบงจานเพาะเล ยงเช อทเตรยมไวออกเปน 5 ชดๆ ละ 3 จาน แลววาง cylinder cup บน
จานอาหารเล ยงเช อจานละ 6 อน 2. ใสสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ทเตรยมไวลงใน cylinder cup หลมละ
300 ไมโครลตร โดยจานเพาะเล ยงเช อชดท 1 ใสสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตร (S3) สลบกบสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 0.64 ไมโครกรมตอมลลลตร (S1) จานเพาะเช อชดท 2, 3, 4 และ 5 ใสสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตร (S3) สลบกบสารละลายมาตรฐานของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 0.8 (S2), 1.25 (S3), 1.56 (S4) ไมโครกรมตอมลลลตร และสารละลายสตรต ารบของยาแอมโฟเทอรซน บ ทความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตร (U) จ านวน 3 จาน
3. จากน นน าจานเพาะเล ยงเช อท งหมดไปบมเพาะทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48ชวโมง แลววดขนาดของโซนใส จากน นค านวณหาคาขนาดของโซนใสทแทจรงและค านวณความเขมขนของยาจากกราฟมาตรฐาน
24
ผลการทดลองและวจารณ 1. การสงเคราะหอนพนธของไขมน (โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate, SDS)) หลงจากท าการสงเคราะหอนพนธของไขมนโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต โดยใชสารต งตนคอ กรดดออกซโคลค (1) จะมผลตภณฑเกดข น 3 ชนด ไดแก เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร (Methyl deoxycholate ester) (2), ดออกซโคลคแอลกอฮอล (Deoxycholic alcohol) (3) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate) (4) ตามล าดบ ซงไดแสดงลกษณะโครงสรางทางเคมดงรปท 3
รปท 3 โครงสรางทางเคมของสารต งตน (กรดดออกซโคลค) (1) และผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหอนพนธของ ไขมน (เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร (Methyl deoxycholate ester) (2), ดออกซโคลคแอลกอฮอล (Deoxycholic alcohol) (3) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate) (4))
ขนตอนท 1
ขนตอนท 2
ขนตอนท 3
2% H2SO4 ใน Methanol, reflux; 4h
NaBH4, dry THF, Methanol, 2N HCl, reflux; 8h
SO3.Py, DMF, dry DCM, Sat.NaHCO3, reflux; 2-3h
25
2. การศกษาคณสมบตทางเคมของยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ และอนพนธของไขมน 2.1 ผลการศกษาคณสมบตของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) โดยใชเทคนค Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) จากการศกษาอนฟราเรดสเปกโทรโฟโตมเตอร (FT-IR) ของสารตวอยางทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (Sodium deoxycholate sulfate, SDS) ทมผลตภณฑเกดข น 3 ตว ไดแก เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร ดออกซโคลคแอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต ตามล าดบ ทความถ (wave number) ต งแต 4000 – 400 cm-1 ไดแสดง IR spectrum ดงรปท 4
รปท 4 IR spectrum ของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต
จากการศกษาเปรยบเทยบคณสมบตของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (เอสเทอร แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต) พบวาผลตภณฑท ง 3 ตว ไดปรากฏการดดกลนของ O-H stretching, C=O stretching และ C-O stretching ทต าแหนงเลขคลนในชวง 3420-3390 cm-1, 1744-1710 cm-1 และในชวง 1043-1042 cm-1 ตามล าดบ นอกจากน ยงพบวาหมคารบอนล ทต าแหนงเลขคลนประมาณ 1700 cm-1 มการดดกลนนองลง ตามล าดบ เมอเปรยบเทยบกบการสงเคราะหในข นท 1 (ข นตอนการสงเคราะหใหเปนเอสเทอร)
26
รปท 5 FT-IR spectrum ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (A), โคลคเอซด (CA) (B), โซเดยมโคเลต (SC) (C), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมโคเลต (AmB-SC) (D), โพแทสเซยมโคเลต (KC) (E) และสตร ต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยมโคเลต (AmB-KC) (F)
รปท 6 FT-IR spectrum ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (A), ดออกซโคลคเอซด (DCA) (B), โพแทสเซยม ดออกซโคเลต (KDC) (C), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยมดออกซโคเลต (AmB-KDC) (D), โซเดยมดออกซโคเลต (SDC) (E), สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (AmB-SDC) (F), โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) (G) และสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต ซลเฟต (AmB-SDS) (H)
A
B
C
D
E
F
G
H
A
B
C
D
E
F
27
ผลการศกษาเปรยบเทยบคณสมบตของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) เดยวๆ กบอนพนธของไขมน ดวยเทคนค FT-IR ดงรปท 5 และ 6 พบวา FT-IR spectrum ของยาแอมโฟเทอรซน บ อนพนธของไขมน และสตรต ารบ มเลขคลนตรงกน ในทกต าแหนง ทกต ารบ ไมเกดการเปลยนแปลง ซงแสดงใหเหนวา อนพนธของไขมน (SDC และ SDS) ทน ามาใชในสตรต ารบ ไมสงผลใหไมเกดการเปลยนโครงสราง รปราง หรอเกดหมแทนทในต าแหนงตางๆ ของยา สงผลใหยาสามารถออกฤทธไดเหมอนเดม 2.2 ผลการศกษาคณสมบตของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) โดยใชเทคนค Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR)
หลงจากศกษาเพอยนยนผลดวยเทคนค Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) วาสารสงเคราะหทไดม functional group ถกตองแลว จงน าสารไปวเคราะหโดยใชเทคนค Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) เพอหาจ านวนโปรตอน (H) แสดงดงตารางท 1 ตารางท 1 คาเคมคลชฟต (chemical shift) ของสญญาณโปรตอนของสารทไดจากการสงเคราะห
ต าแหนง เมทลดออกซโคเลตเอสเทอร ดออกซโคลค แอลกอฮอล โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต
คาเคมคลชฟต (δ, ppm)
ประเภทของโปรตอน
คาเคมคลชฟต (δ, ppm)
ประเภทของโปรตอน
คาเคมคลชฟต (δ, ppm)
ประเภทของโปรตอน
18 0.75 3H(s), -CH3 0.63 3H(s), -CH3 0.60 3H(s), -CH3 19 0.90 3H(s), -CH3 0.85 3H(s) , -CH3 0.85 3H(s), -CH3 21 0.95 3H(d), -CH3 0.95 3H(d), -CH3 0.95 3H(d), -CH3 - 1.0-2.0 24H (m) 1.0-2.0 26H (m) 1.0-1.9 24H(m) - 2.40 2H(t),
-CO-CH2- 2.50 Br(s) , -OH 3.6-3.75 1H(m)
- 3.59-3.65 1H(m), -OCH-
3.2-3.4 1H(m) 3.8 2H(t)
- 3.67-3.7 3H, -OCH3 4.25 1H(t) 4.25 2H(t) - 3.95-4.0 1H(d),
-12-OCH- 4.35 2H(t)
จาก 1H-NMR สเปกตรมแสดงคาเคมคลชฟตของโปรตอนทอย ณ ต าแหนงตางๆ บนโครงสรางของเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร ดออกซโคลค แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต ซงคา chemical shift
28
ดงกลาวจะมความแตกตางกนข นอยกบสภาวะแวดลอมของโปรตอนชนดน นๆ โดยต าแหนงท 18 มคาเคมคลชฟต ของเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร, ดออกซโคลค แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต เทากบ 0.75, 0.63 และ 0.60 ตามล าดบ ต าแหนงท 19 มคาเคมคลชฟต ของเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร ดออกซโคลค แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต เทากบ 0.90, 0.85 และ 0.85 ตามล าดบ และทต าแหนงท 21 มคาเคมคลชฟต ของเมทลดออกซโคเลตเอสเทอร ดออกซโคลค แอลกอฮอล และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต เทากน ซงเทากบ 0.95 เนองจากมสภาวะแวดลอมเชนเดยวกน
2.3 ศกษาลกษณะพ นผวและการกระจายอนภาคของยาแอมโฟเทอรซน บ และต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (Scanning electron microscope, SEM)
จากการศกษาลกษณะพ นผวอนภาคของยาแอมโฟเทอรซน บ และต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซนบ กบอนพนธของไขมนทเตรยมได โดยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM), Quanta 400, FEI, Czech Republic เพอดขนาดและการจดเรยงตวของอนภาคทก าลงขยาย 500, 3500 และ 10000 เทา พบวามการกระจายตวทแตกตางกน ดงแสดงในรปท 7
รปท 7 ภาพถายจากกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM) ทก าลงขยาย 500, 3500 และ 10000 เทา ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (รปท 7 A-C), SDC (รปท 7 D-F), SDC-AmB (รปท 7 G-I) SDS (รปท 7 J-L) และ SDS-AmB (รปท 7 M-O)
A B C
D E F
29
รปท 7 (ตอ) ภาพถายจากกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสองกราด (SEM) ทก าลงขยาย 500, 3500 และ 10000 เทา ของยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) (รปท 7 A-C), SDC (รปท 7 D-F), SDC-AmB (รปท 7 G-I) SDS (รปท 7 J-L) และ SDS-AmB (รปท 7 M-O) 2.4 ผลการศกษาคณสมบตทางความรอนของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และต ารบยาผงแหง ดวยเครอง Differential scanning calorimetry (DSC) จากการศกษาคณสมบตทางความรอน (thermal behavior) ของผงยา อนพนธของไขมน และต ารบยา วดการเปลยนแปลงพลงงานความรอนทอณหภม ในชวง 25 °C – 250 °C ใช Heating rate 10°C/min ไดผลการศกษาดงแสดงในรปท 8
J K L
G H I
M N O
30
รปท 8 DSC thermograms ของต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ SDC-AmB (A) และ SDS-AmB (B)
ยาแอมโฟเทอรซน บ (C) และอนพนธของไขมน SDC (D) และ SDS (E) จาก DSC thermograms ของต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ 2 ต ารบ คอ SDC-AmB และ SDS-AmB ยาแอมโฟเทอรซน บ เดยว และอนพนธของไขมน 2 ชนด ไดแก SDC และ SDS ดงแสดงในรปท 8 แสดงใหเหนวา เมอเพมอณหภมจาก 25-250 °C ดวยอตรา 10 °C/min ยาแอมโฟเทอรซน บ มการดดพลงงานความรอนทอณหภมประมาณ 203 °C โดยมคา enthalpy ประมาณ 47.13 J/g (รปท 8C) ในขณะท SDC เกดการคายพลงงานทอณหภมประมาณ 194 °C และมคา enthalpy ประมาณ 35.27 J/g (รปท 8D) เมอน าอนพนธของไขมนไปใสในสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กลบพบวาไมเกดการดดหรอการคายพลงงาน (รปท 8A-8B) แสดงใหเหนวาหลงจาก SDC และ SDS เกดปฏกรยากบยาแอมโฟเทอรซน บ แลว อาจเกดเปนสารใหมทนาสนใจ 2.5 ผลการศกษาคณสมบตของผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) ซงเปนอนพนธของไขมนทไดจากการสงเคราะห โดยใช Hot stage polarized light microscope (PLM)
จากการศกษาคณสมบตการกระเจงแสงของสาร โดยใช hot stage polarized light microscope พบวาการเปลยนแปลงวตภาคของผลกเหลวจะใหรปราง/ลกษณะการกระเจงแสงทแตกตางกน ซงแสดงใหเหนการเปลยนแปลงของสารกอนและหลงการใหความรอน โดยกอนการใหความรอนจะมลกษณะเปนผงสขาวและสเหลอง เมอน ามาสองดวยกลองจลทรรศน Polarized light Microscope (PLM) พบวาผลกมลกษณะจบตวกนเปนกอน มสเหลอง สขาว ทแตกตางกนไป และเมอมการใหความรอนจนกระทงผลกหลอมละลายจะไดสารละลายทมลกษณะเปนสตางๆ ข นอยชนดของสารน น และเมอปลอยใหสารละลายตกผลกกลบมา พบวาผลกจะมการจดเรยงตวใหมทเปนระเบยบมากยงข น ท าใหสามารถเหนลกษณะผลกไดชดเจนยงข น มสสนแตกตางกนออกไป
31
แตผลกของสารบางตว เชน ยาแอมโฟเทอรซน บ และสตรต ารบตางๆ เปนตน ทเกดการสลายตว (decompose) ไมสามารถตกผลกกลบมาไดอกคร ง ดงสรปไวในตารางท 2
ตารางท 2 ลกษณะของยาแอมโฟเทอรซน บ และอนพนธของไขมนชนดตางๆ กอนและหลงใหความรอน โดยใช Hot stage polarized light microscope (PLM)
สารตวอยาง/สตรต ารบ ลกษณะกอนใหความรอน (อณหภมหอง, 30°C)
ลกษณะหลงจากใหความรอน
(A) ยาแอมโฟเทอรซน บ (AmB) ผงสน าตาลอมสม เกด Decompose ทอณหภม 173-175°C
(B) โซเดยมโคเลต (SC) ผงสขาว เกดผลกหลงจากปลอยใหเยนตว ทอณภมหอง 30°C
(C) โซเดยมดออกซโคเลต (SDC) ผงสขาว เรมเกดผลกทอณหภม 185°C (D) โพแทสเซยมโคเลต(KC) ผงสขาว เกด Decompose
ทอณหภมมากกวา 350°C (E) โพแทสเซยมดออกซโคเลต (KDC)
ผงสขาว เกด Decompose ทอณหภม 340-350°C
(F) โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS)
ผงสขาว เกดการหลอมทอณหภม 173.5-174.8°C
(G) สตรต ารบ AmB-SC ผงสเหลองสม เกด Decompose ทอณหภม 185°C (H) สตรต ารบ AmB-SDC ผงสเหลองสม เกด Decompose บางสวน
ทอณหภม 152.5°C (I) สตรต ารบ AmB-KC ผงสเหลองสม เกด Decompose ทอณหภม 200°C (J) สตรต ารบ AmB-KDC ผงสเหลองสม เกด Decompose ทอณหภม 175.6°C (K) สตรต ารบ AmB-SDS ผงสเหลองสม เกด Decompose บางสวน
ทอณหภม 180°C (L) สตรต ารบ Fungizone®
(AmB-KDC ทางการคา) ผงสเหลองสม เกด Decompose ทอณหภมมากกวา
300°C
32
3. ความคงตวทางกายภาพ (Physical stability) ต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมนชนดตางๆ มลกษณะเปนผงสเหลอง น าหนกเบา
มาก สามารถไหลไดอยางอสระ สามารถละลายน าไดสงและเมอละลายแลวจะไดสารละลายสเหลองใส (Gharib และคณะ, 2011)
3.1 ผลการศกษาขนาดอนภาค และคาศกยซตา ในเบ องตน เมอน าสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมนชนดตางๆ ไปวเคราะหหาขนาด
อนภาคและคาศกยซตา พรอมท งศกษาความคงตวของสตรต ารบในระหวางการเกบ โดยวดทระยะเวลาเกบ 1, 3, 5 และ 7 วน ดวยเครอง Zetasizer Nano ZS โดยใชเทคนคการกระเจงของแสงแบบพลวต (ความเขมขนของยาแอมโฟเทอรซน บ 10 mg/mL) แสดงไดดงตารางท 3 และไดเปรยบเทยบขนาดอนภาคและคาศกยซตาของสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) และสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC-AmB) ดงแสดงในรปท 9 ซงแสดงใหเหนวาขนาดของอนภาคมลกษณะทเหมอนกนและมความคงตวทด ส าหรบคาของศกยซตา เปนคาทแสดงใหเหนวาในระบบคอลลอยดมความคงตวมากนอยเพยงใด ซงจากสตรต ารบของ SDS-AmB ทกระจายตวอยในน า มคาศกยซตา เทากบ -45.53 มลลโวลล อยางไรกตาม ถาคาศกยซตามคานอยหรอมคาต า จะแสดงใหเหนวาจะไมมแรงในการท าใหอนภาคเกดการจบตวกน และคาศกยซตายงแสดงใหเหนวาอนภาคท งหมดไดกระจายอยางสม าเสมอและเปนเน อเดยวกนกบสารละลาย อาจเปนเพราะอนพนธของไขมน ในสตรต ารบ SDS-AmB มประจลบสง (Legand และคณะ, 1992) (-45.537 มลลโวลล) สตรต ารบทไดมความคงตวอยในสารละลายฟอสเฟตบพเฟอรทมความเขมขน 59 mM และมคา pH อยในชวง 7.4-7.8
รปท 9 ขนาดอนภาค และคาศกยซตา ของสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต
(SDS-AmB) และสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC-AmB)
33
ตารางท 3 ขนาดอนภาค และคาศกยซตา ของสตรต ารบยางผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ชนดตางๆ ทระยะเวลาเกบตางๆ
วน
ต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมนชนดตางๆ
ขนาดอนภาค (Particle size) (nm) คาศกยซตา (Zeta potential) (-mV)
SC-AmB
SDC-AmB
KC-AmB
KDC-AmB
SDS-AmB
SC-AmB
SDC-AmB
KC-AmB
KDC-AmB
SDS-AmB
1 28.78 ±0.99
21.76 ±0.57
51.87 ±0.06
17.21 ±0.25
73.85 ±0.49
-32.73 ±1.88
-39.17 ±0.06
-33.77 ±1.17
-38.73 ±1.85
-43.97 ±1.76
3 30.17 ±0.59
22.87 ±0.16
47.54 ±1.00
20.61 ±0.71
73.40 ±0.34
-29.97 ±0.90
-35.43 ±0.45
-32.67 ±1.97
-38.57 ±2.06
-45.53 ±0.70
5 31.47 ±0.15
23.96 ±0.31
46.49 ±0.64
23.75 ±0.51
72.97 ±0.97
-32.83 ±1.53
-36.60 ±2.17
-33.50 ±1.82
-40.13 ±1.08
-44.83 ±1.38
7 33.87 ±0.13
25.09 ±0.24
47.01 ±0.10
21.17 ±0.23
71.77 ±0.03
-29.17 ±0.81
-40.63 ±1.89
-33.73 ±1.02
-41.70 ±1.32
-45.17 ±2.06
นอกจากน ยงพบวาสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยมดออกซโคเลต (KDC-AmB) มขนาดอนภาคทเลกทสด ประมาณ 17.21±0.25 ถง 23.75±0.51 นาโนเมตร ส าหรบสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC-AmB), สตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมโคเลต (SC-AmB) สตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโพแทสเซยมโคเลต (KC-AmB) และสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) มขนาดอนภาคใหญเพมข น ตามล าดบ โดยทสตรต ารบ SDS-AmB มขนาดอนภาคทใหญทสดกวาสตรอนๆ อยางเหนไดชด (ประมาณ 71.77±0.03 ถง 73.85±0.49 นาโนเมตร) เมอพจารณาถงความคงตวของแตละสตร พบวาท ง 5 สตร มขนาดอนภาคทใกลเคยงกน เมอวางท งไว 3, 5 และ 7 วน ซงแสดงใหเหนวาสตรต ารบในแตละสตรไมเกดการเกาะกลมกนของอนภาคทจะสงผลใหสตรต ารบเกดการตกตะกอน ส าหรบคา ศกยซตาทผวอนภาคมคาเปนลบและมคาใกลเคยงกนท ง 5 สตร
34
3.2 ผลการศกษาขนาดอนภาค (Particle size) คาศกยซตา (Zeta potential) และปรมาณยา (Drug content, %) ของต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน หลงจากเกบไวนาน 6 เดอน
ผลจากการน าสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทบรรจในอนพนธของไขมน มาศกษาความคงตวโดยการวดขนาดอนภาค วดคาศกยซตา และค านวณปรมาณของยา กอนน าสตรต ารบไปเกบไวในตเยนทมการควบคมอณหภมท 2-8°C และวางไวในโถควบคมความช น (desicator) ทอณหภมหอง (30±3°C) เปนเวลา 6 เดอน เพอเปรยบเทยบกบสตรต ารบเรมตนกอนท าการทดลอง ซงไดแสดงผลการทดลองดงตารางท 4
ตารางท 4 ขนาดอนภาค คาศกยซตา และปรมาณยา ของต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธ
ของไขมน หลงจากเกบไวนาน 6 เดอน
Characteristics
Formulations mole ratio (2:1)
SDS-AmB SDC-AmB KDC-AmB
Initial 6 months Initial 6 months Initial 6 months
2-8°C 2-8°C 30 ± 3°C 2-8°C 2-8°C 30 ± 3°C 2-8°C 2-8°C 30 ± 3°C
Particle size (nm) 75.2
± 0.6
81.5
± 1.8
89.3
± 1.3
23.3
± 1.1
30.8
± 2.5
34.7
± 1.5
24.7
± 0.8
28.0
± 0.9
35.1
± 0.7
Zeta potential
(–mV)
-47.7
± 1.0
-45.2
± 0.8
-41.3
± 1.1
-38.8
± 0.7
-35.1
± 0.4
-33.7
± 0.9
-39.8
± 0.5
-37.5
± 0.6
-34.7
± 1.2
Drug content (%) 98.5
± 3.8
97.4
± 4.2
71.3
± 3.2
96.8
± 4.0
89.6
± 5.4
43.4
± 4.2
94.3
± 3.0
90.0
± 3.1
63.4
± 6.3
หมายเหต : control temperature ในตเยน (2-8°C) และ room temperature (30±3°C)
หลงจากเกบสตรต ารบยาผงแหงไวนาน 6 เดอน ในททมอณหภมตางกน ขนาดของอนภาคมแนวโนมใหญข น และเกดการเกาะกลมกนของอนภาคทกสตรต ารบ ท งทเกบไวในโถดดความช น (อณหภมหอง) และเกบไวในตเยน ซงผลการทดลองดงกลาวมความสอดคลองกบคาขนาดของอนภาคและคาศกยซตาทแสดงใวในตารางท 4 เมอพจารณาปรมาณยา (drug content) ในสตรต ารบ พบวายาเกดการเสอมสลายอยางเหนไดชด เมอเกบไวในโถดดความช น (อณหภมหอง) แสดงใหเหนวาการเกบรกษาสตรต ารบยาตองเกบใวในตเยนทมอณหภม 2-8 °C และปองกนใหพนจากแสงอกดวย
35
4. คณสมบตทางแอโรโซลของสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน การพฒนาเปนยาผงแหงชนดน าสงสทางเดนหายใจในรปแอโรโซล เพอน าส งไปสอวยวะเปาหมาย สตรต ารบตองมความคงตวทางกายภาพ และมขนาดอนภาคทเหมาะสม ตองมการประเมนสตรต ารบดวยเครองมอ Andersen Cascade Impactor (ACI) และ jet nebulizer ซงไดแสดงคณสมบตทางกายภาพและทางเคมของสตรต ารบ ดงตารางท 5 ตารางท 5 คณสมบตทางแอโรโซลของสตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมน ทละลายดวยน ากลน
Materials Mole ratios %Content MMAD (m)
% FPF (<4.7m)
SDC:AmB 2:1 100.8 ± 1.8 1.70 ± 0.3 70 ± 3.9
SDS:AmB 2:1 101.9 ± 3.4 1.74 ± 0.4 80 ± 2.3
KDC:AmB 2:1 100.4 ± 0.3 1.81 ± 0.3 71 ± 4.9
KC:AmB 2:1 100.2 ± 0.5 1.89 ± 0.4 72 ± 4.2
SC:AmB 2:1 99.5 ± 0.4 2.05 ± 0.3 74 ± 3.3
ผลการประเมนสตรต ารบเพอใชเปนยาผงแหง โดยใชเครองมอ Andersen Cascade Impactor (ACI)
และ jet nebulizer ก าหนดความเรวลมทใชในการวด 28.3 ลตร/นาท พบวาขนาดอนภาคทวดไดในขณะทอนภาคเคลอนทในตวกลางทเปนอากาศ (Mass Median Aerodynamic Diameter, MMAD) ของสตรต ารบ SDC-AmB, SDS-AmB, KDC:AmB, KC:AmB และ SC:AmB ในอตราสวนโมล 2:1 มปรมาณตวยาส าคญอยในชวง 99-102 เปอรเซนต มคา MMAD อยในชวง 1.70 - 2.05 ไมครอน ส าหรบขนาดอนภาคของยาทเตรยมไดควรมขนาดอนภาคนอยกวา 5 ไมครอน เพอใหยาสามารถลงไปถงทางเดนหายใจสวนลางได ซงจากตารางท 5 ไดแสดงใหเหนวาอนภาคยาในสตรต ารบมขนาดอยในชวง 70-80 เปอรเซนต เนองจากอนภาคของยาเกดการเกาะกลมกนนอย จงสงผลให % Fine Particle Fraction (%FPF) มคาคอนขางสง 6. ความคงตวทางเคม (Chemical stability) การเกาะตวกนของยาแอมโฟเทอรซน บ ข นอยกบสตรต ารบ โดยมปจจยทส าคญ คอ คา pH และองคประกอบของสตรต ารบ เชน สารลดแรงตงผว ตวท าละลายรวม (Nishi และคณะ, 2007) โมเลกลของยาแอมโฟเทอรซน บ อาจเกดการรวมตวกนเอง เมอละลายอยในน า ซงปจจยทเกยวของกบความคงตวของยา ไดแก ความเขมขน คา pH อณหภม คาการแตกตวของไอออนในน า และองคประกอบทใชในสตรต ารบ ตวยาแอมโฟ
36
เทอรซน บ ไมสามารถละลายน าได แตสามารถละลายไดดวยสารละลายอนทรย เชน เมทานอล และไดเมธลซล ฟอกไซด (Barwicz และคณะ, 1992; Mazerski และ Borowski, 1996) ยาแอมโฟเทอรซน บ ทอยในรปแบบ monomeric มความเปนพษนอยกวายาแอมโฟเทอรซน บ ทอยในรปแบบ dimeric (Mehta และคณะ, 1984) อยางไรกตาม จะดเหมอนวายาแอมโฟเทอรซน บ ทอยในรปแบบ dimeric จะมความคงตวในน าไดมากกวารปแบบ monomeric คาการดดกลนแสงของ UV ของสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) ในรปแบบอนภาคนาโน มลกษณะทเหมอนกนกบสตรต ารบแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC-AmB) การเกาะกลมกนของยาแอมโฟเทอรซน บ จะสงผลโดยตรงท าใหยาเกดความเปนพษได สามารถศกษาการเกาะกลมกนของสตรต ารบไดโดยใชเทคนค UV spectrophotometry แสดงไดดงรปท 10 คาการดดกลนแสงของยาแอมโฟเทอรซน บ ทละลายอยในฟอสเฟสบพเฟอร ทมคา pH อยในชวง 7.39-7.4 (รป 10A) บางโมเลกลของยาแอมโฟเทอรซน บ ทอยในรปของ dimeric ไดปรากฏพคข นในชวง 328-331 nm ส าหรบพคเลกๆ ทเกดข น จะอยในรปของ monomeric มหลายต าแหนง เชน ทต าแหนง 360-363, 383-385 และ 408-410 nm ถงแมวายาแอมโฟเทอรซน บ จะเกดการเกาะกลมกนบางสวน แตลกษณะของสเปกตรมทไดจากการทดสอบการดดกลนแสงของวนท 1 และวนท 7 ยงคงเหมอนเดมไมมการเปลยนแปลง และสเปกตรมเกดการเลอน (shift) เลกนอย ไมชดเจน นอกจากน ยงแสดงใหเหนวาเมอเกบสตรต ารบนาน 7 วน ยาแอมโฟเทอรซน บ เกดการเสอมสลาย และจากผลการทดลองทไดอาจจะน าไปใชในการท านายความคงตวของสตรต ารบยาแอมโพเทอรซน บ หลงจากการละลายได โดยพบวาสตรต ารบทมไขมนเปนองคประกอบ (สตรต ารบ SDS-AmB และ SDC-AmB) ไมมความคงตว เมอเปรยบเทยบความคงตวในวนท 7 ของสตรต ารบดงกลาวท ง 2 สตร พบวาสตรต ารบ SDS-AmB มคาการดดกลนลดลงนอยกวาสตรต ารบ SDC-AmB ทกชนดของตวท าละลาย
จากรปท 10(B) ไดแสดงคาการดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทละลายสตรต ารบ ดวย 5% สารละลายเดกโตรส (DEX) ซงเมอเปรยบเทยบคาการดดกลนของท ง 2 สตรต ารบ แลวพบวามสเปกตรมของสตรต ารบ SDS-AmB เกดข นทต าแหนง 300-360 nm โดยมลกษณะกวาง (broad) กวาสตรต ารบ SDC-AmB ท ง 1 และ 7 วน และยงพบวาการดดกลนแสงของวนท 7 มคาลดลงอยางมนยส าคญ เมอเปรยบเทยบกบวนท 1 ซงผลจากการเจอจางดวย 5%เดกซโตรส ไดแสดงคาการดดกลนแสงทลดลงจากวนท 1 ทวดเปรยบเทยบกบวนท 7 และคาความแรงไอออน (ionic strength) ของน าเกลอ และฟอสเฟตบพเฟอร เทากบ 154 และ 176 มลลโมลาร ตามล าดบ ซงความคงตวของสารละลายทแตกตางกนน ข นอยกบความแรงของไอออน คาความเปนกรด-เบส
ส าหรบการดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทละลายสตรต ารบดวยสารละลาย Normal saline (NSS) และ Diluted Normal saline ดงแสดงในรปท 10(C) และ 10(D) ตามล าดบ ซงเมอเปรยบเทยบคาการดดกลนของท ง 2 สตรต ารบ แลวพบวามสเปกตรมของสตรต ารบ SDS-AmB เกดข นทต าแหนง 300-360 nm เชนเดยวกน โดยมลกษณะฐานกวาง ท ง 1 และ 7 วน และยงมคาการดดกลนทไมแตกตางกนอยาง
37
มนยส าคญ อกท งยงพบวา เมอละลายดวย Diluted Normal saline จะมคาการดดกลนแสงทเพมข นอยางมนยส าคญ และพคทไดมลกษณะแหลมกวาอยางชดเจน เมอเปรยบเทยบกบสตรทละลายดวย Normal saline และยงแสดงใหเหนวาเมอละลายสตรต ารบดวย Diluted Normal saline แลว ยามความคงตวทางเคมสงกวาการละลายดวยสารละลายชนดอนๆ อยางเหนไดชดเจน เนองจากพคทไดจากวนท 7 มคาลดลงเพยงเลกนอย แทบไมมการเปลยนแปลง แสดงวาสตรต ารบเหมาะทจะละลายอยในสารละลายทเปนสารละลายเจอจาง
38
รปท 10 คาการดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ และอนพนธของไขมน (SDC-AmB คอ คอลมนดานซาย และ SDS-AmB คอ คอลมนดานขวา) ทละลายดวยตวท าละลายตางๆ ((A) ละลายดวย DW (B) ละลายดวย 5% DEX (C) ละลายดวย NSS และ (D) ละลายดวย Diluted NSS) ( คอ วนท 1 คอ วนท 7)
39
7. ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลล ทดสอบความเปนพษตอเซลลของตวพาโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) สตรต ารบยาผงแหง SDS-AmB สตรต ารบยาผงแหง SDC-AmB และยาแอมโฟเทอรซน บ เดยวๆ ตอเซลลมาโครเฟจ (AMs NR8383) เซลลปอด (A549 และ Calu-3) และเซลลไต 293T/17 โดยใชวธ MTT assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) ทดสอบความเปนพษตอเซลลของตวพา SDC และ SDS ในชวงความเขมขน 2 ถง 16 ไมโครกรมตอมลลลตร ไดแสดงเปอรเซนตความสามารถมชวตอยและเจรญเตบโตไดของเซลล (Viability) มากกวา 90 เปอรเซนต ดงแสดงในรปท 11 เมอทดสอบความเปนพษตอเซลลของสตรต ารบยาผงแหง SDS-AmB และต ารบ SDC-AmB (อตราสวนโมล 2:1) ในชวงความเขมขน 1 ถง 8 ไมโครกรมตอมลลลตร ต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) พบวาเปอรเซนตความสามารถมชวตอยและเจรญเตบโตไดของเซลลมาโครเฟจ เซลลปอด และเซลลไต มคามากกวา 85 เปอรเซนต ซงไดแสดงใหเหนวาสามารถลดความเปนพษตอเซลลในระบบทางเดนหายใจ เซลลปอด และเซลลไตไดดงแสดงในรปท 12
รปท 11 การรอดชวตของเซลล AMs NR8383 (A), A549 (B), Calu-3 (C) และ 293T/17 (D) หลงจากบมเซลล
กบตวพาโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) และโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) ท 37 °C, 5% CO2 เปน เวลา 24 ชวโมง
40
รปท 12 การรอดชวตของเซลล AMs NR8383 (A), A549 (B), Calu-3 (C) และ 293T/17 (D) หลงจากบมเซลล กบต ารบยาผงแหง SDS-AmB และต ารบ SDC-AmB ท 37 °C, 5% CO2 เปนเวลา 24 ชวโมง
8. ผลการทดสอบการแตกของเมดเลอดแดง
ศกษาการแตกของเมดเลอดแดงของต ารบ SDS-AmB เปรยบเทยบกบต ารบ SDC-AmB และยาแอมโฟ เทอรซน บ แสดงดงรปท 13 ไดแสดงผลของอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และอนพนธโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) ตอการแตกของเมดเลอดแดง เมอบมกบเมดเลอดแดงจากคนในชวงความเขมขน 2–16 ไมโครกรมตอมลลลตร เปนเวลา 24 ชวโมง พบวาอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต และอนพนธโซเดยมดออกซโคเลต มผลตอการแตกของเมดเลอดแดงต ากวา 1 เปอรเซนต ดงแสดงในรปท 13(A) ซงไมมความเปนพษตอเมดเลอดแดง และผลของต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟตในชวงความเขมขน 1 ถง 8 ไมโครกรมตอมลลลตร มผลตอการแตกของเมดเลอดแดงนอย ในชวง 1, 2 และ 4 ไมโครกรมตอ
41
มลลลตร ดงรปท 13(B) แตเมอเพมความเขมขนเปน 8 ไมโครกรมตอมลลลตร มความเปนพษเพมข น ซงต ารบท งสองต ารบน แสดงคาการแตกของเมดเลอดแดงนอยกวายาแอมโฟเทอรซน บ ต ารบยาผงแหงทมอนพนธของไขมนดงกลาวท าใหยาแอมโฟเทอรซน บ คงตวมากข น และเปนพษนองลง จากรายงานวจยของ Forster และคณะ (Forster และคณะ, 1988) เกยวกบการแตกของเมดเลอดแดงพบวาต ารบเลซตนอมลชน และลโพโซมของยาแอมโฟเทอรซน บ สามารถท าใหยามความคงตวและลดการแตกของเมดเลอดแดงได ซงเกดจากการยดเกาะกนของยาแอมโฟเทอรซน บ กบฟอสโฟลพดทแขงแรง Chuealee และคณะ (Chuealee และคณะ, 2011) ศกษาการน าอนพนธ คอเรสเตอรลมาใชเตรยมต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ และท าใหยาแอมโฟเทอรซน บ น น มความคงตวมากข น และยงปองกนการแตกของเมดเลอดแดงไดดวย ซงการใชตวพาทไมละลายน า เชน กลม long-chain acyl มาเชอมตอกบคอเรสเตอรอล ท าใหการแตกของเมดเลอดแดงแตกลดลงเมอเปรยบเทยบกบต ารบทมอยกอนหนาน
รปท 13 การแตกของเมดเลอดแดงของคนในหลอดทดลองเมอบมกบตวพาโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) และ โซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) (A) และเมอบมกบต ารบยาผงแหง SDS-AmB, SDC-AmB และยา
แอมโฟเทอรซน บ เดยวๆ (AmB) (B) เปนเวลา 24 ชวโมง
42
9. ผลการทดสอบฤทธตานเชอรา
การทดสอบฤทธการยบย งและฆาเช อราไดเลอกเช อรา 3 ชนดคอ Cryptococcus neoformans (CN) Candida albicans (CA) และ Saccharomyces cerevisiae (SC) เช อท ง 3 ชนด ไดจาก ATCC ทดสอบความแรงของยาในต ารบ เขมขนต าสดทสามารถยบย งเช อรา และความเขมขนต าสดในการฆาเช อ ของต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) และ SDC-AmB (Fungizone®) มความแรงของยาในการยบย งเช อในชวง 102% และ 103% ตามล าดบ และความแรงของยาแอมโฟเทอรซน บ เดยวๆ ตอเช อรา มคาเทากบ 100% จากผลการทดสอบดงกลาวแสดงวาอนพนธไขมนทใชในต ารบน นชวยใหยาออกฤทธแรงข น ลกษณะของอนพนธไขมนไมไดมลกษณะเปนวงแหวนอยางเดยวแตมลกษณะคลายผลกไขมนซงชวยใหยามความแรงข น และสามารถน ายาแอมโฟเทอรซน บ ไปสเซลลเช อรา และสามารถซมผานผนงเซลลของเช อราไดดข น และทส าคญคอยาสามารถละลายในน าไดดโดยไมใชสารละลายอนทรยเปนตวท าละลาย และมความคงตว คาการยบย งเช อรา (MIC) และคาความสามารถในการฆาเช อรา (MFC) ของยาแอมโฟเทอรซน บ ตอเช อ C. albicans เทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ คาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราตอเช อ C. neorformans เทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร ต ารบไขมนท งต ารบ SDS-AmB และ SDC-AmB น นแสดงคาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราตอเช อ C. neorformans เทากบ 0.16 และ 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร ซงแสดงคาทต ากวายาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธ และคาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราของต ารบ SDC-AmB ตอเช อ C. albicans เทากบ 0.16 และ 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตรต ากวายาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธ สวนต ารบ SDS-AmB น นแสดงคาทเทากบยาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธเทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร ดงแสดงในตารางท 6 มรายงานกอนหนาน วายาแอมโฟ เทอรซน บ ทบรสทธมคาการยบย งเช อราตอเช อ C. albicans ในชวง 0.03 ถง 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร (Van Eldere และคณะ, 1996) ชวง 0.015 ถง 0.25 ไมโครกรมตอมลลลตร (Park และคณะ, 2006) และในชวง 0.06 ถง 0.3 ไมโครกรมตอมลลลตร (Chuealee และคณะ, 2011) สวนคาการยบย งเช อรา ตอเช อ C. neorformans ในชวง 0.06 ถง 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร (Aller และคณะ, 2000) ชวง 0.5 ถง 2 ไมโครกรมตอมลลลตร (Archibald และคณะ, 2004) ชวง 0.03 ถง 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร (López-Jodra และคณะ, 2000) ชวง 0.0625 ถง 2 ไมโครกรมตอมลลลตร (Lozano-Chiu และคณะ, 1998) และชวง 0.08 ถง 0.3 ไมโครกรมตอมลลลตร (Chuealee และคณะ, 2011) ตามล าดบ จากผลการทดลองดงกลาวน แสดงถงความแรงของยาแอมโฟเทอรซน บ ในต ารบไขมนท งต ารบ SDS-AmB และ SDC-AmB สามารถผานเขาไปสผนงเซลลของเช อรา และออกฤทธไดด (Chuealee และคณะ, 2011)
43
ตารางท 6 ความแรงของยา (Potency) ความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเช อรา (MIC) และความเขมขนต าสด ในการฆาเช อ (MFC) ของต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต ต ารบ ทมใชในปจจบน และยามาตรฐาน C. neoformans, C. albicans และ S. cerevisiae
Materials Potency
(%)
C. neoformans C. albicans S. cerevisiae
MIC (µg/ml)
MFC (µg/ml)
MIC (µg/ml)
MFC (µg/ml)
MIC (µg/ml)
MFC (µg/ml)
Pure AmB* 100 0.32 0.63 0.32 0.63 0.32 0.63 SDS:AmB 103 0.16 0.32 0.32 0.63 0.32 1.28
SDC:AmB** 102 0.16 0.32 0.16 0.32 0.32 1.28
* ยามาตรฐาน ** ต ารบทใชอยปจจบน (Fungizone®) 10. สรปผลการทดลอง
1. สตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ กบอนพนธของไขมนชนดตางๆ ทผานกระบวนการท าแหงแบบเยอกแขง มลกษณะเปนผงสเหลอง น าหนกเบามาก สามารถไหลไดอยางอสระ สามารถละลายน าไดสงและเมอละลายแลวจะไดสารละลายสเหลองใส
2. ขนาดอนภาคของสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) และสตรต ารบยาผงแหงสตรยาแอมโฟเทอรซน บ กบโซเดยมดออกซโคเลต (SDC-AmB) มลกษณะทเหมอนกนและมความคงตวทด มคาศกยซตา เทากบ -45.53 มลลโวลล ซงแสดงใหเหนวาจะไมมแรงในการท าใหอนภาคเกดการจบตวกน อนภาคท งหมดไดกระจายอยางสม าเสมอและเปนเน อเดยวกนกบสารละลาย อาจเปนเพราะอนพนธของไขมน ในสตรต ารบ SDS-AmB มประจลบสง สตรต ารบทไดมความคงตวอยในสารละลายฟอสเฟตบพเฟอรทมความเขมขน 59 mM และมคา pH อยในชวง 7.4-7.8 หลงวางท งไว 3, 5 และ 7 วน จะเหนวาสตรต ารบในแตละสตรไมเกดการเกาะกลมกนของอนภาคทจะสงผลใหสตรต ารบเกดการตกตะกอน ส าหรบคาศกยซตาทผวอนภาคมคาเปนลบและมคาใกลเคยงกนท ง 5 สตร หลงจากเกบสตรต ารบยาผงแหงไวนาน 6 เดอน ในททมอณหภมตางกน ขนาดของอนภาคมแนวโนมใหญข น และเกดการเกาะกลมกนของอนภาคทกสตรต ารบ ท งทเกบไวในโถดดความช น (อณหภมหอง) และเกบไวในตเยน ยาเกดการเสอมสลายอยางเหนไดชด เมอเกบไวในโถดดความช น (อณหภมหอง) ควรเกบรกษาสตรต ารบยาใวในตเยนทมอณหภม 2-8 °C และปองกนใหพนจากแสง
44
3. ผลการประเมนสตรต ารบเพอใชเปนยาผงแหง โดยใชเครองมอ Andersen Cascade Impactor (ACI) และ jet nebulizer ขนาดอนภาคทวดไดในขณะทอนภาคเคลอนทในตวกลางทเปนอากาศ (Mass Median Aerodynamic Diameter, MMAD) ของสตรต ารบ SDC-AmB, SDS-AmB, KDC:AmB, KC:AmB และ SC:AmB ในอตราสวนโมล 2:1 มปรมาณตวยาส าคญอยในชวง 99-102 เปอรเซนต มคา MMAD อยในชวง 1.70-2.05 ไมครอน ส าหรบขนาดอนภาคของยาทเตรยมไดมขนาดอนภาคนอยกวา 5 ไมครอน มขนาดอยในชวง 70-80 เปอรเซนต เนองจากอนภาคของยาเกดการเกาะกลมกนนอย จงสงผลให % Fine Particle Fraction (%FPF) มคาคอนขางสง
4. ศกษาการเกาะกลมกนของสตรต ารบไดโดยใชเทคนค UV spectrophotometry 4.1 คาการดดกลนแสงของยาแอมโฟเทอรซน บ ทละลายอยในฟอสเฟสบพเฟอร ทมคา pH อยในชวง
7.39-7.4 ยาแอมโฟเทอรซน บ จะเกดการเกาะกลมกนบางสวน แตลกษณะของสเปกตรมทไดจากการทดสอบการดดกลนแสงของวนท 1 และวนท 7 ยงคงเหมอนเดมไมมการเปลยนแปลง และสเปกตรมเกดการเลอน (shift) เลกนอย ไมชดเจน เมอเกบสตรต ารบนาน 7 วน ยาแอมโฟเทอรซน บ เกดการเสอมสลาย และจากผลการทดลองทไดอาจจะน าไปใชในการท านายความคงตวของสตรต ารบยาแอมโพเทอรซน บ หลงจากการละลายได โดยพบวาสตรต ารบทมไขมนเปนองคประกอบ (สตรต ารบ SDS-AmB และ SDC-AmB) ไมมความคงตว เมอเปรยบเทยบความคงตวในวนท 7 ของสตรต ารบดงกลาวท ง 2 สตร พบวาสตรต ารบ SDS-AmB มคาการดดกลนลดลงนอยกวาสตรต ารบ SDC-AmB ทกชนดของตวท าละลาย
4.2 การดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทละลายสตรต ารบ ดวย 5% สารละลายเดกโตรส (DEX) มสเปกตรมของสตรต ารบ SDS-AmB เกดข นทต าแหนง 300-360 nm โดยมลกษณะกวาง (broad) กวาสตรต ารบ SDC-AmB ท ง 1 และ 7 วน และการดดกลนแสงของวนท 7 มคาลดลงอยางมนยส าคญ เมอเปรยบเทยบกบวนท 1 ซงผลจากการเจอจางดวย 5%เดกซโตรส ไดแสดงคาการดดกลนแสงทลดลงจากวนท 1 ทวดเปรยบเทยบกบวนท 7 และคาความแรงไอออน (ionic strength) ของน าเกลอ และฟอสเฟตบพเฟอร เทากบ 154 และ 176 มลลโมลาร ตามล าดบ
4.3 การดดกลนแสงยวของสตรต ารบยาผงแหงแอมโฟเทอรซน บ ทละลายสตรต ารบดวยสารละลาย Normal saline (NSS) และ Diluted Normal saline พบวามสเปกตรมของสตรต ารบ SDS-AmB เกดข นทต าแหนง 300-360 nm เชนเดยวกน โดยมลกษณะฐานกวาง ท ง 1 และ 7 วน และยงมคาการดดกลนทไมแตกตางกนอยางมนยส าคญ อกท งยงพบวา เมอละลายดวย Diluted Normal saline จะมคาการดดกลนแสงทเพมข นอยางมนยส าคญ และพคทไดมลกษณะแหลมกวาอยางชดเจน เมอเปรยบเทยบกบสตรทละลายดวย Normal saline และยงแสดงใหเหนวาเมอละลายสตรต ารบดวย Diluted Normal saline แลว ยามความคงตวทางเคมสง
45
กวาการละลายดวยสารละลายชนดอนๆ อยางเหนไดชดเจน เนองจากพคทไดจากวนท 7 มคาลดลงเพยงเลกนอย แทบไมมการเปลยนแปลง แสดงวาสตรต ารบเหมาะทจะละลายอยในสารละลายทเปนสารละลายเจอจาง
5. ทดสอบความเปนพษตอเซลลของสตรต ารบยาผงแหง เปอรเซนตความสามารถมชวตอยและ
เจรญเตบโตไดของเซลลมาโครเฟจ เซลลปอด และเซลลไต มคามากกวา 85 เปอรเซนต แสดงใหเหนวาสามารถลด
ความเปนพษตอเซลลในระบบทางเดนหายใจ และเซลลไตได
6. การแตกของเมดเลอดแดงของต ารบ SDS-AmB เปรยบเทยบกบต ารบ SDC-AmB และยาแอมโฟเทอร
ซน บ อนพนธของไขมนโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟต (SDS) และโซเดยมดออกซโคเลต (SDC) มผลตอการแตก
ของเมดเลอดแดงต ากวา 1 เปอรเซนต ซงไมมความเปนพษตอเมดเลอดแดง และผลของต ารบยาผงแหงแอมโฟ
เทอรซน บ ทมอนพนธของไขมนโซเดยมดออกซโคเลตซลเฟตในชวงความเขมขน 1 ถง 8 ไมโครกรมตอมลลลตร ม
ผลตอการแตกของเมดเลอดแดงนอย ในชวง 1, 2 และ 4 ไมโครกรมตอมลลลตร แตเมอเพมความเขมขนเปน 8
ไมโครกรมตอมลลลตร มความเปนพษเพมข น ซงต ารบท งสองต ารบน แสดงคาการแตกของเมดเลอดแดงนอยกวา
ยาแอมโฟเทอรซน บ ต ารบยาผงแหงทมอนพนธของไขมนดงกลาวท าใหยาแอมโฟเทอรซน บ คงตวมากข น และ
เปนพษนองลง
7. ทดสอบฤทธการยบย งและฆาเช อรา 3 ชนดคอ Cryptococcus neoformans (CN), Candida
albicans (CA) และ Saccharomyces cerevisiae (SC) สตรต ารบยาแอมโฟเทอรซน บ ทมอนพนธโซเดยมด
ออกซโคเลตซลเฟต (SDS-AmB) และ SDC-AmB (Fungizone®) มความแรงของยาในการยบย งเช อในชวง 102%
และ 103% ตามล าดบ และความแรงของยาแอมโฟเทอรซน บ เดยวๆ ตอเช อรา มคาเทากบ 100% คาการยบย ง
เช อรา (MIC) และคาความสามารถในการฆาเช อรา (MFC) ของยาแอมโฟเทอรซน บ ตอเช อ C. albican เทากบ
0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ คาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราตอเช อ
C. neorformans เทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร ต ารบไขมนท งต ารบ SDS-AmB และ SDC-
AmB น นแสดงคาการยบย งเช อรา และคาความสามารถในการฆาเช อราตอเช อ C. neorformans เทากบ 0.16
และ 0.32 ไมโครกรมตอมลลลตร ซงแสดงคาทต ากวายาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธ และคาการยบย งเช อรา และ
คาความสามารถในการฆาเช อราของต ารบ SDC-AmB ตอเช อ C. albican เทากบ 0.16 และ 0.32 ไมโครกรมตอ
46
มลลลตรต ากวายาแอมโฟเทอรซน บ ทบรสทธ สวนต ารบ SDS-AmB น นแสดงคาทเทากบยาแอมโฟเทอรซน บ ท
บรสทธเทากบ 0.32 และ 0.63 ไมโครกรมตอมลลลตร
11. เอกสารอางอง Aller, A.I., Martín -Mazuelos, E., Gutiérrez, M.J., Bernal, S., Chávez, M and Recio, F.J. (2000).
Comparison of the Etest and microdilution method for antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans to four antifungal agents. Antimicrob. Chemother. 46: 997-1000.
Archibald, L.K., Tuohy, M.J., Wilson, D.A., Nwanyanwu, O., Kazembe, P.N., Tansuphasawadikul, S., Eampokalap, B., Chaovavanich, A., Reller, L.B., Jarvis, W.R., Halls, G.S and Procop, G.W. (2004). Antifungal susceptibilities of Cryptococcus neoformans. Emerg. Infect. Dis. 10(1), 143-145.
Barwicz, J., Christian, S. and Gruda, I. (1992). Effects of the aggregation state of amphotericin B on its toxicity to mice. Antimicrob. Agents Chemother. 36(10): 2310-2315.
Bowden, R., Chandrasekar, P., White, M.H., Li, X., Pietrelli, L., Gurwith, M., van Burik, J.A., Laverdiere, M., Safrin, S. and Wingard, J.R. (2002). A double-blind, randomized, controlled trial of amphotericin B colloidal dispersion versus amphotericin B for treatment of invasive aspergillosis in immunocompromised patients. Clin. Infect. Dis., 35(4): 359-366.
Chuealee, R., Aramwit, P., Noipha, K. and Srichana, T. (2011). Bioactivity and toxicity studies of amphotericin B incorporated in liquid crystals. Eur. J. Pharm Sci., 43: 308-317.
Czub, J., Neumann, A., Borowski, E. and Baginski, M. (2009). Influence of a lipid bilayer on the conformational behavior of amphotericin B derivatives – A molecular dynamics study. Biophys Chem., 141(1): 105-116.
Forster, D., Washington, C., and Davis, S.S. (1988). Toxicity of solubilized and colloidal amphotericin B formulations to human erythrocytes. J. Pharm. Pharmacol., 40(5): 325-328.
Gharib, A., Faezizadeh, Z. and Mohammad, A.H. (2011). Preparation and antifungal activity of spray-dried amphotericin B-loaded nanospheres. DARU.,19(5): 351-355.
Herbrecht, R., Natarajan-Amé, S., Nivoix, Y. and Letscher-Bru, V. (2003). The lipid formulation of amphotericin B. Expert Opin. Pharmacother., 4(8): 1277-1287.
47
Ibrahim, F., Gershkovich, P., Sivak, O., Wasan, E.K. and Wasan, K.M. (2012). Assessment of novel oral lipid-based formulations of amphotericin B using an in vitro lipolysis model. Eur. J. Pharm. Sci., 46(5): 323-328.
Kuiper, L. and Ruijgrok, E.J. (2009). A review on the clinical use of inhaled amphotericin B. J. Aerosol Med. Pulm. Drug Deliv., 22(3): 213-217.
Larabi, M., Gulik, A., Dedieu, J.P., Legrand, P., Barratt, G. and Cheron, M. (2004). New lipid formulation of amphotericin B: spectral and microscopic analysis. Biochimi. Biophys. Acta. 1664(2): 172-181.
Legand, P., Romero, E.A., Cohen, B.E. and Bolard, J. (1992). Effects of aggregation and solvent on the toxicity of amphotericin B to human erythrocytes. J. Antimicrob. Agents Chemother., 36(11): 2518-2522.
López-Jodra, O., Torres- Rodríguez, J.M., Méndez-Vásquez, R., Ribas-Forcadell, E., Morere- López, Y., Baró-Tomás, T. and Alia-Aponte, C. (2000). In vitro susceptibility of Cryptococcus neoformans isolates to five antifungal drugs using a colorimetric system and the reference microbroth method. J. Antimicrob.Chemother. 45: 645–649
Lozano-Chiu, M., Paetznick, V.L., Ghannoum, M.A. and Rex, J.H. (1998). Detection of resistance to amphotericin B among Cryptococcus neoformans clinical isolates: Performances of three different media assessed by using E-Test and national committee for clinical laboratory standards M27-A methodologies. J. Clinical Micorb. 36(10): 2817–2822.
Mazerski, J. and Borowski, E. (1996). Molecular dynamics of amphotericin B. II. Dimer in water. Biophys. Chem. 57(2-3): 205-217.
Mehta, R., Lopez- Berestein, G., Hopfer, R., Mills, K. and Juliano, R.L. (1984). Liposomal amphotericin B is toxic to fungal cells but not to mammalian cells. Biochem. Biophys. Acta., 770(2): 230-234.
Misra, A., Hickey, A. J., Rossi, C., Borchard, G., Terada, H., Makino, K., Fourie, P. B. and Colombo, P. (2011). Inhaled drug therapy for treatment of tuberculosis. Tuberculosis. 91: 71-81.
Muttil, P., Wang, C. and Hickey, A. J. (2009). Inhaled drug delivery for tuberculosis therapy.
Pharmaceutical Research. 26(11): 2401-2416.
Nasr, M., Nawaz, S. and Elhissi, A. (2012). Amphotericin B lipid nanoemulsion aerosols for targeting peripheral respiratory airways via nebulization. Int. J. Pharm., 436(1-2): 611-616.
48
Nishi, K.K., Antony, M., Mohanan, P.V., Anilkumar, T.V., Loiseau, P.M. and Jayakrishana, A. (2007). Amphotericin B-gum arabic conjugates: Synthesis, toxicity, bioavailability, and activities against leishmania and fungi. Pharm. Res., 24(5): 971-980.
Park, B.J., Arthington-Skaggs, B.A., Hajjeh, R.A.; Iqbal, N., Ciblak, M.A., Lee-Yang, W., Hairston, M.D., Phelan, M., Plikaytis, B.D., Sofair, A.N., Harrison, L.H., Fridkin, S.K. and Warnock, D.W. (2006). Evaluation of amphotericin B interpretive breakpoints for Candida bloodstream isolates by correlation with therapeutic outcome. Antimicrob. Agents Chemother., 50(4): 1287-1292.
Pilcer, G. and Amighi, K. (2010). Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int. J. Pharm., 392: 1-19.
Torrado, I.J., Espada, R., Ballersteros, M.P. and Santiago-Torrado, S. (2008). Amphotericin B formulation and drug targeting. J. Pharm. Sci., 97(7): 2405-2425.
Van Eldere, J.; Joosten, L.; Verhaeghe, A.; Surmont, I. (1996) Fluconazole and amphotericin B antifungal susceptibility testing by national committee for clinical laboratory standards broth macrodilution method compared with E-test and semiautomated broth microdilution Test. J. Clin. Microbiol., 34 (4): 842-847.
Wingard, J.R., White, M.H. and Anaissie, E. (2000). A randomized, double-blind comparative trial evaluating the safety of liposomal amphotericin B versus amphotericin B lipid complex in the empirical treatment of febrile neutropenia. Clin. Infect. Dis.,31: 1155-1163.
12. ขอคดเหนและขอเสนอแนะส าหรบการวจยตอไป การทดลองในสตวทดลอง ในแงความปลอดภย
49
13. ภาคผนวก ประกอบดวย
นพนธตนฉบบทพรอมสงตพมพ (Manuscript) จ านวน 1 เรอง
สทธบตร จ านวน 1 เรอง
