DIAGNOSIS OF BRUCELLOSISG).pdfDIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS ส านกงานมาตรฐานส นคาเกษตรและอาหารแห งชาต กระทรวงเกษตรและสหกรณ

แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10402(G)-2561

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10402(G)-2018

การชนสตรโรคบรเซลลา

DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 11.220 ISBN XXX-XXX-XXX-X

รางZ(ราง)


มกษ. 10402(G)-2561

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10402(G)-2018


DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 126 ตอนพเศษ 186 ง วนท 28 ธนวาคม พทธศกราช 2556

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร

เรอง การชนสตรโรคบรเซลโลซส

1. อธบดกรมปศสตว หรอผทอธบดมอบหมาย ประธานกรรมการ นางสาวมนยา เอกทตร ทปรกษากรมปศสตว นางสาวเรขา คณตพนธ นายสตวแพทยชานาญการพเศษ

2. ผแทนกรมปศสตว กรรมการ

3. ผแทนสานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กรรมการ นายชยศร มหนตชยสกล

นายสงขลา จลกะเศยน

4. ผแทนสานกควบคม ปองกน และบาบดโรคสตว กรมปศสตว กรรมการ

นางสาวชญาน เจนพานชย

นายโรจนชนะ ปรากฎชอ

นางสาวขวญชนก แกวปราณต

5. ผแทนสถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว กรรมการ

นางสาวเรขา คณตพนธ

นายอสระ สรกนก

นางสาวลขณา รามรน

6. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ

รองศาสตราจารยธระพล ศรนฤมตร

รองศาสตราจารยเกรยงศกด ไพรหรญกจ

7. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยอรญ จนทรลน

ผชวยศาสตราจารยไชยพศร ธารงยศวทยากล

8. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยมหดล กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยวทวช วรยะรตน

นายกฤษฎา ใจชน

นางสาวขวญวลย มากลน

9. ผแทนสตวแพทยสภา กรรมการ

รองศาสตราจารยพพฒน อรณวภาส

10. ผแทนสมาคมโคเนอแหงประเทศไทย กรรมการ

นายสรชย เปยมคลา

นายมนส เรยบรอย

(3)

11. ผแทนสมาคมผเลยงโคนมไทย-โฮลสไตลฟรเชยน กรรมการ

12. ผแทนสมาคมผเลยงสกรแหงชาต กรรมการ

13. ผแทนสมาคมเวชศาสตรชนสตรทางสตวแพทยไทย กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยคมกฤช เทยนคา

นายรชฎ ตนตเลศเจรญ

14. รองศาสตราจารยกตตศกด อจฉรยะขจร กรรมการ

ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรค

15. ผแทนสานกกาหนดมาตรฐาน กรรมการและเลขานการ

สานกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต นายพทกษ ชายสม นางสาวมนตรา ลกขณา

(4)

กระทรวงเกษตรและสหกรณไดประกาศมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคบรเซลลา

(มกษ. 10402-2561) สาหรบใชเปนหลกปฏบตเพอการชนสตรโรคบรเซลลา ใหสอดคลองกบ

ขอกาหนดขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE)

เพอใหมแนวทางในการนามาตรฐานดงกลาวไปปฏบต คณะกรรมการมาตรฐานสนคาเกษตรจงกาหนด

มาตรฐานสนคาเกษตร เรอง แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร การชนสตรโรคบรเซลลา เพอให

เกดการควบคมโรคบรเซลลาในฟารมอยางมประสทธภาพ

มาตรฐานสนคาเกษตรน กาหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

มนยา เอกทตร. 2552. โรคบรเซลโลสสและการชนสตรในประเทศไทย. พมพครงท 1. สถาบนสขภาพสตวแหงชาต,

กรงเทพฯ.

World Organisation for Animal Health (OIE). 2009. Chapter 2.4.3 Bovine Brucellosis. Paris.

World Organisation for Animal Health (OIE). 2016. Chapter 2.1.4 Brucellosis (Brucella abortus, B. melitensis and B. suis) (Infection with B. abortus, B. melitensis and B. suis). Paris.

มกษ. 10402(G)-2561

1



แนวปฏบตน ใหคาอธบายความทางวชาการของตวอยางเพอการชนสตร การตรวจรอยโรค และวธชนสตรโรค

ในมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคบรเซลลา (มกษ. 10402) เพอเปนขอแนะนาในการนาไปปฏบต

คาอธบาย มกษ. 10402 มรายละเอยด ดงน

ขอกาหนดและวธการชนสตร มกษ. 10402 พมพอยในกรอบและมคาอธบายอยใตกรอบ

1. ขอบขาย

มาตรฐานสนคาเกษตรน กาหนดการชนสตรโรคบรเซลลาในโค กระบอ แพะ แกะ และสกร ครอบคลม

ตงแตตวอยางเพอการชนสตร การตรวจรอยโรค การเพาะแยกและตรวจจาแนกเชอแบคทเรย การตรวจหา

สารพนธกรรม และการตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกน

2. นยาม

ความหมายของคาทใชในมาตรฐานสนคาเกษตรน มดงตอไปน

2.1 โรคบรเซลลา (Brucellosis) หมายถง โรคในสตวและคนทมสาเหตจากการตดเชอแบคทเรย Brucella spp.

ซงในมาตรฐานนครอบคลมเชอ B. abortus, B. melitensis และ B. suis

2.2 โคและกระบอ (cattle and buffalo) หมายถง สตวเคยวเอองขนาดใหญ (large ruminant) ในวงศ Bovidae

2.3 แพะและแกะ (goat and sheep) หมายถง สตวเคยวเอ องขนาดเลก (small ruminant) ในวงศ Bovidae

วงศยอย Caprinae

2.4 สกร (pig) หมายถง สตวในวงศ Suidae

2.5 การชนสตรโรค (diagnosis) หมายถง การตรวจสอบเพอหาสาเหตหรอหลกฐานขอเทจจรงประกอบ

การวนจฉยโรค

2.6 ตวอยางควบคมผลบวก (positive control sample) หมายถง ตวอยางทมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ ซงเมอนาไปผานกระบวนการทดสอบตามขนตอนตางๆ เชนเดยวกบตวอยางทตองการ

ทดสอบแลวใหผลบวก

มกษ. 10402(G)-2561

2

2.7 ตวอยางควบคมผลลบ (negative control sample) หมายถง ตวอยางทไมมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ ซงเมอนาไปผานกระบวนการทดสอบตามขนตอนตางๆ เชนเดยวกบตวอยางทตองการ

ทดสอบแลวใหผลลบ

2.8 รอยโรค (lesion) หมายถง พยาธสภาพหรอลกษณะผดปกตทปรากฏในเนอเยอหรออวยวะ

คาอธบาย

นยามทตองการอธบายเพมเตมมดงตอไปน

1) นยามขอ 2.1 โรคบรเซลลา (Brucellosis)

โรคบรเซลลาเปนโรคตดเชอท เกดในสตว และเปนโรคทตดตอจากสตวสคน ซงอยในบญชรายชอ

โรคระบาดสตวบกขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE)

และเปนโรคตามพระราชบญญตโรคระบาดสตว พ.ศ. 2558 มสาเหตจากการตดเชอในสกล Brucella

เชน B. abortus, B. melitensis และ B. suis การตดเชอสวนใหญในโคและกระบอเกดจากเชอ B. abortus

ในแพะและแกะเกดจากเชอ B. melitensis และในสกรเกดจากเชอ B. suis biovar 1-3 โรคนมกแสดง

อาการทางคลนกในสตวไดหลายแบบ เชน การแทง รกคาง อณฑะอกเสบ ทอพกอสจอกเสบ ขออกเสบ

การขบเชอในสารคดหลงจากมดลกและในนานม

เชอ Brucella อยในวงศ Brucellaceae อนดบ Rhizobiales และชน Alphaproteobacteria

การตดเชอบรเซลลาในโคและกระบอ เกดจากการตดเชอ B. abortus มกพบการเกดโรคทไมแสดงอาการ

ในสตวอายนอยหรอสตวเพศเมยทไมตงทอง สตวทตงทองจะแสดงอาการรกอกเสบและทาใหเกดการแทง

ในชวงการตงทองเดอนท 5-9 กรณทสตวไมแทงลกจะพบวามการขบเชอออกมากบรก ของเหลวของตวออน

และสารคดหลงจากชองคลอด กรณทพบการตดเชอในเตานมและตอมนาเหลองทเกยวของจะพบวาม

การขบเชอออกมาในนานม การตดเชอแบบเฉยบพลนจะพบเชออยในตอมนาเหลองเปนหลก ในโคและ

กระบอเพศผจะพบอาการอณฑะอกเสบ ทอพกอสจอกเสบ และอาจทาใหสตวเปนหมน มกพบของเหลวคง

(hygroma) ในขอขา

การตดเชอบรเซลลาในแพะและแกะทเกดจากเชอ B. melitensis ขอมลทางพยาธวทยาและวทยาการ

ระบาด พบวามความคลายคลงกบการตดเชอ B. abortus ในโคและกระบอ โดยรก ของเหลวของตวออน

และสารคดหลงจากชองคลอดของแพะและแกะทตดเชอ เปนชองทางหลกในการแพรกระจายของโรค

รวมทงพบการขบเชอไดในนานมและนาเชอดวย และสามารถแยกเชอไดจากอวยวะตางๆ เชน ตอมนาเหลอง

บรเวณหว มาม มดลก ทอพกอสจ อณฑะ และจากรอยโรคบรเวณขอ

การตดเชอบรเซลลาในสกรทเกดจากเชอ B. suis biovar 1-3 จากการกนอาหารสตวทปนเปอนเชอ และจาก

การผสมพนธ ทงน หลงจากภาวะทมแบคทเรยทมชวตอยในกระแสเลอดแลว เชอ B. suis จะเพมจานวน

ในเซลลของระบบสบพนธ (รก ลกสตว อณฑะ ตอมลกหมาก ทอพกอสจ ตอมสรางนาเลยงอสจ) อาการ

ทางคลนกทวไปทพบไดในสกรเพศเมย คอ การแทง ซงเกดข นไดทกระยะของการตงทอง โดยเฉพาะอยางยง

มกษ. 10402(G)-2561

3

ระหวางวนท 50-110 ของการตงทอง อาจพบอาการขออกเสบ ขอ เอนและปลอกหมเอน (tendon sheath)

บวม เดนกะเผลก และบางครงพบอาการขาหลงเปนอมพาต

โรคบรเซลลาสามารถตดตอสคนไดจากการกน การหายใจ และทางเยอบตา ทงน การดมนานมดบ

เปนความเสยงหลกในการตดตอโรคสคนทวไป ทาใหเกดอาการไขเฉยบพลน หรออาจพบในลกษณะ

อนดแลนท ฟเวอร (undulant fever) และเกดภาวะแทรกซอนของระบบกลามเนอและกระดก ระบบหวใจ

และหลอดเลอด และระบบประสาทสวนกลาง สาหรบอาชพทมความเสยงตอการตดเชอบรเซลลา คอ สตวแพทย

คนทางานในโรงฆาสตว เกษตรกรทมหนาทเกยวของกบสตวหรอซากสตวทตดเชอ ลกสตวทแทง หรอรก

2) นยามขอ 2.5 การชนสตรโรค (diagnosis)

การชนสตรโรคเปนวธการตรวจสอบเพอหาสาเหตหรอหลกฐานขอเทจจรงของการเกดโรค โดยอาศย

ขอมลผลการตรวจโรคทงภายนอกหองปฏบตการและภายในหองปฏบตการประกอบกน เพอนาไปส

การวนจฉยโรคทถกตองและแมนยา สาหรบใชตดสนใจในการดาเนนการตอสตวหรอฝงสตวตอไป

3. ขอกาหนด

การชนสตรโรคบรเซลลา ใหเปนไปตามตารางท 1 สาหรบรายละเอยดขนตอนการปฏบตของแตละวธ

อาจแตกตางกนในหองปฏบตการแตละแหง และตองเปนวธชนสตรทประกาศโดยองคการโรคระบาดสตว

ระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) หรอเผยแพรในวารสารทางวชาการ

ทเปนทยอมรบระดบระหวางประเทศ หรอมการประเมนความใชได (validation) แลววามความไว

(sensitivity) และความจาเพาะ (specificity) ในระดบทยอมรบได


ขอกาหนดใน มกษ. 10402-2561 ระบหลกการสาคญในการชนสตรโรคบรเซลลาดวยวธทไดรบ

การยอมรบจาก OIE ทงน หองปฏบตการอาจใชวธการชนสตรท มรายละเอยดขนตอนการปฏบ ต

ทแตกตางออกไปได โดยเปนไปตามหลกเกณฑ ดงน

1) เปนวธชนสตรทตพมพในเอกสารคมอ หรอวารสารทางวชาการทเปนทยอมรบในระดบระหวางประเทศ

2) เปนวธชนสตรทมผลการประเมนความใชได (validation) โดยการศกษารวมกนของหองปฏบตการ

(collaborative study) ตามหลกเกณฑทเปนทยอมรบในระดบระหวางประเทศ

3) กรณไมมวธชนสตรตามขอ 1 หรอขอ 2 ใหใชวธชนสตรทไดประเมนความใชไดโดยหองปฏบตการเดยว

(single laboratory validation) ทมระบบคณภาพและปฏบตตามหลกเกณฑท เปนทยอมรบในระดบ

ระหวางประเทศ

วธการชนสตรโรคบรเซลลา แบงออกไดเปน 2 วธการหลก คอ การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลา

(agent identification) และการตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกน (detection of immune response)

มกษ. 10402(G)-2561

4

ทงน สามารถเลอกใชวธการชนสตรทแนะนาไว โดยข นอยกบวตถประสงคตามสถานภาพของโรค

และการจดการดานวทยาการระบาด

วธการตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาทแนะนาในมาตรฐานน คอ วธการยอมส วธการเพาะแยกเชอ

วธการตรวจระบและจาแนกชนด รวมทง typing วธ polymerase chain reaction (PCR) และวธการ

จาแนกสายพนธวคซน

วธการตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนทแนะนาในมาตรฐานน คอ วธ rose bengal test วธ fluorescence

polarisation assay ว ธ complement fixation test ว ธ indirect enzyme-linked immunosorbent assay

วธ competitive enzyme-linked immunosorbent assay วธ serum agglutination test วธ milk I-ELISA

และวธ milk ring test

การชนสตรดวยวธในรายการท 3 ถงรายการท 15 ตองมตวอยางควบคมผลบวกและตวอยางควบคม

ผลลบทกครง

ตารางท 1 วธการชนสตรโรคบรเซลลา

รายการท 1 ตวอยางเพอการชนสตร

ตรวจสอบและบนทกขอมลของตวอยางทไดรบ ดงน

1.1 ตวอยางทใชในการชนสตรโรคบรเซลลา

1.1.1 โคและกระบอ ใหเกบตวอยางอยางใดอยางหนง หรอหลายอยางรวมกนดงตอไปน

1) อวยวะ เชน ตอมนาเหลอง มาม เตานม มดลก อณฑะ

2) เยอหมตวออน (fetal membranes)

3) ลกสตวทแทง หรอ ของเหลวในกระเพาะอาหาร ปอด มาม จากลกสตวทแทง

4) สารคดหลงจากชองคลอด (vaginal discharge)

5) นานม

6) ซรม

7) นาเชอ

8) ของเหลวหรอหนองจากขออกเสบ

9) ผลตภณฑจากนานม

1.1.2 แพะและแกะ ใหเกบตวอยาง ตามขอ 1.1.1

1.1.3 สกร ใหเกบตวอยาง ตามขอ 1.1.1

มกษ. 10402(G)-2561

5

1.2 การเกบตวอยางตองปองกนการปนเปอนจากเชอจลชพจากสงแวดลอม

1.3 เกบรกษาตวอยางทอณหภม 4-10˚C นาตวอยางสงหองปฏบตการภายใน 12 h หากไมสามารถสง

ตวอยางภายในวนทเกบตวอยางได ใหแชแขงตวอยางในนาแขงแหง หรอตแช ทอณหภม -20˚C หรอตากวา

แลวนาสงหองปฏบตการในวนถดไป


ใหหองปฏบตการตรวจสอบและบนทกขอมลของตวอยางทไดรบลงในแบบฟอรมรบตวอยางทกครง

ตวอยางทใชในการชนสตรโรคบรเซลลา มดงน

1) อวยวะ

การชนสตรโรคดวยการผาซากและเกบตวอยางอวยวะ มกทาภายหลงสตวตายโดยธรรมชาต หรอสตวท

ทาใหตายโดยวธการณยฆาต เทคนคในการเกบตวอยางตองทาโดยไมใหมการปนเปอน และใสในภาชนะ

ปลอดเชอ หรอถงพลาสตกทสะอาด

2) เยอหมตวออน

ตรวจดเยอหมตวออน และเกบตวอยาง โดยในสตวเค ยวเออง ใหเกบ cotyledon ลกษณะผดปกต จานวน

1-2 อน ใสในภาชนะปลอดเชอ

3) ลกสตวทแทง หรอ ของเหลวในกระเพาะอาหาร ปอด มาม จากลกสตวทแทง

- เกบลกสตวทแทงใสในภาชนะปลอดเชอ

- เกบของเหลวในกระเพาะอาหาร โดยใชเขมเบอร 18 และกระบอกฉดยาปลอดเชอ เจาะกระเพาะอาหาร

และดดสวนทเปนของเหลว ปรมาตร 10-20 ml ใสในหลอดปลอดเชอ

- เกบปอดทง 2 ขาง และมาม โดยใชกรรไกรตดชนสวนของอวยวะตางๆ ใสในภาชนะปลอดเชอ

4) สารคดหลงจากชองคลอด

การทา vaginal swab ใหดาเนนการภายใน 6 สปดาหหลงแทง หรอหลงคลอด ควรใช guarded sterile

swab เพอปองกนการตดโรค แลวนา swab ทไดใสในหลอดปลอดเชอ หรอนา swab ใสในหลอดทม

transport medium

มกษ. 10402(G)-2561

6

5) นานม

ทาความสะอาดเตานม ท งใหแหง และฆาเชอทหวนมดวยแอลกอฮอล 70% รดนานมในชวงแรกท ง

และเกบนานม ปรมาตร 10-20 ml จากแตละเตา ใสในหลอดหรอขวดปลอดเชอ โดยควรจะเกบทง 4 เตา

และตองระมดระวงการปนเปอนในนานมจากมอของผรดนม

6) ซรม

เกบซรม โดยเกบเลอด ปรมาตร 3-5 ml ตงไวทอณหภมหอง นาน 30 min เพอใหซรมแยกชนออกมา

แลวดดสวนซรมใสในหลอดปลอดเชอ

7) นาเชอ

เกบนาเชอ โดยรดเกบนาเชอใสในหลอดปลอดเชอ

8) ของเหลวหรอหนองจากขออกเสบ

เกบของเหลวหรอหนองจากขออกเสบใสในหลอดปลอดเชอ

9) ผลตภณฑจากนานม

เกบผลตภณฑจากนานมใสในภาชนะปลอดเชอ

ทงน เกบรกษาตวอยางในขอ 1) ถงขอ 9) ทอณหภม 4-10˚C นาตวอยางสงหองปฏบตการภายใน 12 h

หากไมสามารถสงตวอยางภายในวนทเกบตวอยางได ใหแชแขงตวอยางในนาแขงแหง หรอตแช ทอณหภม

-20˚C หรอตากวา แลวนาสงหองปฏบตการในวนถดไป


รายการท 2 การตรวจรอยโรค

2.1 ตรวจสภาพของสตวเพอดรอยโรค อยางใดอยางหนง หรอหลายอยางรวมกน ดงตอไปน

1) อณฑะอกเสบ

2) มดลกอกเสบ

3) ขออกเสบ

4) ตอมนาเหลองบวมโต

5) เตานมอกเสบ กรณทสงสยการตดเชอบรเซลลาในแพะและแกะ

และบนทกผลเพอใชประกอบการยนยนผลการชนสตรโรค

2.2 ผปฏบตการชนสตรซาก ควรระมดระวงสขอนามยและใชอปกรณปองกนการตดเชอบรเซลลาทเหมาะสม

ขณะปฏบตงาน

มกษ. 10402(G)-2561

7


รอยโรคทางมหภาค (gross lesion) ของการตดเชอบรเซลลา สามารถสงเกตได โดยตรวจสภาพของสตวเพอดรอยโรค อยางใดอยางหนง หรอหลายอยางรวมกน ดงตอไปน

1) อณฑะอกเสบ

2) มดลกอกเสบ

3) ขออกเสบ

4) ตอมนาเหลองบวมโต

5) เตานมอกเสบ กรณทสงสยการตดเชอบรเซลลาในแพะและแกะ

และบนทกผลเพอใชประกอบการยนยนผลการชนสตรโรค

ผปฏบตการชนสตรซาก ควรระมดระวงสขอนามยและใชอปกรณปองกนการตดเชอบรเซลลาขณะปฏบตงาน

โดยควรสวมผากนเปอนทกนนา ถงมอ 2 ชน หนากากอนามยท มมาตรฐาน แวนตา รองเทาบท

และอปกรณอนๆ

1.1 โคทมอาการอณฑะอกเสบ

1.2 อณฑะบวมและมขนาดไมเทากน

ภาพท 1 อณฑะอกเสบในโค

ทมา : รศ.พพฒน อรณวภาส คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

มกษ. 10402(G)-2561

8

ภาพท 2 ตอมนาเหลองบวมโตในโค

ทมา : สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว

3.1 แพะทมอาการอณฑะอกเสบ

3.2 อณฑะบวมและมขนาดไมเทากน

ภาพท 3 อณฑะอกเสบในแพะ



รายการท 3 การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลา (agent identification) ดวยวธการยอมส (staining

methods)

3.1 นาตวอยางอวยวะหรอตวอยางทเปนของเหลว เชน รก สารคดหลงจากชองคลอด หรอของเหลว

ในกระเพาะอาหารของลกสตวทแทง ปายบนแผนสไลด

3.2 ตรงตวอยางดวยความรอน

3.3 ยอมสแผนสไลดดวยวธ Stamp’s modification of the Ziehl–Neelsen’s method

3.4 ตรวจตวอยางดวยกลองจลทรรศนแสงสวาง จะพบเชอบรเซลลามลกษณะเปน coccobacilli หรอแทงสนๆ

(short rods) อาจพบอยเปนเซลลเดยว หรอเซลลค หรอเปนกลม และตดสบานเยน

มกษ. 10402(G)-2561

9


วธการยอมส เปนการชนสตรเบองตนของโรคบรเซลลา แตวธนมความไวตาในการตรวจตวอยางนานม

และผลตภณฑจากนานม

วธการยอมส มขนตอน ดงน

1) นาตวอยางอวยวะหรอตวอยางทเปนของเหลว เชน รก สารคดหลงจากชองคลอด หรอของเหลว

ในกระเพาะอาหารของลกสตวทแทง ปายบนแผนสไลด

2) นาแผนสไลดมาทาใหแหง และตรงตวอยางดวยความรอน โดยนาแผนสไลดไปผานเปลวไฟ

3) นาแผนสไลดมายอมดวยส Ziehl-Neelsen carbol fuchsin ทเจอจาง 1/10 นาน 10 min

4) ลางแผนสไลดดวยนาสะอาด

5) หยด acetic acid 0.5% บนแผนสไลด ไมควรนานเกน 30 s

6) ลางแผนสไลดดวยนาสะอาด

7) ยอมส counterstain ดวย methylene blue 1% นาน 20 s

8) อานและแปลผล

- ผลบวก: พบเชอบรเซลลาทมลกษณะเปน coccobacilli หรอแทงสนๆ (short rods) ขนาด ยาว 0.6-1.5 µm

กวาง 0.5-0.7 µm อาจพบอยเปนเซลลเดยว หรอเซลลค หรอเปนกลม และตดสบานเยน (ส acid fast

อยางออนๆ) และมสนาเงนเปนพนหลง

- อยางไรกตาม ตองทาการเพาะแยกเชอเพอยนยนผลตอไป ไมวาจะใหผลการยอมสเปนบวกหรอลบ

เนองจากอาจมเชอโรคอนๆ ทเปนสาเหตทาใหเกดการแทงลก ซงมลกษณะคลายคลงกบเชอบรเซลลา

เชน Chlamydia abortus หรอ Coxiella burnetii


รายการท 4 การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาดวยวธการเพาะแยกเชอ (culture)

4.1 นาตวอยางไปเพาะบนอาหารเล ยงเชอจาเพาะชนดแขง 2 เพลต และ/หรอ อาหารเลยงเชอ selective

biphasic 2 ขวด

4.2 สงเกตลกษณะโคโลนบนอาหารเล ยงเชอชนดแขง ตงแต 4-10 วน หลงเพาะเชอ หรอสงเกตความขน

ในอาหารเลยงเชอชนดเหลว ตงแต 4-30 วน หลงเพาะเชอ

4.3 โคโลนของเชอบรเซลลามลกษณะกลม ขนาดเสนผานศนยกลาง 1-2 mm ขอบเรยบ เมอมองผาน

อาหารเลยงเชอกบแสงไฟ จะพบโคโลนโปรงแสง และมสนาผ งออน รวมทงเมอมองจากดานบน จะพบ

ลกษณะโคโลนนน (convex) มสขาว ระยะตอมาโคโลนจะขยายใหญขนและมสขน

มกษ. 10402(G)-2561

10


วธการเพาะแยกเชอ ควรปฏบตในหองปฏบตการชวนรภยระดบทเหมาะสม พรอมทงสวมอปกรณปองกน

สวนบคคล วธการนใหผลชา มราคาแพง และมความยงยาก เชอบรเซลลาทอยในอวยวะ เนอเยอ

หรอสารคดหลงนนมกจะมปรมาณนอย ดงนนวธการเพาะแยกเชอควรจะนาตวอยางไปเพาะบนอาหารเลยงเชอ

จาเพาะชนดแขง 2 เพลต และ/หรอ อาหารเลยงเชอ selective biphasic 2 ขวด

อาหารเลยงเชอม 2 ชนด คอ อาหารเลยงเชอพนฐาน และอาหารเลยงเชอจาเพาะ

อาหารเลยงเชอพ นฐาน (basal media)

การเพาะแยกเชอบรเซลลาสวนใหญจะเพาะบนอาหารเล ยงเชอชนดแขง โดยสามารถพบโคโลนของเชอ

ทแยกไดอยางชดเจน และแนะนาใหใชอาหารเลยงเชอชนดเหลวในกรณทตวอยางเปนของเหลว

หรอตองการเพมปรมาณของเชอบรเซลลา

อาหารเลยงเชอพนฐานทนยมใช เชน

- Brucella medium base, tryptose (or trypticase)–soy agar (TSA)

- blood agar base ห รอ Columbia agar โดยเตม ซ รมโคห รอ ซ รม มา 2-5% เพ อ ชวยให

เชอบรเซลลา เชน เชอ B. abortus biovar 2 เจรญเตบโตไดด

- serum-dextrose agar (SDA) หรอ glycerol-dextrose agar โดย SDA เปนอาหารเลยงเชอ

ทเหมาะสมสาหรบใชในการดลกษณะของโคโลน

- non-selective biphasic medium หรอ Castaneda’s medium เปนอาหารเลยงเชอชนดเหลว

ทแนะนาใหใชในการเพาะแยกเชอบรเซลลาจากตวอยางเลอด ของเหลว หรอนานม

อาหารเลยงเชอจาเพาะ (selective media)

อาหารเลยงเชอพนฐานสามารถใชเตรยมเปนอาหารเล ยงเชอจาเพาะได โดยการเตมยาตานจลชพ

ทเหมาะสม เพอยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรยอนๆ ทไมใชเชอบรเซลลา

อาหารเลยงเชอจาเพาะทนยมใช เชน

- modified Farrell’s medium ซงเตมยาตานจลชพ จานวน 6 ชนด ในอาหารเลยงเชอ ปรมาตร 1 L

ค อ polymyxin B sulphate (5,000 units = 5 mg), bacitracin (25,000 units = 25 mg),

natamycin (50 mg), nalidixic acid (5 mg), nystatin (100,000 units) และ vancomycin (20 mg)

ทงน nalidixic acid และ bacitracin ในอาหารเล ยงเชอ มผลยบยงการเจรญเตบโตของเชอ B. abortus,

B. melitensis และ B. suis บางสายพนธ

- modified Thayer-Martin’s medium ประกอบดวย GC medium base (38 g/L) และเตม

haemoglobin (10 g/L), colistin methanesulphonate (7.5 mg/L), vancomycin (3 mg/L),

nitrofurantoin (10 mg/L), nystatin (100,000 IU/L = 17.7 mg) และ amphotericin B (2.5 mg/L)

มกษ. 10402(G)-2561

11

ทงน อาหารเลยงเชอชนดนมสวนผสมของ haemoglobin จงทาใหสงเกตลกษณะโคโลนของเชอไดยาก

- biphasic medium ประกอบดวย Castaneda’s medium และเตม polymyxin B (sulphate)

(6,000 units = 6 mg), bacitracin (25,000 units = 25 mg), natamycin (50 mg), nalidixic

acid (5 mg), amphotericin B (1 mg), vancomycin (20 mg) และ D-cycloserine (100 mg)

ในสวน liquid phase

- CITA ประกอบดวย blood agar base และเตมซรมลกโค 5%, vancomycin (20 mg/L),

colistin methanesulfonate (7.5 mg/L), nitrofurantoin (10 mg/L), nystatin (100,000 IU/L)

และ amphotericin B (4 mg/L)

ทงน CITA สามารถยบยงเชอจลชพทปนเปอนสวนใหญได และชวยใหเชอบรเซลลาทกชนดเจรญเตบโต

ไดด และมความไวมากกวาการใชอาหารเลยงเชอ modified Farrell’s medium และ modified Thayer-Martin’s

medium ในการเพาะแยกเชอบรเซลลา

นอกจากน ในการเพาะแยกเช อ B. abortus ตองบมในตทม CO2 5-10% ซงแตกตางจาก B. melitensis

และ B. suis ทไมตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต

การเพมปรมาณของเชอบรเซลลาใน enrichment medium โดยการเพาะแยกเชอในอาหารเลยงเชอ

ชนดเหลว เชน serum-dextrose broth ห รอ tryptose broth (or trypticase)-soy broth (TSB) ห รอ

Brucella broth ท เต ม ย า ต าน จ ล ชพ amphotericin B (1 µ g/ml) แล ะ vancomycin (20 µg/ml)

และบมทอณหภม 37˚C±2˚C ทม CO2 5-10% นาน 6 สปดาห หรอใชอาหารเลยงเชอจาเพาะ biphasic

medium เพอชวยลดขนตอนของการเพาะขยายเชอ (subculture) ตอไป

1) การเตรยมตวอยาง และการเพาะแยกเชอ

- อวยวะ: บดตวอยางอวยวะ และทาใหเปนสารแขวนลอย ดวยการเตม phosphate buffered saline (PBS)

หรอ nutrient broth กอนทจะนาไปเพาะแยกเชอ

- เยอหมคพภะ: นาเยอหมคพภะมาลางดวยนาเกลอทสะอาด จานวน 3 ครง ตดเปนชนเลกๆ และบด

หรอ smear บนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงไดโดยตรง

- ของเหลวอนๆ: ของเหลวในกระเพาะอาหารของลกสตวทแทง นาเชอ หรอ ของเหลวหรอหนอง

จากขออกเสบ หยดตวอยาง ปรมาตร 0.2 ml และเกลยบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง และเตม

ตวอยางลงในอาหารเลยงเชอ selective biphasic ขวดละ 2 ml จานวน 2 ขวด

- สารคดหลงจากชองคลอด: นา swab ออกจากหลอด และ smear บนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

แลวนา swab ใสลงในอาหารเลยงเชอ selective biphasic

- นานม: ตองนานานมมาจากเตานมทกเตา โดยนาตวอยางนานมใสในหลอดทปดฝามดชดและนามา

ปนเหวยงท 6,000-7,000 g นาน 15 min หรอ 2,000 g นาน 30 min แยกหางนมท ง แลวนาสวนครม

มกษ. 10402(G)-2561

12

และ sediment ผสมใหเขากนมาเพาะบนอาหารเล ยงเชอจาเพาะชนดแขง และอาหารเล ยงเชอ selective

biphasic ขวดละ 2 ml จานวน 2 ขวด

- ผลตภณฑจากนานม: ควรเพาะผลตภณฑจากนานม เชน เนยแขง บนอาหารเลยงเชอเฉพาะทเปน

enrichment เนองจากมปรมาณเชอจานวนนอย ใชตวอยางตรงสวนกลางของเนยแขงในการเพาะแยกเชอ

โดยบดตวอยางกบ phosphate buffered saline ใหเปนเนอเดยวกน


- สงเกตลกษณะโคโลนบนอาหารเลยงเชอชนดแขง ตงแต 4-10 วน หลงเพาะเชอ โดยโคโลนของเชอบรเซลลา

จะมลกษณะกลม ขนาดเสนผานศนยกลาง 1-2 mm ขอบเรยบ เมอมองผานอาหารเล ยงเชอกบแสงไฟ

จะพบโคโลนโปรงแสง และมสนาผ งออน รวมทงเมอมองจากดานบน จะพบลกษณะโคโลนนน (convex)

มสขาว ระยะตอมาโคโลนจะขยายใหญขนและมสขน

- สงเกตความขนในอาหารเล ยงเชอชนดเหลว ตงแต 4-30 วน หลงเพาะเชอ

ภาพท 4 ลกษณะโคโลนของเชอบรเซลลาบนอาหารเลยงเชอจาเพาะ modified Farrell’s medium


มกษ. 10402(G)-2561

13


รายการท 5 การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาดวยวธการตรวจระบและจาแนกชนด รวมท ง

typing (identification and typing)

5.1 การตรวจระบและจาแนกเชอบรเซลลา โดยการทดสอบรวมกนหลายอยาง เชน ดลกษณะโคโลน

การเจรญเตบโต ลกษณะของเชอหลงการยอมสแกรมหรอ Stamp’s staining การทดสอบทางชวเคม

(urease และ oxidase tests) และการทดสอบ slide agglutination test กบ polyclonal anti-Brucella

serum

5.2 การตรวจระบและจาแนกชนด (species) และ biovar ของเชอบรเซลลา โดยการทา phage sensitivity

หรอ phage lysis และการทดสอบ agglutination กบ anti-A, -M หรอ -R monospecific sera รวมทง

การทดสอบความตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต การสราง H2S และการเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอ

ทมส basic fuchsin และ thionin

5.3 การ typing ใหสงเชอบรเซลลาชนดเรยบไปยงหองปฏบตการอางอง เชน สถาบนสขภาพสตวแหงชาต

กรมปศสตว


การตรวจระบและจาแนกเชอบรเซลลา โดยการทดสอบรวมกนหลายอยาง เชน ดลกษณะโคโลน การเจรญเตบโต

ลกษณะของเชอหลงการยอมสแกรมหรอ Stamp’s staining การทดสอบทางชวเคม (urease และ oxidase tests)

และการทดสอบ slide agglutination test กบ polyclonal anti-Brucella serum

1) urease test

วธการ

- เพาะเชอทสงสยลงใน urea broth และบมทอณหภม 37 ˚C ในอางควบคมอณหภมหรอตบม

- อานและแปลผล

อานผลท 15 min 30 min และ 60 min และหลงจากนนอานผลทกชวโมง เมอสของ urea broth เปลยนจาก

สเหลองเปนสชมพ หรอสชมพเขม ใหถอเปนผลบวก

มกษ. 10402(G)-2561

14

ภาพท 5 ตวอยางผลการทดสอบดวยวธ urease test


2) oxidase test

Brucella spp. สวนมากจะใหผลบวก วธนจะใชสาหรบการพสจนสายพนธ (genus)

วธการ

- ใช platinum loop หรอแทงแกวปลายเลกมนเขยโคโลนของเชอทสงสยวาเปนเชอบรเซลลาแลวไปแตะบน

แผนกระดาษกรอง ซงม oxidase reagent (1% NNN´N´-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride)


เมอเชอสมผสกบกระดาษกรองทเปยกชนแลวเปลยนสเปนสมวงเขม ภายใน 10 s จะถอวาใหผลบวก

ภาพท 6 ตวอยางผลบวกจากการทดสอบดวยวธ oxidase test


3) การทดสอบ slide agglutination test กบ polyclonal anti-Brucella serum

Brucella spp. ชนดเรยบจะเกดปฏกรยาการเกาะกลมกบ antisera ตอเชอบรเซลลาชนดเรยบ โดยเชอแบคทเรย

ท เป น แกรมลบอ นๆ เชน Bordetella bronchiseptica, Campylobacter fetus, Moraxella spp. และ

Acinetobacter spp. จะไมเกดปฏกรยาการเกาะกลมกบ antisera ตอเชอบรเซลลาชนดเรยบ

มกษ. 10402(G)-2561

15

วธการ

- นาเชอทสงสย จานวน 1 loop มากระจายใน normal saline 1 หยด แลวหยด antiserum ตอเชอบรเซลลา

ชนดเรยบ ผสมใหเขากน


สงเกตดผลปฏกรยาการเกาะกลม โดยเปรยบเทยบผลกบการทดสอบควบคมโดยใชซรมปกตและเชอบรเซลลา

หากพบปฏกรยาการเกาะกลมถอวาใหผลบวก

ตารางท 1 การจาแนกชนดของเชอบรเซลลา

ชนด

ลกษณะของโคโลน phage lysis

oxid

ase

test

ure

ase

test

Pre

ferr

ed h

ost

Tb Wb Iz1 R/C

RTD

*

10

4 R

TD

RTD

RTD

RTD

B. abortus เรยบ + + + + - + + โคและ

กระบอ

B. melitensis เรยบ - - - + - + + แพะและแกะ

B. suis เรยบ - + + + - + + Bv. 1: สกร

Bv. 2: สกร

Bv. 3: สกร

* RTD: routine test dilution

การตรวจระบและจาแนกชนด (species) และ biovar ของเชอบรเซลลา โดยการทา phage sensitivity หรอ

phage lysis และการทดสอบ agglutination กบ anti-A, -M หรอ -R monospecific sera รวมทงการทดสอบ

ความตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต การสราง H2S และการเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอทมส

basic fuchsin และ thionin

1) การทา phage sensitivity หรอ phage lysis

phage เปนเชอไวรสของเชอแบคทเรยทพบในธรรมชาต โดยพบรวมกบเชอแบคทเรยทเปนโฮสตจาเพาะ

จากความสามารถในการทาลายเชอแบคทเรยทแตกตางกนจงนามาใชในการแยกชนดของเชอแบคทเรย

โดย phage ทใชม 4 ชนด คอ Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz1) และ R/C (สาหรบชนด

ไมเรยบ)

มกษ. 10402(G)-2561

16

antiserum A antiserum M antiserum R

วธการ

- เตรยมเชอทดสอบและเชออางอง บมนาน 48-72 h

- ทา suspension ของแตละเชอดวย PBS

- ใช swab จม suspension ของแตละเชอลงบนเพลต TSA

- หยด phage ทเจอจางตามอตราสวน ปรมาตร 10 µl ลงบนแถบของเชอแตละชนด

- บมทอณหภม 37 ˚C ทม CO2 5% นาน 24 h


lysis โดยสมบรณ ไมมเชอเกดตรงตาแหนงทหยด phage

lysis บางสวน มเชอขนบางสวนตรงตาแหนงทหยด phage

ไมเกดการ lysis เชอขนสมบรณ

2) การทดสอบ agglutination กบ anti-A, -M หรอ -R monospecific sera

วธการ

- เพาะเชอทดสอบบน plate TSA อาย 48-72 h

- หยด monospecific serum ปรมาตร 15-25 µl ลงบนแผนสไลด

- ใสเชอ 1-2 โคโลน ลงในแตละหยดของ monospecific serum คนใหเขากน


ผลบวก หมายถง การเกดปฏกรยาการเกาะกลมกบ mono-specific antiserum ทตรงกนภายใน 1 min

ภาพท 7 ปฏกรยาการเกาะกลมตกตะกอนกบ antiserum A และ antiserum M

ถอวาเปน B. melitensis biovar 3


มกษ. 10402(G)-2561

17

3) การทดสอบความตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต

วธการ

- เตรยม suspension ของเชอประมาณ 1 loop ใน normal saline ปรมาตร 0.5-1 ml แลวเพาะบน

serum dextrose agar 2 หลอด และบมทอณหภม 37 ˚C นาน 2-3 วน ในต บมทมและไมม CO2 5-10%

อยางละหลอด


เชอบรเซลลาทตองการ CO2 ในการเจรญเตบโตจะเตบโตไดดในต บมทม CO2 และจะเตบโตไดนอย

หรอไมมการเตบโตในตบมทไมม CO2

ภาพท 8 เชอ B. melitensis ไมตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต


4) การสราง H2S

วธการ

- นากระดาษกรองจมลงใน suspension of neutral lead acetate 10% (ในนากลน) ทาใหแหงและตดเปนแถบ

ขนาด 0.5 x 5 cm

- นาแถบกระดาษกรองของ lead acetate ใสในหลอดอาหารเลยงเชอท subculture เชอไวแลว โดยให

แถบกระดาษกรองอยเหนอผวหนาอาหารเลยงเชอ ระวงไมใหแถบกระดาษกรองสมผสกบอาหารเลยงเชอ


การเกด H2S จะทาใหแถบกระดาษกรองเปลยนเปนสดา ตรวจดแถบกระดาษกรองทกวน เปนเวลา 4 วน

มกษ. 10402(G)-2561

18

ภาพท 9 ตวอยางการทดสอบการสราง H2S


5) การเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอทมส basic fuchsin และ thionin

- เชอทสงสย 1 loop ละลายใน normal saline ปรมาตร 1 ml ใช swab จม streak บนอาหารเลยงเชอทม

ส basic fuchsin และ thionin ทมความเขมขนของสเทากบ 20 µg/ml และเพลตควบคม (basal medium)

นาเพลตไปบมทอณหภม 37 ˚C ในบรรยากาศทม CO2 5-10%


ตรวจดผลการเตบโตของเชอหลงจากการบมเชอ นาน 3-4 วน

ภาพท 10 การเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอทมส thionin และ basic fuchsin


มกษ. 10402(G)-2561

19

ตารางท 2 การจาแนก biovar ของเชอบรเซลลา ชนด

Bio

var

การทดสอบความตองการ

CO

2

การสราง

H2S

การเจรญเตบโต

บนอาหาร

เลยงเชอทมส

การทดสอบ

agglutination กบ

monospecific sera

Reference strain

Thio

nin

Bas

ic F

uch

sin

A M R ชนด ATCC NCTC

B.

abortus

1 + + - + + - - 544 23448 10093

2 + + - - + - - 86/8/59 23449 10501

3 + + + + + - - Tulya 23450 10502

4 + + - + - + - 292 23451 10503

5 - - + + - + - B3196 23452 10504

6 - - + + + - - 870 23453 10505

9 +/- + + + - + - C68 23455 10507

B.

melitensis

1 - - + + - + - 16M 23456 10094

2 - - + + + - - 63/9 23457 10508

3 - - + + + + - Ether 23458 10509

B. suis

1 - + + - + - - 1330 23444 10316

2 - - + - + - - Thomsen 23445 10510

3 - - + + + - - 686 23446 10511

4 - - + - + + - 40 23447 11364

5 - - + - - + - 513 / 11996

การ typing ใหสงเชอบรเซลลาชนดเรยบไปยงหองปฏบตการอางอง เชน สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว

1) เชอทจะสงไปยงหองปฏบตการอางอง ตองอยในสภาพใดสภาพหนง ดงตอไปน

- เชออยในสภาพดดแหงใน ampule ทปดสนท และใสในหลอดทดสอบทมฝาปดอกชนหนง

- เชอทเพาะบนอาหารเลยงเชอทเหมาะสมในหลอดทดสอบทเรยกวา nutrient slant agar ปดฝาเกลยวใหแนน

- เชอใน transport media แตวธนอาจจะทาใหเชอกลายพนธเปนชนดไมเรยบไดงาย ซงจะใชในการ typing ไมได

มกษ. 10402(G)-2561

20

2) ขอควรระวงในการสงเชอไปยงหองปฏบตการอางอง

- เชอบรเซลลามอนตรายและมความเสยงสาหรบผปฏบตงานในหองปฏบตการทเรยกวา laboratory-acquired

infection ในกรณขนสงทางอากาศ การสงเชอบรเซลลาตองปดฝาเกลยวใหแนน พรอมทงปดดวยเทป PVC

และหอดวยกระดาษซบ หรอ cotton wool แลวใสในถง polyethylene ปดใหแนน และใสในภาชนะ

ตามขอกาหนดของ International Air Transport Association (IATA) ในการขนสงสนคาอนตราย

โดยจะตองปฏบตตามอยางเครงครด ในกรณขนสงทางบกใหปฏบตตามเชนเดยวกบการขนสงทางอากาศ

และสอดคลองกบพระราชบญญตเชอโรคและพษจากสตว พ.ศ. 2558

- กอนทจะมการสงตวอยาง หรอเชอบรเซลลาสาหรบการชนสตรโรค หองปฏบตการทรบตรวจตองตรวจสอบ

การขออนญาตนาเขาใหถกตองตามระเบยบทกาหนด และตองไดรบเอกสารกอนตวอยางหรอเชอบรเซลลา

ทสงตรวจจะมาถง


รายการท 6 การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาดวยวธ polymerase chain reaction (PCR)

6.1 วธ PCR มขนตอนดงน

- สกดดเอนเอ

- เพมจานวนดเอนเอเปาหมายแบบทวคณโดยใชไพรเมอรจาเพาะใหมจานวนมากพอทจะตรวจพบได

- แยกแถบดเอนเอดวยวธอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)

- ตรวจหาลาดบสารพนธกรรมเพอยนยนความจาเพาะของแถบดเอนเอ


ปจจบนไดมการพฒนาวธการทางชวโมเลกลมาใชในการชนสตรโรค คอ วธ PCR โดยนามาใชในการตรวจหา

และจาแนกชนดของเชอบรเซลลา วธ PCR ทใชในมาตรฐานฉบบน คอ Bruce-ladder multiplex PCR

ซงเปนวธการชนสตรเพอจาแนกชนดของเชอท งายและรวดเรว เนองจากสามารถแยกและจาแนก

เชอ Brucella spp. สวนใหญ และสายพนธวคซน (vaccine strains) ไดแก B. abortus S19, B. melitensis

Rev.1 และ B. abortus RB51 ไดในขนตอนเดยว

วธการ ดงน

1) การสกดดเอนเอเปาหมายจากตวอยาง

เตรยมด เอนเอจากโคโลนของเชอใน agar plate โดยนาโคโลนของเชอ จานวน 1 loop (10 µl)

ใสใน normal saline 0.5 ml ในหลอดขนาดเลก (หรอ 1 โคโลน + normal saline ปรมาตร 200 µl)

มกษ. 10402(G)-2561

21

ตมใหความรอน ทอณหภม 100 ˚C นาน 10 min จากนนปนเหวยงท 12,000 g นาน 20 s และเกบสวนใส

ปรมาตร 1µl สาหรบใชเปน DNA template

2) การเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย

- เตรยมสารละลาย Bruce-ladder PCR mix ซงประกอบดวยสารตามตารางท 3 จากนนผสมใหเขากน

ตารางท 3 สวนประกอบของ Bruce-ladder PCR mix (สาหรบปฏกรยาปรมาตร 25 µl)

สารเคม ความเขมขน ปรมาตร/ตวอยาง

PCR buffer 10× 1× 2.5 µl

dNTPs (2 mM) 400 µM each one 5.0 µl

Mg2+

(50 mM) 3.0 mM 1.5 µl

Bruce-ladder eight pair primer cocktail (12.5 µM)

ตามตารางท 4 6.25 pmol each one 7.6 µl

นากลน (PCR-grade) - 7.1 µl

DNA polymerase 1.5 U 0.3 µl

DNA template* - 1.0 µl

*DNA template ไดจากตวอยางทตองการทดสอบ หรอตวอยางควบคมผลบวก หรอตวอยางควบคมผลลบ

โดยตวอยางควบคมผลบวกใหใชดเอนเอของ B. abortus, B. melitensis และ B. suis และตวอยางควบคม

ผลลบใหใชนา (ปราศจากดเอนเอ)

ตารางท 4 แสดงลาดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในมาตรฐานฉบบน

ไพรเมอร ลาดบนวคลโอไทดของไพรเมอร 5'-3' คเบส (base pairs; bp)

BMEI0998f ATC CTA TTG CCC CGA TAA GG 1,682

BMEI0997r GCT TCG CAT TTT CAC TGT AGC

BMEI0535f GCG CAT TCT TCG GTT ATG AA 450

BMEI0536r CGC AGG CGA AAA CAG CTA TAA

BMEII0843f TTT ACA CAG GCA ATC CAG CA 1,071

BMEII0844r GCG TCC AGT TGT TGT TGA TG

BMEI1436f ACG CAG ACG ACC TTC GGT AT 794

BMEI1435r TTT ATC CAT CGC CCT GTC AC

BMEII0428f GCC GCT ATT ATG TGG ACT GG 587

BMEII0428r AAT GAC TTC ACG GTC GTT CG

มกษ. 10402(G)-2561

22

ไพรเมอร ลาดบนวคลโอไทดของไพรเมอร 5'-3' คเบส (base pairs; bp)

BR0953f GGA ACA CTA CGC CAC CTT GT 272

BR0953r GAT GGA GCA AAC GCT GAA G

BMEI0752f CAG GCA AAC CCT CAG AAG C 218

BMEI0752r GAT GTG GTA ACG CAC ACC AA

BMEII0987f CGC AGA CAG TGA CCA TCA AA 152

BMEII0987r GTA TTC AGC CCC CGT TAC CT

- นาตวอยางเขาเครอง thermocycler โดยตงสภาวะในขนตอนตางๆ ดงน

ปฏกรยา อณหภม เวลา จานวนรอบ

การสญเสยสภาพธรรมชาต

(denaturation) 95

oC 7 min 1

การสญเสยสภาพธรรมชาต

แอนนลลง (annealing)

การยด (extension)

95oC

64oC

72oC

35 s

45 s

3 min

25

การยดครงสดทาย

(final extension) 72

oC 6 min 1


- ตรวจสอบผลดวยวธอเลกโทรโฟรซส โดยใชอะกาโรสเจล (agarose gel) 1.5 % และเปรยบเทยบ

แถบเรองแสงทเกดจากแถบดเอนเอของผลตภณฑ (product band) กบเครองหมายดเอนเอ (DNA

marker) 100 bp และตวอยางควบคมผลบวก เพออานผล ดงน

พบ product band 1,682 794 587 450 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ B. abortus

พบ product band 1,682 794 450 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ B. abortus S19

พบ product band 1,682 1,071 794 587 450 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ B. melitensis

พบ product band 1,682 1,071 794 587 450 272 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ B. suis

พบ product band 1,682 1,071 794 587 450 218 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ

B. melitensis Rev.1

พบ product band 794 587 450 และ 152 bp ใหอานผลเปนบวกตอเชอ B. abortus RB51

- ตรวจหาลาดบสารพนธกรรมเพอยนยนความจาเพาะของแถบดเอนเอ

มกษ. 10402(G)-2561

23

MK = DNA marker

Lane 1 = ตวอยางทใหผลบวกตอ B. abortus

Lane 2 = ตวอยางทใหผลบวกตอ B. abortus S19

Lane 3 = ตวอยางทใหผลบวกตอ B. melitensis

Lane 4 = ตวอยางทใหผลบวกตอ B. ovis

Lane 5 = ตวอยางทใหผลบวกตอ B. suis

ภาพท 11 ตวอยางผลการทดสอบดวยวธ Bruce-ladder multiplex PCR



รายการท 7 การตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาสายพนธวคซน (identification of vaccine strains)

ใชวธ PCR โดยใชไพรเมอรจาเพาะตอเชอสายพนธวคซน หรอดการเจรญเตบโตหลงจากการเพาะแยกเชอ

เพอแยกสายพนธวคซน B. abortus S19, B. melitensis Rev.1 และ B. abortus RB51


1) ใชวธ PCR โดยใชไพรเมอรจาเพาะตอเชอสายพนธวคซน

- มหลกการ การอานและแปลผลเหมอนกบการตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาดวยวธ PCR

2) ดการเจรญเตบโตหลงจากการเพาะแยกเชอ

- มหลกการเหมอนกบการตรวจหาและจาแนกเชอบรเซลลาดวยวธการเพาะแยกเชอ


B. abortus S19 เปนเชอทมคณสมบตเปน B. abortus biovar 1 โดยไมตองการ CO2 ไมเจรญเตบโต

ในอาหารเลยงเชอทม benzyl-penicillin (3 µg/ml = 5 IU/ml), thionin blue (2 µg/ml) หรอ

i-erythritol (1 mg/ml) และ L-glutamate ในปรมาณทสง

มกษ. 10402(G)-2561

24

B. melitensis Rev.1 เปนเชอทมคณสมบตเฉพาะของ B. melitensis biovar 1 แตจะมโคโลนเลกกวา

เมอเจรญบนอาหารเลยงเชอชนดแขง ไมเจรญเตบโตในอาหารเล ยงเชอทม basic fuchsin (20 µg/ml)

และ thionin (20 µg/ml) หรอ benzyl-penicillin (3 µg/ml) แตเจรญเตบโตไดในอาหารเลยงเชอ

ทม streptomycin 2.5 หรอ 5 µg/ml (5 IU/ml)

B. abortus RB51 สามารถแยกจาก B. abortus biovar 1 ชนดเรยบได โดย B. abortus RB51

จะมผวไมเรยบ และสามารถเจรญเตบโตไดในอาหารเลยงเชอทม rifampicin (250 µg/ml)


รายการท 8 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกน (detection of immune response) ดวยวธ

rose bengal test (RBT)

8.1 วธ RBT เปน buffered Brucella antigen tests โดยมหลกการของการทดสอบ คอ แอนตบอดในตวอยาง

ซรมจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลาในภาวะทเปนกรด

8.2 นาตวอยางซรมมาผสมกบแอนตเจนของเชอบรเซลลาทยอมส rose bengal ในอตราสวนทเทากน

คนใหเขากนบนเพลต

8.3 อานผลจากปฏกรยาการเกาะกลม (agglutination) ท 4 min ซงมลกษณะคลายตะกอนละเอยด/หยาบ

สามารถมองเหนไดชดเจนดวยตาเปลา


วธ RBT เปน buffered Brucella antigen tests โดยมหลกการของการทดสอบ คอ แอนตบอดในตวอยาง

ซรมจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลาทยอมส rose bengal ในภาวะทเปนกรด (pH 3.65±0.05)

วธนทาไดงาย และเปนวธทเหมาะสมในการตรวจคดกรองโรคเบองตน เพอตรวจหาฝงสตวทตดเชอ

หรอใชในการตรวจเพอรบรองการปลอดโรคบรเซลลาของฝงสตว แตอาจใหผลบวกลวง (false-positive)

ในโคและกระบอทไดรบการฉดวคซน B. abortus S19 หรอเกดจากปฏกรยาขามกบการตดเชออนๆ

(false-positive serological reactions; FPSR) และสามารถใหผลบวกลวงในแพะ แกะ หรอสกร จาก FPSR

รวมทงเกดผลบวกลวงในแพะและแกะทไดรบการฉดวคซน B. melitensis Rev.1 ดงนนจงตองมการทดสอบ

ยนยนกบวธอนทเหมาะสม รวมกบขอมลวทยาการระบาด สวนผลลบลวง (false negative) เกดขนไมบอย

มกษ. 10402(G)-2561

25

วธ RBT มขนตอน ดงน

1) การเตรยมการทดสอบ

- วางตวอยางซรมทตองการทดสอบ ตวอยางควบคมผลบวก ตวอยางควบคมผลลบ และแอนตเจนของ

เชอบรเซลลาทอณหภมหอง (22oC±4

oC) กอนการทดสอบอยางนอย 30 min เพอใหมอณหภมเทากบ

อณหภมหอง

- ตรวจสอบความสะอาดของเพลตใหพรอมสาหรบการทดสอบ

2) เขยาหลอดตวอยางซรมจนเปนเนอเดยวกน แลวใชไมโครปเปตต ดดซรม ปรมาตร 30 µl หยดลงในชอง

บนเพลต โดยทดสอบซรมครงละไมเกน 10 ตวอยาง

3) สาหรบตวอยางควบคมผลบวกและตวอยางควบคมผลลบ ดาเนนการเชนเดยวกนกบขอ 2) เพอควบคม

คณภาพการทดสอบ

4) เขยาขวดแอนตเจนของเชอบรเซลลา ใชไมโครปเปตตดดแอนตเจน ปรมาตร 30 µl (ปรมาตรเทากบ

ตวอยางซรม) แลวหยดลงบนเพลต ขางตวอยางซรม

5) คนตวอยางซรมและแอนตเจนของเชอบรเซลลาใหเขากนทนท โดยใชแผนพลาสตกลกษณะเปน

ฟนปลา 5 แฉก ครงละ 5 ตวอยาง หรออาจใชแทงแกวหรอแทงพลาสตก คนใหเปนวงกลมเสนผาน

ศนยกลางประมาณ 2 cm แลวเอยงเพลตไปมา

6) ครบ 4 min ใหอานผลบนกลองแสงสวาง

7) อานและแปลผล จากปฏกรยาการเกาะกลม สงเกตลกษณะคลายตะกอนละเอยด/หยาบ สามารถมองเหน

ไดชดเจนดวยตาเปลา

Negative (-) = ไมมการเกาะกลม

Positive (+) = มการเกาะกลม

มกษ. 10402(G)-2561

26

12.1 อปกรณสาหรบการทดสอบดวยวธ RBT

12.2 หยดแอนตเจนขางๆ ตวอยางซรมบนเพลต

12.3 คนตวอยางซรมและแอนตเจน

ของเชอบรเซลลาใหเขากน

ภาพท 12 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ RBT

มกษ. 10402(G)-2561

27

ตารางท 5 หลกเกณฑการใหคะแนนตามลกษณะของการเกาะกลมตกตะกอน

ลกษณะตะกอน ลกษณะนา

- ตะกอนหยาบเกาะกลมชดเจนทงหมด

- สชมพออน

ใส

- ตะกอนหยาบเกาะกลมคอนขางชดเจน

ทบรเวณขอบ

- สชมพออน

คอนขางขน

ตะกอนละเอยดกระจายเหนไดชดเจน

ขน

ตะกอนละเอยดขนาดเลก

สามารถมองเหนไดเมอเอยงเพลต

ขน

ไมมตะกอน

ขน

+ 4

+3

+2

+1

0

มกษ. 10402(G)-2561

28

การใหคะแนน

0 = ไมมการเกาะกลม (no agglutination)

+1 = มการเกาะกลมนอยมาก (barely precipitible agglutination) สงเกตจากขอบๆ วงกลม

+2 = มการเกาะกลมนอย (fine agglutination)

+3 = มการเกาะกลมชดเจน (medium agglutination)

+4 = มการเกาะกลมชดเจนมาก (coarse agglutination)


รายการท 9 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ fluorescence polarisation assay (FPA)

9.1 วธ FPA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางซรม โดยใชแอนตเจน

ของเชอบรเซลลาท เคลอบดวยสารเรองแสง (fluorescein isothiocyanate; FITC) และตรวจวดระดบ

การเรองแสงโดยใชเครอง fluorescence polarisation analyser

9.2 นาตวอยางซรมมาเจอจางในระดบความเขมขนตางๆ และอานคาการกระจายของแสง (light scatter)

ของตวอยางซรมดวยเครอง fluorescence polarisation analyser ครงท 1

9.3 ผสมแอนตเจนของเชอบรเซลลากบตวอยางซรม (จากขอ 9.2) ท งไว 2 min และอานคาการกระจาย

ของแสงของตวอยางซรมดวยเครอง fluorescence polarisation analyser ครงท 2

9.4 แปลผลโดยการนาผลตางระหวางคาการกระจายของแสง ครงท 2 และครงท 1 ไปเปรยบเทยบกบ

คา threshold level ทหองปฏบตการไดทดสอบความใชได (validation) แลว


วธ FPA เปนวธทงายและรวดเรว ในการตรวจสอบปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอด โดยวธน

ตองมการอาน blank/background ของแตละตวอยางซรมกอนการเตมแอนตเจนของเชอบรเซลลา

ทงน เมอไดผลการทดสอบเปนบวกตองมการทดสอบยนยนกบวธอนทเหมาะสม รวมกบขอมลวทยาการ

ระบาด

วธ FPA มขนตอน ดงน

1) เจอจางตวอยางซรมในหลอดแกว หรอเพลต 96 หลม (96-well plate) ดงน

- เจอจางซรมโค กระบอ แพะ แกะ และสกร ทเจอจาง 1/10 ในเพลต

- เจอจางซรมโคและกระบอ ทเจอจาง 1/100 ในหลอดแกว

- เจอจางซรมแพะและสกร ทเจอจาง 1/25 ในหลอดแกว

- เจอจางซรมแกะ ทเจอจาง 1/40 ในหลอดแกว

มกษ. 10402(G)-2561

29

และเตม Tris 0.01 M (1.21 g) โดยประกอบดวย sodium chloride 0.15 M (8.5 g), lgepal CA630

0.05% (500 µl), EDTA 10 mM (3.73 g) ตอนากลน 1 L ท pH 7.2±0.2

2) ตรวจวดคาการกระจายของแสงดวยเครอง fluorescence polarisation analyser ครงท 1

3) ผสมแอนตเจนของเช อบรเซลลาทเคลอบดวยสารเรองแสง FITC isomer กบตวอยางซรมใหเขากน

ทงไว 2 min

4) ตรวจวดคาการกระจายของแสงดวยเครอง fluorescence polarisation analyser ครงท 2


แปลผลโดยการนาผลตางระหวางคาการกระจายของแสง ครงท 2 และครงท 1 ไปเปรยบเทยบกบ

คา threshold level ทหองปฏบตการไดทดสอบความใชได (validation) แลว

หากคา threshold level อยทระดบ 90-100 mP (millipolarisation units) ใหอานผลเปนบวก

ภาพท 13 อปกรณสาหรบการทดสอบดวยวธ FPA



รายการท 10 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ complement fixation test (CFT)

10.1 วธ CFT มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางซรม โดยแอนตบอด

ทจาเพาะจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา เกดเปนแอนตบอด-แอนตเจนเชงซอน (antibody-antigen

complex) และคอมพลเมนต (complement) ท เตมลงไปจะจบกบแอนตบอด-แอนตเจนเชงซอน

ปฏกรยาทเกดข นจะมองเหนไดดวยการเตมเมดเลอดแดงทผานกระบวนการทาใหไวตอการกระตน

(sensitised red blood cell) สวนคอมพลเมนตทไมไดทาปฏกรยาจะจบกบเมดเลอดแดง ทาใหเมดเลอดแดงแตก

ทงน การแตกของเมดเลอดแดง (hemolysis) ดไดจากสของฮโมโกลบนในของเหลวสวนบนและตะกอน

ของเมดเลอดแดง ซงจะเปนสดสวนกบระดบของแอนตบอดทจาเพาะในตวอยางซรม

มกษ. 10402(G)-2561

30

10.2 อานผลการใหคะแนนตามรอยละของการแตกของเมดเลอดแดงในการทดสอบ และเปลยนคะแนน

ดงกลาวเปนหนวยของ international complement fixation test units per milliliter (ICFTU/ml)


วธ CFT เปนวธทใชในการตรวจยนยนทมความไวและความจาเพาะ และตองทาในหองปฏบตการทม

ความพรอมและผทดสอบไดรบการฝกฝนอยางด รวมทงตองมการรบประกนคณภาพของการทดสอบ

การทดสอบดวยวธ CFT มหลายแบบ แตทนยมใชคอการทดสอบในไมโครเพลต ซงอาจเปนการทดสอบ

แบบ cold fixation (5 oC±3

oC นาน 14-18 h) หรอ warm fixation (37

oC±2

oC นาน 30 min)

ทงน มหลายปจจยทมผลกระทบตอการทดสอบดวยวธ CFT เชน ตวอยางซรมทมคณภาพไมเหมาะสม

หรอมการปนเปอนกบเชอแบคทเรยอน หรอมการทาลายคอมพลเมนตทไมสมบรณในขนตอนการเตรยม

ตวอยางซรม จะทาใหมผลการทดสอบเปนบวก ทงๆ ทไมมแอนตเจน และทาใหเกด anti-complementary

activity ในการทดสอบแบบ cold fixation ทาใหไมสามารถอานผลได สวนการทดสอบแบบ warm fixation

มกจะพบปฏกรยา prozone

วธ CFT มการใชเมดเลอดแดงแกะ (sheep red blood cells; SRBCs) ท suspension 2%, 2.5% หรอ 3%

โดยใชเลอดทเตมสารคงสภาพ เชน Alsever's solution และผานกระบวนการทาใหไวตอการกระต น

(sensitisation) กบ rabbit anti-SRBCs serum ซงเจอจางทความเขมขนตาสดทตองการใหเกดการแตก

ของเมดเลอดแดงแกะอยางสมบรณในคอมพลเมนตของหนตะเภา

สารละลาย barbital (veronal) buffered saline ท pH 7.35±0.05 เปนสารละลายมาตรฐานสาหรบวธ CFT

อยางไรกตาม บางประเทศไมอนญาตใหใชสารละลายดงกลาว และแนะนาใหใชสารละลายทไมม barbiturate

ของโซเดยมคลอไรด 0.85% ทมสวนผสมของแคลเซยมและแมกนเซยมแทน

วธ CFT มขนตอน ดงน

1) นาตวอยางซรมมาทาลายคอมพลเมนตทอณหภม 60oC±2

oC นาน 30 min

2) เจอจางตวอยางซรมตามตารางท 7 ดงน

- ใช multichannel micropipette ดดสารละลาย barbital (veronal) buffered saline

- ใช multichannel micropipette ดดตวอยางซรมตามขอ 1) จาก microplate U-shape deep-well ปรมาตร

50 µl ในแถวท A แลวใช multichannel micropipette ดดขนลง เพอผสมประมาณ 5-6 ครง

- ดดสารละลายจากหลม A ปรมาตร 25 µl ใสหลม B ดดขนลง เพอผสมประมาณ 5-6 ครง แลว

ดดสารละลายจากหลม B ปรมาตร 25 µl ทง

- ดดสารละลายจากหลม A ปรมาตร 25 µl ใสหลม C

มกษ. 10402(G)-2561

31

- ดดสารละลายจากหลม A ปรมาตร 25 µl ใสหลม D แลวทา serial dilution ปรมาตร 25 µl ตงแตหลมท

DEFGH และจากหลม H ดดสารละลายทง ปรมาตร 25 µl

- เตมสารละลาย barbital (veronal) buffered saline ปรมาตร 25 µl ใสหลม A และหลม B (ทดแทน

ปรมาตรของแอนตเจนของเชอบรเซลลา)

3) เตมแอนตเจนของเชอบรเซลลาทเจอจางตามคาแนะนาของผผลต ปรมาตร 25 µl ทกหลม ยกเวน

แถว A และแถว B เขยาเพลตดวยเครองเขยาเพลต นาน 1 min

4) เตมคอมพลเมนต (2 units) ปรมาตร 25 µl ทกหลม เขยาเพลต นาน 1 min ทกครงททดสอบ

ใหทาการควบคม 3 ปจจย คอ แอนตเจนของเชอบรเซลลา คอมพลเมนต และ sensitised SRBCs

โดยใสสารตางๆ ใน microplate U-shape (96 หลม) ตามตารางท 6 ดงน

ตารางท 6 การเตรยมการควบคมแอนตเจนของเชอบรเซลลา คอมพลเมนต และ Sensitised SRBCs

แถว control veronal buffer diluted antigen complement

A antigen control 25 µl 25 µl 25 µl

B complement control 50 µl - 25 µl

C sensitised SRBCs control 75 µl - -

และนาเพลตเกบในตเยน นาน 16-20 h

5) วนท 2 เตรยม sensitised SRBCs โดยผสม haemolysin (2 units) จานวน 1 สวน กบเมดเลอดแดงแกะ 2.5%

จานวน 1 สวน วางไวทอณหภมหอง นาน 10 min

6) เตม sensitised SRBCs ปรมาตร 50 µl ทกหลม เขยาเพลตใหเขากน

7) นาเพลตไปเกบไวในตบม ทอณหภม 37 oC±2

oC นาน 30 min

8) นาเพลตไปปนเหวยงท 200-400 g นาน 5-10 min หรอเกบในต เยน ทอณหภม 5 oC±3

oC

ไมนอยกวา 2 h หรอคางคน

มกษ. 10402(G)-2561

32

ตารางท 7 การดาเนนการทดสอบตอ 1 ตวอยาง

serum

dilution

VB

(µl)

diluted

serum

VB

(µl)

antigen

(µl)

complement

(µl)

เกบท 5

oC

±3

oC

นาน

16-20 h

SRBCs

(µl)

37

oC

±2

oC

นาน

30 m

in

ปนเหวยงท 2

00-400 g

นาน

5-10 m

in

หรอเกบในตเยน

A Serum control well 1:2 50 50 25 0 25 50

B Serum control well 1:4 25 25 25 0 25 50

C 1:2 0 25 0 25 25 50

D 1:4 25 25 0 25 25 50

E 1:8 25 25 0 25 25 50

F 1:16 25 25 0 25 25 50

G 1:32 25 25 0 25 25 50

H 1:64 25 25 0 25 25 50

Discard

= discard 25 µl = transfer สารจากหลมตนลกศรไปปลายลกศร 25 µl

9) การเตรยมเพลต สาหรบใชประกอบการอานผล เปรยบเทยบกบสของการแตกของเมดเลอดแดง

เพอใหคะแนนตามรอยละของการแตกของเมดเลอดแดงในการทดสอบ ใหดาเนนการดงน

haemolysis control (%) 100 75 50 25 0

notation 0 + ++ +++ ++++

veronal buffer (µl) 0 25 50 75 100

total haemolysis supernatant (µl)* 100 75 50 25 0

* เตรยมจาก negative control wells (100% haemolysis)


- การอานผล

ใหคะแนนตามรอยละของการแตกของเมดเลอดแดงในการทดสอบ

คะแนน haemolysis (%) haemolysis inhibition (%)

++++ (4+) 0 100

+++ (3+) 25 75

++ (2+) 50 50

+ (1+) 75 25

0 100 0

มกษ. 10402(G)-2561

33

หมายเหต: ในกรณทไมเกดการแตกของเมดเลอดแดง หรอเมดเลอดแดงแตกไมสมบรณ ในหลมควบคม

ทเจอจาง 1/2 หรอ 1/4 สามารถเกดขนได เรยกวา anti-complementary activity อาจเนองมาจากสตวนน

เปนโรคอน หรอตวอยางซรมเกดการปนเปอนทาใหคอมพลเมนตเสอมคณภาพ

- การแปลผล

ผลการทดสอบจะเปลยนเปนหนวยของ international complement fixation test units per milliliter

(ICFTU/ml) ดงน

serum dilution haemolysis inhibition

25% (+) 50% (++) 75% (+++) 100% ( ++++)

1/2 8.3 10 11.6 13.3

1/4 16.6 20* 23.3 26.6

1/8 33.3 40 46.6 53.3

1/16 66.6 80 93.3 107

1/32 133 160 187 213

1/64 267 320 373 427

1/128 533 640 747 853

1/256 1,067 1,280 1,493 1,707

* จดตดสนเปนบวกของ OIE และ EU ( 20 ICFTU/ml)

ตดสนผล: a) ผลบวก 20 ICFTU/ml โดยมการยบยงการแตกของเมดเลอดแดง (haemolysis

inhibition) 50% ขนไป ทเจอจาง 1/4

b) ผลสงสย 13.3 ICFTU/ml แต < 20 ICFTU/ml

c) anticomplement กรณเกดการแตกของเมดเลอดแดง ≤ 75% ทเจอจาง 1/2 หรอ 1/4

ในหลมซรมควบคม

d) ในกรณสตวทฉดวคซน B. abortus S19 ใหตดสนผลบวกท 30 ICFTU/ml

มกษ. 10402(G)-2561

34

ภาพท 14 ผลการทดสอบดวยวธ CFT



รายการท 11 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ indirect enzyme-linked immunosorbent

assay (I-ELISA)

11.1 วธ I-ELISA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางซรมทจบกบ

แอนตเจนของเชอบรเซลลา ชนด smooth lipopolysaccharide (S-LPS) และบงชการเกดปฏกรยา โดยใส

antiglobulin-enzyme conjugates

11.2 วดคาการดดกลนแสงดวยเครองอานผลอไลซา (ELISA reader)


วธ I-ELISA มหลายแบบ โดยมการใชแอนตเจนหลายชนด เชน whole cell, smooth lipopolysaccharide

(S-LPS) หรอ O-polysaccharide (OPS) ของเชอบรเซลลา และมวธการเตรยมทแตกตางกน ทงน ชดทดสอบ

และแอนตเจนทใชควรผานการประเมนความใชไดของแอนตเจนและวธการ ตามวธการประเมนของ OIE

I-ELISA ทใชแอนตเจน S-LPS หรอ OPS มความไวสง แตไมสามารถแยกผลบวกจากสตวทเปนโรค

หรอสตวทไดรบการฉดวคซน (B. abortus S19 และ B. melitensis Rev.1) หรอ FPSR ทงน การทดสอบ

เพอยนยนสตวทเปนโรคสามารถทาไดโดยการใชแอนตเจน rough LPS หรอ cytosol

การทดสอบดวยวธ I-ELISA สามารถใชชดทดสอบสาเรจรปของกรมปศสตวท จดทาขนโดยสถาบน

สขภาพสตวแหงชาต หรอชดทดสอบสาเรจรปทพฒนาโดยผผลตชดทดสอบ และทดสอบตามคาแนะนา

ของผผลต

มกษ. 10402(G)-2561

35


รายการท 12 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ competitive enzyme-linked immunosorbent

assay (C-ELISA)

12.1 วธ C-ELISA มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางซรม โดยการท

แอนตบอดกบแอนตบอดโคลนเดยว (monoclonal antibody; MAb) ทตดฉลากดวยเอนไซม แยงจบกบ

แอนตเจนของเชอบรเซลลา

12.2 วดคาการดดกลนแสงดวยเครองอานผลอไลซา (ELISA reader)


วธ C-ELISA จะใช MAb ทจาเพาะตอ OPS ของเชอบรเซลลา ซงจะมความจาเพาะมากกวาวธ I-ELISA

ทงน วธ C-ELISA ไมสามารถลด FPSR ทงหมดจากเชอแบคทเรยอนๆ ในโค กระบอ และสกรได

ทงน ชดทดสอบและแอนตเจนทใชควรผานการประเมนความใชไดของแอนตเจนและวธการ ตามวธการ

ประเมนของ OIE

การทดสอบดวยวธ C-ELISA สามารถใชชดทดสอบสาเรจรปทพฒนาโดยผผลตชดทดสอบ และทดสอบ

ตามคาแนะนาของผผลต


รายการท 13 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ serum agglutination test (SAT)

13.1 วธ SAT มหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหาแอนตบอดในตวอยางซรมทเกาะกลมกน

กบแอนตเจนของเชอบรเซลลา และเกดปฏกรยาการเกาะกลม

13.2 นาตวอยางซรมมาผสมกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา โดยมการเจอจางตวอยางซรมแบบอนกรม

คนใหเขากนในหลอดหรอเพลต

13.3 อานผลจากปฏกรยาการเกาะกลม


วธ SAT เปนวธการทดสอบทประสบความสาเรจในการนาไปใชเฝาระวงและควบคมโรคบรเซลลาในโค

และกระบอ

มกษ. 10402(G)-2561

36

ดดสาร

ละลาย

สวนเกนท ง

วธ SAT มขนตอนดงน

1) เตรยมหลอดควบคมสาหรบเปรยบเทยบในการอานผล ดงน

ระดบคะแนน 0 +1 +2 +3 +4

การเกดปฏกรยาการเกาะกลม1 (%) 0 25 50 75 100

phenol saline solution2 (µl) 500 625 750 875 1000

antigen (µl) 500 375 250 125 0

1/ หากเกดปฏกรยาการเกาะกลมนอย สารละลายจะขน

2/ โซเดยมคลอไรด 0.85% + ฟนอล 0.5%

บมทอณหภม 37 oC นาน 16-20 h แลวนาออกจากตบม

2) เตรยมการทดสอบ ดงน

หลอดทดลอง 1 2 3 4 5

serum3 (µl) 200 - - - -

phenol saline solution (µl) 800 500 500 500 500

dilution 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80

two fold dilution (µl) 500 500 500 500 500

antigen (µl) 500 500 500 500 500

final dilution 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160

3/ ในการทดสอบตวอยางซรม ตองทดสอบตวอยางควบคมผลบวกและตวอยางควบคมผลลบดวย

หลงจากนนบมทอณหภม 37 oC นาน 16-20 h แลวนาออกจากตบม และอานผล


อานผลจากปฏกรยาการเกาะกลม หากมากกวา 30 IU/ml ใหอานผลเปนบวก ดงตารางท 8

มกษ. 10402(G)-2561

37

ตารางท 8 การแปลผล

รอยละของการเกดปฏกรยา

การเกาะกลม

IU/ml

ระดบ

คะแนน dilution

1/10 1/20 1/40 1/80 1/160

25 +1 13 25 50 100 200

50 +2 15 30 60 120 240

75 +3 18 35 70 140 280

100 +4 20 40 80 160 320

ภาพท 15 ตวอยางปฏกรยาดวยวธ serum agglutination test



รายการท 14 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ milk I-ELISA

วธ milk I-ELISA มหลกการเหมอนกบการทดสอบตวอยางซรมดวยวธ I-ELISA


วธ milk I-ELISA ใชตรวจหาโรคบรเซลลาของโค กระบอ แพะ และแกะ จากตวอยางนานมในถงรวม

(bulk milk samples) วธนจะพบ FPSR ไดนอยกวาเมอเปรยบเทยบกบการทดสอบดวยวธ I-ELISA

การทดสอบดวยวธ milk I-ELISA สามารถใชชดทดสอบสาเรจรปของกรมปศสตวทจดทาขนโดยสถาบน

สขภาพสตวแหงชาต หรอชดทดสอบสาเรจรปทพฒนาโดยผผลตชดทดสอบ และทดสอบตามคาแนะนา

ของผผลต

มกษ. 10402(G)-2561

38


รายการท 15 การตรวจหาการตอบสนองทางภมคมกนดวยวธ milk ring test (MRT)

15.1 วธ milk ring test ใชตรวจในโคนมและกระบอนมเทานน และมหลกการของการทดสอบ คอ การตรวจหา

แอนตบอดในตวอยางนานม โดยใชแอนตเจนของเชอบรเซลลาท ยอมส haematoxylin แอนตบอด

ทจาเพาะในตวอยางนานมจะจบกบแอนตเจนของเชอบรเซลลา

15.2 เตมตวอยางนานมในหลอด และเตมแอนตเจนของเชอบรเซลลา ผสมใหเขากน

15.3 อานผล โดยตวอยางทใหผลบวกจะพบวงแหวนสมวงในสวนบนของนานม


วธ MRT ใชในการตรวจหาโรคบรเซลลาในฝงโคนมและกระบอนมเทานน ทงน ความไวของวธตรวจ

จะลดลง หากฝงสตวมจานวนโคและกระบอรดนมมากกวา 100 ตวข นไป จงตองปรบจานวนตวอยาง

นานม เพอชดเชยกบ dilution factor จากตวอยางนานม ดงน

- ขนาดของฝงสตว นอยกวา 150 ตว ใชตวอยางนานม ปรมาตร 1 ml

- ขนาดของฝงสตว 150-450 ตว ใชตวอยางนานม ปรมาตร 2 ml

- ขนาดของฝงสตว 451-700 ตว ใชตวอยางนานม ปรมาตร 3 ml

ผลบวกลวงอาจเกดขนไดจากโคและกระบอทไดรบการฉดวคซนโรคบรเซลลาในระยะเวลาทนอยกวา 4 เดอน

กอนการทดสอบ หรอในตวอยางนานมทปนเปอนนมนาเหลอง หรอจากโคและกระบอทเปนโรคเตานม

อกเสบ

วธ MRT มขนตอนดงน

1) ตวอยางนานมตองไมผานการแชแขง การใหความรอน การเขยาทรนแรง หรอการเกบไวนานเกน 72 h

2) วางตวอยางนานม และแอนตเจนของเชอบรเซลลาทอณหภมหอง (22oC±4

oC)

3) เขยาขวดแอนตเจนของเชอบรเซลลา

4) เตมแอนตเจน ปรมาตร 30-50 µl ในตวอยางนานม ปรมาตร 1-2 ml (ทงน ปรมาตรของตวอยาง

นานมอาจเพมขนไดตามขนาดของฝงสตว) ผสมใหเขากน

5) ความสงของนานมในหลอดทดสอบตองไมนอยกวา 25 mm โดยใชหลอดทดสอบขนาดเลก

6) บมทอณหภม 37oC±2

oC นาน 1 h หรอ ทอณหภม 5

oC±3

oC นานขามคน ซงจะชวยเพมความไว

ในการทดสอบและทาใหอานผลไดงายขน

มกษ. 10402(G)-2561

39

1 2

3

4


ตวอยางทใหผลบวกจะพบวงแหวนสมวงในสวนบนของนานม

ภาพท 16 ตวอยางปฏกรยาดวยวธ milk ring test โดยหลอดท 2,3 ใหผลการทดสอบเปนบวก


Documents

DIAGNOSIS OF BRUCELLOSISG).pdfDIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS ส านกงานมาตรฐานส นคาเกษตรและอาหารแห งชาต กระทรวงเกษตรและสหกรณ