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Diagnóstico laboratorial – Brucelose
TESTE DO ANTÍGENO ACIDIFICADO
TAMPONADO (TAAT)
Universidade Federal de Pelotas
Medicina Veterinária
Zoonoses
Teste do AAT
• Triagem
• Muito sensível
• Fácil execução
• MV habilitado / laboratório credenciado / oficial
credenciado
• Soro do animal
Falso-positivo: 2 fatores
• Anticorpos não específicos:
• Infecções por bactérias: Yersinia enterocolitica 0:9,
Salmonella sp, Escherichia coli 0:157,
Pseudomonas sp.
• Resultado da vacinação com B19 após a idade
recomendada (acima 8 meses)
• Conhecimento da dinâmica das imunoglobulinas
nos diferentes estágios da resposta imune
Resposta imune – infecção e vacinação
• Imunoglobulinas em soro bovídeo:
• Classe G (IgG 1 e IgG 2) – seguidas de:
• Classe M (IgM)
• Classe A (IgA)
Infecção B. abortus ou
vacinação com B 19
Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados
com amostra patogênica de Brucella abortus ou vacinados com B19.
1º = IgM
2º = IgG 1
IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas
permanecem níveis baixos
Pós-infecção ou pós-vacinação (a partir da 1ª
semana) (IgM)
Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em
bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus.
Leve decréscimo IgM
IgG 1 permanece alto, inalterado
IgG 2 e IgA permanecem níveis baixos e estáveis
Infecção crônica B. abortus - IgG
Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em
bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus.
Vacinados até 8 meses (3 – 8 meses)
Títulos Acs decrescem rapidamente – depois 12 meses
Vacinação acima 8 meses
Títulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )
Vacinação
com B 19
TAAT
• Teste de aglutinação: soroaglutinação (Ag + Acs = grumos)
• Antígeno:
• Células inteiras da amostra de B. abortus 1119-3 a
concentração de 8%
• Tamponado em pH ácido (3,65) (inibe IgM)
• Corado com o Rosa de Bengala
• A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos
apresenta reação a essa prova
TAAT
• Pode ocorrer alguns poucos casos de reações falso + em
decorrência da utilização da vacina B19
• Toda reação positiva nesse teste → confirmada por testes
de maior especificidade para se evitar o sacrifício de
animais não infectados
• Prova qualitativa: não indica o título de anticorpos do soro
testado.
Vacina B19
• Amostra B. abortus lisa
• Brasil: obrigatória bezerras 3 – 8 meses
• Atenuada para fêmeas jovens
• Machos: orquite
• Fêmeas gestantes: aborto
• Lisa → induz anticorpos aglutinantes específicos contra
LPS liso → interferência diagnóstico sorológico (B. abortus,
B. suis, B. melitensis)
• Persistência dos Acs – relacionado à idade de vacinação
Vacina B19
• Fêmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e
interferem por mais de 24 meses
• Vacina até 8 meses: Acs desaparecem rapidamente:
animais > 24 meses são negativos ao teste
Vacina RB 51
• Amostra de B. abortus rugosa atenuada (diversas
passagens → rugosa)
• Proteção semelhante à B 19
• Rugosa: não induz formação Acs anti-LPS liso (B. canis
e B. ovis)
• Não interfere na sorologia
• Não indutora de Acs aglutinantes
• Viva: mesmos cuidados que B 19
Animais que devem ser testados
• Fêmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 – 8 m)
• Machos e fêmeas não vacinadas igual ou > 8 m (exclui
castrado)
• Fêmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas?
• Sim. Idade igual ou > 24 meses
Colheita de sangue
• Sangue → soro
• Tubos com vácuo (sem anticoagulante)
• Siliconados: facilita a retração do coágulo
• Agulhas individuais e descartáveis
• Sangue: 50% tubo 10 mL
• Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz – boa
coagulação
• Soro: frasco limpo e seco
• Enviar para laboratório rapidamente (resfriado ou
congelados)
• Identificação correta frascos
Protocolo
• Antígeno para AAT
• Soros a testar
• Soros controles positivo e negativo
• Pipetas de Bang
• Micropipetador de 30 µL (0,03 mL)
• Ponteiras
• Placa de vidro – quadrados delimitados 4 cm x 4 cm
• Misturador de plástico ou metal
• Caixa de luz indireta para leitura
• Agitador de placa (opcional)
Protocolo
• Antígeno para AAT
• Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido
no serviço de DSA Estadual
• Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)
• Usados sempre dentro do prazo de validade
• Não podem ser congelados
Cuidados na execução
• Antígeno não em uso: manter 2 a 8 ºC (perda da
sensibilidade por resfriar/aquecer
• Temperatura de execução: 22ºC ± 4ºC
• Limpar material após uso (placas, pipetas, misturadores)
• Soros muito hemolisados = desprezados → Falso +
• Controle positivo e negativo da reação
Técnica
• Equilibrar soro e antígeno – T.A. (30 min)
• Soro congelado: tempo maior
• Homogeneizar soros (cuidado!)
• Identificar área da placa
• 30 µL de soro por área da placa – encostar pipeta num
ângulo 45º
• Agitar suavemente antígeno – 30 µL ao lado do soro
(sem misturar)
Técnica
• Misturar soro e Ag com misturador (círculo 2 cm
diâmetro)
• Agitar a placa – movimentos oscilatórios (30
movimentos / minuto) por 4 minutos
• Colocar placa na caixa de leitura
• Anotar resultados
• Desconsideram reações de aglutinação que ocorrem
após os 4 minutos
Técnica
• Resultado
• Presença de grumos – Reagente
• Ausência de grumos – Não reagente
NegativaPositiva
Reação
positiva
DIAGNÓSTICO de BRUCELOSE
2-ME
2-ME (RETESTE)
Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT