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Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften
Studiengang Lebensmittel – und Bioprodukttechnologie
WS 2013/14
Die Entwicklung eines Lateral Flow Assay zum Nachweis
von Fischallergenen
Verfasser: Robert Falk
1. Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Christine Wittmann
2. Betreuer: Prof. Dr. sc. agr. Heidrun Schniedewind
URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis 2013 – 0133 – 3
1
Abstract
The work is about the development of a Lateral Flow Assay for the detection of fish allergen,
especially Parvalbumin, in food. In general food allergy increases over the last years and
becomes a problem of public interest, because of the health hazard for persons concerned.
Parvalbumin is identified to be the main fish allergen that is responsible for about 90 % of IgE –
mediated immune reactions to fish. The aim of the work is to develop a colloidal gold-based
Lateral Flow Assay for the rapid detection of Parvalbumin in food. Therefore several
investigations are performed to optimize the production of colloidal goldparticles and the
preparation of the LFA components developing a high sensitive LFA. Finally a test for the
detection of Parvalbumin of codfish with an LOD of 4,88 μg/ml is developed. Furthermore a
cross reactivity of the used monoclonal antibody (specific for codfish) against pollack (up to 48
μg/ml) and hering (up to 49 μg/ml) could be determined. Further investigations, especially in
complex food, to optimize the developed LFA are necessary.
2
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN FORMELZEICHEN, SYMBOLE UND
ABKÜRZUNGEN ......................................................................................................................... 4
1. EINLEITUNG ....................................................................................................................... 5
1.1 Lebensmittelallergie .......................................................................................................................... 7 1.1.1 Definition & Klassifikation ............................................................................................................ 7 1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems ............................................................................... 9 1.1.3 Antikörper .................................................................................................................................. 15 1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen .......................................................... 17 1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin .................................................................................... 20 1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen ......................... 22
1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren ............................................................................ 24 1.2.1 Allgemein................................................................................................................................... 24 1.2.2 Lateral Flow Assay .................................................................................................................... 26
2. MATERIAL & METHODEN ............................................................................................ 27
2.1 Chemikalien & Equipment .............................................................................................................. 27 2.1.1 Chemikalien .............................................................................................................................. 27 2.1.2 Puffer & Lösungen .................................................................................................................... 28 2.1.3 Antikörper .................................................................................................................................. 29 2.1.4 Fischproben .............................................................................................................................. 29 2.1.5 LFA – Komponenten ................................................................................................................. 29 2.1.6 Geräte ....................................................................................................................................... 30
2.2 Lateral Flow Assay .......................................................................................................................... 30 2.2.1 Aufbau ....................................................................................................................................... 31 2.2.2 Funktionsprinzip ........................................................................................................................ 34
2.3 Versuchsvorbereitung ..................................................................................................................... 37 2.3.1 Fischprobenaufbereitung .......................................................................................................... 37 2.3.2 Proteingehaltbestimmung ......................................................................................................... 37 2.3.3 Untersuchung zur optimalen Konjugation zw. Antikörper und kolloidalem Gold ...................... 38 2.3.4 Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats ................................................................ 39 2.3.5 Vorbereitung der LFA – Komponenten ..................................................................................... 39
2.4 LFA – Testdurchführung ................................................................................................................. 41
3. ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 43
3.1 Proteingehaltsbestimmung der Fischproben ............................................................................... 43
3
3.2 Konjugationsoptimierung zwischen Nanogoldpartikeln und sekundärem Antikörper ............ 44
3.3 Vorversuche ..................................................................................................................................... 46 3.3.1 Herstellungsoptimierung vom Antikörper – Nanogold – Konjugat ............................................ 47 3.3.2 Optimierung der LFA – Komponenten ...................................................................................... 49
3.4 Hauptversuche ................................................................................................................................. 55 3.4.1 Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination ...................................................................... 55 3.4.2 Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze ..................................................................................... 61 3.4.3 Signalstärkenoptimierung & Verbesserung der Nachweisgrenze............................................. 66
4. ABSCHLUSSDISKUSSION .............................................................................................. 71
5. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 75
LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................... 76
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................ 80
TABELLENVERZEICHNIS ..................................................................................................... 81
ERKLÄRUNG ÜBER DIE SELBSTSTÄNDIGE ANFERTIGUNG DER ARBEIT ........... 82
4
Verzeichnis der verwendeten Formelzeichen, Symbole und Abkürzungen
AS - Aminosäure
BfR - Bundesinstitut für Risikobewertung
CD - Cluster of Differentiation
CDR - Complementarity Determining Regions
DNA - Desoxyribonukleinsäure
ECARF - European Centre for Allergy Research Foundation
ELISA - Enzyme – linked Immunosorbent Assay
IgA - Immunglobulin A
IgD - Immunglobulin D
IgE - Immunglobulin E
IgG - Immunglobulin G
IgM - Immunglobulin M
IL - Interleukin
kDA - Kilo Dalton (atomare Masse)
KP I - Konjugatpadpuffer I
LFA - Lateral Flow Assay
LMKV - Lebensmittelkennzeichnungsverordnung
LOAEL - Lowest Observed Adverse Effect Level
MB I - Membranpuffer I
MHC - Major Histocompatibility Complex
MRI - Max Rubner – Institut
nm - Nanometer
OD - Optische Dichte
PCR - Polymerase Chain Reaction
pAK - primärer Antikörper
RT - Raumtemperatur
sAK - sekundärer Antikörper
pg - Pikogramm
SPR – Biosensoren - Surface Plasmon Resonance Biosensoren
VITAL - Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling
5
1. Einleitung
In der öffentlichen Gesundheit der Bevölkerung sind in der heutigen Zeit allergieauslösende
Lebensmittel ein Problem von stetig wachsender Bedeutung, da einerseits eine Zunahme von
Lebensmittelallergien über die letzten Jahrzehnte zu verzeichnen ist und andererseits mit ihnen
ein hohes gesundheitliches Risiko für die Betroffenen einhergeht [1]. Als Ursachen für den
stetigen Anstieg von Lebensmittelallergien vermutet man die sich ändernden Lebens – und
Ernährungsgewohnheiten der Bevölkerung, hervorgerufen durch die Globalisierung und das
erweiterte Nahrungsmittelangebot [2]. Schätzungen zufolge leiden etwa 4 – 8% der deutschen
Bevölkerung unter Nahrungsmittelallergien oder Nahrungsmittelunverträglichkeiten. [3] [2]. Das
Bewusstsein, einer ständig präsenten Gefahr bei der Nahrungsaufnahme ausgesetzt zu sein sowie
die mühsame Nahrungsmittelbeschaffung, bedingt durch das aufmerksame Studieren der
Zutatenliste auf der Lebensmittelverpackung, vermindern die Lebensqualität der Allergiker
erheblich [4]. Zur Verbesserung des Verbraucherschutzes hat die Europäische Kommission die
EU Richtlinien 2003/89, 2006/142 und 2007/68/EG als Ergänzung zur EU Richtlinie 2000/13
zur Kennzeichnung bzw. Deklaration von Inhaltsstoffen erlassen [5]. Darin enthalten sind unter
anderem die kennzeichnungspflichtigen allergischen Inhaltsstoffe, wobei letztendlich 8
Allergene für mehr als 90% der auftretenden Lebensmittelallergien verantwortlich sind [5]. Zu
dieser Kategorie gehören neben Eiern, Milch, Gluten, Krustentiere, Nüsse (Erdnüsse,
Baumnüsse) und Sojabohnen auch Fisch als einer der Hauptverursacher von allergischen
Symptomen, wie z. B. Atemwegsstörungen, Kreislaufbeschwerden, Hautreizungen, Verdauungs-
störungen oder einem lebensbedrohlichen anaphylaktischem Schock [6].
In einer gesunden Humanernährung nimmt Fisch eine wichtige Rolle ein, da er reichhaltig an
mehrfachungesättigten Fettsäuren (Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure), fettlöslichen
Vitaminen sowie an Proteinen mit einer hohen biologischen Wertigkeit ist [7]. Eine Fischallergie
stellt demnach neben den gesundheitlichen Risiken auch einen signifikanten Einschnitt für die
Ernährungsweise dar. Hauptsächlich ist die Fischallergie bei Kindern und jungen Erwachsenen
zu beobachten bzw. bei Personen aus Küstenregionen / Küstenländern wie z. B. Norwegen, die
einen hohen Fischkonsum aufweisen oder in der Fischindustrie tätig sind [7] [8]. Für über 90%
der Betroffenen ist das Fischallergen Parvalbumin der Hauptverursacher einer IgE – vermittelten
Immunreaktion des Körpers [9] [10]. Bei Parvalbumin handelt es sich um Ca2+/Mg2+ bindende
Muskelproteine, die vorwiegend im weißen Muskelfleisch von Fischen, wie z. B. Kabeljau,
Seelachs oder Flunder, vorkommen und die Bewegungsabläufe (Muskelentspannung)
unterstützen [10].
6
Zum Nachweis von Parvalbumin in Lebensmittelprodukten existieren bereits mehrere
Verfahren, wie z. B. PCR, ELISA oder SPR – Biosensoren [11]. Der gemeinsame Vorteil dieser
Methoden ist die hohe Spezifität und Sensitivität, sodass bereits Spuren von Parvalbumin in der
Nahrung detektiert werden können. Die Nachweisgrenze beim ELISA liegt z. B. bei 0.01 mg
Parvalbumin/kg Lebensmittel [12]. Mittels PCR ist der Nachweis von Parvalbumin sogar bis auf
die Nukleinsäurenebene möglich, jedoch wird das Allergen nicht direkt nachgewiesen, weshalb
die Methode vorwiegend als Indikator für allergene Lebensmittelbestandteile eingesetzt wird
[13]. Die aufgeführten Nachweisverfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv,
kostenintensiv und teilweise laborgebunden, zumal deren Durchführung geschultes und
qualifiziertes Personal erfordert [5]. Deshalb ist die Entwicklung eines praktikablen Schnelltests,
der zuverlässig, genau und zeitsparend arbeitet sowie die Rechtsvorschriften erfüllt,
unumgänglich [5]. Einerseits kann dadurch der Hersteller die Problematik der „versteckten
Allergene“, d h. die Kontamination (Kreuzkontaminationen) von Lebensmittelprodukten mit
Parvalbumin, während des Herstellungsprozesses schnell und kostengünstig überprüfen,
wodurch der Verbraucherschutz steigt. Andererseits sind Schnelltests auch für den Verbraucher
geeignet, um Lebensmittel, die mit Spuren von Fisch deklariert sind, zu überprüfen, wodurch
sich Produktauswahl und Produktsicherheit erhöhen und letztendlich zur Verbesserung der
Lebensqualität für den Allergiker führen. Grundlage für die Entwicklung des Schnelltestformats
zum Parvalbuminnachweis bildet dabei die Methode Lateral Fow Assay, welche auf
immunchromatographischen Vorgängen basiert, bei denen spezifische Antigen – Antikörper
Wechselwirkungen genutzt werden, um entsprechende Analyten, wie z. B. Hormone, Toxine,
Pestizide oder Allergene, optisch nachzuweisen [14]. Vorteile dieser Technik sind die kurzen
Analysezeit, das benutzerfreundliche Format, die lange Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) sowie die
kostengünstige Herstellung, weshalb sich die Technik in vielen Bereichen etabliert hat, wie z. B.
in der Medizin zum Nachweis von Krankheiten, pathogenen Organismen, Schwangerschaften
oder in der Strafverfolgung zum Drogennachweis [15] [16].
Die Masterarbeit beschäftigt sich demnach mit der Entstehung von Lebensmittelallergien und
den dabei ablaufenden immunologischen Mechanismen im menschlichen Körper, wobei
insbesondere auf die Fischallergie, die rechtlichen Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungs-
pflicht und deren Einfluss auf die Lebensmittelindustrie eingegangen wird. Das Hauptziel der
Arbeit ist die Entwicklung eines LFA basierenden Schnelltests zum qualitativen Nachweis von
Fischallergenen, einschließlich dessen Beurteilung hinsichtlich Funktionalität, Sensitivität und
Praktikabilität im Vergleich mit anderen etablierten Nachweisverfahren.
7
1.1 Lebensmittelallergie
1.1.1 Definition & Klassifikation
Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergien um abnormale immunologische
Reaktionen gegenüber Lebensmitteln, die bestimmte Inhaltsstoffe (Allergene) enthalten [4].
Dabei differenziert man Lebensmittelallergien anhand der Vermittlungsart und der Zeitdifferenz
von Allergenaufnahme / Nahrungsmittelaufnahme bis hin zur ersten Überempfindlichkeits-
reaktion in 2 Kategorien [4]. Im Vergleich dazu handelt es sich bei Lebensmittelintoleranzen um
Unverträglichkeitsreaktionen auf Lebensmittel oder deren Inhaltsstoffe unter Ausschluss des
Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Antikörpern [9]. Abbildung 1 gibt dabei
einen schematischen Überblick zur Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittel-
unverträglichkeiten.
Abbildung 1: Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelintoleranzen
Reaktionen auf Lebensmittel
Lebensmittelallergie Lebensmittelintoleranz
Zell – vermittelte – Allergie (nicht IgE vermittelt) z. B.
- Zöliakie
Typ – I – Allergie (IgE vermittelt) z. B.
- Erdnussallergie - Fischallergie - Kuhmilchallergie
Enzymatische Int. (Stoffwechselstörung) z. B.
- Laktoseintoleranz
Pharmakologische Int. z. B.
- Biogene Amine - Glutamate
1
2
1
2
Idiosynkratische Int. z. B.
- Sulfit bedingtes Asthma
- Tartrazin bedingtes Asthma
3
8
Zur 1. Kategorie der Lebensmittelallergien zählt die Typ – I – Allergie (Soforttyp), welche durch
Immunglobin E (IgE) Antikörper vermittelt wird und allergische Reaktionen innerhalb von
Minuten bis maximal 1 Stunde nach der Nahrungsaufnahme auftreten [4]. Die IgE Antikörper
bewirken die Ausschüttung von Histamin und weiteren Botenstoffen durch die Mastzellen,
wodurch allergische Symptome, wie z. B. Asthma, Nasenschleimhautentzündungen, Schwel-
lungen und Erweiterung der Blutgefäße, hervorgerufen werden [17]. Zudem kann durch IgE
vermittelte Reaktion eine Anaphylaxie ausgelöst werden, bei der es sich um eine schnell und
heftig auftretende Immunreaktion handelt, die durch Abfall des Blutdrucks, Brustschmerzen und
Kreislaufschock gekennzeichnet ist [17]. Eine Anaphylaxie ist demnach sehr lebensbedrohlich,
da sie den gesamten Organismus betrifft und somit auch einen schwerwiegenden Einfluss auf die
Organfunktionen hat, der bis hin zum tödlichen Kreislaufversagen führen kann. Der
anaphylaktische Schock und Asthma zählen zu den häufigsten Todesursachen, die in Verbindung
mit Lebensmittelallergien vom Soforttyp I gebracht werden können [4]. Derartige extreme
Immunantworten werden hauptsächlich durch Erdnüsse hervorgerufen, jedoch treten sie auch
gelegentlich bei Eiern, Milch oder Schalentieren auf [17]. Die Fischallergie, welche durch das
Allergen Parvalbumin (Muskelprotein) ausgelöst wird, gehört ebenfalls zur 1. Kategorie der Typ
– I – Allergien und kann bei den betroffenen Allergikern die beschriebenen Symptome auslösen.
Generell kommen IgE – vermittelte allergische Reaktionen häufiger bei Säuglingen und
Kleinkindern vor als bei Erwachsenen, wobei genetische Faktoren auf die Entstehung von Typ –
I – Allergien einen signifikanten Einfluss haben [17]. In diesem Zusammenhang beschreibt der
medizinische Begriff Atopie die erbliche Neigung, auf den Kontakt mit harmlosen
Umweltsubstanzen überempfindlich zu reagieren. Demnach existiert bei Allergikern eine
körperliche Bereitschaft, Immunglobin E Antikörper in erhöhten Mengen zu bilden, wobei dieser
Umstand genetisch verankert ist [17].
Zur 2. Kategorie der Lebensmittelallergien gehört die Zell – vermittelte (Typ IV) „verzögerte
Überempfindlichkeitsreaktion“. Hervorgerufen werden diese Allergien in der Regel durch
sensibilisierte Immunzellen im Dünndarm, wobei es sich hauptsächlich um Lymphozyten (T –
Zellen) handelt, die gegen die entsprechenden allergieauslösenden Substanzen sensibilisiert sind
[4]. Die Folge sind Gewebeentzündungen, die sich auf bestimmte Körperbereiche beschränken,
und erst 24 h bis 48 h nach der jeweiligen Nahrungsaufnahme (Stoffaufnahme) auftreten [4]. Das
bekannteste Beispiel ist die Zöliakie (Glutenunverträglichkeit), bei der die Betroffenen auf
Proteine (Prolamine, Gluteline) mit hohem Anteil an Prolin und Glutamin überempfindlich
reagieren, was zur chronischen Erkrankung der Dünndarmschleimhaut führt [18]. Ursache dafür
ist die Fähigkeit der Proteine, die Epithelzellschicht der Darmschleimhaut bei den erkrankten
9
Personen zu passieren wodurch das Enzym t-Transglutaminase die Gliadinpeptide modifiziert,
und eine lokale Immunreaktion ausgelöst wird, bei der die Aktivierung von T-Lymphozyten
erfolgt [18]. Insbesondere in vielen Getreidesorten, wie z. B. in Weizen, Roggen, Gerste oder
Hafer, kommt dieses Klebereiweiß (Prolamine / Gluteline) vor und ist bei der Brot – und
Gebäckherstellung essentiell für das Teiggerüst bzw. das Gashaltevermögen eines Teiges
notwendig [18]. Zöliakie ist die in Europa am häufigsten auftretende genetische Erkrankung mit
einer Häufigkeit von 0,3 – 0,5 % [9].
Im Vergleich zu Lebensmittelallergien lassen sich Lebensmittelintoleranzen in 3 Kategorien
einteilen. Zur 1. Kategorie gehören die enzymatischen Intoleranzen, bei denen es sich um
genetisch bedingte Stoffwechselstörungen handelt [4]. Betroffene Personen sind dabei nicht in
der Lage, bestimmte Lebensmittel bzw. deren Inhaltsstoffe zu verstoffwechseln, da spezifische
körpereigene Enzyme zum Abbau der Stoffe nicht gebildet werden können. Z. B. sind Laktose
intolerante Personen unfähig, den Milchzucker zu metabolisieren, da das intestinale Enzym β –
Galaktosidase nicht vorhanden ist [4]. Demnach kann Laktose nicht von den Darmlumen
absorbiert werden, was zur Fermentation der Laktose durch die Darmbakterien führt und als
Folge bei den Betroffenen schaumige Diarrhoe und Flatulenz auslöst [4]. Die 2. Kategorie der
Lebensmittelintoleranzen beinhaltet die pharmakologischen Intoleranzen, bei denen
Lebensmittelinhaltsstoffe pharmakologische Wirkungen hervorrufen können. So weisen
Betroffene dieser Kategorie eine Intoleranz gegenüber Lebensmitteln auf, die Histamin
(Gewebshormon / Neurotransmitter) enthalten oder eine vermehrte Histaminausschüttung im
Körper bewirken, wie z. B. Champagner, Rotwein, Schokolade, Tomaten, Thunfisch oder
Johannesbeeren [9] [17]. Die Symptome einer pharmakologischen Intoleranz sind u. a. Übelkeit,
Erbrechen, Juckreize oder Hautreitzungen [9]. In der 3. Kategorie werden die idiosynkratischen
Intoleranzen zusammengefasst, bei denen Lebensmitteln negative körperliche Reaktionen
auslösen, der Mechanismus hinter dieser Reaktion jedoch noch ungeklärt bzw. unbewiesen ist
[4]. Z. B. sind die genauen Wirkmechanismen für Asthma, das durch den Farbstoff Tartrazin
oder durch Sulfite ausgelöst wird, noch nicht eindeutig geklärt [4].
1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems
Der menschliche Organismus besitzt zum Selbstschutz gegen die pathogene Wirkung von
Fremdsubstanzen biologische und chemische Abwehrmechanismen, die harmonisch aufeinander
abgestimmt sind und je nach Bedrohungsgrad unterschiedlich reagieren. Auslöser
immunologischer Reaktionen sind Antisomatogene (Antigene), da sie auf Grund ihrer
körperfremden Struktur durch das menschliche Immunsystem als Gefahr eingestuft werden. Im
10
Allgemeinen lässt sich das menschliche Abwehrsystem in 3 verschiedene Bereiche einteilen,
wobei diese in Tabelle 1 dargestellt sind. [19]
Tabelle 1: Einteilung menschlicher Immunreaktionen (Probst, 2004, S. 267)
Unspezifische Immunreaktion Spezifische Immunreaktion
Passive Resistenz Aktive Resistenz Immunität
Erblich bedingte allgemeine
Unempfindlichkeit durch die
körperliche Konstitution
Unspezifische Abwehr im
Körperinneren durch Proteine
und phagocytierende Abwehr-
zellen
Im Laufe des Lebens
erworbener hochspezifischer
Abwehrmechanismus
Die unspezifische Immunreaktion stellt das von Geburt an vorhandene Abwehrsystem dar, um
den menschlichen Organismus unspezifisch gegenüber pathogene Erreger zu schützen. Man
unterscheidet in die Teilbereiche passive Resistenz und aktive Resistenz. Bei der passiven
Resistenz handelt es sich um mechanische, chemische und mikrobielle Mechanismen, die das
Eindringen und Wirksamwerden körperfremder Strukturen verhindern sollen. Tabelle 2 gibt
dabei eine Übersicht zu den einzelnen Barrieren und ihre Schutzmechanismen. [19]
Tabelle 2: Barrieren der passiven Resistenz (Probst, 2004, S. 268)
Mechanisch Chemisch Mikrobiell
- Haut mit wasserabwei-
sender, verhornter toter
Außenschicht
- Augenspülung durch
Tränenflüssigkeit
- Schleimhäute durch Sekre-
tion adhäsiven Schleims
- niedrige pH-Werte auf der
Haut (3 – 5 ), im Scheiden-
gewölbe (4 – 4,5) und im
Magen (1 – 2)
- bakterizide Wirkung des
Lysozyms in Tränen – und
Speichelflüssigkeit
- Apathogene Bakterien im
Mund, Darm sowie auf der
Haut bilden Konkurrenzflora
Die aktive Resistenz beinhaltet die „zweite Abwehrreihe“ und verhindert die Vermehrung der
Antigene, nachdem diese die Barrieren der passiven Resistenz überwunden haben. In diesem
Zusammenhang spielen Mastzellen, Granulocyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen
eine entscheidende Rolle, da diese mittels Rezeptorerkennung ein breites Spektrum an Erregern
identifizieren. Diese unspezifischen Abwehrzellen besitzen eine amorphe Zellgestalt, wodurch
sie zwischen dem humoralen Blut – und Lymphsystem wechseln können und somit über
11
Interzellularräume in der Lage sind, den gesamten Organismus zu kontrollieren. Granulocyten
und Makrophagen, auch Fresszellen genannt, stellen das Bindeglied zur spezifischen
Immunreaktion dar, auf Grund ihrer Fähigkeit Fremdpartikel sowie pathogene Mikroorganismen
mittels Endocytose aufzunehmen und intrazellulär zu verdauen (Vorgang der Phagocytose).
Nach diesem Verdauungsprozess werden die antigenen Determinanten (Epitope) der
körperfremden Strukturen, bei denen es sich um charakteristische Antigenfragmente handelt, auf
der Membranoberfläche der Zellen positioniert, wobei diese Epitope einen Signalcharakter für
die spezifischen Immunzellen besitzen, um entsprechende spezifische Immunreaktionen
einzuleiten. Abbildung 2 gibt dabei einen allgemeinen Überblick zu den verschiedenen
Abwehrzellen und ihrer Entstehung bzw. ihrem Vorkommen [17] [19].
Abbildung 2: Im menschlichen Organismus vorkommende Abwehr - und Immunzellen
(Probst, 2004, S. 269)
Die spezifische Immunantwort wird auch als adaptive Immunreaktion bezeichnet, da es sich um
eine erworbene Fähigkeit handelt, die erst nach dem Kontakt mit den jeweiligen Antigenen
ausgelöst werden kann. Demnach tritt sie in Kraft, wenn die Abwehrreihen der unspezifischen
Immunreaktion überwunden worden sind. Die spezifische Immunreaktion lässt sich in die
humorale Immunantwort und die zelluläre Immunantwort aufteilen. Beide Abwehrsysteme
laufen parallel ab und ergänzen sich nachhaltig in ihrer Wirkungsweise. Demnach umfasst die
humorale Immunantwort die Antikörperproduktion in der Lymph – und Blutflüssigkeit gegen die
freien Antigene in den Körperflüssigkeiten und wird hauptsächlich über B – Lymphozyten
12
realisiert. Im Gegensatz dazu beinhaltet die zelluläre Immunantwort die Bildung von Killerzellen
gegen Erreger (Antigene), die in Körperzellen eingedrungen sind, und wird hauptsächlich über T
– Lymphozyten realisiert. Beide Zelltypen werden in Untergruppen eingeteilt und können
anhand ihrer membrangebunden Oberflächenmarker systematisiert werden. Abbildung 3 gibt
dabei einen Überblick über die an der spezifischen Immunantwort beteiligten Zelltypen und
deren Einteilung. [17] [19]
Abbildung 3: An spezifischer Immunantwort beteiligte Zelltypen (Probst, 2004, S. 271)
Anhand der Abbildung 3 wird ersichtlich, dass sich die T – Lymphozyten in T – Killerzelle, T –
Helferzelle und T – Entzündungszelle aufteilen. Die T – Helferzelle sowie die T –
Entzündungszelle besitzen als membrangebundenen Oberflächenmarker den CD4 – Rezeptor
(Glykoprotein) und sind für die Regulation der Immunantwort durch Ausschüttung von
Cytokinen, wie z. B. Interleukine oder Interferon, verantwortlich. Die T – Killerzelle ist mit dem
CD8 – Rezeptor ausgestattet, der als Erkennungsmolekül für körpereigene Zellen dient.
Demnach ist die Aufgabe der T – Killerzelle die Identifizierung und Zerstörung infizierter
Körperzellen bzw. ausgemachter Fremdzellen. Im Gegensatz dazu entwickelt sich die B – Zelle
zur Plasmazelle, wobei auf den B – Lymphozyten spezielle Immunglobuline (IgM) als
Rezeptoren für Antigenbindungen lokalisiert sind, weshalb ihre Aufgabe die Antigenpräsentation
einschließlich der Synthese von Antikörpern ist. [17] [19]
13
Im Allgemeinen lässt sich die Entwicklung einer spezifischen Immunantwort in verschiedene
Phasen unterteilen. In der ersten Phase werden die Antigene, welche nach der Infektion nicht in
Wirtszellen eindringen konnten, durch Makrophagen bzw. B – Lymphozyten in den sekundären
lymphatischen Organen, wie z. B. Milz, Mandeln oder Lymphknoten, erfasst und mittels
Phagocytose aufgenommen. Anschließend erfolgt die Prozessierung (Abbau & Bearbeitung) der
Antigene im Zellinneren, wobei die entstehenden kurzkettigen Peptide an MHC – Moleküle
gebunden werden. Bei MHC-Komplexen handelt es sich um Gene, die für
Gewebeverträglichkeit, Immunerkennung und die immunologische Individualität essentiell sind,
da die Genprodukte körpereigene Antigene umfassen und auf der Zelloberfläche zur
Identifizierung von Körperzellen lokalisiert sind [20]. Demnach erfolgt der Transfer der
antigenen Determinanten / Epitop (Peptid – MHC – Komplex) zur Zelloberfläche, sodass diese
den T – Lymphocyten dargeboten werden können. Von den im Blut und Lymphen befindlichen
T – Zellen (ca. 100.000) besitzt lediglich eine Zelle den zum Epitop passenden T – Zell –
Rezeptor, wobei diese Bindung nach dem Schlüssel – Schloss – Prinzip funktioniert und durch
CD4 – bzw. CD8 – Co – Rezeptoren der T – Lymphozyten stabilisiert wird. Im Anschluss daran
kommt es zur Differenzierung, d. h. die T – Lymphozyten mit CD8 – Rezeptor entwickeln sich
zu Killerzellen und im Gegenzug T – Lymphozyten mit CD4 – Rezeptor zu Helferzellen. Dabei
werden die Lymphozyten durch den Kontakt mit mehreren Oberflächenmarkern der Antigen
präsentierenden Zelle aktiviert, wobei die interzelluläre Kommunikation über Cytokine
(Proteine, Glykoproteide), wie z. B. Interferon oder Interleukine, realisiert wird. An die
Differenzierungsphase schließt sich die Klonselektion der T – Zellen an. Das bedeutet, die
Teilung der bis dato ruhenden T – Zelle setzt ein, sodass in sehr kurzer Zeit ein Klon erbgleicher
Zellen mit höchster Antigenspezifität entsteht und parallel dazu die Synthese der Cytokine
gefördert wird. In dieser Phase entsteht ebenfalls das immunologische Gedächtnis (adaptive
Immunantwort), da T – und B – Zellen in der Lage sind nach dem Erstkontakt mit
Antigenpräsentierenden Makrophagen durch Unterbrechung ihrer Weiterentwicklung zu
langlebigen Gedächtniszellen zu werden. Im weiteren Verlauf der spezifischen Immunantwort
lagern sich die spezifischen Antikörper, gebildet während der Immunisierung durch B –
Lymphozyten, über komplementäre Molekülstrukturen beider Reaktionspartner durch nicht
kovalente Bindungen mit den entsprechenden Antigenen zu Antigen – Antikörper – Komplexen
zusammen und immobilisieren dadurch die Antigene bzw. bereiten sie für den anschließenden
Abbau vor. Zum Abschluss der Immunantwort findet die Lyse der infizierten Körperzellen statt.
Dabei werden zunächst die durch Pathogene infizierte Körperzellen anhand ihrer auf der
Zellmembranoberfläche befindlichen an MHC – Moleküle gebundenen Epitope (antigene
14
Determinanten), durch die T – Killerzellen identifiziert. Anschließend binden sich die T –
Killerzellen mittels spezifischer Rezeptoren an die infizierte Zelle, wodurch der Kontakt die
Freisetzung des in der T – Killerzelle produzierten Perforin bewirkt. Es kommt zur Perforation
der Zellmembran, sodass durch die entstandenen Poren Granzyme B (Proteasen) in die Zelle
eindringen können und dort eine Apoptose (programmierten Zelltod) auslösen. Die Zelle stirbt
ab und wird anschließend aufgelöst. Abbildung 4 dient zur Veranschaulichung des im Vorfeld
beschriebenen Vorgangs der spezifischen Immunantwort. [17] [19] [21]
Abbildung 4: Übersicht zur spezifischen Immunantwort im menschlichen Organismus
(Probst, 2004, S. 273)
15
1.1.3 Antikörper
Antikörper sind quartär strukturierte Glykoproteine aus der multigenen Proteinfamilie der
Immunglobuline und spielen eine essentielle Rolle bei der menschlichen Immunabwehr gegen
pathogene Fremdsubstanzen bzw. körperfremde Strukturen. Die Einteilung der Immunglobuline
(Antikörper) erfolgt in 5 Hauptklassen (Isotypen), die man anhand von Größe, Ladung,
Aminosäurezusammensetzung und Kohlenhydratgehalt unterscheiden kann. Die Bezeichnung
der einzelnen Klassen ist IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Anhand von Abbildung 5 soll der
allgemeine Grundaufbau der Immunglobuline und die daraus resultierenden Funktionalität am
Beispiel des Immunglobulins G (IgG) erläutert werden. [19] [22]
Abbildung 5: Aufbau der Antikörpergrundstruktur (IgG) (Wild, 2001, S. 119)
Im Allgemeinen setzen sich Antikörper aus 2 identischen schweren Polypeptidketten („Heavy
Chains“) und 2 identischen leichten Polypeptidketten („Light Chains“) zusammen. Die beiden
schweren Ketten sind über Disulfidbrückenbindungen mit einander verlinkt, wobei jede schwere
Kette ebenfalls über eine Disulfidbrücke mit einer leichten Kette verbunden ist. Daraus ergibt
sich eine flexible Y – Form des Proteinmoleküls. Des Weiteren sind die schweren Ketten
unterteilt in 3 konstante (CH1, CH2, CH3) sowie 1 variable (VH) Domäne. Die leichten Ketten
gliedern sich in 1 konstante (CL) und 1 variable (VL) Domäne. Dabei bestehen die einzelnen
Domänen aus schätzungsweise 110 Aminosäuren. Die hohe Spezifität der jeweiligen Antikörper
ergibt sich aus der Strukturvielfalt (Sequenzvielfalt der AS) der variablen Domänen VL und VH,
16
die sich am Ende der jeweiligen Kette befinden und das Fv-Fragment bilden. Innerhalb der
beiden variablen Domänen (VL/VH) sind jeweils 3 hypervariable AS – Sequenzbereiche, die
auch als CDR („Complementarity Determining Region“) bezeichnet werden und eine β –
Faltblattstruktur aufweisen. Letztendlich bilden diese 6 CDR pro Antikörperarm die spezifische
Antigenbindungsstelle, wonach jeder Antikörper 2 identische Bindungsstellen für Antigene
besitzt. Die Funktionalität der Antikörper bzw. die unterschiedlichen Effektormechanismen der
einzelnen Isotypen werden über die variierenden Fc – Regionen, die sich am unteren schweren
Kettenende (CH2, CH3) befinden, realisiert. Man unterscheidet dabei in 5 Hauptarten schwerer
Ketten bzw. Fc – Regionen, die durch entsprechende Fc – Rezeptoren (Membranrezeptoren)
gebunden werden können und dadurch die spezifischen Eigenschaften der verschiedenen
Immunglobuline bestimmen. Dabei handelt es sich um die Domänen Fcα (IgA), Fcγ (IgG), Fcε
(IgE), Fcδ (IgD) und Fcμ (IgM). Z. B. ist der Fcε – Rezeptor auf der Membranoberfläche von
Mastzellen zu finden und bindet die Fc – Domäne des IgE, sodass die Mastzelle aktiviert wird,
sobald sich Antigene an den IgE Antikörper binden. Dieser Vorgang ist insbesondere bei IgE
vermittelten Immunantworten (Typ – I – Allergien) relevant. [17] [19] [22]
Im oberen Teil wurde bereits erwähnt, dass insgesamt 5 Immunglobulinklassen existieren, die
unterschiedliche Funktionen bei der Immunabwehr des Menschen übernehmen und teilweise in
weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. Bei den Immunglobulinen der Klasse IgM
und IgD handelt es sich um Monomere, die auf der Zelloberfläche von B – Lymphozyten
lokalisiert sind und die Funktion antigenspezifischer Rezeptoren ausführen. Des Weiteren ist
IgM dazu in der Lage, durch Polymerisation Pentamere zu bilden, was die eigentlich IgM –
Struktur im Blutserum widerspiegelt. Generell besitzen die variablen Domänen des IgM eine
geringe Bindungsaffinität gegenüber Antigenen, jedoch ist die Bindungsstärke auf Grund der
hohen Anzahl an Bindungsstellen (10) in der Pentamerform sehr ausgeprägt. Insbesondere in der
Frühphase der Immunatwort tritt IgM vorwiegend auf, wobei im weiteren Verlauf IgG, IgA bzw.
im Falle einer allergischen Immunreaktion IgE Antikörper den größten Anteil darstellen. Dieses
Phänomen wird als Isotypen – Klassenwechsel bezeichnet und beinhaltet eine DNA bedingte
Umstellung der Gene, die für die Synthese der konstanten Domänen der schweren
Polypeptidketten zuständig sind. Das heißt, es existieren unterschiedliche Isotypen mit der
gleichen Antigenspezifität, da die variablen Domänen unverändert bleiben. Gesteuert wird dieser
Prozess durch die T – Zellen und die Sekretion der entsprechenden Cytokine, wie z. B.
Interleukin – 4 (IL – 4), das die B – Lymphozyten auf die IgE Produktion umstellt. Das bereits
erwähnte IgG besitzt eine monomere Struktur und ist das am häufigsten im Blutserum
vorkommende Immunglobulin mit einem Anteil von 70 – 75%. IgG wird zudem in 4
17
Unterklassen aufgeteilt, die sich durch strukturelle Unterschiede im Aufbau der schweren
Polypeptidketten zueinander unterscheiden. Des Weiteren wird IgG als der wichtigste Antikörper
der Sekundärreaktion (Immunantwort) beschrieben, wobei die Unterklassen IgG1 sowie IgG3
plazentagängig sind und eine passive Immunisierung des Fötus bewirken. Der Antikörper IgA
stellt mit einem Blutserumanteil von 15 – 20% neben dem IgG das zweithäufigste
Immunglobulin im menschlichen Organismus dar und ist ebenfalls in Tränenflüssigkeit und
intestinalen Sekreten wie Speichel nachweisbar. Zudem ist IgA in der Lage, durch
Polymerisation Diamere zu bilden und verfolgt als hauptsächliches Ziel, die Anheftung von
Bakterien oder Viren an Epitheloberflächen zu verhindern, sodass eine Infektion humoraler
Zellen unmöglich bzw. eingeschränkt wird. Beim letzten Isotyp handelt es sich um den IgE
Antikörper, der bei allergischen Immunreaktionen involviert ist und bei Immunantworten
gegenüber Parasiten (z. B. Würmern) eine entscheidende Rolle spielt. Die schwere
Polypeptidkette dieses Antikörpers besitzt eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch die
Fcε – Region mit hoher Affinität an den Fcε – Rezeptoren auf den Mastzellen, basophilen
Granulozyten (enthalten Histamin, Heparin) sowie auf eosinophilen Granulozyten binden kann.
Zudem kann diese Bindung über mehrere Jahre aktiv bleiben, sodass bei der entsprechenden
Antigenaufnahme der Antigen – Antikörper – Komplex die Mastzelle zur Ausschüttung
allergieauslösender Stoffe, wie z. B. Histamin, veranlasst. [17] [19]
1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen
Im Allgemeinen existieren 4 Allergietypen, bei denen die spezifischen Immunreaktionen
entweder durch Antikörper (Allergietypen I – III) oder durch T – Zellen übertragen werden (Typ
IV – Allergie). Im Falle der Fischallergie, die zu den Typ I – Allergien zählt, wird die
Immunreaktion durch IgE Antikörper vermittelt. [23] Generell läuft die Entwicklung einer
Lebensmittelallergie (Soforttyp – I) in 2 Phasen ab, wobei die 1. Phase als Sensibilisierung und
die 2. Phase als Erhebung bzw. Effektorphase bezeichnet wird. Anhand von Abbildung 6 soll der
Prozess näher erläutert werden [17].
18
Abbildung 6: Entstehungsprozess einer IgE vermittelten Typ-I-Allergie (Probst, 2004,
S.279)
In der Sensibilisierungsphase kommt es zunächst zum 1. Kontakt zwischen den entsprechenden
Antigenen, meist einem natürlichen in der Nahrung vorkommenden Protein (Parvalbumin bei
Fisch) und den B – Lymphozyten. Die Antigene binden dabei zunächst an die auf der
Membranoberfläche der B – Lymphozyten befindlichen IgM/IgD Antikörper, wodurch der
Antigen – Immunglobulin – Komplex anschließend intern abgebaut wird. In Folge dessen
kommt es zur Bindung der Peptid Segmente an die entsprechenden MHC – Moleküle, sodass
diese präsentiert und durch die jeweiligen T – Helferzellen anhand des passenden Epitops
identifiziert werden. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass man in 2 Arten von T –
Helferzellen differenziert. Zum einen gibt es die Th1 CD4+ - Zellen, deren Eigenschaften die
Interferon – γ Ausschüttung sowie die IgG vermittelte Zerstörung intrazellulärer Bakterien und
Pilze ist. Des Weiteren sind durch Th1 – Zellen unangemessen ausgelöste Immunantworten die
Grundlage für die Entstehung von Typ – IV Allergien (z. B. Zöliakie). Andererseits gibt es die
Th 2 CD4+ - Zellen, die vorwiegend Interleukin (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) als Botenstoff
ausschütten und für die IgE vermittelte Zerstörung von Parasiten (Würmern) verantwortlich sind.
Diese Th 2 – Zellen sind ebenfalls einer der Hauptgründe für die Entstehung von IgE vermittelter
Lebensmittelallergien, da sie in der Sensibilisierungsphase die Isotypen – Umstellung der B –
Lymphozyten bewirkt. D. h. nachdem der T – Zell – Rezeptor an das MHC – Peptidsegment
(Antigenfragment) auf der B – Zelle gebunden hat, kommt es zur zusätzlichen Ausschüttung von
Th 2 Cytokinen (IL-4, IL-13). Dadurch erfolgt zunächst die Entwicklung der B – Zelle zur
19
Plasmazelle, die anschließend in der Lage ist, IgE – Antikörper zu produzieren. Demnach ist die
unangemessene Immunreaktion der Th 2 – Zellen gegenüber harmlosen Proteinen eine der
Hauptursachen für IgE vermittelte Lebensmittelallergien. Im weiteren Verlauf der
Sensibilisierungsphase kommt es zur Bindung des IgE – Antikörpers an den Fcε – Rezeptoren
auf den Mastzellen. Wie bereits unter Punkt 1.1.3 beschrieben, besitzen die Immunglobuline E
Fcε – Domänen sowie eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch eine hohe
Bindungsaffinität zum Mastzellenrezeptor (Fcε) besteht und daraus eine lange Bindungsdauer
resultiert. Die Bindung der IgE Antikörper an die Mastzellen bildet dabei den Abschluss der
Sensibilisierungsphase, wobei der menschliche Körper nun gegen diese Antigene sensibilisiert
ist. [17] Während dieser Phase treten in der Regel keine Symptome einer allergischen
Abwehrreaktion auf [4].
In der 2. Phase, auch als Effektorphase bezeichnet, kommt es im Falle einer erneuten
Antigenaufnahme zur Kreuzvernetzung zwischen den auf der Mastzelle befindlichen IgE –
Antikörpern und den spezifischen Antigenen, wobei das Antigen für eine erfolgreiche
Querverbindung an beide Epitope (linker-rechter Arm) des IgE – Antikörpers binden muss, um
eine ausreichende Mastzellstimulation zu erreichen [24]. Die Vernetzung bewirkt eine
Konformitätsänderung des Antigen – Antikörperkomplexes, wodurch Calcium-Ionen in die
Mastzelle strömen und diese dadurch aktiviert wird. In Folge dessen tritt die exocytotische
Freisetzung (Degranulation) der Mediatoren, die in den Granula der Mastzellen gespeichert sind,
ein. Bei diesen Mediatoren bzw. Botenstoffen handelt es sich vorwiegend um Histamin,
Serinproteasen, Proteoglykane, Leukotricine und Serotonin. Innerhalb der Degranulation binden
die Proteoglykane ionisch an das Histamin und die Serinproteasen, wodurch eine kristalline
Struktur entsteht, die eine erhöhte Löslichkeit aufweist (solubilisiert). Die Freisetzung der
Mediatoren erfolgt in kürzester Zeit nach dem Kontakt zwischen Antigen und IgE – Antikörper
und bewirkt im Organismus die Auslösung schwerwiegender allergischer Symptome. Histamin
ist dabei für Bronchokonstriktion (Verengung der Atemwege), Schleimsekretion, Vasodilatation
(Erweiterung der Blutgefäße), Juckreiz, Nesselsucht sowie Gewebeschwellungen durch
Wassereinlagerungen (Ödem) verantwortlich, wobei im schlimmsten Fall ein anaphylaktischer
Schock ausgelöst werden kann. [17] Leukotricine hingegen zählen zu den Mediatoren, die
allergische Symptome langsamer entwickeln lassen, wie z. B. verzögerte asthmatische
Reaktionen [4]. Letztendlich ist die Ausprägung allergischer Symptome hauptsächlich von der
Antigenmenge, der IgE – Konzentration im Körper und der Bindungsaffinität des Antigens
abhängig [17].
20
1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin
Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergenen um Substanzen, die mit IgE –
Antikörpern reagieren, eine allergische Sensibilisierung sowie eine allergische Immunantwort
hervorrufen. Letztendlich müssen alle 3 Kriterien durch das Allergen erfüllt werden, sodass die
Bezeichnung „komplettes Allergen“ zutrifft. Im Gegensatz dazu handelt es sich um
„unvollständige Allergene“, wenn die Kriterien lediglich zum Teil erfüllt werden. Dabei
unterscheidet man in „Nicht – Allergieauslöser“, die lediglich mit IgE – Antikörpern reagieren
ohne eine allergische Sensibilisierung oder Immunreaktion auszulösen, und in „Nicht –
Sensibilisierungsauslöser“, die ebenfalls mit IgE – Antikörpern reagieren, jedoch eine allergische
Immunreaktion auslösen, ohne selbst am Sensibilisierungsvorgang beteiligt zu sein. Im Falle der
1. Gruppe („Nicht – Allergieauslöser“) weisen einige pflanzliche und tierische Glykoproteine die
Eigenschaft auf, mit auf den Mastzellen befindlichen IgE – Antikörper zu reagieren, jedoch
bleibt eine Stimulation (Degranulation) der Mastzellen aus, da sie auf Grund ihres monovalenten
Charakters lediglich mit einem Epitop der IgE – Antikörper reagieren und letztendlich keine
Kreuzvernetzung der IgE – Rezeptoren bewirken. Glykoproteine werden auch als Hapten –
Träger – Komplexe bezeichnet, wobei Haptene Substanzen darstellen, die lediglich mit einem
entsprechenden Protein – Trägermolekül allergieauslösend sind. Im Gegensatz dazu sind bei der
2. Gruppe („Nicht – Sensibilisierungsauslöser“) Substanzen durch Kreuzreaktivität in der Lage,
allergische Immunreaktionen zu bewirken, ohne vorher selbst eine IgE – Produktion zu
induzieren. Zum Beispiel existiert eine Kreuzreaktivität zwischen dem Birkenpollenallergen und
dem Apfelallergen. Das Pollenallergen löst dabei den Sensibilisierungsprozess im Organismus
aus, sodass IgE – Antikörper durch Plasmazellen produziert werden. Demnach kommt es bei der
Aufnahme des Apfelallergens zur Kreuzreaktivität zwischen den Bindungsstellen der IgE –
Antikörper auf den Mastzellen und denen des Allergens auf Grund ähnlicher bzw. identischer
Eigenschaften der Epitope vom Pollenantigen und Apfelantigen. In Folge dessen wird die
Degranulation der Mastzelle hervorgerufen und diese initiiert eine allergische
Immunreaktion. [24]
Das Fischallergen Parvalbumin erfüllt die Kriterien eines „kompletten Allergens“ und ist
demnach in der Lage, den Sensibilisierungsprozess sowie die Immunreaktion beim 2. Kontakt
auszulösen [24]. Parvalbumin gehört zur Klasse der tierischen Lebensmittelallergene, im
Speziellen zu den Calcium-bindenden EF – Hand – Proteinen, wobei EF – Hand für eine
spezifische Proteindomäne (Aminosäuresequenz) steht [4]. Auf Grund dieser Struktureigenschaft
besitzt Parvalbumin eine hohe Affinität gegenüber Ca2+ und Mg+. Insbesondere im weißen
Muskelfleisch niederer Wirbeltiere, wie z. B. im Kabeljau, Seelachs oder Flunder, kommt
21
Parvalbumin in höheren Mengen vor. Im Gegensatz dazu tritt Parvalbumin im dunklen (roten)
Muskelfleisch, wie z. B. im Thunfisch oder Schwertfisch, oder in der Skelettmuskulatur höherer
Wirbeltiere in geringeren Konzentrationen auf, sodass im Falle der genannten Fischarten ein
geringeres allergisches Potential besteht. Des Weiteren ist Parvalbumin insbesondere am Prozess
der Muskelentspannung beteiligt, da es Ca2+ Ionen zwischenspeichert und von den Myofibrillen
(Funktionseinheit in Muskelzelle) zum Sarkoplasmatischen Retikulum transportiert. Dort erfolgt
die Speicherung der Ca2+ Ionen, sodass beim Eintreffen eines Aktionspotenzials die Ionen erneut
in die Myofibrillen diffundieren und die Muskelkontraktion auslösen. [10] Generell ist die
Parvalbuminstruktur in verschiedenen Fischarten sehr ähnlich bzw. als homolog anzusehen,
sodass eine Kreuzreaktivität der IgE – Antikörper gegenüber unterschiedliche Fischarten besteht.
Zudem wurde festgestellt, dass sich die Parvalbumin Isotypen unter den Fischen einer Art
unterscheiden, wobei diese differenzierte Expression der Parvalbumin Isotypen auf die
entsprechenden physiologischen Anforderungen während der Wachstumsphase zurückzuführen
ist. [25] Anhand von Abbildung 7 soll die Parvalbuminstruktur, insbesondere das EF – Hand –
Motiv, näher erläutert werden.
Abbildung 7: Karpfenparvalbumin mit 2 Calcium-bindenden Seiten (lila markiert)
(Breiteneder, 2005, S. 16)
22
Wie bereits im Vorfeld erwähnt, gehört Parvalbumin zur Calcium – bindenden Proteinfamilie der
EF – Hand. Hinter dieser Bezeichnung verbirgt sich der strukturelle Aufbau einer Calcium –
bindenden Domäne die aus 2 α – Helix besteht, die über eine β – Schleife (Calcium – bindend)
miteinander verbunden sind. Dabei stellt das EF – Hand – Motiv, auch als Helix – Turn – Helix
– Motiv (HTH) bezeichnet, ein sekundäres Proteinstrukturelement dar. Des Weiteren handelt es
sich bei den EF – Hand Proteinen um die ersten intrazellulären Calcium – bindenden Proteine,
die identifiziert und charakterisiert worden sind, zumal neben Parvalbumin ebenfalls Troponin C
(in Skelett – und Herzmuskel), Calbindin (Transportprotein) oder die Leichte – Myosinkette
(Motorprotein z. Bewegungserzeugung) in diese Kategorie gehören. [26] Das Fischallergen
Parvalbumin setzt sich aus 3 EF – Hand – Motiven zusammen, wobei 2 dieser Motive
(Motivdomänen) Calcium – bindend und in Abbildung 7 lila gefärbt sind. Das 3. EF – Hand –
Motiv im Parvalbumin stellt eine „inaktive Domäne“ dar, die eine Art Schutzkappe bildet und
die hydrophobe Oberfläche der beiden aktiven Domänen abdeckt. Auf Grund seiner Struktur und
den daraus resultierenden chemischen Eigenschaften weist das Fischallergen eine hohe Resistenz
gegenüber Hitze, chemischer Denaturierung sowie proteolytischem Enzymabbau auf. [27]
Außerdem wurde festgestellt, dass Parvalbumin selbst nach Hitzeeinwirkungen von 90°C seine
Struktur nur teilweise verliert bzw. die Strukturveränderung reversibel ist, sodass das allergische
Potenzial bestehen bleibt. Besonders für von einer Fischallergie betroffene Allergiker ist dieser
Umstand sehr kritisch, da es keine effiziente Möglichkeit gibt, Parvalbumin vollständig zu
inaktivieren. [28] Des Weiteren besitzt Parvalbumin ein geringes Molekulargewicht zwischen 10
– 12 kDa, weist eine hohe Wasserlöslichkeit auf und der Isoelektrische Punkt liegt im Bereich
3,9 (Karpfen) – 6,6 (Lungenfisch) [10] [26].
1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen
Allergiker müssen bei der Nahrungsaufnahme darauf achten, dass die von ihnen verzehrten
Produkte keine Lebensmittelallergene enthalten, da bereits geringe Spuren der entsprechenden
Substanzen lebensbedrohliche Immunreaktionen auslösen können. Im Fall einer Fischallergie
haben Untersuchungen ergeben, dass bereits Immunreaktionen bei 1 mg Fischprotein / kg
Nahrungsmittel verursacht werden, wobei die allergieauslösenden Proteinkonzentrationen unter
Allergikern stark schwanken (1mg/kg – 100mg/kg), da genetische und physiologische Faktoren
einen signifikanten Einfluss darauf haben [29]. Demnach sind Allergiker bei der
Lebensmittelauswahl auf die eindeutige Kennzeichnung von allergenenthaltenden Lebensmitteln
23
durch die Lebensmittelhersteller angewiesen, wobei die rechtlichen Grundlagen durch den
Gesetzgeber bestimmt werden müssen.
Die Grundlage für die Kennzeichnung von Lebensmitteln bildet die Richtlinie 2000/13/EG vom
20. März 2000 „zur Angleichung der Rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über die
Etikettierung und Aufmachung von Lebensmitteln, sowie die Werbung hier“. Des Weiteren wird
die Allergenkennzeichnung durch diese Richtlinie und insbesondere durch die entsprechenden
Änderungen in den Richtlinien 2003/89/EG vom 10.11.2003, 2006/142/EG vom 22.12.2006 und
2007/68/EG vom 27.11.2007 geregelt. Im Anhang IIIa der Richtlinie 2003/89/EG wurden 12
Produktgruppen aufgelistet, die eine allergische Immunreaktion auslösen, weshalb diese
Produkte sowie die daraus hergestellten Lebensmittel kennzeichnungspflichtig sind. Im weiteren
Verlauf wurden diese Produktgruppen in der Richtlinie 2006/142/EG um die Gruppen Lupine
und Weichtiere (Krebstiere) ergänzt, wobei diese im Anhang IIIa der Richtlinie 2007/68/EG
aufgeführt werden und ebenfalls als kennzeichnungspflichtig einzustufen sind. Die von der EU
erlassenen Richtlinien mit den jeweiligen Vorgaben wurden in die deutsche
Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV) aufgenommen. Damit ist die Allergenkenn-
zeichnung für die Lebensmittelindustrie seit 2005 gesetzmäßig festgelegt. Dadurch soll der
Verbraucherschutz erhöht und insbesondere Personen, die an einer Lebensmittelallergie bzw.
Lebensmittelunverträglichkeit leiden, besser über Produktinhaltsstoffe informiert werden. [9]
Problematisch ist jedoch, dass es keine gesetzlichen Grenzwerte für Allergene der 14
Produktgruppen gibt, Gluten (20 mg/kg) und Sulfit (10 mg/kg) ausgeschlossen, da die
wissenschaftlichen Daten zu allergieauslösenden Lebensmitteln noch unzureichend sind, um
fundierte Schwellenwerte zu definieren. Diesbezüglich wurden durch das BfR und MRI
verschiedene internationale Modelle, wie z. B. das australische VITAL – Konzept oder das
ECARF – Konzept, hinsichtlich der Festlegung von Schwellenwerten zur Allergenkenn-
zeichnung überprüft und als unzureichend bewertet, da die wissenschaftliche Datenlage derzeit
nicht ausreicht und demnach weitere Forschungen notwendig sind. Im Falle einer zwingend
erforderlichen Festlegung von vorläufigen Schwellenwerten empfiehlt das BfR und MRI nach
derzeitiger wissenschaftlicher Lage einen allergenspezifischen Bereich von 0,01% - 0,001%
allergener Inhaltsstoff pro fertigem Lebensmittel zu definieren. [29]
Eine weitere Problematik sind Kreuzkontaminationen im Herstellungsprozess, z. B. durch den
Einsatz kontaminierter Rohstoffe oder durch Verschleppung auf Grund unzureichender
Reinigungsmaßnahmen, nicht in den Richtlinien berücksichtigt worden. Generell sind
Kreuzkontaminationen nach heutigem Stand der Technik bei der industriellen Herstellung nicht
vermeidbar, wodurch der Hersteller keine 100% allergenfreien Produkte deklariert, sofern eine
24
Kreuzkontamination bei den jeweiligen Produkten nicht ausschließbar ist. Z. B. sind geringe
Spuren von Nüssen in Vollmilchschokolade nicht auszuschließen, wenn in dem Betrieb
Schokoladenprodukte mit Nüssen hergestellt werden. Deshalb gibt es auf vielen Packungen die
freiwilligen und vorsorglichen Warnhinweise „Kann Spuren von…enthalten“ oder „Spuren:…“,
sodass letztendlich die rechtliche Haftung des Produzenten beschränkt wird. Grund dafür ist,
dass der Lebensmittelhersteller für fehlerhafte oder falsche Allergenkennzeichnungen auf
Verpackungen, die eine Gesundheitsschädigung des Verbrauchers zur Folge haben, haftet,
soweit der Verbraucher die Kennzeichnungsfehler beweisen kann. Rechtlich relevant ist in
diesem Falle das Produkthaftungsgesetzt, insbesondere §3 Abs. 1 a, der Produktfehler im Sinne
der fehlerhaften Darbietung einer Allergenkennzeichnung beinhaltet, zu denen auch
Warnhinweise zählen, die nicht den gesetzlichen Anforderungen entsprechen. [9] Dabei spielt
insbesondere die aktuelle EU – Verordnung Nr. 1169/2011 vom 22.11.2011 eine entscheidende
Rolle, da sie die Allergenkennzeichnung auf europäischer Ebene neu regelt, wobei z. B.
allergieauslösende Inhaltsstoffe im Zutatenverzeichnis besonders hervorgehoben werden müssen
(z. B. durch Schriftart oder Farbe). Zudem muss zukünftig auch unverpackte Ware (z. B.
Bedienthekenbereich) entsprechend gekennzeichnet werden. [30] Grundsätzlich meiden
Allergiker jedoch Verpackungen, die mit entsprechenden Warnhinweisen gekennzeichnet sind,
zumal die vorsorgliche Deklaration durch die Hersteller steigt. Einerseits wird dadurch die
Auswahl an Lebensmitteln für betroffene Personen immer geringer und andererseits verliert die
Industrie potentielle Käufer für ihre Produkte, wodurch Umsatzeinbußen entstehen. [9]
1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren
1.2.1 Allgemein
Zur Kategorie der immunologischen Testverfahren zählen, neben dem LFA, auch ELISA oder
die SPR Biosensoren (SPR Immunoassay). Im Allgemeinen basieren diese Testverfahren auf der
Wechselwirkung zwischen einem selektiven Antikörper und dem jeweiligen Zielanalyten
(Antigen), wobei diese zusammen einen Antigen – Antikörper – Komplex bilden. Die
immunologische Reaktion kann dabei z. B. über Enzymmarkierungen (Meerrettichperoxidase,
alkalische Phosphatase) im Fall des ELISA – Verfahrens oder durch Radionuklide (I125) im Fall
des radioimmunologischen Verfahrens sichtbar gemacht werden. Neben den genannten
Markierungsmöglichkeiten existiert eine Vielzahl weiterer Visualisierungsmethoden, wie z. B.
Fluoreszenzpolarisation, Chemolumineszenz oder elektrochemische Detektionsmethoden
(Impedanzmessung) im Fall von SPR – Biosensoren. Grundsätzlich unterscheidet man die
25
immunologischen Verfahren in heterogene und homogene Immunassays. Bei den heterogenen
Analyseverfahren wird ein Immunreagenz auf einer Festphase, wie z. B. Latexkugeln,
Magnetpartikeln, Mikroplatten, Teströhrchen oder Filterpapier, immobilisiert und anschließend
erfolgt durch einen Waschschritt die Trennung gebundener und freier Reagenzien. Im Gegensatz
dazu findet die Immunreaktion bei homogenen Immunassays in Lösung statt, wodurch kein
weiterer Waschschritt notwendig ist. Die Störanfälligkeit der homogenen Reaktion ist jedoch auf
Grund von Matrixinterferenzen höher. [31]
Die einzigartige Charakteristik der immunologischen Testverfahren wird durch 3 entscheidende
Antikörpereigenschaften geprägt. Eine dieser Eigenschaften ist die hohe Bindungsspezifität des
Antikörpers gegenüber den jeweiligen Antigenen, sodass in Anwesenheit verschiedener
Substanzen die Zielanalyten selbst in sehr geringen Konzentrationsbereichen
(10-12 [pg]) detektierbar sind. Zudem existiert zwischen Antikörpern und Antigenen eine hohe
Bindungsstärke (nicht – kovalente Bindung), die dazu beiträgt, dass die gebildeten Komplexe die
Signalentwicklung bzw. das Testverfahren überstehen und demnach sehr präzise im niedrigen
Konzentrationsbereich gearbeitet werden kann. Zusätzlich ist das weite Bindungsspektrum der
Antikörper sehr vorteilhaft, da diese in der Lage sind, an die unterschiedlichsten Chemikalien
(natürliche/künstliche), Biomoleküle, Zellen oder Viren zu binden. Auf Grund dieser Tatsachen
ist die Bindungskinetik von Antikörper – Antigen Wechselwirkungen für die
immunchromatographischen Testverfahren sehr wichtig, da sie ausschlaggebend für die
Entwicklung effizienter Analyseverfahren ist. Dabei beeinflussen verschiedene Faktoren, wie z.
B. der pH – Wert, Temperatur, Reaktionszeit oder Pufferkonzentration (Ionenstärke) diese
Gleichgewichtsreaktion. [22]
Im Allgemeinen sind für analytische Methoden, insbesondere bei denen, die für den Nachweis
gesundheitsschädigender Substanzen in Lebensmitteln eingesetzt werden, z. B. zum Nachweis
von Allergenen, Pestiziden oder Mykotoxinen, die aufgeführten Faktoren essentiell:
zufriedenstellende Sensitivität - Detektionsbereich mg/kg - μg/kg
ausreichende Spezifität - Detektion in komplexen Matrizen
schnelle Detektion - kurze Analysezeit
einfache Handhabung - keine Fachleute notwendig
Die existierenden immunologischen Testverfahren erfüllen die Anforderungen zum großen Teil,
jedoch ist insbesondere der Faktor der einfachen Handhabung problematisch, da sehr häufig
geschultes Fachpersonal zur Durchführung notwendig ist. Im Fall von forschungsunabhängigen
26
Anwendungen also für den „Heimgebrauch“ oder für industrielle Anwendungszwecke („Vor –
Ort – Schnelltests, z. B. zur Verbesserung des Verbraucherschutzes oder zur Einhaltung der
Qualitätsanforderungen, sind viele immunologische Testverfahren ungeeignet. [4]
1.2.2 Lateral Flow Assay
Das immunchromatographische Testverfahren Lateral Flow Assay erfüllt die im Vorfeld
aufgeführten Anforderungen und zeichnet sich zusätzlich durch eine hohe Zuverlässigkeit und
geringe Kosten aus. Grundsätzlich basiert das LFA – Verfahren auf spezifischen
Wechselwirkungen zwischen Antikörper – Antigen, wobei die Visualisierung des
Testergebnisses über den Einsatz von Markern realisiert wird. Dabei handelt es sich vorwiegend
um farbige oder fluoreszierende Nanopartikel, wie z. B. kolloidales Gold, Latex, Karbon oder
Liposome. Letztendlich handelt es sich beim LFA um Teststreifen, die aus einem Trägermaterial
bestehen, auf dem verschiedene Antikörper (sAK, pAK, IgG) immobilisiert sind, wobei der
Teststreifen durch das Auftragen der flüssigen Probe aktiviert wird. Die LFA – Methode wird für
qualitative sowie semiquantitative Nachweise als Vor – Ort – Schnelltest in vielen
Einsatzbereichen angewendet, wie z. B. zum Nachweis von Pathogenen, Hormonen
(Schwangerschaftstest), Drogen, Metaboliten in der Medizin oder Allergenen (Erdnussprotein
etc.) in der Lebensmittelbranche. [32]
27
2. Material & Methoden
2.1 Chemikalien & Equipment
Für die Experimente zur Entwicklung eines LFA zum Nachweis von Fischallergenen werden die
im Anschluss aufgeführten Chemikalien und Geräte verwendet.
2.1.1 Chemikalien
Zur Herstellung der jeweiligen Pufferlösungen werden die folgenden Reagenzien verwendet:
Sodium tetraborate, Lot. A0237931, ACROS Organics, USA
Natriumhydrogenphosphat, Lot. A925646638, Merck, Germany
Di – Natriumhydrogenphosphat, Lot. F529186905, Merck, Germany
Natriumchlorid, Lot. 161169881, Carl Roth GmbH, Germany
Natronlauge 0,1 M, Lot. 0638/08/10, Carl Roth GmbH, Germany
Bei der Herstellung aller weiteren benötigten Lösungen werden folgende Chemikalien
eingesetzt:
Succrose, Lot. 1260903, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland
Dextran 35, Lot. 3707873, Carl Roth GmbH, Germany
BSA (further purified fraction V), Lot. 027K0740, SIGMA –Aldrich Inc., USA
Casein Sodium Salt, Lot. 10K0198, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,
Switzerland
Tween 20, Lot. BCBF7669V, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland
Polyvinylpyrrolidone (PVP), Lot. 013K0049, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,
Switzerland
Natriumazid, Lot. 25358170, Carl Roth GmbH, Germany
Kaliumcarbonat, Lot. A258946657, Merck, Germany
Kolloidale Goldlösung ø 40 nm (OD 1,1), Lot. 8818, BB International, UK
Bradford Reagent, Lot. 116K433J, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland
28
2.1.2 Puffer & Lösungen
Während der Experimente werden die aufgeführten Pufferlösungen verwendet:
5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)
100 mM PBS (pH 7,4)
40 mM PBS (pH 7,4)
100 mM PB (pH 7,4)
10 mM PB (pH 7,0)
Für die Herstellung des 5 mM Boraxpuffers (pH 9,0) wird Sodium tetraborate in destilliertem
Wasser gelöst und anschließend der pH – Wert mit 0,1 M Natronlauge auf 9,0 eingestellt. Die
Herstellung des 100 mM PBS (pH 7,4) erfolgt durch das Mischen von Natrium-
hydrogenphosphat und Di – Natriumhydrogenphosphat. Dabei werden zunächst separat 13,9 g
des einbasischen Natriumhydrogenphosphats in 500 ml destilliertem Wasser und 28,4 g des
zweibasischen Di – Natriumhydrogenphosphats in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst.
Anschließend werden 600 ml destilliertes Wasser mit 48 ml einbasischer Lösung und 252 ml
zweibasischer Lösung kombiniert, sodass 100 mM PB (pH 7,5) entsteht. Durch die Zugabe von 8
g NaCl auf 1000 ml PB (pH 7,5) bildet sich 100 mM PBS (pH 7,4). Bei der Herstellung des 10
mM PB wird zunächst 100 mM PB (pH 7,0) durch das Mischen von 600 ml dest. Wasser mit
117 ml einbasischer Lösung und 183 ml zweibasischer Lösung hergestellt. Anschließend erfolgt
die Verdünnung mit Reinstwasser auf 10 mM PB (pH 7,0). Alle hergestellten Pufferlösungen
werden mit Filterpapier (ø 0,45 μm, Schleicher & Schnell, Lot.: DC 0406-1) gefiltert.
Während der Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats werden die aufgeführten
Lösungen verwendet:
100 mM Kaliumcarbonatlösung (pH 11,2) in Reinstwasser
10% BSA in 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)
Des Weiteren werden die folgenden Lösungen zur Vorbehandlung der einzelnen LFA –
Komponenten eingesetzt:
Membranblocker:
o 5% Succrose in 10 mM PB – Puffer (pH 7,0)
o 1% BSA in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)
o 1 % PVP in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)
29
o 2% Casein in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)
Konjugatpad:
o 0,5% Casein + 0,5 % Tween 20 in 100 mM PBS (pH 7,4)
o 0,5 % BSA + 0,2% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4)
o 5% Succrose + 1% BSA + 0,5% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4)
Sample Pad:
o 5% Succrose + 5 % Dextran + 0,5% Tween 20 + 0,05% Natriumazid
2.1.3 Antikörper
Es werden für die Untersuchungen monoklonale Antikörper eingesetzt, die gegen Parvalbumin
aus Kabeljau gerichtet sind. Die Antikörper werden bereits aufgereinigt von der BIOMETEC
GmbH Greifswald bezogen. Dabei handelt es sich um die aufgeführten monoklonalen
Antikörper:
Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
Wi 11 – 3D12G7 [1,9 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111
Außerdem wird der polyklonale Antikörper für die Experimente verwendet:
Host: Goat – Anti [2 mg/ml]
Antigen: Mouse IgG (H+L)
Label: unconjugated
Lot. OE1714962, Thermo Scientific, IL61101, USA
2.1.4 Fischproben
Die Fischproteine werden aus tiefgefrorenem Kabeljau (Lot. L161/3), Alaska Seelachs (Lot.
417/3B) und Hering isoliert. Der Fisch stammt von Frigofood International Sarl 27, Luxemburg.
2.1.5 LFA – Komponenten
Für die Durchführung des Lateral Flow Assay werden die im Anschluss aufgeführten
Komponenten eingesetzt, wobei alle Materialen von der Millipore – Corporation, Bedford, MA
01730, USA, stammen:
30
Membran:
o HIFLOW Plus 75 Membran; Lot. 0035621
o HIFLOW Plus 090 Membran; Lot. R2PN90542
o HIFLOW Plus 138 Membran; Lot. R2PN90535
o HIFLOW Plus 180 Membran; Lot. R2PN90535
o HIFLOW Plus 240 Membran; Lot. 0050819X07081
Konjugatpad:
o Glass Fiber Conjugate Pad; Lot. 92083401
Sample Pad:
o Cellulose Fibre Sample Pad; Lot. 92054701
Absorbentpad:
o Absorbent Pad GF/DVA 17 x 300 mm; Lot. 580896-2
o Absorbent Pad CF6 27 x 300 mm; Lot. 655959-1
2.1.6 Geräte
Während der Durchführung der Experimente kommen die nachfolgend aufgeführten
Gerätschaften zum Einsatz:
Horizontal – Schüttler (Heidolph Polymax 1040)
Spektralfotometer (1510 Thermo Scientific Multiskan Go)
Laborzentrifuge (3K30 SIGMA)
Trockenschrank (Heraeus Instruments UT 20)
Reinstwassersystem Clear UV Plus (SG Wasseraufbereitung & Regenerierstation)
Vortexer (Heidolph Reax top)
Magnetrührer (Variomag)
pH – Meter (pH 720 WTW Series inoLab)
Waage (BP210S Sartorius)
Universal – Zerkleinerer (KRUPS, Speedy Plus Universal Zerkleinerer)
2.2 Lateral Flow Assay
Die immunchromatographische Methode Lateral Flow Assay wird, wie bereits unter Punkt 1.2.2
beschrieben, auf Grund seiner positiven analytischen und praktikablen Eigenschaften in vielen
Anwendungsgebieten eingesetzt. Insbesondere in der Lebensmittelindustrie weckt die Methode
31
erhöhtes Interesse, da sie als Vor – Ort – Schnelltest zur Erstuntersuchung von Chargen auf
Kontaminationen (Allergene, Toxine) eingesetzt werden kann. [33]
2.2.1 Aufbau
Ein Lateral Flow Assay setzt sich generell aus 5 unterschiedlichen Komponenten zusammen, die
für die korrekte Funktionalität genau aufeinander abgestimmt sein müssen. Bei den 5
Komponenten handelt es sich um:
1. Sample Pad
2. Konjugatpad
3. Membran
4. Test – und Kontrolllinie
5. Absorbentpad
Anhand von Abbildung 8 soll der allgemeine Aufbau eines LFA – Teststreifen dargestellt und
die Funktionen der einzelnen Komponenten näher erläutert werden. [4]
Abbildung 8: Aufbau eines LFA - Teststreifen (www.rapid-diagnostics.org, 05.08.2013)
Das Sample Pad befindet sich über dem Konjugatpad, besteht aus einem papierartigen Material
und dient zur Probenfilterung, d. h. es soll sämtliche Feststoffe (Lebensmittelpartikel etc.)
zurückhalten, die einen negativen Einfluss auf die Kapillarkräfte ausüben [4]. Des Weiteren
dient das Sample Pad als Zwischenspeicher für die Probe, um diese zum Konjugatpad zu
befördern und dort gleichmäßig zu verteilen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass Sample
Pad mit verschiedenen Substanzen, wie z. B. Proteinen, Tensiden, Puffern oder Zuckern, zu
32
behandeln, um die Flussrate (Flow) zu beeinflussen. Derartige Behandlungen bewirken eine
Verbesserung der Probenviskosität oder der Reaktionszeit zwischen Zielanalyten (Antigenen)
und dem Antikörper – Nanogoldkomplex auf dem Konjugatpad. [32]
Ein weiterer Bestandteil des LFA ist das Konjugatpad (Conjugate Pad), welches sich unterhalb
des Sample Pads befindet und ca. 2 mm überlappend auf der Membran (Nitrocellulose
membrane) ist. Das Konjugatpad besteht aus fiberglasartigem Material, auf das der markierte
sekundäre Antikörper (Antikörper – Konjugat) aufgetragen wird. Dabei kann das Auftragen des
Konjugats entweder über Sprühen erfolgen, was eine wohldefinierte und reproduzierbare
Konjugatmenge pro mm² ergibt, oder durch „Baden“ geschehen, was eine unkontrollierte
Konjugatmenge pro mm² bewirkt und Intensitätsschwankungen der Test – und Kontrolllinie zur
Folge haben kann. [4] Als Antikörper – Marker (Label) wird hauptsächlich kolloidales Gold
eingesetzt, gefolgt von gefärbten Latexpartikeln. Außerdem kommen gefärbte Karbon – oder
Selenpartikel zum Einsatz, wobei chemilumineszierende oder fluoreszierende Nanopartikel
selten verwendet werden. Die kolloidale Stabilität der Nanopartikel in Lösung spielt eine
entscheidende Rolle für die Funktionalität des LFA – Teststreifens. Diese wird erreicht, indem
die Antikörper auf der Oberfläche der Nanogoldpartikel binden. [32] Die Ursache dafür ist, dass
Proteine, insbesondere Antikörper, dazu in der Lage sind, an der Oberfläche der kolloidalen
Goldpartikel (Nanopartikel) stark zu adsorbieren, sodass stabile Konjugate gebildet werden
können, wobei die Antikörper (Proteine) ihre biologischen Eigenschaften behalten. Die
Proteinadsorbtion an der Goldoberfläche ist eine nicht kovalente Bindung, die einerseits auf
ionischen Wechselwirkungen zwischen negativ geladenen Nanopartikeln und positiv geladenen
Proteinstellen basiert und andererseits durch hydrophobe Anziehungskräfte zwischen dem
Protein und der Metalloberfläche zu Stande kommt. Des Weiteren haben koordinative
Bindungen zwischen dem Metall und den leitfähigen Stickstoff – und Schwefelatomen der
Antikörper (Proteine) einen Einfluss auf die Ausprägung der nicht kovalenten Bindung. Die
Problematik bei den sogenannten Biokonjugaten (Nanopartikel – Protein) ist, dass diese auch an
anderen Systembestandteilen bzw. Stoffen mit hoher Affinität adsorbieren können und dadurch
unerwünschte Bindungen (nicht spezifisch) eingehen. Auf Grund dieser Tatsache werden die
Biokonjugate zusätzlich mit „trägen“ (inerten) Makromolekülen, wie z. B. BSA (Bovine Serum
Albumin), Gelatine oder Polyethylen Glykol, nach der Adsorption der Antikörper (Proteine)
stabilisiert. [34] Weitere wichtige Faktoren für die Konjugatbildung sind die
Pufferzusammensetzung, Pufferstärke und der pH – Wert der Lösung sowie die Größe der
Nanopartikel, im Falle von kolloidalem Gold 15 – 40 nm [32].
33
Die Membran ist die zentrale Komponente des LFA und stellt mit den wichtigsten Teil des
immunchromatographischen Systems dar, da einerseits auf ihr die Test – und Kontrolllinie
immobilisiert sind und andererseits ihre Materialeigenschaften die Signalerzeugung maßgebend
beeinflussen. Auf Grund seiner positiven Eigenschaften wird vorwiegend Nitrozellulose als
Membranmaterial eingesetzt, wobei auch andere Materialen, wie z. B. Nylon, Polyethersulfon
oder Polyethylen zum Einsatz kommen. Eine der vorteilhaften Eigenschaften von Nitrozellulose
ist das hohe Vermögen, Proteine (Antikörper) zu adsorbieren. Zunächst sind Wechselwirkungen
zwischen den Nitrogruppen (funktionelle Gruppe -NO2) des Polymers und den Carbonylgruppen
(funktionelle Gruppe –CO) der Peptidbindung (Protein) ausschlaggebend für die anfängliche
Anziehungskraft. Die Adsorption wird anschließend über weitere Wechselwirkungen zwischen
der Nitrozellulose und den hydrophoben Proteindomänen verstärkt. Im Fall vom IgG –
Antikörper (Kontrolllinie) beträgt die Bindungskapazität z. B. 100 μg/cm², was sehr hoch ist, da
in der Regel lediglich 1 – 2 μg/cm aufgetragen werden. Zusätzlich erhält die Nitrozellulose-
membran die biologische Aktivität der gebundenen Proteine über einen langen Zeitraum, wobei
diesbezüglich Pufferzusammensetzungen einen größeren Einfluss haben. Ein weiterer Vorteil
von Nitrozellulosemembranen sind die Oberflächeneigenschaften, da diese sehr glatt
(geschmeidig) sind und deshalb die Antikörper der Test – und Kontrolllinie sehr gut aufgetragen
werden können. Hingegen bewirken raue Strukturen ein unregelmäßiges Auftragen der Linien
auf die Membranoberfläche, sodass eine ungleichmäßige Signalerzeugung während des Tests die
Folge sein kann. In der Regel wird das Membranmaterial auf Grundlagen bestehend aus
Polypropylen, Polyethylen oder Polystyrol zur Verbesserung der Stabilität und Festigkeit
geklebt. Die jeweilige Grundlage hat jedoch keinen Einfluss auf die Reaktionen während der
LFA – Durchführung. [35] Ausschlaggebend für die kapillare Fließgeschwindigkeit (s/cm)
sprich die Zeit, welche die Flüssigkeitsfront (Probe – Antikörper – Konjugat) benötigt, um sich
im Membranmaterial zu bewegen, ist die Porengröße. Diese beeinflusst maßgeblich die
Reaktionszeit und somit auch die Sensitivität des Tests [4].
Die Test – und Kontrolllinie sind auf der Membran immobilisiert, wobei die Testlinie vor der
Kontrolllinie positioniert wird. Bei der Testlinie handelt es sich um den primären Antikörper
(Fänger – Antikörper), der lediglich die Zielanalyten (Antigene) bindet bzw. detektiert, die am
sekundären Antikörper (goldmarkierter Antikörper) gebunden sind. Die Positionierung der
Testlinie auf der Membran beeinflusst die Leistungsfähigkeit des LFA – Tests, da eine weitere
Entfernung der Testlinie vom Sample Pad / Konjugatpad eine längere Reaktionszeit für die
Bildung des Antigen – Antikörper (sekundärer) – Nanogoldkomplexes zur Folge hat. Dabei ist
zu beachten, dass die Fließgeschwindigkeit mit zunehmender Distanz abnimmt. Die
34
Kontrolllinie stellt ebenfalls einen Antikörper dar, in der Regel einen IgG – Antikörper, der
sämtliche Proteinmoleküle, wie z. B. den goldmarkierten sekundären Antikörper, bindet.
Demnach wird anhand der Kontrolllinie die Funktionalität des LFA überprüft. Die letzte
Komponente eines LFA ist das Asorbentpad, welches am Ende des Teststreifens, ca. 2 mm
membranüberlappend, positioniert ist und den Abtransport der Flüssigkeit übernimmt. Deshalb
besteht es hauptsächlich aus mehrschichtiger Cellulose mit einer hohen Saugfähigkeit, sodass
viel Feuchtigkeit durch die Kapillarwirkung aufgenommen werden kann. Durch das
Vorhandensein eines Absorbentpads kann ein höheres Probenvolumen eingesetzt werden,
wodurch sich die Sensitivität verbessert. [32]
2.2.2 Funktionsprinzip
Beim LFA existieren grundsätzlich 2 Funktionsprinzipien, die je nach Anwendungsbereich
eingesetzt werden. Das erste Prinzip wird als Kompetitiver LFA bezeichnet, bei dem sich die
Signalentwicklung verschlechtert, je höher die Konzentration der Zielanalyten in einer Probe ist.
Dabei korreliert die Verschlechterung des Signals mit der Konzentrationszunahme an
Zielanalyten. [32] Normalerweise wird dieses Format zur Detektion von Hormonen oder
Pestiziden eingesetzt, da diese von geringer molekularer Größe sind. Es existieren jedoch auch
derartige Formate zum Nachweis von Allergenen. [4]
Das zweite LFA – Prinzip wird als Sandwich – Format bezeichnet und kommt bei Analyten zum
Einsatz, die mehr als ein Epitop für Antigen – Antikörper – Interaktionen besitzen. Es ist
ebenfalls Grundlage der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen und wird
deshalb näher erläutert. Abbildung 9 soll dabei zur Verdeutlichung der Abläufe im LFA
Sandwich – Format dienen.
35
Abbildung 9: Funktionsprinzip des LFA Sandwich – Formats (www.lequanbio.com,
11.09.2013)
Im ersten Schritt erfolgt die Probenaufgabe auf das Sample Pad, wobei die aufgebebenen
Volumina zwischen 150 – 250 μl liegen. Die Probe läuft anschließend durch das Sample Pad
zum Konjugatpad, wo sich die goldmarkierten sekundären Antikörper befinden. Diese sind
spezifisch gegen ein Epitop des Zielanalyten gerichtet und binden sich an jenen. In diesem
Zusammenhang ist die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit entscheidend, sodass ausreichend
Reaktionszeit für die Bindung zwischen sekundärem Antikörper und Antigen vorhanden ist, da
der kapillare Fluss durch die Membran sofort nach der Probenaufgabe einsetzt. Des Weiteren
muss beachtet werden, dass das Konjugatpad mit der Membran überlappt, sodass der
Kapillarfluss überhaupt zu Stande kommt. Im weiteren Verlauf bindet der Antigen – Antikörper
– Goldkomplex an den primären Antikörper (Testlinie), der auf der Membran immobilisiert ist
und spezifisch gegen ein anderes (freies) Epitop des Zielanalyten gerichtet ist, d. h. die beiden
Antikörper (sAK / pAK) konkurrieren nicht um dasselbe Epitop. Dadurch erfolgt die Anlagerung
der goldmarkierten Komplexe an die Testlinie, was zur Bildung einer roten Linie führt. Die
Signalstärke (Intensität der Färbung) ist direkt proportional zur Antigenkonzentration in der
Probe. In diesem Fall ist die Fließgeschwindigkeit erneut ein wichtiger Faktor für die
36
Reaktionszeit und Testsensitivität. An den auf der Kontrolllinie befindlichen IgG – Antikörper
binden die goldmarkierten Antikörper ohne Antigen, sodass sich die Kontrolllinie in Folge der
Anlagerung ebenfalls rot verfärbt. Dabei ist zu beachten, dass immer ein Überschuss an
goldmarkierten sekundären Antikörpern präsent sein muss. Dadurch wird gewährleistet, dass
einerseits ausreichend Antigen – Antikörper – Komplexe gebildet werden können, um sich am
primären Antikörper anzulagern und andererseits noch genügend freie sekundäre Antikörper
vorhanden sind, um sich an der Kontrolllinie anzusammeln. In diesem Fall bestätigt die
Kontrolllinie diesen Überschuss und garantiert, dass der Test funktioniert. Letztendlich gibt es 3
mögliche Testergebnisse, die durch die jeweilige Linienbildung angezeigt werden und anhand
von Abbildung 10 näher erläutert werden sollen. [32] [36]
Abbildung 10: Mögliche Testergebnisse eines LFA Sandwich - Format (Koppelmann 2006,
S. 179)
Die in Abbildung 10 dargestellten Teststreifen zeigen 3 verschiedene Testergebnisse, wobei zu
erwähnen ist, dass die Teststreifen in diesem Fall eingehaust sind und diese Form die
kommerziell erwerblichen darstellt. Teststreifen a zeigt ein positives Ergebnis, d. h., dass
Zielanalyten in der Probe präsent sein müssen. Dabei bestätigt die Kontrolllinie, dass der Test
korrekte Resultate liefert. Hingegen zeigt Teststreifen b ein negatives Ergebnis, da keine
Testlinie zu sehen ist und demnach keine Antigene in der Probe sind. In diesem Fall bestätigt
ebenfalls das Vorhandensein der Kontrolllinie, dass der Test funktioniert. Teststreifen c zeigt ein
ungültiges Ergebnis, da keine der beiden Linien gebildet wurden und der Test somit nicht
37
ordnungsgemäß abgelaufen ist. Zudem handelt es sich ebenfalls um ein ungültiges Ergebnis,
wenn eine Testlinie vorhanden ist, jedoch keine Kontrolllinie angezeigt wird. [4]
2.3 Versuchsvorbereitung
In diesem Abschnitt soll die Vorgehensweise geschildert werden, die notwendig ist, um einen
LFA im Sandwich – Format zum Nachweis von Fischallergenen durchzuführen. Die im Rahmen
dieser Arbeit angestellten Untersuchungen berücksichtigten die entsprechenden Punkte.
2.3.1 Fischprobenaufbereitung
Die Proben der Fischarten Kabeljau, Alaska Seelachs und Hering werden aufgetaut und anschlie-
ßend im Universal – Zerkleinerer homogenisiert, sodass die Muskelstrukturen zerstört werden.
Anschließend erfolgt die Zugabe von 250 ml 100mM PB – Puffer (pH 7,0) zu je 500 g der
entsprechenden Fischproben. Auf Grund der Tatsache, dass Parvalbumin ein hitzestabiles
Protein (bis 90°C) ist, werden die Proben bei 80°C 30 Minuten lang erhitzt, sodass die
hitzeempfindlichen Proteinstrukturen denaturieren und ausfallen. Im Anschluss daran werden die
Proben abgekühlt und für 20 min. bei 4°C mit 12.000 rpm zentrifugiert, sodass die denaturierten
Proteine sowie andere Partikel vom hitzestabilen Parvalbumin getrennt werden. Nach dem
Zentrifugieren wird der Überstand sorgfältig abgenommen, gefiltert und bei -20°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert. [28] [37]
2.3.2 Proteingehaltbestimmung
Die Bestimmung des Proteingehalts in den Fischproben wird mittels Bradford Assay durch-
geführt. Dabei handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrations-bestimmung
von Proteinen. Das Verfahren beruht generell auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie
Brilliant Blau G an Proteine in saurem Medium, wodurch sich das Absorptionsmaximum des
Farbstoffes von 465 nm nach 595 nm verschiebt. Ursache dafür ist die Komplexbildung von
Coomassie Brilliant Blau G mit den kationischen und unpolaren Seitenketten der Proteine. Diese
Komplexbildung bewirkt eine Stabilisierung des Farbstoffes in seiner anionischen
(unprotonierten) Sulfonatform, wobei das Absorptionsmaximum dieser Form im Bereich bei 595
nm liegt. Des Weiteren ist der Extinktionskoeffizient des Protein – Farbstoff – Komplexes höher
im Vergleich zum unkomplexierten Farbstoff, wodurch die Absorptionszunahme bei 595 nm
gegenüber dem freien Farbstoff photometrisch ermittelt werden kann und letztendlich
38
maßgebend für die Proteinkonzentration ist. Demnach kann über die Erstellung einer
Kalibrierungsgeraden mit einer Standardsubstanz die Proteinkonzentration einer unbekannten
Probe quantifiziert werden. Bei der Auswahl des Standards muss beachtet werden, dass dieser
einen ähnlichen Gehalt an basischen Aminosäuren hat wie die zu quantifizierende Probe, da die
Farbreaktion davon abhängig ist. Als Standardsubstanz für die Kalibrierung wird in der Regel
BSA (Rinderserumalbumin) eingesetzt. Dabei ist zu beachten, dass die zu untersuchenden
Proben im Konzentrationsbereich der Standards liegen. Des Weiteren sind die Inkubationszeiten
(5-45 min.) einheitlich auf die gesamte Untersuchung anzuwenden, da sonst Ungenauigkeiten
bezüglich der Proteinkonzentrationen entstehen. Nach Abschluss der photometrischen Messung
wird durch lineare Regression und Interpolation der Proteingehalt der Proben ermittelt. [38] [39]
2.3.3 Untersuchung zur optimalen Konjugation zw. Antikörper und kolloidalem Gold
Die Untersuchung dient zur Ermittlung der minimalen Antikörperkonzentration, die erforderlich
ist, um kolloidales Gold zu stabilisieren, sodass es nicht zur Aggregation der Partikel kommt, die
durch einen Farbumschlag von Rot nach Blau gekennzeichnet ist. Der Grund dafür ist, dass
kolloidales Gold in Lösung hergestellt wird, in der ein Gleichgewicht zwischen elektrostatischer
Abstoßung und Van – der – Waals – Wechselwirkung zwischen den Goldpartikeln besteht. Der
Einsatz von Puffern (ionische Substanzen) bewirkt jedoch eine Verschiebung des
Gleichgewichts, sodass die Anziehungskräfte (Van – der – Waals – Kräfte) größer werden als die
Abstoßungskräfte, was letztendlich zur Aggregation der Nanopartikel führt. Der Einsatz von
Puffern ist jedoch unumgänglich für den LFA, da dieser für die Stabilisierung der Antikörper
und die Reaktionsabläufe essentiell ist. [40] Wie bereits unter Punkt 2.2.1 erwähnt, wird durch
die Zugabe von Proteinen (Antikörpern, BSA) der Verklumpung durch Oberflächenadsorption
entgegengewirkt. Dafür ist die Ermittlung der optimalen Bedingungen für die Konjugatbildung,
d. h. die minimal notwendige Antikörperkonzentration, unumgänglich [34].
Die Untersuchung wird nach der Methode Wang et al. (2009) durchgeführt, wobei zunächst das
Absorptionsmaximum des Antikörper – Goldkomplexes zwischen 520 nm und 580 nm mittels
Spektralanalyse ermittelt wird. Anschließend wird die optische Dichte von Goldkonjugaten mit
unterschiedlicher Antikörperkonzentration in 10% NaCl – Goldlösung (pH 9,0) am
Absorptionsmaximum photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse werden grafisch dargestellt,
wodurch eine Sättigungskurve entsteht. Zur Bestimmung der minimalen Antikörper-
konzentration werden 120% der Konzentration genommen, die durch den ersten Punkt auf der
Sättigungsgeraden repräsentiert werden. Dadurch wird garantiert, dass ausreichend Proteine
39
(Antikörper) vorhanden sind, um das kolloidale Gold in Puffern (ionischen Substanzen) zu
stabilisieren. [40]
2.3.4 Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats
Für die Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats müssen die unter den Punkten 3.2.1
und 2.3.3 beschriebenen Fakten bezüglich der Stabilisierung der kolloidalen Goldlösung
berücksichtigt werden. Andernfalls kann es zur Agglomeration, der Goldpartikel kommen was
das Goldkonjugat für weitere Verwendungen unbrauchbar macht. Zur Konjugatherstellung
existiert eine Vielzahl von Methoden, die den benötigten Rahmenbedingungen angepasst sind,
jedoch ist das Grundprinzip einheitlich. Zu Beginn der Konjugatherstellung wird der benötigte
pH – Wert (7,5 – 10,0) der kolloidalen Goldlösung eingestellt, sodass für die
Adsorptionsreaktion optimale Bedingungen herrschen. Anschließend wird der sekundäre
Antikörper in der benötigten Konzentration zur kolloidalen Goldlösung gegeben und diese mit
Puffer aufgefüllt. Während der Inkubationszeit von 30 Minuten auf dem Horizontalschüttler
erfolgt die Bildung des Antikörper – Nanogold – Komplexes durch Oberflächenadsorption. [40]
Im nächsten Schritt werden die noch freien Bindungsstellen der Goldpartikel durch die Zugabe
„inerter“ Makromoleküle (z. B. BSA) geblockt, sodass keine weiteren Stoffe an der Oberfläche
adsorbieren können. [34] Für diesen Vorgang ist erneut eine Inkubationszeit von 30 Minuten
notwendig. Anschließend werden die Konjugate bei 4°C zentrifugiert, sodass sich das
Goldkonjugat als Pellet absetzt. Der Überstand wird abgenommen und das Goldkonjugat in
Puffer resuspendiert. Der Zentrifugiervorgang mit anschließender Resuspendierung des Pellets
wird erneut wiederholt. Der Antikörper – Nanogold – Komplex ist dann bereit, um auf das
Konjugatpad aufgetragen zu werden. [41] Die während der Untersuchungen verwendeten
Reagenzien sowie Parameter mit den daraus resultierenden Ergebnissen sind unter Punkt 3.3.1
genau beschrieben.
2.3.5 Vorbereitung der LFA – Komponenten
Die LFA – Komponenten können durch verschiedene Reagenzien hinsichtlich ihrer
Eigenschaften modifiziert werden, sodass die Funktionalität des LFA – Teststreifen verbessert
bzw. optimiert wird. Im ersten Schritt der Membranvorbereitung wird die Membran aus der
Vorlage (30 cm Membranstreifen) in 6 cm breite Streifen geschnitten. Danach erfolgt das
Auftragen des primären Antikörpers (Testlinie) und des IgG – Antikörpers (Kontrolllinie) auf die
Membranfläche. Dabei kann das Auftragen automatisch (mit Dispenser) oder manuell
40
(mit Pipette) durchgeführt werden. Anschließend wird die Membran für 5 min bei RT
vorgetrocknet und kommt danach für 1 h bei 30°C in den Trockenschrank. Die niedrige
Trocknungstemperatur wird eingesetzt, um die immobilisierten Antikörper zu schonen. Nach der
Trocknung erfolgt das Blocken der Membran, sodass die freien Bindungsstellen der
Nitrozellulose nicht mit dem Konjugat oder den Zielanalyten in Wechselwirkung treten und
somit den Test unbrauchbar machen. Zum Blocken der Membran werden Proteine, wie z. B.
BSA oder Casein, oder Laminier Mittel, wie z. B. PVP, eingesetzt. Dazu werden die jeweiligen
Substanzen in Puffer gelöst und die Membran anschließend für 30 min bei RT in der Lösung
inkubiert. Zur Verbesserung der Proteinlöslichkeit werden grenzflächenaktive Reagenzien, wie
z. B. Tween 20, verwendet. Im Anschluss daran erfolgt das Spülen der Membranfläche mit
destilliertem Wasser zur Entfernung der überschüssigen Moleküle bzw. Fremdpartikel. Zum
Abschluss besteht die Möglichkeit, die Membran mit Konservierungsmitteln, wie z. B. Succrose,
zu behandeln, die einerseits die auf der Membran befindlichen Proteine schützen und
andererseits einen positiven Einfluss auf das Resolubilisierungsverhalten haben. Dafür werden
die Konservierungsmittel ebenfalls in Puffer gelöst und die Membran anschließend für 15
Minuten in der Lösung bei RT inkubiert. Nach der Prozedur wird die behandelte Membranfläche
erneut mit destilliertem Wasser gespült und über Nacht bei RT getrocknet. Dabei wird die
Membran dunkel gelagert und durch eine perforierte Abdeckung (z. B. Alufolie) vor
Verschmutzung geschützt. Die zur Vorbehandlung der Membran eingesetzten Reagenzien sind
unter Punkt 2.1.2 (Membranblocker) zu finden. [41] [42]
Das Konjugatpad wird zur Vorbereitung aus der Vorlage in Streifen von 0,6 cm x 10 cm
geschnitten. Die Konjugatpadstreifen können anschließend mit verschiedenen Reagenzien
behandelt werden, die Eigenschaften wie z. B. Sensitivität oder Resolubilisierungsverhalten des
Goldkonjugats beeinflussen. Dabei werden die entsprechenden Substanzen, wie z. B. BSA,
Succrose oder Casein, in Puffern gelöst und das Konjugatpad anschließend für 30 min. in der
Lösung inkubiert. Anschließend erfolgt die Trocknung der Streifen bei 30°C für 1 h im
Trockenschrank. Danach wird auf die Konjugatpads das Goldkonjugat pipettiert oder die
Streifen werden gefaltet und anschließend in das Goldkonjugat getaucht. Dabei müssen 500 μl
Goldkonjugat für die Herstellung von 5 Konjugatpads (2,0 cm x 0,6 cm) eingeplant werden. Die
Trocknung der Konjugatpads erfolgt über Nacht bei RT unter einer perforierten Abdeckung (z.
B. Alufolie) zum Schutz vor Verschmutzungen. Des Weiteren werden die Konjugatpads beim
Trocknen auf Träger (z. B. Pipettenspitzen) gelegt, sodass der Trocknungsvorgang durch
Luftzirkulation verbessert wird. Dadurch wird gewährleistet, dass das Konjugat im Konjugatpad
bleibt und nicht durch Wechselwirkungen mit anderen Oberflächen austritt. Die zur Vorbe-
41
handlung des Konjugatpads eingesetzten Reagenzien sind unter Punkt 2.1.2 (Konjugatpad)
beschrieben [41] [42]
Das Sample Pad kann ebenfalls mit verschiedenen Reagenzien, wie z. B. Succrose, Dextran
oder Tween 20, behandelt werden, um die Probenverteilung auf das Konjugatpad zu verbessern
oder die Sensitivität des Teststreifen zu verstärken. Es besteht die Möglichkeit, Substanzen wie
Natriumazid einzusetzen, die konservierende Eigenschaften besitzen. Dabei werden die
entsprechenden Reagenzien ebenfalls in Puffer gelöst und das Sample Pad (1,7 cm x 0,6 cm) in
der Lösung für 30 min bei RT inkubiert. Danach wird das Sample Pad bei 30°C für 1 h im
Trockenschrank getrocknet und anschließend dunkel und trocken bis zum Einsatz gelagert. Das
zur Vorbehandlung eingesetzte Reagenz ist unter Punkt 2.1.2 (Sample Pad) beschrieben. [41]
Das Absorbentpad bedarf keiner weiteren Vorbehandlung, da es lediglich zum Abtransport bzw.
Aufsaugen des Goldkonjugats nach dem Testdurchlauf dient.
2.4 LFA – Testdurchführung
Die jeweiligen LFA – Komponenten werden zurecht geschnitten und anschließend zu einem
Teststreifen zusammengesetzt. Dabei wird die Membran (6,0 x 0,6 cm), das Konjugatpad (2,0 x
0,6 cm), das Sample Pad (1,7 x 0,6 cm) und das Absorbentpad (4,0 x 0,6 cm) entsprechend der
angegebenen Maße in Streifen geschnitten. Bei diesem Vorgang ist zu beachten, dass
Einweghandschuhe getragen werden, der Arbeitsplatz sauber ist und der Arbeitsvorgang
räumlich getrennt von möglichen Fischproben (Verdünnungsreihen etc.) durchzuführen ist.
Generell empfiehlt es sich 2 separate Arbeitsplätze zu schaffen, um Kreuzkontaminationen zu
vermeiden, da diese das Ergebnis verfälschen. Zudem muss darauf geachtet werden, dass die
Membran nicht auf der Lauffläche berührt wird, auf der die jeweiligen Antikörper immobilisiert
sind. An den Enden der Membran befinden sich abgedeckte Klebeflächen, die für die
Handhabung zu nutzen sind. Nachdem die Komponenten zurecht geschnitten sind, erfolgt der
Zusammenbau der Teststreifen, wozu es sich empfiehlt, neue Einweghandschuhe zu verwenden
und die einzelnen Teile auf weißem Papier zu positionieren. Im ersten Schritt des
Zusammenbaus wird die Abdeckung der langen Membranklebefläche (2 separate Teile) entfernt
und das Konjugatpad mit einer Pinzette 2 mm membranüberlappend durch leichten Druck
aufgebracht. Es ist darauf zu achten, dass das Konjugatpad vor der Druckausübung gerade ist
und in Fluchtrichtung mit der Membran steht. Der verbleibende Überstand von der Klebefläche
wird abgeschnitten. Im zweiten Schritt wird das kürzere Ende der Klebefläche von der
Abdeckung entfernt und das Absorbentpad 2 mm membranüberlappend nach gerader
Ausrichtung durch Druck befestigt. Der letzte Schritt beinhaltet das Aufbringen des Sample Pads
42
auf das Konjugatpad, wobei dieses mittels Pinzette zum Rand hin abschließend auf dem
Konjugatpad ausgerichtet wird und das Anpressen durch kurzen Druck erfolgt. Bei diesem
Schritt sollte der Teststreifen bereits in waagerechter Position liegen, sodass anschließend keine
größeren Bewegungen notwendig sind und das Sample Pad ohne weitere Fixierungen halten
kann. Auf Grund des glasfaserartigen Materials, aus dem das Konjugatpad besteht, hält das
Sample Pad. Abbildung 11 gibt einen schematischen Überblick zum korrekten Zusammenbau
eines Teststreifens.
Abbildung 11: Schematischer Teststreifenaufbau
Nach dem korrekten Zusammenbau des Teststreifens werden zwischen 150 – 250 μl
Probenvolumina aufgegebenen, wodurch der LFA Test gestartet wird. Sollte der Flow nicht
einsetzten, ist mittels Pipettenspitze ein kurzer Druck auf das Sample Pad auszuüben.
43
3. Ergebnisse
3.1 Proteingehaltsbestimmung der Fischproben
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration via Bradford Assay wird das „96 Well Plate Assay
Protocol“ der Firma SIGMA angewendet [41]. Für die Erstellung der Kalibrierkurve wird BSA
als Standardsubstanz eingesetzt und Konzentrationen im Bereich von 0,25 – 1,5 mg/ml
hergestellt. Als Puffer für die entsprechenden Verdünnungsreihen wird PB 10 mM (pH 7,0)
genutzt. Die Fischproben sind 100fach verdünnt, um im Konzentrationsbereich der BSA –
Standards zu liegen. Es werden 250 μl Bradford Reagenz in die jeweilige Kavität gegeben und
anschließend mit 5 μl der entsprechenden Substanz (BSA – Standard, Fischprobe, Puffer)
vermischt. Nach ca. 10 Minuten Inkubation auf dem Horizontalschütter (Stufe 6) werden die
photometrischen Messungen (Doppelbestimmungen) bei RT 20°C im Spektralfotometer
durchgeführt. Die auf Basis der Messwerte errechnete Kalibrierkurve ist in Abbildung 12
dargestellt.
Abbildung 12: Kalibrierkurve zur Proteinbestimmung der Fischproben
Die Kalibrierkurve weist einen hohen Regressionskoeffizienten auf. Demnach besteht zwischen
den Messwerten eine lineare Abhängigkeit, was durch den Graphen verdeutlicht wird. Anhand
der Kalibriergeraden werden die unbekannten Proteinkonzentrationen der Fischproben mittels
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5
Extin
ktio
n (O
ptis
che
Dic
hte)
Konzentrationen der BSA - Standards [mg/ml]
BSA - Kalibriergerade
Standardsy = 0,1927x + 0,41 R² = 0,998
44
Doppelbestimmung ermittelt und sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Standardabweichung für die
photometrischen Messungen innerhalb einer Fischart liegt unter 2%.
Tabelle 3: Proteinkonzentration der Fischproben
Kabeljau [mg/ml] Hering [mg/ml] Alaska Seelachs [mg/ml]
48,8 49,0 48,4
Die Proteinkonzentrationen der Fischproben liegen annähernd im gleichen
Konzentrationsbereich, wobei die Werte als realistisch eingeschätzt werden, da in der Literatur
die Eiweißgehalte auch eine geringe Schwankungsbreite aufweisen. Auf Basis der in Tabelle 3
abgebildeten Konzentrationen werden alle Verdünnungsreihen sowie Nachweisgrenzen der
Experimente berechnet bzw. ermittelt.
3.2 Konjugationsoptimierung zwischen Nanogoldpartikeln und sekundärem Antikörper
Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Antikörperkonzentrationen werden nach
Wang et al. (2009) exemplarisch am Antikörper Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] durchgeführt.
Dazu wird eine Verdünnungsreihe des Antikörpers im Konzentrationsbereich 0,02 – 0,16 mg/ml
erstellt. Als Verdünnungsreagenz wird 5mM Boraxpuffer (pH 9,0) eingesetzt. Zur Durchführung
der Spektralanalyse wird in die Kavitäten der 96 Well Platte 250 μl Goldsuspension gegeben und
diese mit 5 μl Kaliumcarbonat versetzt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 25 μl
Antikörperlösung in die jeweiligen Kavitäten. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten auf
dem Horizontalschüttler bei Stufe 6 werden 25 μl 10% NaCl – Lösung in die jeweiligen
Kavitäten gegeben und erneut für 15 Minuten auf dem Horizontalschüttler bei Stufe 6 inkubiert.
Danach wird die Spektralanalyse im Spektralfotometer bei RT 20°C im Bereich 470 – 610 nm
durchgeführt. Es wird bei den eingesetzten Mengen an kolloidaler Goldlösung und Antikörpern
von Wang et al. (2009) abgewichen, um Material zu sparen, jedoch ist das Verhältnis der
Mengen zueinander gleich. Des Weiteren werden die Inkubationszeiten von 5 Minuten auf 15
Minuten verlängert, um die Oberflächenadsorption zu verbessern. Der Spektralbereich wird
ebenfalls erweitert, um eine genauere Aufzeichnung zu erhalten. Zudem werden bei den
Untersuchungen Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Spektralanalyse sind in
Abbildung 13 dargestellt.
45
Abbildung 13: Spektralanalyse zur Optimierung der Konjugationsbedingungen
Aus den in Abbildung 13 dargestellten Ergebnissen wird ersichtlich, dass das
Absorptionsmaximum von reinem kolloidalem Gold bei 522 nm – 526 nm liegt. Hingegen
bewegt sich das Maximum im Falle der Goldkonjugate unterschiedlicher Konzentrationen
zwischen 528 – 535 nm. Ursache für die leichte Verschiebung des Absorptionsmaximums ist die
Komplexbildung zwischen kolloidalem Gold und den Antikörpern, wodurch sich die
Partikelgröße der in Lösung befindlichen Komponenten verändert. Es ist zu erkennen, dass das
Absorptionsmaximum ab einer Konzentration von 0,14 mg/ml bei einer OD um 1,0 liegt. Dies ist
als positiv zu bewerten, wenn man eine kolloidale Goldlösung mit einer OD von 1,1 einsetzt, da
die Höhe der optischen Dichte letztendlich einen signifikanten Einfluss auf die Signalstärke des
LFA hat. Das Absorptionsmaximum für die im Anschluss durchgeführten photometrischen
Messungen zur Bestimmung der minimalen Antikörperkonzentration wird anhand der
Spektralanalyse auf 530 nm festgelegt. Die Ergebnisse der photometrischen Messungen sind in
Abbildung 14 dargestellt.
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610
Opt
isch
e D
icht
e (E
xtin
ktio
n)
Wellenlänge [nm]
Spektralanalyse sAK + Gold 40 nm [470 - 610 nm]
Gold 40 nm
sAK 0.00 mg/ml
sAK 0.02 mg/ml
sAK 0.04 mg/ml
sAK 0.06 mg/ml
sAK 0.08 mg/ml
sAK 0.10 mg/ml
sAK 0.12 mg/ml
sAK 0.14 mg/ml
sAK 0.16 mg/ml
46
Abbildung 14: Photometrische Messungen zur Optimierung der Konjugationsbedingungen
Abbildung 14 zeigt die Extinktionen verschiedener Antikörperkonzentrationen in kolloidaler
Goldlösung am ermittelten Absorptionsmaximum von 530 nm. Dabei handelt es sich um die
Mittelwerte der photometrischen Doppelbestimmung. Die Standardabweichung für die
ermittelten Einzelwerte liegt unter 5%. Aus der Grafik geht hervor, dass bei einer sekundären
Antikörperkonzentration von 0,14 mg/ml die Sättigungsgerade beginnt. Demzufolge befindet
sich die minimale Antikörperkonzentration zur Stabilisierung von 1 ml kolloidaler Goldlösung
bei etwa 0,17 mg/ml. Bei zukünftigen Optimierungsversuchen der Antikörperkonzentration darf
dieser Wert nicht unterschritten werden.
3.3 Vorversuche
Die Ziele der Vorversuche waren die Entwicklung eines LFA – Teststreifens, der eine Testlinie
und eine Kontrolllinie anzeigt sowie die Optimierung der Vorbereitungsschritte zur Herstellung
der jeweiligen LFA – Komponenten. Letztendlich sollte das Verfahren für die Hauptversuche
soweit optimiert werden, dass der Teststreifen einwandfrei funktioniert und die
Versuchsvorbereitung effizient durchgeführt werden kann.
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16
Opt
isch
e D
icht
e
sAK Konzentration [mg/ml]
Optimierung sAK Konzentration zur Konjugatherstellung
530 nm
Trend
47
3.3.1 Herstellungsoptimierung vom Antikörper – Nanogold – Konjugat
In den Vorversuchen wird Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] als sekundärer Antikörper eingesetzt.
Zur Herstellung des Goldkonjugats werden die Methoden von Choi et al. (2010) und Safenkova
et al. (2010) als Grundlage bzw. Orientierung genutzt, wobei die verwendeten Mengen
(Volumina) zur Materialeinsparung angepasst werden. Zu Beginn der Konjugatherstellung wird
500 μl kolloidale Goldlösung in Eppendorfgefäße (1,5 ml) gefüllt und mit 10 μl
Kaliumcarbonatlösung (100 mM, pH 11,2) zur Justierung des pH – Wertes (9,0) versetzt.
Anschließend werden 100 μl sekundärer Antikörper (unverdünnt) zur Goldlösung zugegeben
und diese auf 1 ml mit Boraxpuffer (5 mM, pH 9,0) aufgefüllt. Nach einer Inkubationszeit von
30 min bei RT auf dem Horizontalschüttler (Stufe 6) werden 100 μl 10 % BSA – Boraxlösung
(pH 9,0) zur Goldlösung gegeben und diese erneut für 30 min bei RT auf dem
Horizontalschüttler (Stufe 6) inkubiert. Nach jedem Zugabeschritt wird die Lösung für mindes-
tens 30 Sekunden auf dem Vortexer gründlich durchmischt. Das Zentrifugieren der Goldlösung
wird mit der Laborzentrifuge (3K30) bei 4°C und 8800 rpm für 60 Minuten durchgeführt. Zudem
wird für das Zentrifugieren der Rotorkopf 12110 H mit zugehörigem Deckel verwendet. Im
Anschluss an das erste Zentrifugieren werden ca. 80 – 90% des Überstandes aus dem
Eppendorfgefäß entnommen und das Pellet in 1 ml PB (10 mM, pH 7,0) auf dem Vortexer
resuspendiert. Danach erfolgt das zweite Zentrifugieren bei den gleichen Parametern wie im
ersten Durchlauf. Der Überstand wird erneut abgenommen und das Pellet in 500 μl PB (10 mM,
pH 7,0) auf dem Vortexer resuspendiert und bis zum weiteren Gebrauch, spätestens am nächsten
Tag, bei 4°C im Kühlschrank zwischengelagert.
Es zeigt sich, dass die oben beschriebene Methode zur Konjugatherstellung am besten geeignet
ist. Diesbezüglich werden während der Untersuchungen verschiedene Experimente durchgeführt,
in denen die Parameter des Zentrifugierens und die zur Herstellung eingesetzten Reagenzien
variieren. In Bezug auf den Vorgang des Zentrifugierens werden die in der Tabelle 4
dargestellten Parameter überprüft.
48
Tabelle 4: Parameter des Zentrifugierens bei der Konjugatherstellung
Versuch Zeit [min] Drehzahl [rpm] T [°C] Quelle
1 20 10.000 4 Choi et al. (2010) [42]
2 20 12.000 4 eigene Anpassung
3 30 10.000 4 Safenkova et al. (2010) [44]
4 30 12.000 4 eigene Anpassung
5 50 9.000 4 eigene Anpassung
Das Zentrifugieren mit den Parametern aus den Versuchen 1 und 2 hat nicht funktioniert, da sich
das Goldkonjugat bereits nach dem ersten Zentrifugieren an der Innenwandung des
Eppendorfgefäßes absetzt und dadurch unbrauchbar ist. Der Einsatz einer höheren Drehzahl bei
gleichbleibender Zeit bringt keine Verbesserung, wobei zunächst vermutet wird, dass eine
höhere Drehzahl ein besseres Absetzen am Gefäßboden bewirkt auf Grund höherer G – Kräfte.
Die Problematik der Konjugatabsetzung an der Gefäßinnenwand ist in Abbildung 15 dargestellt.
Abbildung 15: Abgesetztes Goldkonjugat an der Innenwandung eines Eppendorfgefäßes
49
Bei den Folgeexperimenten 3 und 4 wird eine neue Methode ausprobiert, die eine Zeitver-
längerung des Zentrifugierens vorsieht. Dabei setzt sich das Konjugat nach dem ersten Durchlauf
am Gefäßboden als Pellet ab, wodurch ein zweiter Zentrifugiervorgang durchgeführt werden
kann. Das Goldkonjugat bildet jedoch nach dem zweiten Zentrifugieren erneut an der Innen-
wandung einen Schmierfilm und ist für weitere Verwendungen unbrauchbar. Eine Drehzahl-
erhöhung bei gleichbleibender Zeit und Temperatur führt zu keiner signifikanten Verbesserung
der Problematik. Es wird vermutet, dass die hohe Drehzahl das Problem verursacht, da durch die
hohen G – Kräfte der Antikörper – Nanogold – Komplex zu stark an die Innenwandung gedrückt
wird. In Folge dessen verteilt sich der Komplex an der Gefäßwandung und tritt mit dieser in
Wechselwirkungen. Zur Bestätigung der Hypothese wird im Versuch 5 die Drehzahl verringert
und die Zeit erhöht bei gleichbleibender Temperatur. Dies führt zu den gewünschten
Ergebnissen. Die Problematik der Konjugatabsetzung an der Gefäßwand ist nicht mehr
aufgetreten. Zur Erhöhung der Herstellungssicherheit beim Zentrifugieren werden die optimalen
Parameter auf 8800 rpm für 60 Minuten bei 4°C festgelegt. Dadurch wird sichergestellt, dass die
Konjugatherstellung standardisiert und ohne Materialverlust durchgeführt werden kann.
Es wird ebenfalls der Einsatz verschiedener Pufferlösungen während der Konjugatherstellung
untersucht. Dabei wird zum Resuspendieren des Pellets PBS (40 mM, pH 7,4) ohne Zusätze und
mit BSA Zusätzen (1% 1. Durchlauf, 0,1% 2. Durchlauf) getestet. Des Weiteren wird zum
Blocken der freien Bindungsstellen vor dem Zentrifugieren 1% BSA – PBS Lösung ausprobiert.
Während der Untersuchungen ist kein signifikanter Einfluss auf die Konjugatqualität
festzustellen. Es empfiehlt sich jedoch, die im Vorfeld als optimal beschriebenen Reagenzien
einzusetzen, da sie die Reaktionsbedingungen für die Konjugatherstellung begünstigen und sich
im Verlauf der durchgeführten Experimente als sichere Parameter erweisen. Außerdem zeigt
sich, dass das Zentrifugieren der Kernprozess der Konjugatherstellung ist, weil er einen hohen
Einfluss auf die Qualität des Goldkonjugats ausübt.
3.3.2 Optimierung der LFA – Komponenten
Zur Optimierung der LFA – Komponenten werden die Methoden von Choi et al. (2010), Zhang
et al. (2009) und Kolosova et al. (2008) als Grundlage genutzt. In den Vorversuchen wird Wi 11
– 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer Antikörper für die Testlinie und Goat – Anti Mouse IgG [2
mg/ml] als Antikörper für die Kontrolllinie unverdünnt eingesetzt. Es wird die Hi Flow Plus 240
Membran verwendet. Die Testlinie und Kontrolllinie werden manuell mittels Pipette auf-
getragen, wobei das Volumen 2,5 μl/cm (je 2 x aufgetragen) beträgt. Die Membran wird
anschließend für 5 Minuten bei RT vorgetrocknet und dann für 1h bei 30°C in den Trockenofen
50
gegeben. Nach dem Trocknen wird die Membran für 30 Minuten in 1% PVP (in 100 mM PBS)
eingelegt und danach mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn gewaschen.
Im Anschluss daran erfolgt die Inkubation der Membran in 5% Succrose (in 10 mM PB) für 15
Minuten sowie erneutes Waschen mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn.
Zum Abschluss wird die Membran in Plastikschalen gelegt, die am Boden gewellt sind, sodass
die Trocknung auch auf der unteren Membranseite gewährleistet werden kann. Die Plastik-
schalen werden mit perforierter Alufolie abgedeckt und die Trocknung der Membran erfolgt über
Nacht bei RT. Das Konjugatpad wird aus der Vorlage in Streifen (0,6 cm x 10 cm) geschnitten.
Das hergestellte Goldkonjugat (500 μl) wird mit 500 μl einer 5% Succrose – 1% BSA – 0,5%
Tween 20 Lösung (in 40 mM PBS) direkt im Eppendorfgefäß auf dem Vortexer gemischt.
Anschließend wird der Konjugatpadstreifen sorgfältig gefaltet und mittels Pipette ins
Goldkonjugat getaucht, sodass dieser sich vollsaugen kann. Der mit Konjugat durchtränkte
Streifen wird zum Trocknen auf Pipettenspitzen in eine Plastikschale gelegt, sodass die
Auflagefläche des Streifens möglichst gering ist und das Goldkonjugat im Pad bleibt. Dadurch
können Wechselwirkungen mit der Plastikoberfläche auf ein Minimum reduziert werden. Die
Plastikschale wird ebenfalls mit perforierter Alufolie abgedeckt und das Konjugatpad bei RT
über Nacht getrocknet. Das Sample Pad und das Absorbentpad werden nach den, unter Punkt 2.4
beschriebenen Maßen zurecht geschnitten und nicht vorbehandelt. Der Zusammenbau und der
LFA – Test werden ebenfalls nach Punkt 2.4 durchgeführt, wobei die in den Vorversuchen
eingesetzten Probenvolumina 150 μl betragen. Die Fischproben der 3 getesteten Fischarten
werden für die Vorversuche mit PB 10 mM (pH 7,0) 10fach verdünnt.
Während der Untersuchungen zeigt sich, dass die Kombination der im Vorfeld beschriebenen
Parameter, Komponenten sowie Reagenzien die besten Ergebnisse hinsichtlich der Bildung von
Test und Kontrolllinie liefern. In Abbildung 16 sind die Testreifen abgebildet, die entsprechend
der Vorgehensweise behandelt sind.
51
Abbildung 16: Optimierte Teststreifen der Vorversuche
Anhand von Abbildung 16 ist zu sehen, dass die Testlinie und Kontrolllinie klar zu erkennen
sind. Dabei hat sich die Kontrolllinie nach 3 Minuten und die Testlinie nach 5 Minuten gebildet,
wobei der Testreifen nach 3 Minuten durchgelaufen ist, d. h. das Absorbentpad erreicht. Der
Testdurchlauf ist sehr schnell und es bildet sich eine einheitliche Flowfront. Die Intensität der
Linien, insbesondere der Testlinie, nimmt nach 15 Minuten nicht mehr zu. Das Fischallergen
Parvalbumin kann bei den in Abbildung 16 angegebenen Proteinkonzentrationen klar detektiert
werden. Des Weiteren zeigt sich, dass die gegen Kabeljau gerichteten monoklonalen Antikörper
eine Kreuzreaktivität gegenüber Hering und Alaska Seelachs aufweisen.
Zur Optimierung der LFA – Komponenten bzw. zur Entwicklung der im Vorfeld beschriebenen
Vorgehensweise werden während der Vorversuche verschiedene Experimente durchgeführt.
Dabei werden zunächst unterschiedliche Vorbehandlungen der LFA – Komponenten getestet, um
den Einfluss auf die Singnalentwicklung und das Laufverhalten zu überprüfen. Die jeweiligen
Testkombinationen sind in Tabelle 5 dargestellt.
52
Tabelle 5: Kombination verschiedener Vorbehandlungen der LFA Komponenten
Vers
.
Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp
1 unbehandelt
0,5% BSA +
0,2% Tween 20
1% BSA + 5%
Succrose Hi Flow Plus 75
2 unbehandelt
0,5% Casein +
0,5% Tween 20
1% BSA + 5%
Succrose Hi Flow Plus 75
3 0,5% Tween 20 + 5%
Succrose +5% Dextran +
0,05% Natriumazid
unbehandelt 1% BSA + 5%
Succrose Hi Flow Plus 75
4
unbehandelt
5% Succrose +
1% BSA + 0,5%
Tween 20
2% Casein Hi Flow Plus 75
5
unbehandelt
5% Succrose +
1% BSA + 0,5%
Tween 20
1% PVP + 5%
Succrose Hi Flow Plus 75
6
unbehandelt
5% Succrose +
1% BSA + 0,5%
Tween 20
1% PVP + 5%
Succrose Hi Flow Plus 240
Bei den in Tabelle 5 dargestellten Kombinationen wird lediglich die Fischprobe des Kabeljaus
eingesetzt, um eine Test – und Kontrolllinie zu erzeugen. Zudem wird zu Beginn Wi 11 –
3G9D5 [2,5 mg/ml] als primärer Antikörper auf der Membran immobilisiert und Wi 11 –
1G3G11 [3,85 mg/ml] als sekundärer Antikörper zur Herstellung des Goldkonjugats genutzt. Bei
den Versuchen 1 – 3 kann mit den Vorbehandlungen und der Antikörperpaarkombination weder
eine Test – noch eine Kontrolllinie erzeugt werden. Zudem ist festzustellen, dass aus dem
unbehandelten Konjugatpad (V3) kein Goldkonjugat eluiert, obwohl das Sample Pad
entsprechend vorbehandelt wird. Das liegt vermutlich daran, dass das Goldkonjugat nach der
Trocknung nicht mehr resolubilisiert werden kann und in Wechselwirkungen mit
glasfaserartigem Material des Konjugatpads tritt. Das Phänomen ist in den Versuchen 1 – 2 nicht
erkennbar, da der Einsatz von BSA und des grenzflächenaktiven Stoffes Tween 20 diesem
Verhalten entgegenwirken. Eine Wiederholung des Versuchs sowie der Tausch zwischen dem
primären und sekundären Antikörper bringen keinen Erfolg. Die Teststreifen der Versuche 1 – 3
sind in Abbildung 17 dargestellt.
53
Abbildung 17: Teststreifen Versuche 1 – 3
Mit den Versuchen 4 – 5 wird die Versuchsplanung überdacht und angepasst, da in den
Versuchen 1 – 3 kein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wird. Dabei erfolgt die Kombination
neuer Vorbehandlungen nach Kolosova et al. (2008). Der Tausch der Antikörperpaarungen, d. h.
die Verwendung von Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer und Wi 11 – 3G9D5 [2,5
mg/ml] als sekundärer Antikörper wird beibehalten. Durch die Anpassungen kann ein Signal
erzeugt werden, jedoch sind beide Linien verwischt und deshalb nicht voneinander zu
differenzieren. Als Ursache für die unklaren Linien werden die Eigenschaften der Membran Hi
Flow Plus 75 sowie der geringe Abstand zwischen den Linien (0,5 cm) ermittelt. Es wird
festgestellt, dass der Membrantyp für die Untersuchungen ungeeignet ist, da die Lauffläche sehr
dünnschichtig ist und somit bei der manuellen Antikörperimmobilisierung leicht beschädigt
werden kann. Des Weiteren wird beobachtet, dass sich beim Auftragen der Antikörper ein breiter
Hof bildet, d. h. der flüssige Antikörper geht zu sehr in die Breite, wodurch sich die Linie
ebenfalls verbreitert. Diesem Verhalten kann durch den Einsatz von weniger Antikörpervolumen
nicht entgegengewirkt werden, weshalb die robustere Membran Hi Flow Plus 240 mit einer
dickschichtigen Lauffläche für den Versuch 6 ausgewählt wird. Außerdem zeigt sich, dass das
Laufverhalten der Flowfront durch 1% PVP Lösung im Gegensatz zu 1% BSA verbessert
werden kann. Die 2 % Casein Lösung ruft ebenfalls gute Laufeigenschaften hervor, jedoch ist
die Kombination der Vorbehandlung von Membran und Konjugatpad optimaler. Insbesondere
die Vorgehensweise nach Kolosova et al. (2008) zur Behandlung des Goldkonjugats mit der 5%
Succrose - 1% BSA - 0,5% Tween 20 Lösung bewirkt eine signifikante Verbesserung der
54
Farbintensität und der Signalentwicklung. Die Testreifen aus den Versuchen 4 – 5 mit den
verwischten Linien sind in Abbildung 18 dargestellt.
Abbildung 18: Testreifen Versuche 4 – 5
Die im Versuch 6 beschriebene Vorbehandlung bringt die besten Ergebnisse hinsichtlich
Laufverhalten, Signalentwicklung und Signalstärke und stellt deshalb die optimalen Bedin-
gungen dar. Während der Vorversuche werden neben den bereits erwähnten Membrantypen (HF
75, HF 240) die Eigenschaften der Membrantypen HF 090, HF 135 und HF 180 untersucht. Es
zeigt sich, dass lediglich die Membran HF 180 für weitere Testzwecke in Frage kommt, da sie
ebenfalls eine robustere Lauffläche im Vergleich zu den anderen Membrantypen aufweist. Des
Weiteren ermöglicht sie auch eine verbesserte Reaktionszeit für die Komplexbildung zwischen
sAK – Antigen – pAK durch die geringere Laufgeschwindigkeit. Letztendlich stellt jedoch die
Membran HF 240 das Optimum dar. Auf Grund ihrer hohen Schichtdicke und der geringeren
Laufgeschwindigkeit besitzt sie einerseits die besten Grundvoraussetzungen für die manuelle
Antikörperimmobilisierung und andererseits gewährleistet sie ausreichend Reaktionszeit für die
Komplexbildung bzw. für die Signalentwicklung.
Das Ziel der Vorversuche einen LFA – Teststreifen zu entwickeln, der eine Testlinie und eine
Kontrolllinie anzeigt, wird erreicht. Zudem erfolgt die Optimierung der Vorbereitungsschritte
zur Herstellung der LFA – Komponenten. Auf Grundlage der in den Vorversuchen ermittelten
Ergebnisse erfolgen die Untersuchungen bzw. Experimente der Hauptversuche.
55
3.4 Hauptversuche
Die Hauptversuche verfolgen als Ziel die Entwicklung eines LFA – Teststreifens zur Detektion
des Fischallergens Parvalbumin, wobei dieser eine hohe Zuverlässigkeit in Verbindung mit einer
hohen Sensitivität aufweisen soll. Des Weiteren wird als Ziel die Ermittlung der Nachweisgrenze
verfolgt sowie die Optimierung dieser mit den vorhandenen Ressourcen. Letztendlich soll durch
die Untersuchungen eine Grundlage geschaffen werden, auf der weiterführende Experimente zur
Verbesserung des Schnelltest einschließlich des Herstellungsverfahrens durchgeführt werden
können.
3.4.1 Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination
Die Herstellung des Goldkonjugats und die Vorbereitung der LFA – Komponenten für die
Versuche werden nach den optimierten Bedingungen, beschrieben unter den Punkten 3.3.1 und
3.3.2, durchgeführt. Zu Beginn der Hauptversuche wird der letzte Vorversuch (Versuch 6 / Abb.
16), bei dem eine Kreuzreaktivität des monoklonalen Antikörpers gegenüber Hering und Alaska
Seelachs festgestellt wurde, wiederholt. Dabei wird neben den 3 Teststreifen mit den
entsprechenden Fischarten ein weiterer Teststreifen eingesetzt, der als Blindwert dient und auf
den an Stelle von Fischprotein (Parvalbumin) PB 10 mM (pH 7,0) gegeben wird. PB 10 mM ist
der gleiche Puffer, mit dem auch die Fischproben verdünnt werden. Bei den Untersuchungen ist
festzustellen, dass das Parvalbumin aller 3 Fischarten eindeutig detektiert werden kann, jedoch
ist auch der Blindwert positiv. Die Testlinien der 3 Fischarten sind bereits unmittelbar nach dem
Kontakt mit der Flow Front schwach erkennbar (1 Minute), wobei die jeweiligen Kontrolllinien
nach 4 Minuten die Funktionalität der Teststreifen bestätigen. Die Testlinie des Blindwertes ist
nach 5 Minuten schwach zu erkennen und die Kontrolllinie bildet sich nach bereits nach 4
Minuten. Nach 12 Minuten sind bei allen Testreifen eindeutige Signale zu erkennen, wobei nach
20 Minuten keine Verbesserung der Intensität mehr eintritt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 19
dargestellt.
56
Abbildung 19: Positive Blindwerte (Wdh. Vorversuch - V6)
Als Ursache für die positiven Blindwerte wird zunächst unsauberes Arbeiten vermutet, d. h., dass
es zu einer Kreuzkontamination während der Vorbereitung gekommen ist. Im Verdacht stehen
dabei die eingesetzten Sample Pads und Konjugatpads, obwohl durch die getrennten
Arbeitsplätze und die gewissenhafte Vorgehensweise (regelmäßige Reinigung / Handschuhe /
räumliche Trennung) eine Kontamination während der Herstellung fast ausgeschlossen werden
kann. Dennoch werden für die Wiederholung LFA – Komponenten einer anderen Herstellungs-
charge und ein zusätzlicher Blind – Teststreifen mit Reinstwasser als Probe verwendet, um
Kreuzkontaminationen auszuschließen. Eine Kontamination der Pufferlösungen wird von
vornherein ausgeschlossen, da diese separat zu den Proben gelagert werden. Die Wiederholung
des Versuchs ergibt ebenfalls positive Blindwerte, sodass neue Ansatzpunkte zur Problemlösung
gesucht werden.
Der neue Ansatz zur Problemlösung befasst sich mit der Kombination der entsprechenden
Antikörperpaare. Dabei wird vermutet, dass der sekundäre Antikörper unkomplexiert, d. h. ohne
gebundenes Antigen an den primären Antikörper bindet und in Folge dessen die positiven
Blindwerte entstehen. Deshalb werden Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene
Kombinationen zwischen sekundärem und primärem Antikörper untersucht werden. Dadurch
sollte einerseits die Problematik positiver Blindwerte analysiert und andererseits die optimale
Antikörperpaarkombination für die Weiterentwicklung des LFA – Verfahrens zum Nachweis des
Fischallergens Parvalbumin gefunden werden. Für die Untersuchungen werden die im Vorfeld
optimierten Methoden (Siehe Punkt 3.3.1 / 3.3.2) eingesetzt. Die 3 verwendeten Fischproben
57
werden 10fach mit PB 10 mM verdünnt, wobei für die beiden Blindwerte erneut PB 10 mM und
Reinstwasser verwendet wird. Tabelle 6 stellt die untersuchten Antikörperpaarkombinationen
dar.
Tabelle 6: Untersuchte Antikörperpaarkombinationen
Versuch Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper
1 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 1G3G11
2 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3G9D5
3 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3D12G7
4 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 1G3G11
5 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 3G9D5
6 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 3D12G7
Die Untersuchungen zur Optimierung der Antikörperpaarkombinationen zeigen, dass
insbesondere die Kombinationen der Versuche 2, 5 und 6 sehr gut harmonieren. Die
Antikörperpaarungen liefern eindeutige Signale, wobei es sich bei der V 2 – Kombination um die
Antikörperpaarung handelt, die bei den im Vorfeld als optimal beschriebenen Methoden
eingesetzt wird. Die Problematik der positiven Blindwerte kann jedoch durch die Experimente
nicht gelöst werden, da in allen 6 Versuchen beide Testreifen (PB 10 mM / Reinstwasser) ein
positives Testergebnis anzeigen. Dabei wird beobachtet, dass die Testliniensignale der
Blindwerte in den Versuchen 1, 3, 4 teilweise stärker sind als die der eigentlichen 3 Fischproben.
Hingegen sind die positiven Blindwerte der Versuche 2, 5, und 6 deutlich schwächer als die
Testliniensignale auf den LFA – Streifen mit dem Fischprotein (Parvalbumin). In Abbildung 20
sind die Ergebnisse des Versuchs 2 dargestellt.
58
Abbildung 20: Antikörperpaarkombination - Versuch 2
Anhand von Abbildung 20 wird ersichtlich, dass insbesondere Kabeljau und Alaska Seelachs
sehr starke Signale aufweisen und diese sich deutlich von den schwach positiven Blindwerten
unterscheiden. Im Vergleich mit den anderen Fischproben liefert Hering eine sehr schwache
Testlinie, wobei dies durch Testschwankungen, z. B. durch unterschiedliche Konjugatqualitäten
die sich aus dem Trocknungsprozess ergeben, hervorgerufen werden kann. Die Testlinie
entwickelt sich bei den Fischproben annähernd einheitlich innerhalb von 3 Minuten und die
Kontrolllinie ist bereits nach 2 Minuten vorhanden, wobei die Intensität über die Zeit
unterschiedlich zunimmt. Bei den Blindwerten zeigt sich die Testlinie erst schwach nach 10
Minuten und die Kontrolllinie nach 5 Minuten. Zum Vergleich mit den sehr guten Signalstärken
aus den Versuchen 2, 5 und 6 enthält Abbildung 21 einen Vertreter der eher schlechten
Antikörperpaarkombinationen (V3).
59
Abbildung 21: Antikörperpaarkombination - Versuch 3
Anhand von Abbildung 21 ist der Unterschied zum Versuch 2 eindeutig zu erkennen. Es wird
ersichtlich, dass die Blindwerte ein stärkeres Testliniensignal erzeugen als die eigentlichen
Proben mit dem Fischprotein Parvalbumin. Die Kontrolllinien bilden sich im Versuch 3 nach 3
Minuten annähernd einheitlich. Bei den Testlinien kann erst nach 25 Minuten eine leichte
Schattierung auf der Testlinie erkannt werden, die in ihrer Intensität nicht weiter zunimmt.
Auf Grund der guten Signalentwicklung mit der Antikörperpaarkombination V 2 und der guten
Erfahrung bei den Vorbereitungen zur LFA – Testdurchführung wird die Paarung in den
Folgeexperimenten weiter eingesetzt. Die Untersuchungen zur optimalen Antikörperpaar-
kombination können die Problematik der positiven Blindwerte nicht lösen, weshalb eine neue
Ursache in Betracht gezogen wird. Dabei wird vermutet, dass die Kombination der behandelten
LFA – Komponenten, insbesondere die Membran und das Konjugatpad, nicht optimal
aufeinander abgestimmt sind und deshalb Wechselwirkungen zwischen den Reagenzien
auftreten. D. h. es wird überlegt, ob das PVP die Membran an der Stelle unzureichend blockt, wo
der primäre Antikörper immobilisiert ist, also zwischen den einzelnen primären Antikörpern, und
es deshalb zur Anlagerung von BSA kommt, das die freien Bindungsstellen der
Nanogoldpartikel blockt. Diese Möglichkeit wird in Betracht gezogen, da sich unmittelbar nach
dem die Flow Front über den immobilisierten primären Antikörper zieht, sich eine schwache
Schattierung auf der Testlinie bildet und demnach eine Wechselwirkung zwischen den
Komponenten definitiv vorhanden ist. Deshalb werden erneut Folgeversuche durchgeführt, um
die beteiligten Komponenten dieser Reaktion zu ermitteln. Dabei werden verschiedene
Vorbehandlungen der LFA – Komponenten miteinander kombiniert, die einerseits in den
Vorversuchen gute Signale entwickelt haben und andererseits noch nicht bei Blind – Testreifen
60
zum Einsatz gekommen sind. Die unterschiedlichen Kombinationen der LFA – Komponenten
sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: Folgeversuche zur Antikörperpaarkombination
Versuch Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp
1 unbehandelt 5% Succrose + 1%
BSA + 0,5% Tween 20 2% Casein HF 240
2 unbehandelt 5% Succrose + 1%
BSA + 0,5% Tween 20
1% BSA + 5%
Succrose HF 240
3 unbehandelt 0,5% BSA + 0,2%
Tween 20
1% PVP + 5%
Succrose HF 240
In den Folgeversuchen zur Antikörperpaarkombination zeigt sich, dass die Kombination aus
Versuch 1 keine positiven Blindwerte erzeugt, d. h. die Vorbehandlung der Membran mit 2%
Casein in PBS 100 mM (pH 7,4) für 30 Minuten ist die optimale Methode zum
Membranblocken. Dabei wird auf eine anschließende Behandlung der Membran mit 5%
Succrose verzichtet. Zudem ist zu erwähnen, dass die Behandlungsart des Konjugatpads und der
Membran von Kolosova (2008) stammt. Es kommt zu keinen Einschränkungen bezüglich der
Signalentwicklung und Farbintensität bei den 3 Fischproben (10fach verdünnt), sodass
Parvalbumin eindeutig detektiert wird bei negativen Blindwerten (PB 10 mM / Reinstwasser).
Durch die Membranbehandlung mit 2% Casein verlangsamt sich die Geschwindigkeit der Flow
Front, sodass mehr Zeit für die Reaktionen (Komplexbildung) zur Verfügung steht. Die
Teststreifen sind nach 7 Minuten komplett durchgelaufen (Sample Pad – Absorbentpad), wobei
sich die Kontrolllinie einheitlich bei allen LFA – Streifen nach 8 Minuten bildet und in ihrer
Intensität nach 20 Minuten am Maximum ist. Die Testlinien bei den 3 Fischproben bilden sich
nach 10 Minuten und können nach 15 Minuten als eindeutig positiv eingestuft werden. Hingegen
kommt es bei den Blindwerten nach 1h zu keiner Testlinienbildung oder schwachem
Schattierungsansatz, sodass diese als eindeutig negativ beurteilt werden. Das Ergebnis des
Versuch 1 ist in Abbildung 22 dargestellt, wobei eine Wiederholung des Versuchs 1 die gleichen
Ergebnisse bringt. Die in den Versuchen 2 – 3 angewandten Vorbehandlungen sind ungeeignet
und führen zu positiven Blindwerten.
61
Abbildung 22: Folgeversuch 1 - Negative Blindwerte
Anhand der Abbildung 22 wird ersichtlich, dass die Fischproben eindeutig positiv und die
Blindwerte eindeutig negativ sind. Auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse werden die Versuche
zur Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze durchgeführt. Die Vorbereitung der Membran wird
dahingehend angepasst, dass an Stelle von 1% PVP in PBS 100 mM (pH 7,4) mit anschließender
5% Succrose Behandlung die Membran lediglich für 30 Minuten in 2% Casein (in PBS 100 mM
pH 7,4) inkubiert wird, um anschließend bei RT über Nacht zu trocknen. Die Vorbereitung der
anderen LFA – Komponenten bleibt unverändert und wird weiterhin nach den unter Punkt 3.3.1
und Punkt 3.3.2 beschriebenen Methoden durchgeführt.
3.4.2 Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze
In den bisher durchgeführten Vorversuchen und Hauptversuchen wird ein funktionsfähiger LFA
– Schnelltest entwickelt und optimiert, sodass das Fischallergen Parvalbumin nachgewiesen
werden kann. Die bei der Testentwicklung eingesetzten Proteinkonzentrationen sind jedoch mit
ca. 4,9 mg/ml (4,9 g/kg) sehr hoch, da bei diesen Versuchen die Signalentwicklung und
Verfahrensoptimierung im Vordergrund stehen. Zum Spurennachweis in Lebensmitteln ist diese
Nachweisgrenze jedoch unzureichend, weshalb Versuche zur Ermittlung der Test –
Nachweisgrenze durchgeführt werden. Der Test zeigt bei den Experimenten eindeutige Signale
bei Test – und Kontrolllinie, wodurch niedrigere Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der
Nachweisgrenze untersucht werden. Die Versuchsvorbereitung wird nach den Punkten 3.3.1 und
3.3.2 durchgeführt, wobei die Membranbehandlung entsprechend der Ergebnisse unter Punkt
3.4.1 (2% Casein zum Blocken) angepasst ist. Die Konzentrationsbereiche der 3 Fischarten
(Parvalbumin) werden in 100er Verdünnungsschritten aufgeteilt (mg/ml - μg/ml – ng/ml), sodass
62
einerseits Material eingespart werden kann und andererseits der Nachweisgrenzenbereich grob
abgeschätzt wird. Für den jeweiligen Konzentrationsbereich werden pro Fischart 2 LFA –
Streifen verwendet, um Schwankungen zwischen den Teststreifen zu erkennen. Des Weiteren
werden pro Versuch 2 Blind – Streifen mit PB 10 mM und Reinstwasser zur Kontrolle
eingesetzt. Das Probevolumen wird bei den Versuchen von 150 μl auf 200 μl pro Testreifen
erhöht. Die untersuchten Konzentrationsbereiche sind in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Konzentrationsbereiche zur Abschätzung der Nachweisgrenze
Bereich Kabeljau Hering Alaska Seelachs
[mg/ml] 4,88 4,90 4,84
[μg/ml] 48 49 48
[ng/ml] 480 490 480
Die Untersuchungen ergeben, dass Kabeljau bis 48 μg/ml nachgewiesen werden kann, jedoch ist
das Testliniensignal bei den Streifen sehr schwach und zeigt sich erst nach 1h in Form einer
leichten Schattierung. Im Vergleich dazu ist das Testliniensignal im Konzentrationsbereich 4,88
mg/ml bereits nach 15 Minuten erkennbar, wobei nach 20 Minuten bei beiden Testreifen ein
eindeutiges Signal vorhanden ist. Im Messbereich 480 ng/ml ist kein Testliniensignal auf den
LFA – Streifen zu erkennen. Die Kontrolllinien aller Testreifen bilden sich nach 5 – 7 Minuten
annähernd einheitlich. Bei den Untersuchungen zur Fischart Hering kann eine Kreuzreaktivität
bis in den Konzentrationsbereich 49 μg/ml nachgewiesen werden, wobei sich das Testlinien-
signal beider LFA – Streifen nach 30 Minuten entwickelt. Im Messbereich 4,9 mg/ml sind auch
hier die Testsignale früher (nach 10 Minuten) zu erkennen. Die Funktionalität aller Teststreifen
wird durch die Bildung der Kontrolllinie bestätigt. Die Kreuzreaktivität des Parvalbumin der
Fischart Alaska Seelachs kann bis in den Konzentrationsbereich 48 μg/ml nachgewiesen werden.
Die Testlinien bilden sich in dem Messbereich nach 50 Minuten, sind jedoch sehr schwach. Die
Kontrolllinien bestätigen die Funktionalität der Teststreifen, wobei alle Blindwerte der
Untersuchungen negativ sind.
Auf Grundlage der ermittelten Ergebnisse kann der Nachweisbereich stärker eingeschränkt
werden, sodass Zwischenverdünnungen (10fach) eingebaut sind. Dadurch soll einerseits die
Signalstärke in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration verdeutlicht werden und andererseits
die Nachweisgrenze aufgezeigt werden, bei der eine eindeutige Detektion noch möglich ist.
Gleichzeitig dient dieser Versuch als Wiederholung des zuvor durchgeführten Versuchs. Dabei
63
ist die Vorgehensweise gleich, wobei die verwendeten Konzentrationsbereiche für die jeweiligen
Fischarten in Tabelle 9 dargestellt sind.
Tabelle 9: Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der Nachweisgrenze
Bereich Kabeljau Hering Alaska Seelachs
[μg/ml] 480 490 480
[μg/ml] 48 49 48
[μg/ml] 4,8 4,9 4,8
Die Folgeversuche zur Ermittlung der Nachweisgrenze zeigen, dass das Kabeljau Protein bis zu
einer Konzentration von 4,8 μg/ml nachweisbar ist. Das Testliniensignal entwickelt sich bei
einem von zwei Streifen nach 40 Minuten und ist nach 55 Minuten schwach zu erkennen. Der
zweite dieser Teststreifen zeigt lediglich eine sehr schwache Schattierung, die nicht als
eindeutiges Signal gewertet wird, da sie kaum zu erkennen ist. Im Konzentrationsbereich ist die
Signalentwicklung deutlicher, wobei sich nach 30 Minuten 2 Testlinien auf beiden Streifen
bilden. Die Intensität der Signale ist schwach, aber als eindeutig positiv zu bewerten. Generell
werden starke Schwankungen bezüglich der Signalentwicklung sowie Intensität innerhalb eines
Messbereichs und zwischen den Messbereichen beobachtet. Es treten bei allen LFA – Streifen
Kontrolllinien auf, sodass diese die Funktionalität der Streifen bestätigten. Die Ergebnisse der
Kabeljau Teststreifen sind in Abbildung 23 dargestellt.
Abbildung 23: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Kabeljau
64
Bei der Fischart Hering kann bei den Folgeversuchen eine Kreuzreaktivität bis zu einer
Proteinkonzentration von 49 μg/ml festgestellt werden. Damit wird die Nachweisgrenze aus den
vorherigen Experimenten bestätigt und nicht weiter verbessert. Die Testliniensignale im
Messbereich 49 μg/ml entwickeln sich unterschiedlich, sodass ein Streifen nach 25 Minuten als
positiv bewertet werden kann und der zweite Streifen erst nach 40 Minuten ein schwaches Signal
bildet, das noch als erkennbar einzustufen ist. Demnach treten auch beim Hering starke
Schwankungen innerhalb eines Messbereichs sowie zwischen den Messbereichen auf. Bei allen
Testreifen der Versuchsreihe bilden sich Kontrolllinien. Die Ergebnisse der Teststreifen sind in
Abbildung 24 dargestellt.
Abbildung 24: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Hering
Es wird durch die Folgeversuche ermittelt, dass Alaska Seelachs bis zu einer
Proteinkonzentration von 48 μg/ml nachweisbar ist und demnach die Kreuzreaktivität aus den
Voruntersuchungen bestätigt wird. Im Messbereich 48 μg/ml können 2 von 2 Testreifen als
positiv eingestuft werden, jedoch tritt eine starke Signalschwankung innerhalb des Messbereichs
auf. Im Vergleich mit den Schwankungen, die bei den anderen Fischarten beobachtet werden,
handelt es sich hierbei um den größten Unterschied zwischen 2 Teststreifen eines Konzen-
trationsbereichs. Die intensive Testlinie des einen LFA – Streifens entwickelt sich bereits nach
15 sehr gut und kann eindeutig als positiv eingestuft werden. Im Vergleich dazu erscheint die
Testlinie des zweiten Streifens erst nach 30 Minuten und zeigt keine Veränderungen in Bezug
auf die schwache Intensität. Alle Teststreifen der Versuchsreihe weisen Kontrolllinien auf,
wodurch die Funktionalität bestätigt wird. Die Versuchsergebnisse der Fischart Alaska Seelachs
65
sind in Abbildung 25 dargestellt, wobei insbesondere auf die starke Signalschwankung im
Konzentrationsbereich 48 μg/ml zu achten ist.
Abbildung 25: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Alaska Seelachs
Die Untersuchungen zur Ermittlung der Nachweisgrenze zeigen, dass Kabeljau bis zum
Konzentrationsbereich 4,8 μg/ml mit dem entwickelten und optimierten LFA – Verfahren
nachweisbar ist. Problematisch ist jedoch die hohe Signalschwankung, insbesondere innerhalb
eines Konzentrationsbereiches, wodurch eine eindeutige Interpretation der Testergebnisse nicht
gewährleistet werden kann. Zudem sind die erzeugten Testsignale auch zwischen den
Messbereichen sehr unterschiedlich, sodass kein deutlicher Zusammenhang zwischen Parv-
albuminkonzentration und Signalintensität erkennbar ist. Dabei stehen die Konjugatpads im
Verdacht, die starken Messschwankungen hervorzurufen, da diese unterschiedliche
Farbintensitäten aufweisen. Demzufolge müssen sich die Konjugatpads, auch innerhalb einer
Charge, hinsichtlich der auf ihnen befindlichen Konjugatmenge unterscheiden. Dies bedeutet,
dass die Konzentration an sekundärem Antikörper und Nanogoldpartikeln zwischen den Pads
variiert und die LFA – Streifen keine einheitlichen Signale entwickeln können. Auslöser dieser
Problematik ist die Herstellung der Konjugatpads, da diese in 10 cm Streifen geschnitten und
anschließend mit Goldkonjugat durchtränkt werden. Dadurch kommt es beim Trocknungs-
prozess zur Aufkonzentrierung des Goldkonjugats an den Padenden des 10 cm – Streifens, was
eine einheitliche Konjugatpadqualität verhindert. Die Ansammlung des Goldkonjugats an den
Padenden wird einerseits durch Kapillarkräfte und andererseits durch die Schwerkraft
hervorgerufen, da die Streifen sich auf Pipettenspitzen zur besseren Trocknung befinden. Die
66
Problematik ist erst bei den Versuchen zur Ermittlung der Nachweisgrenze aufgefallen, da in
diesen geringen Konzentrationsbereichen bereits minimale Veränderungen ausreichen, um die
Sensitivität der LFA – Streifen zu beeinflussen. In den Untersuchungen zur Signalstärken-
optimierung soll die Problematik unterschiedlicher Konjugatpadqualitäten durch Optimierung
des Herstellungsverfahrens gelöst werden, um die Nachweisgrenze zu verbessern und die
Messschwankungen auf ein Minimum zu reduzieren.
3.4.3 Signalstärkenoptimierung & Verbesserung der Nachweisgrenze
In den Versuchen zur Ermittlung der Nachweisgrenze wird festgestellt, dass diese beim
Parvalbumin des Kabeljaus im Bereich 4,9 μg/ml (4,6 mg/kg) liegt, jedoch die starken
Signalschwankungen keine zuverlässige und einheitliche Detektion in diesem Konzentrations-
bereich ermöglichen. Als Ursache für die Problematik wird der Herstellungsprozess des
Konjugatpads ermittelt, insbesondere der Trocknungsprozess. Demnach ist eine Optimierung des
Prozesses erforderlich, um qualitativ gleichwertige Konjugatpads herzustellen, die die
Signalschwankungen auf ein Minimum reduzieren und somit die Zuverlässigkeit des LFA –
Verfahrens erhöhen. Dafür werden die Versuchsvorbereitung der Konjugatherstellung und die
Vorbereitung des Konjugatpads angepasst. Bei der Konjugatherstellung wird das Goldkonjugat
nach dem zweiten Zentrifugieren, im Anschluss an die Abnahme des Überstands, nicht in 500 μl
PB 10 mM (pH 7,0), sondern sofort in 500 μl 5% Succrose - 1% BSA - 0,5% Tween 20 Lösung
(in 40 mM PBS, pH 7,4) resuspendiert. Normalerweise wird diese Lösung erst nach der Zugabe
von 500 μl PB 10 mM zugegeben, um das Laufverhalten des Konjugats und die Sensitivität des
Tests zu verbessern. Durch das Weglassen dieses Zwischenschrittes erhöht sich die
Konzentration des sekundären Antikörpers und die der Nanogoldpartikel im Konjugat. Dabei
wird vermutet, mit dieser Anpassung eine Verbesserung der Signalstärke und der Sensitivität zu
erzielen. Des Weiteren wird die Vorbereitung des Konjugatpads dahingehend angepasst, dass die
glasfaserartigen Konjugatstreifen bereits vor dem Tränken in Goldlösung auf eine Länge von 2
cm geschnitten werden. Dadurch soll verhindert werden, dass das Goldkonjugat sich vorwiegend
an den Padenden des 10 cm Streifens anlagert und zwischen den Konjugatpads qualitative
Unterschiede entstehen. Eine Anlagerung der Goldlösung an den Konjugatpadenden, wenn diese
sich bereits im „Endzustand“ befinden, wird als weniger kritisch betrachtet, da sich durch das
Tränken auf allen Konjugatpads annähernd die gleiche Menge Goldkonjugat befindet. Die
einzelnen Pads werden dabei mittels Pinzette direkt in das Eppendorfgefäß gegeben und
anschließend auf Pipettenspitzen getrocknet. Auf Grund der geringen Länge, die mehr Stabilität
liefert, wird ebenfalls der Einfluss der Schwerkraft beim Trocknen verringert. Alle weiteren
67
Versuchsvorbereitungen werden nach den unter den Punkten 3.3.1 und 3.3.2 beschriebenen
Methoden und nach den beschriebenen Anpassungen zur Membranbehandlung unter Punkt 3.4.1
(2% Casein-beschichtung) durchgeführt. Abbildung 26 zeigt die Trocknung der mit
Goldkonjugat durchtränkten Konjugatpads (links) und die angebrachten Konjugatpads auf den
Teststreifen (rechts).
Abbildung 26: Konjugatpadtrocknung (links) und Teststreifen mit Konjugatpads (rechts)
Anhand von Abbildung 26 wird ersichtlich, dass die durchgeführten Optimierungen, in Bezug
auf die Versuchsvorbereitung, einheitliche und qualitativ gleichwertige Konjugatpads mit einer
intensiven Rotfärbung liefern. Für die Versuche zur Signalstärkenoptimierung werden die
jeweiligen ermittelten Nachweisgrenzen der 3 Fischarten als Ansatzpunkt verwendet, um
Messbereiche für die Untersuchungen festzulegen. Es wird mit einer Verbesserung der
Signalstärke und Sensitivität durch die Anpassungen gerechnet, weshalb die Protein-
konzentrationen der 3 Fischarten weiter verringert werden. Dabei werden pro Messbereich 3
LFA – Streifen eingesetzt, sodass die Messschwankungen besser zu erfassen sind und Rück-
schlüsse auf die Effektivität der Optimierungen gezogen werden können. Es werden erneut 2
Blindstreifen (PB 10 mM, Reinstwasser) eingesetzt, wobei das Probevolumen 200 μl beträgt.
Die Proteinkonzentrationen werden mit PB 10 mM verdünnt. Tabelle 10 enthält die untersuchten
Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze.
68
Tabelle 10: Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze
Kabeljau Hering Alaska Seelachs
4,8 μg/ml 490 μg/ml 480 μg/ml
480 ng/ml 49 μg/ml 48 μg/ml
48 ng/ml 4,9 μg/ml 4,8 μg/ml
Die durchgeführten Anpassungen ergeben bei der Fischart Kabeljau eine Verbesserung der
Signalstärke im Konzentrationsbereich 4,8 μg/ml, wobei es zu keinen Signalschwankungen in
diesem Bereich kommt. Die Testlinien bilden sich bei allen 3 LFA – Streifen einheitlich nach 25
Minuten und die Signalintensität erreicht nach 40 Minuten ihr Maximum. Des Weiteren zeigt
jeweils ein Testreifen im Bereich 480 ng/ml und 48 ng/ml eine sehr schwache Test-
linienschattierung, die sich nach 40 Minuten entwickelt und in ihrer Intensität nicht weiter
zunimmt. Dabei sind alle weiteren LFA – Streifen negativ und erzeugten demnach kein Test-
liniensignal. Außerdem werden alle Streifen als funktionsfähig eingestuft, da sich durchweg nach
6 Minuten Kontrolllinien bilden. Auf Basis der ermittelten Ergebnisse wird die Nachweisgrenze
für Kabeljau (Parvalbumin) auf 4,8 μg/ml festgelegt, da es in diesem Messbereich zu einer
deutlichen Signalentwicklung kommt und keine Signalschwankungen innerhalb des Konzen-
trationsbereichs auftreten. Die Ergebnisse der Versuchsreihe sind in Abbildung 27 dargestellt.
Abbildung 27: Signalstärkenoptimierung Kabeljau
69
Bei der Fischart Hering bewirkt die Optimierung eine Verbesserung der Signalstärke im
Konzentrationsbereich 49 μg/ml, wobei alle 3 Teststreifen ein einheitliches Signal entwickeln
und demnach keine Signalschwankungen auftreten. Die Testlinien bilden sich nach 25 Minuten
und ihre Intensität erreicht ihr Maximum nach 40 Minuten. Im Messbereich 4,9 μg/ml wird keine
Testlinie gebildet, sodass die aus dem Hauptversuch 3.4.2 ermittelte Nachweisgrenze (49 μg/ml)
bestätigt werden kann. Demnach weist der eingesetzte monoklonale Antikörper eine
Kreuzreaktivität gegenüber Hering bis zu einer Proteinkonzentration von 49 μg/ml auf. Die
Teststreifen der Versuchsreihe entwickeln alle eine Kontrolllinie nach ca. 7 Minuten. Bei einem
Teststreifen im Konzentrationsbereich 490 μg/ml treten Probleme beim Laufverhalten auf, die
durch versehentliches Berühren mit der Fingerfläche (Fettabdruck) ausgelöst werden. Die
Ergebnisse sind Abbildung 28 dargestellt.
Abbildung 28: Signalstärkenoptimierung Hering
Bei der Fischart Alaska Seelachs bewirkt die Optimierung eine Verbesserung der Signalstärke
im Konzentrationsbereich 48 μg/ml, wobei geringere Proteinkonzentrationen keine Testlinie
erzeugen. Demnach wird auch in diesem Fall die ermittelte Nachweisgrenze (48 μg/ml) aus dem
Hauptversuch 3.4.2 bestätigt, sodass der monoklonale Antikörper Kabeljau bis zu dieser
Proteinkonzentration eine Kreuzreaktivität aufweist. Bei der Signalentwicklung in diesem
Messbereich kommt es zu keiner Signalschwankung, d. h. alle 3 LFA – Streifen entwickeln
einheitlich nach 25 Minuten eine Testlinie, die in ihrer Intensität nach 40 Minuten das Maximum
erreicht. Zudem werden auch bei dieser Versuchsreihe alle Kontrolllinien nach ca. 7 Minuten
70
gebildet, sodass die Funktionalität des LFA – Verfahrens bestätigt werden kann. Die Ergebnisse
sind in Abbildung 29 dargestellt.
Abbildung 29: Signalstärkenoptimierung Alaska Seelachs
In den Untersuchungen zur Signalstärkenoptimierung wird die Problematik der
Messschwankungen innerhalb eines Konzentrationsbereiches durch die Optimierung der
Konjugatherstellung behoben. Die Erhöhung der Antikörper – und der Goldpartikelkonzentration
durch Verringerung des Resuspendierungsvolumens sowie die Anpassung des
Trocknungsprozesses hinsichtlich einer Verkürzung der zu trocknenden Konjugatstreifen
bewirkt eine deutliche Verbesserung der Signalstärke. Insbesondere die Signalstärke im
Konzentrationsbereich der Nachweisgrenze kann bei den jeweiligen Fischproben optimiert
werden, wobei in diesem Bereich keine Messschwankungen erkennbar sind.
Das Ziel der Hauptversuche, einen LFA – Teststreifen zur Detektion des Fischallergens
Parvalbumin zu entwickeln, der eine hohe Zuverlässigkeit in Verbindung mit einer hohen
Sensitivität aufweist, wird erreicht. Des Weiteren kann durch die Hauptversuche eine
Nachweisgrenze ermittelt werden, die mit den vorhandenen Ressourcen ausgereizt wird.
71
4. Abschlussdiskussion
Das Hauptziel der Arbeit, einen LFA basierenden Schnelltest zum qualitativen Nachweis von
Fischallergenen, insbesondere des Allergens Parvalbumin, zu entwickeln, wird erreicht. Die in
den Hauptversuchen ermittelten Ergebnisse zeigen, dass die Nachweisgrenze des LFA – Tests
bezüglich der Fischart Kabeljau (Fischprotein) bei 4,8 mg/kg liegt und eine Kreuzreaktivität des
eingesetzten monoklonalen Antikörpers gegenüber Alsaka Seelachs (48 mg/kg) und Hering (49
mg/kg) besteht. Diese Sensitivität bezüglich der Nachweisgrenze ist grundsätzlich als positiv zu
bewerten, da laut der Stellungnahme 002/2010 des BfR vom 29.07.2009 der LOAEL für Fisch
zwischen 1 – 100 mg Protein / kg Lebensmittel definiert wird und demzufolge die ermittelte
Nachweisgrenze sich im unteren Bereich der LOAEL – Angabe befindet. Dabei muss jedoch
berücksichtigt werden, dass bei den durchgeführten Untersuchungen lediglich reine Fischproben
eingesetzt werden und deshalb keine Aussagen über das Detektionsverhalten des LFA – Tests in
komplexen Lebensmitteln getroffen werden können. Auf Grund dieser Tatsache müssen
Folgeversuche durchgeführt werden, in denen definierte Mengen Fischprotein (Parvalbumin)
komplexen Lebensmitteln zugesetzt werden, um den Einfluss auf die Sensitivität, Signalstärke
und das Laufverhalten zu untersuchen und die beschriebene Vorbereitung der LFA –
Komponenten ggf. anzupassen. Außerdem ist eine weitere Verbesserung der in den
Hauptversuchen ermittelten Nachweisgrenze erforderlich, weil einerseits die derzeitige
Detektionsgrenze nicht unterhalb des angegebenen LOAEL (1 – 100 mg Protein/kg Lebens-
mittel) liegt und andererseits das BfR die in der Stellungnahme 002/2010 dargestellten LOAEL –
Werte, auf Grund verschiedener Unsicherheiten, als kritisch eingestuft.
Zur Verbesserung der Nachweisgrenze existieren mehrere Möglichkeiten, die sich vorwiegend
auf den Prozess der Konjugatherstellung und der Versuchsvorbereitung beziehen. In den
durchgeführten Experimenten wird zur Konjugatherstellung kolloidales Gold mit einer sehr
geringen OD von 1,1 eingesetzt. Im Gegensatz dazu verwendet Shyu et al. (2002) [14]
kolloidales Gold mit einer OD von 5,0 und Kolosova et al. (2007) [45] setzt sogar kolloidales
Gold mit einer OD von 10,2 ein. Dabei bewirkt kolloidales Gold mit einer hohen OD ein
stärkeres Detektionssignal durch eine intensivere Linienfärbung (höhere optische Aktivität) auch
in geringen Konzentrationsbereichen. Außerdem weist die in den Versuchen eingesetzte
Goldlösung eine Partikelgröße von 40 nm auf und wird nicht eigenständig hergestellt. Wang et
al. (2009) [40] setzt ebenfalls kolloidales Gold mit einer Größe von 40 nm ein, da Goldpartikel
mit zunehmender Partikelgröße instabil werden. Des Weiteren stellt Wang et al. (2009) die
kolloidale Goldlösung eigenständig nach der durch Frens (1973) [46] beschriebenen Methode
her. Dabei besteht die Möglichkeit, Goldpartikel unterschiedlicher Größen bzw. Durchmesser zu
72
produzieren und so das Detektionssignal weiter zu verbessern. Nach Posthuma – Trumpie et al.
(2009) [32] bewirken höhere Partikelgrößen eine Verbesserung der Sensitivität. Die durch Wang
et al. (2009) beschriebene Problematik der zunehmenden Instabilität von Goldpartikeln mit
wachsendem Partikeldurchmesser ist nach Posthuma – Trumpie et al. (2009) nicht eindeutig
geklärt, da mehrere Untersuchungen unterschiedliche Ergebnisse aufweisen. Ein weiterer
wichtiger Parameter für die Konjugatherstellung ist der pH – Wert der kolloidalen Goldlösung,
wobei in den Untersuchungen 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0) zur Komplexbildung zwischen
sekundärem Antikörper und Nanogold eingesetzt wird und für das Blocken der freien
Bindungsstellen 10% BSA – Boraxpuffer (5 mM, pH 9,0) zum Einsatz kommt. Im Gegensatz
dazu verwendet Choi et al. (2010) [42] 100 mM Boraxpuffer (pH 8,5) für die Komplexbildung
und setzt 1% BSA – PBS (10 mM pH 7,4) für das Blocken ein. Nach Wang et al. (2009) hat die
Pufferzusammensetzung einen essentiellen Einfluss auf die Stabilität der Goldpartikel, sodass
dies für die Komplexbildung zwischen Partikel und sekundärem Antikörper sehr wichtig ist. In
Folgeuntersuchungen müssen deshalb verschiedene pH – Werte und Puffer zur Optimierung der
Komplexbildung untersucht werden, weil diese ebenfalls die Sensitivität des LFA beeinflussen.
Safenkova et al. (2010) [44] beschreibt dabei unterschiedliche pH – Werte und Puffer, die zu
berücksichtigen sind. Neben den Eigenschaften der kolloidalen Goldlösung wird in der Arbeit
das Zentrifugieren als Kernprozess der Konjugatherstellung ermittelt, wobei die optimierten
Parameter 8.800 rpm für 60 Minuten bei 4°C betragen. Im Vergleich dazu zentrifugiert
Safenkova et al. (2010) bei 10.000 rpm (4°C) für 30 Minuten und Choi et al. (2010) bei 10.000
rpm für 20 Minuten. In den Untersuchungen zeigt sich, dass die hohen Drehzahlen ein Absetzten
des Goldkonjugats an der Innenwandung des Eppendorfgefäßes bewirken und das Konjugat
unbrauchbar wird. In Bezug auf die Zentrifugierzeit besteht jedoch noch Verbesserungspotential,
weshalb in Folgeexperimenten verkürzte Zeiten bei gleichbleibender Drehzahl untersucht
werden sollten, um den Vorbereitungsprozess zu optimieren.
In den durchgeführten Experimenten werden verschiedene Methoden zur Vorbehandlung der
LFA – Komponenten untersucht. Die nach Kolosova et al. (2008) [41] eingesetzte indirekte
Konjugatpadbehandlung mit 5% Succrose – 1% BSA – 0,5% Tween 20 in PBS (40 mM, pH 7,4)
sowie die Beschichtung der Membran mit 2% Casein liefern die besten Ergebnisse hinsichtlich
Signalentwicklung und Nachweisgrenze. Im Vergleich dazu kommt es beim Blocken der
Membran nach Wang et al. (2009) mit 1% BSA nicht zur Signalentwicklung. Die nach Choi et
al. (2010) beschriebene Behandlung des Sample Pads mit 5% Succrose – 5% Dextran – 0,5%
Tween 20 – 0,05 % Natriumazid führt ebenfalls zu keiner Signalentwicklung, da kein Konjugat
aus dem Konjugatpad eluiert. Ursache dafür ist vermutlich eine Verschlechterung des
73
Resolubilisierungsverhaltens des Konjugats, hervorgerufen durch das unbehandelte Konjugat-
pad. Eine interessante Vorbehandlung der Membran wird durch Guo et al. (2009) [47]
beschrieben, bei der 0,25% BSA – 0,25% PVP – 5% Succrose in PBS (10 mM, pH 8,5)
eingesetzt werden. Eine derartige Kombination von PVP und BSA wird in den durchgeführten
Experimenten nicht untersucht und sollte in Folgeexperimenten näher betrachtet werden, auch
vor dem Hintergrund, dass PVP positive Blindwerte erzeugt. Als optimaler Membrantyp für die
Untersuchungen hat sich die Membran HF Plus 240 etabliert, wobei die nach Kolosova et al.
(2008) eingesetzte HF Plus 75 sowie die nach Wang et al. (2009) verwendete HF Plus 090
schlechte bis gar keine Signale erzeugen. Ein Verbesserungspotential zur Vorbereitung der LFA
– Komponenten besteht bei den Antikörpern (sAK, pAK, IgG), da diese in den Experimenten
unverdünnt eingesetzt werden, um eine hohe Sensitivität zu erreichen. Im Vergleich dazu setzen
Wang et al. (2009) sAK – Konzentrationen von 9,6 μg/ml und pAK Konzentrationen von 1
μg/ml ein. Hingegen beträgt bei Choi et al. (2010) die sAK – Konzentration 100 μg/ml und die
Konzentration von pAK und IgG 1 mg/ml. In diesem Zusammenhang muss berücksichtigt
werden, dass eine Verringerung der Antikörperkonzentration eine Verschlechterung der
Sensitivität zur Folge hat. Zudem muss bei Folgeexperimenten die in den Experimenten
ermittelte minimale Antikörperkonzentration von 0,14 mg/ml zur Stabilisierung von 1 ml
kolloidaler Goldlösung beachtet werden. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die Menge der
immobilisierten Antikörper zu optimieren. In den Untersuchungen werden 2,5 μl unverdünnter
Antikörper (pAK / IgG) pro cm zur Immobilisierung verwendet, wobei nach Kolosova et al.
(2008) 1 μl/cm und im Falle von Wang et al. (2009) 1 μl/cm pAK und 0,5 μl/cm IgG
immobilisiert werden. Eine Reduzierung der Antikörperkonzentration beeinflusst grundsätzlich
die Sensitivität, jedoch sind ebenfalls die wirtschaftlichen Einsparungen zu berücksichtigen.
Der entwickelte Lateral Flow Assay besitzt derzeit eine Detektionsgrenze für Kabeljau von 4,88
mg Fischprotein / kg (4,88 μg/ml) sowie eine Kreuzreaktivität gegenüber Hering (49 mg/kg) und
Alaska Seelachs (48 mg/kg). Im Vergleich dazu weist der durch Faeste et al. (2008) [12]
beschriebene quantitative Sandwich ELISA zum Nachweis von Fischallergenen einen LOD von
5 mg Fisch / kg Lebensmittel (0,01 mg Parvalbumin/kg) auf. Demnach ist die Nachweisgrenze
des entwickelten LFA bereits in einem vergleichbaren Detektionsbereich, wobei Faeste et al.
(2008) ebenfalls Kabeljau untersucht. In diesem Zusammenhang muss jedoch berücksichtigt
werden, dass es sich bei Faeste et al. (2008) um einen validierten Test handelt, der in 4
komplexen Lebensmitteln, wie z. B. Suppe, Brot oder weißer Sauce, den oben genannten LOD
von 5mg/kg erreicht. Im Vergleich dazu wird in den Experimenten Parvalbumin qualitativ in
reinen Fischproben unterschiedlicher Konzentrationen nachgewiesen. Demzufolge ist der
74
Konzentrationsbereiche zwar der gleiche, jedoch ist die Sensitivität der beiden Testverfahren
anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht miteinander vergleichbar. Dafür sind weitere
Untersuchungen in den nach Feaste et al. (2008) beschriebenen komplexen Lebensmitteln
notwendig. Neben dem Sandwich ELISA stellen SPR Biosensoren ebenfalls ein Verfahren zum
Allergennachweis dar. Koppelmann et al. (2006) [4] beschreiben SPR Biosensoren, die einen
LOD von 10 ng/ml (10 μg/kg) aufweisen. Dabei handelt es sich um aufgereinigte Proteine von
Eiern und Milch, die untersucht werden, weshalb ein direkter Vergleich schwierig ist. Anhand
des durch Koppelmann et al. (2006) beschriebenen Detektionslimit im Nanogrammbereich wird
jedoch ersichtlich, dass der entwickelte LFA eine deutlich geringere Sensitivität aufweist und
weitere Optimierungen notwendig sind. Außerdem ist eine Wiederholung der Versuche, in denen
die Nachweisgrenze von 4,88 mg/kg ermittelt wird, erforderlich, sodass eine höhere
Zuverlässigkeit bestätigt werden kann. Nach Posthuma – Trumpie et al. (2009) besitzen jedoch
LFA – Formate im Allgemeinen ein sehr hohes Potential als praktikable Vor – Ort – Schnelltests
auf Grund ihrer einfachen Handhabung, hohen Sensitivität und Zuverlässigkeit, im Gegensatz zu
ELISA und SPR Biosensoren.
Letztendlich stellen die in der Arbeit ermittelten Ergebnisse eine fundierte wissenschaftliche
Grundlage dar, auf deren Basis der entwickelte LFA – Test zum Nachweis von Fischallergenen
weiter optimiert werden kann. In diesem Zusammenhang müssen die im Vorfeld beschriebenen
Sachverhalte in den Folgeexperimenten berücksichtigt werden.
75
5. Zusammenfassung
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines Lateral Flow Assay zum Nachweis von
Fischallergenen, insbesondere Parvalbumin, in Lebensmitteln. Hintergrund ist die Problematik,
dass in der heutigen Zeit allergieauslösende Lebensmittel ein Problem von stetig wachsender
Bedeutung sind und ein hohes gesundheitliches Risiko für die Betroffenen mit ihnen einhergeht.
Im Falle einer Fischallergie ist für über 90% der Betroffenen das Fischallergen Parvalbumin der
Hauptverursacher einer IgE – vermittelten Immunreaktion des Körpers. Die existierenden
Nachweisverfahren, wie z. B. PCR, ELISA oder SPR – Biosensoren, sind sehr zeitaufwendig,
arbeitsintensiv, kostenintensiv und teilweise laborgebunden, zumal deren Durchführung
geschultes und qualifiziertes Personal erfordert. Im Vergleich dazu sind die Vorteile der
immunchromatographischen Technik Lateral Flow Assay kurze Analysezeiten, ein benutzer-
freundliches Format, die lange Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) sowie die kostengünstige
Herstellung. Das Hauptziel der Arbeit ist demnach die Entwicklung eines LFA basierenden
Schnelltests zum qualitativen Nachweis von Fischallergenen, einschließlich dessen Beurteilung
hinsichtlich Funktionalität, Sensitivität und Praktikabilität im Vergleich mit anderen etablierten
Nachweisverfahren. Die Masterarbeit geht dabei auf die Entstehung von Lebensmittelallergien
und den dabei ablaufenden immunologischen Mechanismen im menschlichen Körper ein, wobei
insbesondere die Fischallergie, die rechtlichen Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht
und deren Einfluss auf die Lebensmittelindustrie betrachtet wird. In den durchgeführten
Versuchen zur Entwicklung des LFA wird einerseits die Herstellung von Goldkonjugaten sowie
dessen Optimierung beschrieben und andererseits werden diverse Untersuchungen zur
Verbesserung der verwendeten LFA – Bestandteile Membran, Konjugatpad und Sample Pad
dargestellt. Letztendlich gelingt es, das Hauptziel der Arbeit zu erreichen, einen Kabeljau
spezifischen LFA – Test zu entwickeln und dessen Nachweisgrenze durch weitere Versuche auf
4,88 μg/ml zu optimieren. Außerdem wird eine Kreuzreaktivität der eingesetzten monoklonalen
Antikörper gegenüber den Fischarten Alaska Seelachs (48 μg/ml) und Hering (49 μg/ml)
ermittelt. Fazit der Untersuchungen ist, dass die Sensitivität grundsätzlich als positiv zu bewerten
ist, jedoch weitere Verbesserungen hinsichtlich Detektionslimit und Testeigenschaften, wie z. B.
Laufverhalten, Analysezeit oder Signalstärke, erforderlich sind. Des Weiteren sind
Folgeexperimente in komplexen Lebensmitteln notwendig, um einen praktikablen und sensitiven
Vor – Ort – Schnelltest zu entwickeln. Die Arbeit stellt demnach eine wissenschaftlich fundierte
Grundlage dar, auf der weitere Untersuchungen aufbauen können.
76
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80
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelintoleranzen .............. 7
Abbildung 2: Im menschlichen Organismus vorkommende Abwehr - und Immunzellen ........... 11
Abbildung 3: An spezifischer Immunantwort beteiligte Zelltypen ............................................... 12
Abbildung 4: Übersicht zur spezifischen Immunantwort im menschlichen Organismus ............. 14
Abbildung 5: Aufbau der Antikörpergrundstruktur (IgG) ............................................................ 15
Abbildung 6: Entstehungsprozess einer IgE vermittelten Typ-I-Allergie .................................... 18
Abbildung 7: Karpfenparvalbumin mit 2 Calcium-bindenden Seiten (lila markiert) ................... 21
Abbildung 8: Aufbau eines LFA - Teststreifen ............................................................................. 31
Abbildung 9: Funktionsprinzip des LFA Sandwich – Formats..................................................... 35
Abbildung 10: Mögliche Testergebnisse eines LFA Sandwich - Format ..................................... 36
Abbildung 11: Schematischer Teststreifenaufbau ......................................................................... 42
Abbildung 12: Kalibrierkurve zur Proteinbestimmung der Fischproben ...................................... 43
Abbildung 13: Spektralanalyse zur Optimierung der Konjugationsbedingungen ........................ 45
Abbildung 14: Photometrische Messungen z. Optimierung d. Konjugationsbedingungen .......... 46
Abbildung 15: Abgesetztes Goldkonjugat an der Innenwandung eines Eppendorfgefäßes ......... 48
Abbildung 16: Optimierte Teststreifen der Vorversuche .............................................................. 51
Abbildung 17: Teststreifen Versuche 1 - 3 ................................................................................... 53
Abbildung 18: Testreifen Versuche 4 - 5 ...................................................................................... 54
Abbildung 19: Positive Blindwerte (Wdh. Vorversuch - V6) ....................................................... 56
Abbildung 20: Antikörperpaarkombination - Versuch 2 .............................................................. 58
Abbildung 21: Antikörperpaarkombination - Versuch 3 .............................................................. 59
Abbildung 22: Folgeversuch 1 - Negative Blindwerte .................................................................. 61
Abbildung 23: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Kabeljau ............................ 63
Abbildung 24: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Hering ............................... 64
Abbildung 25: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Alaska Seelachs ................ 65
Abbildung 26: Konjugatpadtrocknung (links) und Teststreifen mit Konjugatpads (rechts) ......... 67
Abbildung 27: Signalstärkenoptimierung Kabeljau ...................................................................... 68
Abbildung 28: Signalstärkenoptimierung Hering ......................................................................... 69
Abbildung 29: Signalstärkenoptimierung Alaska Seelachs .......................................................... 70
81
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Einteilung menschlicher Immunreaktionen ................................................................. 10
Tabelle 2: Barrieren der passiven Resistenz ................................................................................. 10
Tabelle 3: Proteinkonzentration der Fischproben ......................................................................... 44
Tabelle 4: Parameter des Zentrifugierens bei der Konjugatherstellung ........................................ 48
Tabelle 5: Kombination verschiedener Vorbehandlungen der LFA Komponenten ..................... 52
Tabelle 6: Untersuchte Antikörperpaarkombinationen ................................................................. 57
Tabelle 7: Folgeversuche zur Antikörperpaarkombination ........................................................... 60
Tabelle 8: Konzentrationsbereiche zur Abschätzung der Nachweisgrenze .................................. 62
Tabelle 9: Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der Nachweisgrenze ...................................... 63
Tabelle 10: Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze ............................................... 68
82
Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe und keine
anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Neverin, den 24.09.2013 _________________________
Ort, Datum Unterschrift