Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger

Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die

Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider

D. Wuttig 1, B. Baier 2, S. Fuessel 1, M. Meinhardt 3, S. Zastrow 1, C. Höfling 1, M.-O.

Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 2, M.P. Wirth 1

Transkriptomweite Expressionsanalysen

an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen

gefördert von der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung

1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden2 Fachkrankenhaus Coswig, Zentrum für Pneumologie, Beatmungsmedizin,

Thorax- und Gefäßchirurgie3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden

2

Nierenzellkarzinom und Metastasierung

Nierenzellkarzinom (NZK)

dritthäufigster urologischer Tumor

Dtl.: 10.000 Neuerkrankungen/Jahr [RKI, Stand 11/2004]

urolog. Tumor mit höchster prozentualer Todesrate

Metastasen (60% der Patienten; 50-60% in Lunge)

medianes Überleben: 6–12 Monate

Einleitung

metastatic colonization

dormancy

Metastasierung

metastasierungs-assoziierte Faktoren: Angiogenese, Zelladhäsion, Invasion, Migration

[http://www.nccr-oncology.ch]

3

Zielstellung

Zielstellung

molekulare Faktoren, die mit Ausbildung variierender DFI und verschiedener

Mets-Zahlen assoziiert (Microarray-Analysen)

Untersuchungsmaterial

20 kryokonservierte Lungen-Mets von 18 Patienten mit klarzelligem NZK

homogenes Patientenkollektiv: Nephrektomie, keine anderen Tumoren, nur operative

Therapien (außer 1 Pat.), klin. keine distanten Mets vor Lungen-Mets-Diagnose

Patienten mit frühen (synchronen) Mets sowie Patienten mit multiplen Mets

haben extrem schlechte Prognose

molekulare Ebene: „aggressivere“ Tumorherde (höhere Proliferationsrate, aktivierte

Angiogenese, bessere Fähigkeit zu Anlagerung und Anwachsen in Sekundärorganen)

Hypothese

Zielstellung

Untersuchung pulmonaler Mets (1318nm Nd-YAG-Laser, FKH Coswig)

4

Oligonukleotid-Microarrays: Methodik und Auswertung

Material & Methoden

HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix), 47.400 Transkripte (38.500 Gene)

Probenaufarbeitung

Gewebeschnitte RNA cDNA biotinylierte cRNA Fragmentierung

Hybridisierung und Waschen

Scannen

- Detektion via Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (750 nm)

- Fluoreszenzsignal Transkriptmenge

25nt-Sonden auf Glasmatrix

Auswertung (Software: RMAExpress)

- globale Background-Korrektur, Quantil-Normalisierung

- Signalberechnung, Logarithmieren (Pseudonormalisierung)

- differenziell exprimierte Transkripte:

Fold Change = MW Gruppe 1 / MW Gruppe 2 ≥ |1,8| (t-Test, FDR<0,05)

5

Gruppeneinteilung: frühe vs. späte Metastasen

DFI ≤9 Monate (0-9 Mon., Med=1 Mon.; n=5) vs.

DFI 5 Jahre (60-156 Mon., Med=92,5 Mon; n=6)

306 differenziell expr. Transkripte

(„späte Mets“: 279, 27; 414 Sondensets)

Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI I

Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

DFI 5 years

DFI ≤ 9 months

Visualisierung:

Principal component analysis, heat map (Auszug)

DFI ≤ 9 months

DFI ≥ 5 years

6

Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse)

Motilität / Migration der Zellen

Zelladhäsion

Angiogenese

aktiviert in

„späte Mets“

(z.B. KDR, PDGFB, PDGFA, PDGFRB, ETS1, CD31)

Literaturrecherche

lt. Literatur 73/306 (47%) metastasierungsassoziiert

75% in „späten Mets“ reguliert wie für Tumoren beschrieben

unerwartet, da Patienten mit „frühen Mets“ schlechtere Prognose haben

Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte

Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

„späte Mets“ weisen höheres metastatisches Potential auf als „frühe Mets“

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306 Gene (414 Sondensets) Vorhersagemodell (k-nearest neighbouring)

Tumorbiologische Ursache?

molekularen Unterschied zwischen synchronen und metachronen Mets

Theorie

Primärtumor bei Mets-Wachstum noch anwesend und somit selbst in der Lage

zur Metastasierung metastatisches Potential der Mets gering

Primärtumor bereits entfernt bei Beginn des Mets-Wachstums

Mets entwickeln von Beginn an höheres Metastasierungspotential

Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

frühe Mets (DFI ≤ 9 Monate) späte Mets (DFI ≥ 5 Jahre)

1/8 Mets (DFI=15 Monate) 7/8 Mets (DFI=11 - 30 Monate)

8 Mets (DFI = 11 – 30 Monate)

8

viele Mets wenige Mets

Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl I

135 differenziell exprimierte Transkripte

(„viele MS“: 50, 85; 163 Sondensets)

Visualisierung:

Principal component analysis, heat map

Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

Gruppeneinteilung: wenige vs. viele Metastasen

≤8 (1-8, Med=3, n=10) vs. 16 (16-80, Med=24, n=7) Lungen-Mets/Pat.

(klinisch: längeres Überleben für ≤9 vs. >9 Mets) [Rolle et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2006]

viele Mets

wenige Mets

9

Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte

Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

Grund für Unterschiede in MS-Anzahl sind möglicherweise

verschiedene Wachstumseigenschaften der Tumorzellen

Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse)

Zellteilung und Zellzyklus (z.B. PBK, Survivin, PTTG1)

aktiviert in „viele Mets“

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Erstellung von Vorhersagemodellen

Ausgangspunkt:

Sondensets, deren differenzielle Expression mit zwei weiteren mathematischen

Algorithmen validiert (GCOS, dCHIP)

k-nearest neighbouring, weighted voting

Vorhersagemodell zum DFI (11 + 1 Mets)

6-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation

richtige Einordnung einer weiteren Proben

Ergebnisse: Vorhersagemodelle

Vorhersagemodell zur Metastasenanzahl (17 + 3 Mets)

11-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation

richtige Einordnung dreier weiterer Proben

Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential

11

0,001

0,01

0,1

1

10

1 2

Fold Change=5,5 p=0,004*

(n=6)

(n=5)

0,1

1

10

1 2

0,1

1

10

1 2

späte Mets frühe Metsviele Mets wenige Mets

Fold Change=2,5 p=0,002*

(n=10) (n=19)

Validierung der Microarray-Ergebnisse

Ergebnisse: Validierung

Expression von 6 Genen mittels quantitativer PCR validiert (TBP, CP)

PTTG1 (pituitary tumor-transforming 1) GALNTL2

( Median; * zweiseitiger t-Test basierend auf log2-Daten)

(n=7)(n=10)

Fold Change=2,7 p=0,001*

Übe

rexp

ress

ion

rela

tiv z

u fik

tive

r P

robe

mit

CP

=0

Fold Change=5,1 p=0,001*

(n=11)(n=8)

Array: Fold Change=2,1 p=0,002 Array: Fold Change=3,4 p=0,002

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Zusammenfassung und Ausblick

molekulare Unterschiede verschiedener Mets-Charakteristika:

verschiedene DFI spielgeln sich in unterschiedlichem metastatischen

Potential der Mets wider

verschiedene Mets-Zahlen aufgrund variierendem Wachstumspotentials

Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential

Ausblick

Primärtumoren einbeziehen:

Microarrays, Validierung (qPCR, Immunhistochemie)

prognostisch relevante Gensignaturen Therapieregime anpassen

Zusammenfassung