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Aus der Klinik und Poliklinik für Allgemeine Chirurgie, Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie
(Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. C. D. Heidecke)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Die Wirkung des
CCR4-Chemokin-Rezeptors auf die
Progression des Pankreaskarzinoms im murinen
orthotopen syngenen Pankreaskarzinommodell
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades eines
Doktors der Medizin
(Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2017
Vorgelegt von:
Felix Erne
geb. am 05.11.1984
in Konstanz
2
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. P. Baur
1. Gutachter: Prof. Dr. med. W. von Bernstorff
2. Gutachter: Prof. Dr. med. R. Jaster
Tag der Disputation: Mittwoch, der 06.12.2017
3
4
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................ 4
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................................... 7
Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................. 7
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................ 7
EINLEITUNG ........................................................................................................................................... 10
Anatomie und Physiologie des Pankreas .......................................................................................... 10
Das humane Pankreaskarzinom ........................................................................................................ 13
Pathologie ...................................................................................................................................... 13
Epidemiologie ................................................................................................................................ 14
Risikofaktoren, Prophylaxe und Risikogruppen ............................................................................ 14
Primärdiagnostik ........................................................................................................................... 17
Kurative Therapie .......................................................................................................................... 20
Palliative Therapie ......................................................................................................................... 27
Das murine Pankreaskarzinom .......................................................................................................... 29
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor und seine Liganden .......................................................................... 30
Zytokine und Chemokine ............................................................................................................... 30
Chemokin-Rezeptoren ................................................................................................................... 31
CCR4-Chemokin-Rezeptor ............................................................................................................. 32
Spezifische Liganden des CCR4-Chemokin-Rezeptors ................................................................... 34
CCR4-Chemokin-Rezeptor als Therapieziel ................................................................................... 35
Makrophagen und ihre Rolle im Tumormilieu .................................................................................. 37
Makrophagen ................................................................................................................................ 37
Tumor-assoziierte Makrophagen .................................................................................................. 38
Makrophagen und der CCR4-Chemokin-Rezeptor ........................................................................ 38
Tumor-assoziierte Makrophagen als Therapieziel ........................................................................ 39
FRAGESTELLUNG DER ARBEIT ............................................................................................................... 41
Einleitende Übersicht und Fragestellung .......................................................................................... 41
Versuchsplanung ............................................................................................................................... 41
5
MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................................. 43
Material ............................................................................................................................................. 43
Geräte ............................................................................................................................................ 43
Verbrauchsmaterialien .................................................................................................................. 43
Versuchstierkäfige und Käfigzubehör ........................................................................................... 45
Versuchstiere ................................................................................................................................. 45
Zelllinie .......................................................................................................................................... 45
Software ........................................................................................................................................ 46
Methoden .......................................................................................................................................... 47
Zelllinie und Zellkultur ................................................................................................................... 47
Versuchstierhaltung und Versuchstiere ........................................................................................ 47
Planung, Vorbereitung, Methode und Durchführung der Operation ........................................... 49
Durchführung der Volumenmessung ............................................................................................ 51
Erstellung der Überlebenskinetik .................................................................................................. 53
Immunhistochemische Färbung in der Kryostat-Histologie .......................................................... 53
Immunhistochemische Färbung in der Paraffin-Histologie ........................................................... 54
Migrationsanalyse ......................................................................................................................... 55
Statistische Auswertung .................................................................................................................... 57
Software ........................................................................................................................................ 57
Kaplan-Meier-Kurve und Log-rank-Test ........................................................................................ 57
Gepaarter und ungepaarter t-Test, F-Test .................................................................................... 57
ERGEBNISSE ........................................................................................................................................... 59
Einleitung ........................................................................................................................................... 59
Vorversuche ...................................................................................................................................... 59
Tumorvolumen .................................................................................................................................. 59
Überlebenskinetik ............................................................................................................................. 61
Makrophageninfiltration ................................................................................................................... 62
Makrophagenmigration .................................................................................................................... 63
Zusammenfassung der Ergebnisse .................................................................................................... 65
DISKUSSION ........................................................................................................................................... 66
Einleitung zur Diskussion ................................................................................................................... 66
Tumor-assoziierte Makrophagen als Therapieziel ............................................................................ 66
Limitationen und technische Herausforderungen im Versuchsaufbau ............................................ 68
Manus manum lavat – Tumorzellen u. tumorassoziierte Makrophagen in der Tumorprogression . 70
6
Quid pro quo – regulatorische T-Zellen und tumorassoziierte Makrophagen in der
Tumorprogression ............................................................................................................................. 71
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor als Therapieziel ................................................................................ 73
ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................................... 75
ANHANG ................................................................................................................................................ 76
Literaturverzeichnis ........................................................................................................................... 76
Danksagung ....................................................................................................................................... 83
7
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 - Anatomie des Pankreas in situ .......................................................................... 10
Abbildung 2 - Anatomische Lage und Verlauf des Pankreasgangs ......................................... 11
Abbildung 3 - Histologischer Aufbau des Pankreas ................................................................ 12
Abbildung 4 - Ergebnisse der Tumorvolumenmessung im MRT nach 3 und 5 Wochen ........ 60
Abbildung 5 - Ergebnisse der Überlebenskinetik .................................................................... 61
Abbildung 6 - Ergebnisse der Makrophageninfiltration im Tumorgewebe ............................. 62
Abbildung 7 - Ergebnisse der Makrophagenmigration zu Tumorzellen .................................. 64
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 - Karnofsky-Index und Index zur Lebensqualität der ECOG .................................. 28
Tabelle 2 - Materialliste Geräte ................................................................................................ 43
Tabelle 3 - Materialliste Verbrauchsmaterial ........................................................................... 44
Tabelle 4 - Materialliste Versuchstierkäfige und Käfigzubehör .............................................. 45
Tabelle 5 - Versuchstiere .......................................................................................................... 45
Tabelle 6 - Zelllinie .................................................................................................................. 45
Tabelle 7 - Materialliste Software ............................................................................................ 46
Tabelle 8 - Belastungs-Score bei Mäusen mit einem Pankreaskarzinom ................................ 49
Abkürzungsverzeichnis
AJCC American Joint Committee on Cancer
ATLL Adulte T-Zell-Leukämie (Adult T-cell leukemia/lymphoma)
C57BL/6 Wildtypmaus, Inzuchtstamm mit vollständig sequenziertem Genom
CA 19-9 Carbohydrate-Antigen 19-9
CCL17 CC-Motiv-Ligand 17, auch als Thymus and activation-regulated
chemokine (TARC) bezeichnet
CCL22 CC-Motiv-Ligand 22, auch als Macrophage-derived chemokine
(MDC) bezeichnet
CRM Zirkumferentieller Resektionsrand (Circumferential Resection Margin)
CSF kolonie-stimulierender Faktor (Colony Stimulating Factor)
8
CSF1R kolonie-stimulierender Faktor-1-Rezeptor (Colony stimulating factor
1-Receptor)
CT Computertomographie
CTLA-4 Zytotoxisches-T-Lymphozyten-assoziiertes-Protein 4 (cytotoxic T-
lymphocyte-associated protein 4)
DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung
ECOG Eastern Cooperative Oncology Group
EORTC European Organisation for Research and Treatment of Cancer
ERCP Endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie
FACS Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated cell sorting)
FAMMM-Syndrom Familiäres atypisches multiples Muttermal Syndrom
FBA Fetales Kälberserum (Fetal Bovine Serum Albumin)
FDG-PET 2-Fluor-2-desoxy-D-glucose Positronen-Emissions-Tomographie
FPC Familiäres Pankreaskarzinom (Familial Pancreatic Carcinoma)
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor (G Protein-Coupled Receptor)
HNPCC-Syndrom hereditäres nicht-Polyposis-assoziiertes kolorektales Karzinom
(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer), auch als Lynch-
Syndrom bezeichnet
IFN Interferon
IL Interleukin
MDC Makrophagenstämmiges Chemokin (Macrophage-derived chemokine),
auch als CC-Motiv-Ligand 22 (CCL22) bezeichnet
min Minuten
MRCP Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie
MRT Magnetresonanztomographie, auch als Kernspintomographie
bezeichnet
mm Millimeter
ms Millisekunden
PanIN intraepitheliale Neoplasie des Pankreas (Pancreatic Intraepithelial
Neoplasia)
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphat Buffered Saline)
PDA duktales Adenokarzinom des Pankreas (Pancreatic Ductal
Adenocarcinoma)
PD-L1 Programmierter-Zelltod-Protein 1 (Programmed cell death protein 1)
Penstrep Antibiotikamischung mit Penicillin und Streptomycin, wird verwendet
gegen eine bakterielle Kontamination von Zellkulturen
QLQ standardisierter Fragebogen der EORTC zur Lebensqualität (Quality of
life questionnaire)
TARC thymusaktivitätsreguliertes Chemokin (Thymus and activation-
regulated chemokine), auch als CC-Motiv-Ligand 17 (CCL17)
bezeichnet.
TNF Tumornekrosefaktor
TNFRSF9 Tumornekrosefaktor 9 (tumor necrosis factor receptor superfamily
member 9)
9
TNM-Klassifikation Internationale Klassifikation der UICC zur Einteilung maligner
Tumoren
TAMs tumor-assoziierte Makrophagen
Tregs regulatorische T-Zellen
UICC Internationale Vereinigung gegen Krebs (Union internationale contre
le cancer)
10
EINLEITUNG
Anatomie und Physiologie des Pankreas
Das Pankreas ist ein Drüsenorgan des Verdauungstraktes mit endokrinen und exokrinen
Anteilen. Der Name leitet sich aus dem Altgriechischen ab, von „πάγ-„ für „alles“ und „κρεας“
für „Fleisch“ und beschreibt das makroskopische Erscheinungsbild. Im Deutschen wird das
Organ als „Bauchspeicheldrüse“ bezeichnet.
Abbildung 1 - Anatomie des Pankreas in situ
(Mit Zustimmung der Thieme Verlagsgruppe aus „Prometheus, LernAtlas der Anatomie, Hals
und Innere Organe, 2005“)
11
Das Pankreas liegt sekundär retroperitoneal an der Rückwand der Bursa omentalis auf Höhe
des zweiten Lendenwirbelkörpers. Es wird makroskopisch in drei Teile geteilt, man
unterscheidet Caput, Corpus und Cauda pancreatis. Das Caput wird c-förmig vom Duodenum
umlagert, die Cauda grenzt nahe an die Milz. Durch die enge nachbarschaftliche Lage zu den
großen Bauchgefäßen und die Überdeckung durch andere große Bauchorgane ist ein
chirurgischer Zugang sehr komplex. Die arterielle Blutversorgung wird sowohl aus dem
Truncus coeliacus, als auch aus der Arteria mesenterica superior rekrutiert. Die Versorgung
erfolgt über die sogenannte Pankreasarkade, welche mit mehreren Anastomosen untereinander
verbunden ist. Die venöse Anbindung erfolgt über die Vena porta. Der Lymphabfluss verläuft
über die lokalen Lymphknoten zur Cisterna chyli und den Ductus thoracicus. In der
Embryonalentwicklung wachsen die ventrale und dorsale Anlage in das jeweilige
Mesoduodenum ein. Diese verschmelzen durch Drehung und unterschiedliche Entwicklung der
einzelnen Knospen in der Regel zu einem zusammenhängenden Drüsenorgan mit einem
durchgehenden Drüsengang.
Abbildung 2 - Anatomische Lage und Verlauf des Pankreasgangs
(Mit Zustimmung der Thieme Verlagsgruppe aus „Prometheus, LernAtlas der Anatomie, Hals
und Innere Organe, 2005“)
12
Der Drüsengang, der sogenannte Ductus pancreaticus, leitet die exokrinen Syntheseprodukte
des Pankreas in das Duodenum. Etwa 98% der Organmasse produzieren diesen exokrinen
„Bauchspeichel“, welcher zu großen Teilen aus Enzymen zur Verdauung von
Nahrungsbestandteilen besteht. Hierzu zählen unter anderem Enzyme und Enzymvorstufen
zum Verdau von Eiweißen, Stärke und Fetten, wie z. B. Trypsinogen, Chymotrypsinogen,
Procarboxypeptidasen, Proelastasen, α-Amylasen, Ribo- und Desoxyribonukleasen und
Lipasen. Bei der exokrinen Pankreasinsuffizienz werden nicht mehr ausreichend viele
pankreatische Verdauungsenzyme sezerniert. Dies führt zu Maldigestion, Malabsorption und
letztlich zur krankhaften Mangelernährung. Eine pharmakologische Behandlungsmöglichkeit
ist die Substitution von Pankreasenzymen. Etwa 2% der Organmasse produzieren endokrine
Syntheseprodukte. Die verschiedenen Zellen sind in sogenannten Langerhans-Inseln
organisiert und produzieren unter anderem Glucagon (α-Zellen), Insulin (β-Zellen),
Somatostatin (δ-Zellen), Pankreatisches Polypeptid (PP-Zellen) und Ghrelin (ε-Zellen). Durch
Insulin und Glucagon kann der Blutzuckerspiegel kontrolliert werden.
Abbildung 3 - Histologischer Aufbau des Pankreas
(Mit Zustimmung der Thieme Verlagsgruppe aus „Prometheus, LernAtlas der
Anatomie, Hals und Innere Organe, 2005“)
13
Die bekannteste Form der endokrinen Pankreasinsuffizienz im weitesten Sinne ist der Diabetes
mellitus. Hier liegt ein Missverhältnis von Insulinbedarf und Blutzuckerspiegel vor. Der
Krankheitsverlauf und die Auswirkung des Diabetes mellitus können häufig durch Lifestyle-
Modifikationen beeinflusst werden. Die pharmakologische Therapie stützt sich je nach
Krankheitsschwere auf unterstützende Medikamente und letztlich auf Insulingaben [1-3].
Operative Therapieansätze am Pankreas werden meistens im Therapiekontext eines
Pankreaskarzinoms indiziert. Seltener besteht eine Operationsindikation aufgrund chronischer
oder nekrotisierender Pankreatitiden. Seit der Erstbeschreibung einer Pankreasresektion durch
Kausch et al. im Jahre 1909 hat sich die Operationstechnik stetig weiterentwickelt. Whipple et.
al. beschrieben 1935 die erste radikale Pankreaskopfresektion. Watsen et al. beschrieben 1944
die erste Pylorus-erhaltende partielle Pankreatoduodenoektomie. Im Laufe der Jahre sind
zahlreiche Resektions- und Drainageoperationen hinzugekommen. In den letzten Jahren
erfolgte ein deutlicher Wandel hin zu organsparenderen Verfahren. Bei malignen Tumoren des
Pankreaskopfes wird die Operation heute in aller Regel pyloruserhaltend durchgeführt. Dabei
hat sich aktuell die weiterentwickelte und 1978 veröffentlichte partielle
Duodenopankreatektomie nach Traverso und Longmire zunehmend durchgesetzt. Insgesamt
werden in Deutschland jährlich schätzungsweise etwa 10.000 operative Eingriffe an der
Bauchspeicheldrüse durchgeführt [1, 4].
Das humane Pankreaskarzinom
Pathologie
Über 95% der Pankreaskarzinome sind Adenokarzinome. Sie entstehen in der Regel durch
maligne Entartung des exokrinen Anteils des Pankreas. Nach derzeitigem Wissensstand
entsteht das exokrine Pankreaskarzinom meist aus einer prämalignen Vorstufe des Epithels im
Pankreasgang, der sogenannten PanIN (pankreatischen intraepithelialen Neoplasie). Darüber
hinaus gibt es zystische Tumoren, die ebenfalls aus den Gangzellen hervorgehen, oder azinäre
Tumoren, die von den sekretproduzierenden Parenchymzellen des Pankreas ausgehen. Seltener
sind endokrine Tumoren, die sich von den stoffwechselaktiven Zellen der Langerhans-Inseln
ableiten [5].
14
Epidemiologie
Im Jahr 2010 erkrankten in Deutschland über 16.000 Menschen an Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Aufgrund der ungünstigen Prognose verstarben fast ebenso viele Betroffene daran. Seit Ende
der 1990er Jahre sind die altersstandardisierten Erkrankungs- und Sterberaten nahezu konstant.
Die absolute Zahl von Neuerkrankungs- und Sterbefällen steigt stetig [6]. Männer und Frauen
sind in etwa gleich häufig betroffen. In der Statistik der Krebsneuerkrankungen in Deutschland
nimmt das Pankreaskarzinom bei Männern den 9. Platz und bei Frauen den 7. Platz ein. Die
meisten Betroffenen erkranken im höheren Lebensalter. Das mittlere Erkrankungsalter liegt für
Männer bei 70 Jahren, für Frauen bei 76 Jahren [5]. Obwohl Pankreaskarzinome auch vor dem
50. Lebensjahr auftreten können, zeigen die altersabhängigen Inzidenzkurven erst einen
Anstieg ab dem 50. Lebensjahr [7]. Das Pankreaskarzinom weist die niedrigste Überlebensrate
unter allen Krebserkrankungen auf und ist die vierthäufigste Krebstodesursache [6].
Verantwortlich dafür sind unter anderem die späte Diagnosestellung, die frühe Metastasierung
und die aus beiden Aspekten resultierende geringe Anzahl kurativer Resektionen [3]. Die
jährliche Inzidenz und Mortalitätsrate des Pankreaskarzinoms liegen sehr nahe beieinander, ein
Langzeitüberleben ist eher die Ausnahme [5].
Risikofaktoren, Prophylaxe und Risikogruppen
Im Rahmen der Krebsprophylaxe besteht die Absicht, Krebserkrankungen durch Erkennung
und Unterbindung kausaler Zusammenhänge zu verhindern. Hier werden unter anderem
ernährungsphysiologische, soziokulturelle, berufsspezifische und genetische Zusammenhänge
erforscht.
In einer ausführlichen Literaturübersicht des „World Cancer Research Funds“ im Jahr 1997
wurden einige Zusammenhänge zwischen Ernährungsfaktoren und dem Pankreaskarzinom als
wahrscheinlich angesehen. Keine der Assoziationen wurde als überzeugend eingestuft. Seitdem
wurden immer wieder Assoziationen von Ernährungsfaktoren und dem Auftreten von
Pankreaskarzinomen angedeutet. Dem gegenüber stehen Forschungsergebnisse, die einen
Zusammenhang negieren. Nach der aktuellen Studienlage kann keine spezifische
Ernährungsempfehlung gegeben werden, um das Risiko an einem Pankreaskarzinoms zu
erkranken zu vermindern. Zur Risikoreduktion von Krebserkrankungen sollten die aktuellen
Ernährungsempfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung (DGE) beachtet werden.
15
Es ist für das Pankreaskarzinom nicht eindeutig belegt, dass durch erhöhte Obst- und
Gemüseaufnahme eine Senkung des Erkrankungsrisikos bewirken zu können [5]. Dennoch
wird eine Empfehlung zur Förderung des Obst- und Gemüsekonsums als wünschenswert
eingestuft, da regelmäßiger Obst- und Gemüsekonsum das Krebsrisiko generell senkt [8]. Eine
Zufuhr Vitamin-C-haltiger Nahrung ist möglicherweise förderlich zur Dezimierung des
Pankreaskarzinomrisikos. Dies zeigen mehrere Studien, welche aber zum Teil in ihrer
Empfehlungsstärke limitiert sind [5]. Eine fett- und cholesterinarme Ernährung trägt nicht zur
Reduktion des Pankreaskarzinomrisikos bei. Eine Verminderung der Aufnahme von rotem
Fleisch, sowie eine bevorzugte Aufnahme von weißem Fleisch kann nicht mit der Reduktion
des Pankreaskarzinomrisikos vereinbart werden. In der Literatur beschriebene positive
Assoziationen bezüglich des Fleischkonsums werden eher mit der Zubereitungsart in
Verbindung gebracht. Der Verzehr geräucherter und gegrillter Speisen kann mit einem erhöhten
Risiko für ein Pankreaskarzinom assoziiert sein. Eine vermehrte Aufnahme von Fisch zur
Senkung des Pankreaskarzinomrisikos kann nicht empfohlen werden. Es gibt Hinweise, dass
ein erhöhter Zuckerkonsum mit einem erhöhten Risiko des Pankreaskarzinoms assoziiert ist.
Ein möglicher statistisch signifikanter Zusammenhang wurde jedoch nur für Frauen berichtet.
Eine allgemeine Empfehlung zur Reduktion der Zuckerzufuhr kann nicht ausgesprochen
werden. Eine erhöhte allgemeine Aufnahme von Milch und Milchprodukten führt nicht zu einer
Reduktion des Pankreaskarzinomrisikos. In zahlreichen Studien wurde kein Zusammenhang
zwischen moderatem Alkoholkonsum und dem Pankreaskarzinomrisiko festgestellt. Der
Verzicht auf exzessiven Alkoholkonsum kann zur Verringerung des Pankreaskarzinomrisikos
empfohlen werden. Exzessiver Alkoholkonsum wurde in einzelnen Studien mit dem
Pankreaskarzinom assoziiert. Daher sollte der Alkoholkonsum auf ein moderates Maß
beschränkt werden, zumal ein erhöhter Alkoholkonsum auch im Zusammenhang mit der
Pathogenese anderer Krebserkrankungen diskutiert wird und chronische Pankreas- und
Lebererkrankungen zur Folge haben kann. Ein allgemeiner Verzicht auf Kaffee- oder
Teekonsum zur Senkung des Pankreaskarzinomrisikos kann nicht gegeben werden, hier
konnten keine Zusammenhänge nachgewiesen werden.
Ergebnisse aus Familienstudien zeigen, dass bestimmte Lebensgewohnheiten das Risiko, an
einem Pankreaskarzinom zu erkranken, erhöhen. Adipositas ist mit einem erhöhten
Pankreaskarzinomrisiko assoziiert. Übergewicht sollte daher vermieden werden [5].
Übergewichtige Personen scheinen von körperlicher Bewegung besonders zu profitieren. Die
Förderung der Bewegung vor dem Hintergrund der Gewichtsregulierung hat daher einen hohen
Stellenwert [9]. Der Tabakkonsum in Form von Zigaretten- oder Zigarrenrauchen verdoppelt
16
nachweislich das Risiko an einem Pankreaskarzinom zu erkranken. Dieser Zusammenhang ist
konsistent durch mehrere Kohorten- und Fall-Kontroll-Studien belegt. Individuelle genetische
Faktoren scheinen den Grad der Assoziationen zu beeinflussen. Selbst zwischen Passivrauchen
und dem Pankreaskarzinomrisiko wurde ein Zusammenhang gefunden. Der Verzicht auf
Tabakkonsum kann zur Reduktion des Pankreaskarzinomrisikos beitragen [5].
Die Möglichkeit einer medikamentösen Senkung des Erkrankungsrisikos war Gegenstand
aktueller Studien. Eine medikamentöse Prophylaxe zur Verminderung des
Pankreaskarzinomrisikos ist derzeit nicht bekannt. Insbesondere die Supplementierung von
Antioxidantien oder die Einnahme nicht-steroidaler Antirheumatika führte zu keiner Reduktion
des Pankreaskarzinomrisikos [5].
Einige Berufs- und Arbeitsfelder scheinen mit einem geringfügig erhöhten Erkrankungsrisiko
assoziiert zu sein. Der Kontakt mit Pestiziden, Herbiziden und Fungiziden könnte
möglicherweise das Pankreaskarzinomrisiko erhöhen. Weitere potenzielle Risikofaktoren
können chlorierte Kohlenwasserstoffe, Chrom und Chromverbindungen, elektromagnetische
Felder und Kraftstoffdämpfe sein [5].
Das Risiko, an einem Pankreaskarzinom zu erkranken, wird durch Erkrankungen des Pankreas
erhöht. Das gilt für Patienten mit einer hereditären Pankreatitis ebenso wie für Patienten mit
einer langjährigen chronischen Pankreatitis. Bei Patienten mit einem Diabetes mellitus Typ 2
besteht ebenfalls ein erhöhtes Risiko für das Auftreten eines Pankreaskarzinoms. Hier wird in
verschieden Studien von einer bis zu 8-fachen Risikoerhöhung berichtet [5].
Das Risiko, an einem Pankreaskarzinom zu erkranken, wird durch genetische Dispositionen
erhöht. Für Verwandte ersten Grades eines Patienten mit Pankreaskarzinom ist das Risiko um
das 2-fache erhöht. Ist das Erkrankungsalter des Patienten unter 60 Jahre, so erhöht sich das
Risiko auf das 3-fache. Gibt es in der Familie zwei Betroffene mit Pankreaskarzinom, erhöht
sich das Risiko eines erstgradig Verwandten auf das 18-fache. Tritt in einer Familie bei mehr
als einem erstgradig Verwandten ein Pankreaskarzinom auf, so spricht man nicht mehr vom
sporadischen Pankreaskarzinom, sondern vom Familiären Pankreaskarzinom (FPC). Ein
spezifischer Gendefekt für das FPC konnte nur in einer kleinen Subgruppe (etwa 10%) der FPC-
Familien nachgewiesen werden. Daher ist aktuell eine breite prädiktive Gendiagnostik
außerhalb von Studien nicht sinnvoll. Eine genetische Beratung muss in jedem Fall erfolgen,
denn das FPC muss von anderen hereditären Syndromen abgegrenzt werden. Die Studienlage
beschreibt ein erhöhtes Pankreaskarzinomrisiko beim Peutz-Jeghers-Syndrom, beim FAMMM-
17
Syndrom (Familiäres atypisches multiples Muttermal Syndrom), beim hereditärem Mamma-
und Ovarialkarzinom und bei der FAP (Familiäre Adenomatöse Polyposis). Eine fragliche
Erhöhung ist mit dem HNPCC-Syndrom (hereditäres nicht-Polyposis-assoziiertes kolorektales
Karzinom Syndrom) und dem Li-Fraumeni-Syndrom verbunden. Kein erhöhtes Risiko konnte
für die zystische Fibrose und die Ataxia teleangiektatika nachgewiesen werden. Auch für
Angehörige von Pankreaskarzinompatienten gelten die allgemeinen Empfehlungen zur
Pankreaskarzinomrisikoreduktion. Es existiert derzeit keine wissenschaftliche Evidenz für den
Nutzen von davon abweichenden Maßnahmen [5].
Primärdiagnostik
Klinische Diagnostik
Es gibt keine für das Pankreaskarzinom spezifischen Symptome oder Symptomkombinationen.
Dies erschwert die Diagnosestellung. Prinzipiell ist bei neu aufgetretenen Oberbauch- und
Rückenschmerzen, die durch eine Pankreatitis oder ein Pankreaskarzinom ausgelöst sein
könnten, eine weitere Diagnostik erforderlich. Dazu gehören alters- und geschlechtsunabhängig
neu aufgetretene Schmerzen, die lokalisiert und/oder gürtelförmig in den Rücken ausstrahlen
und des Nachts wahrnehmbar sind. Je höher das Patientenalter und die Anzahl weiterer
Symptome sind, umso dringlicher sollte eine weiterführende Diagnostik erfolgen. Zu den
weiteren Symptomen gehören z. B. Inappetenz, Gewichtsverlust und Schwäche. Auch ein neu
aufgetretener schmerzloser Ikterus sollte eine weitere diagnostische Untersuchung bedingen.
Denn bei über 60-jährigen Patienten sind Pankreas- oder Gallengangskarzinome die häufigste
Ursache für einen neu aufgetretenen Ikterus [5]. Obgleich Pankreaskarzinome auch vor dem
50. Lebensjahr auftreten können, zeigen die altersabhängigen Inzidenzkurven einen Anstieg
erst ab dem 50. Lebensjahr [7]. Daher sollen auch Patienten über 50 Jahren mit einer akuten
Pankreatitis unklarer Ätiologie zusätzliche diagnostische Maßnahmen erhalten.
Ein neu aufgetretener Diabetes mellitus Typ 2 muss bei fehlenden weiteren Symptomen keine
weitere routinemäßige diagnostische Abklärung zum Ausschluss eines Pankreaskarzinoms
bedingen [5].
18
Bildgebende Primär-Diagnostik
Wenn klinisch der Verdacht auf ein Pankreaskarzinom besteht, so schließt sich eine
bildgebende Primärdiagnostik an. Dabei sind mehrere Verfahren geeignet. Die Verfahren der
ersten Wahl sind die Sonographie, die Endosonographie, die Computertomographie (CT), die
Magnetresonanztomographie (MRT), auch als Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie
(MRCP), und die endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographie (ERCP).
Prinzipiell sollte zuerst eine Oberbauchsonographie erfolgen. Diese nicht-invasive Diagnostik
ermöglicht in der Regel bereits die Verdachtsdiagnose eines Pankreaskarzinoms. Bei
erfahrenen Untersuchern erreicht die Sonographie eine sehr hohe Sensitivität. In der Literatur
sind die beiden sensitivsten Verfahren zur Detektion des Pankreaskarzinoms die CT und die
MRT in Kombination mit der MRCP. Eine eindeutige Wertung für oder gegen eines der
Verfahren kann auch hier nicht vorgenommen werden. Es sollte primär das Verfahren
eingesetzt werden, bei dem in der entsprechenden Einrichtung die größte Expertise besteht. Je
nach befundabhängiger Fragestellung müssen die Verfahren auch komplementär eingesetzt
werden. Die CT sollte nach Leitlinienempfehlung als Multidetektorcomputertomographie mit
einem zumindest biphasischen Kontrastmittelprotokoll durchgeführt werden
(Pankreasparenchymphase und portalvenöse Phase). Die Schichtdicke sollte ≤ 3 mm betragen.
Die MRT/MRCP sollte mit einer Feldstärke von mindestens 1,5 Tesla und Standardwichtungen
(T1 und T2 inklusive MRCP) durchgeführt werden. Die Schichtdicke sollte 5–7 mm betragen
Präoperative histopathologische Diagnostik
Die präoperative histologische Diagnostik hängt von der Einschätzung ab, ob der Tumor kurativ
oder palliativ behandelt werden kann. Bei einem kurativen Therapieansatz soll ausdrücklich
keine präoperative histopathologische Diagnostik erfolgen. Beim Vorliegen einer potenziell
resektablen und karzinomverdächtigen Raumforderung im Pankreas wird primär die Resektion
angestrebt. Die Resektion ist beim Pankreaskarzinom der einzige kurative Therapieansatz.
Eine endosonographisch gesteuerte Biopsie kann dann durchgeführt werden, wenn es
differentialdiagnostische therapierelevante Hinweise gibt, die das Vorgehen ändern würden.
Hierzu gehört z. B. der Verdacht auf Metastasen beim Vorliegen eines anderen Karzinoms in
der Vorgeschichte.
19
Besteht kein kurativer Therapieansatz, so wird eine palliative Therapie durchgeführt. Vor der
Durchführung einer spezifischen palliativen Therapie ist eine bioptische Diagnosesicherung
obligat, unabhängig davon, ob es sich um ein lokal fortgeschrittenes, inoperables oder um ein
metastasiertes Pankreaskarzinom handelt. Durch die Sicherung der palliativen Diagnose soll
eine potenzielle Fehlbehandlung ausgeschlossen werden [5].
Präoperative Labordiagnostik
Bei Nachweis einer Pankreasraumforderung sollte der Tumormarkern CA 19-9 (Carbohydrate-
Antigen 19-9) bestimmt werden [10]. Bei potentieller Resektabilität in der Bildgebung und sehr
hohem präoperativem CA 19-9-Wert kann eine zusätzliche Staging-Laparoskopie sinnvoll sein.
In solchen Befundkonstellationen liegt meist eine größere Tumorlast vor, als es die Bildgebung
vermutet lassen würde. Dies kann zum Beispiel durch eine disseminierte Tumoraussaat bewirkt
werden und sollte dann bei der Wahl des Therapieregimes in die Überlegungen einbezogen
werden [5].
Präoperative Ausbreitungsdiagnostik
Zur Festlegung der weiteren Therapie sollte immer eine bildgebende Staging-Untersuchung
durchgeführt werden. Durch die Staging-Untersuchung wird die lokale von der systemischen
Tumorausbreitung abgegrenzt. Diese Erkenntnisse werden zur grundsätzlichen Wahl des
Therapieverfahrens benötigt. Zur ersten Beurteilung der systemischen Tumorausbreitung ist die
Sonographie des Abdomens obligat. Eine Thorax-Röntgen Untersuchung gehört ebenfalls
obligat zur Staging-Untersuchung, wobei diese aufgrund der guten technischen Verfügbarkeit
und hohen Aussagekraft in vielen Häusern durch die CT des Thorax ersetzt wurde [5]. Die CT
stellt das Standardverfahren zur Beurteilung der Größe des Primärtumors und der lokalen
Tumorausbreitung dar. Die Kernspintomographie wird aufgrund ihrer höheren Kosten nur
fakultativ zur primären Untersuchung der lokalen Tumorausbreitung herangezogen [11].
Die Endosonographie, ERCP und MRCP, sowie Skelettszintigraphie werden nicht zur Staging-
Untersuchung des Pankreaskarzinoms herangezogen. Die FDG-PET (2-Fluor-2-desoxy-D-
glucose Positronen-Emissions-Tomographie) Untersuchung hat ebenso wie die
20
Mikrometastasendiagnostik aus Vollblut außerhalb von Studien aktuell keinen Stellenwert in
der präoperativen Ausbreitungsdiagnostik [5].
Die zusätzliche Staging-Laparoskopie ist insbesondere bei einer Diskrepanz von erhöhtem
Tumormarkerwert ohne entsprechenden pathologischen Bildbefund sinnvoll. Dies kann zum
Beispiel durch eine peritoneale Aussaat bedingt sein. Bei bis zu einem Drittel dieser Patienten
werden laparoskopische Befunde erhoben, die eine kurative Resektion ausschließen [12].
Kurative Therapie
Neoadjuvante Therapie
Der Begriff neoadjuvante Therapie beschreibt eine onkologische Therapie, welche vor einem
geplanten operativen Eingriff durchgeführt wird. Liegt bei einem Pankreaskarzinom ein
kurativer Therapieansatz vor, so wird standardmäßig keine neoadjuvante Therapie
durchgeführt. Bei einem als resektabel eingeschätzten Pankreaskarzinom wird primär operiert.
Die verfügbaren Studien zeigen keinen Vorteil einer neoadjuvanten Therapie gegenüber der
alleinigen Operation. Dies gilt hinsichtlich Gesamtüberleben, rezidivfreiem Überleben und
krankheitsfreiem Überleben. Es gibt hierzu aktuell keine randomisierten kontrollierten Studien.
An den Möglichkeiten von neoadjuvanten Therapieansätzen wird weiterhin geforscht. Eine
neoadjuvante Strahlentherapie, Strahlenchemotherapie oder Chemotherapie sollte nur im
Rahmen von Studien durchgeführt werden. Potentielle Vorteile eines neoadjuvanten Konzeptes
sind eine frühe systemische Behandlung existierender Mikrometastasen, eine bessere
Verträglichkeit der Chemotherapie, eine Risikoreduktion für eine intraoperative
Tumorzellverschleppung, eine in-vivo-Erfolgsbeurteilung der Therapie und eine
möglicherweise erhöhte R0-Resektionsrate [5]. Es gibt Hinweise, dass ein pathologisch
komplettes Ansprechen auf eine neoadjuvante Therapie signifikant mit der Prognose korreliert
[13].
Beim lokal fortgeschrittenen Pankreaskarzinom kann in speziellen Fällen die Zuordnung zu
einem kurativen oder palliativen Therapieregime nicht eindeutig abgeschätzt werden. Mit Hilfe
einer Strahlenchemotherapie oder Chemotherapie kann bei primär als nicht resektabel
eingeschätzten Patienten in einigen Fällen eine Resektabilität durch Minderung der
21
Tumormassen erreicht werden. Durch eine neoadjuvantes Therapieregime kann eine
verbesserte Ausgangssituation für die Operation geschaffen werden [5].
Chirurgische Therapie
Die chirurgische Therapie ist das einzige potenziell kurative Therapieverfahren beim
Pankreaskarzinom. Durch alleinige Chemo- und/oder Strahlentherapie lässt sich bei diesem
Tumor keine Heilung erzielen [14]. Das Ziel der Resektion soll die sogenannte Resektion im
Gesunden (R0-Resektion) sein, das heißt, dass der Tumor mit einem Sicherheitsabstand entfernt
wird. Es gibt in der aktuellen Literatur keine einheitliche Empfehlung zum Mindestabstand
zwischen Tumor und Resektionsrand. Daher wird die Einhaltung des größtmöglichen
Sicherheitsabstandes empfohlen. Aufgrund der tumorbiologischen und morphologischen
Besonderheiten duktaler Adenokarzinome des Pankreas, kann die exakte Beurteilung eines
Resektionsrands erschwert sein. Hierzu zählen die typische diskontinuierliche Ausbreitung, die
desmoplastische Stromareaktion und die zumeist ausgedehnte Perineural- bzw.
Lymphgefäßinvasion [5]. In neuesten Veröffentlichungen empfehlen D´Haese und Werner eine
differenziertere Einteilung in resektable, grenzwertig resektable, lokal fortgeschrittene primär
unresektable und metastasierte Krankheiten [15]. Trotz einer Infiltration von Nachbarorganen
kann ein Pankreaskarzinom im Gesunden resektabel sein [16]. Auch lokal fortgeschrittene
Karzinome können mit den entsprechenden Nachbarorganen en bloc reseziert werden, da auch
bei erweiterter R0-Resektion die Prognose identisch zu der Prognose nach Standardresektion
ist [17].
Bei einem Nachweis von Fernmetastasen soll nach aktuell gültiger Leitlinie die Resektion des
Primärtumors unterbleiben. Die Resektion des Primärtumors, unabhängig vom
Sicherheitsabstand, verbesserte zum Datum der Leitlinienveröffentlichung die Prognose der
Patienten nicht mehr [5]. Im Kontext verbesserter chirurgischer Techniken und differenzierterer
Abgrenzungen innerhalb des Patientenkollektivs, weisen Kruger et al. auf das gute operative
Outcome von Patienten mit isolierten Lungenmetastasen hin [18]. Ebenso zeigte ein Kollektiv
von primär resektablen Pankreaskarzinomen und einer singulären Lebermetastase nach
Resektion und anschließender Chemotherapie ein deutlich besseres Outcome im Vergleich zu
nicht operierten Patienten [19]. Wahrscheinlich wird demnach zukünftig bei Nachweis von
Fernmetastasen in bestimmten Subgruppen ebenfalls eine Resektion von Primärtumor und
Metastase als empfehlenswert eingestuft werden können. In Einzelfällen wird die Resektion
22
des Pankreaskarzinoms trotz nachgewiesener Metastasierung auch mit der primären Intention
einer Schmerzkontrolle durchgeführt [5].
Der Befall von Lymphknoten korreliert in der Regel mit einer signifikant schlechteren
Prognose. Bei der Resektion des Pankreaskarzinoms sollen mindestens 10 regionäre
Lymphknoten mit entfernt werden. Je höher die Resektionszahl ist, umso genauer wird die
Klassifizierung im Sinne der TNM-Klassifikation nach UICC (Union internationale contre le
cancer). Eine erweiterte Lymphadenektomie soll nicht durchgeführt werden. Durch die
Erhöhung der Radikalität der Resektion ist kein Überlebensvorteil nachweisbar [5].
Die internationale TNM-Klassifikation nach UICC dient zur Einteilung von malignen
Tumoren. Die drei Hauptkategorien entsprechen den drei Buchstaben: T
(Tumor/Primärtumor), N (Nodes/Lymphknoten/Lymphknotenmetastasen) und M
(Metastasen/Fernmetastasen). Hier werden verschiedene Punkte vergeben und somit
eine Einteilung in Tumorstadien erreicht. Die TNM-Klassifikation wird von zahlreichen
Krebsregistern abgefragt und statistisch ausgewertet. Hierdurch können diese Daten zur
Berechnung individueller prognostischer Aussagen herangezogen werden und
beeinflussen häufig auch die weiteren Therapieentscheidungen. Inzwischen wurde die
ursprüngliche TNM-Klassifikation um zahlreiche prognoserelevante Zusatzkategorien
ergänzt.
Das operative Vorgehen unterscheidet sich je nach Lage des Pankreaskarzinoms. Bei
Pankreaskopfkarzinomen beinhaltet die Resektion meist die partielle Duodenopankreatektomie
mit oder ohne Pyloruserhalt [5]. Eine Metaanalyse der Literatur zum Vergleich von
pyloruserhaltender und klassischer Duodenopankreatektomie ergab keine relevanten
Unterschiede zwischen beiden Verfahren hinsichtlich des Gesamtüberlebens der Patienten [20].
Pankreaskorpuskarzinome machen im Allgemeinen eine subtotale Pankreaslinksresektion oder
eine totale Duodenopankreatektomie erforderlich [5]. Das operative Verfahren bei Karzinomen
des Pankreasschwanzes ist die Pankreaslinksresektion [5]. Es gilt dabei immer, dass bei
Infiltration von Nachbarorganen und anderer Strukturen die Resektion entsprechend
ausgedehnt werden sollte [5].
23
Intraoperative histopathologische Diagnostik
Zur Beurteilung der Tumorfreiheit kann eine Schnellschnittuntersuchung durchgeführt werden.
Bei positivem Tumornachweis am Schnittrand kann durch eine lokale Nachresektion die Rate
kurativ resezierter Pankreaskarzinome erhöht werden [5].
Postoperative histopathologische Diagnostik
Die postoperative histopathologische Diagnostik setzt eine gute Kommunikation zischen
Chirurgie und Pathologie voraus. Aufgrund des Wachstumsmusters duktaler
Pankreaskarzinome mit starker Fibrose und sogenannter desmoplastischer Stromareaktion kann
die histopathologische Aufarbeitung der Resektionsränder erschwert sein. In Abstimmung mit
dem untersuchenden histopathologischen Institut sollte das Präparat daher, passend zur
intraoperativen Lage in situ, markiert werden. So ist eine spätere Zuordnung der jeweiligen
Resektionsränder im Situs möglich. Der sogenannte zirkumferentielle Resektionsrand setzt sich
aus einem vorderen, medialen und posterioren Resektionsrand bzw. der entsprechenden
Resektionsfläche zusammen. Um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass die Karzinomzellen
relativ häufig an diesen zirkumferentiellen Resektionsrand heranreichen, wird das Konzept des
zirkumferentiellen Resektionsrands (Circumferential Resection Margin, CRM) empfohlen [5].
Dies ergänzt die Zusatzkategorie R (Residualtumor oder Tumorrest nach chirurgischer
Behandlung) der internationalen TNM-Klassifikation.
Die Zusatzkategorie R der TNM-Klassifikation beschreibt, ob und inwieweit das
Tumorgewebe im Gesunden entfernt worden ist. Dabei werden die Resektionsränder
der Gewebeprobe beurteilt und in die Kategorien R0 bis R2 eingeteilt. R0 bedeutet, dass
kein Tumor am Resektionsrand nachweisbar ist. R1 bedeutet, dass mikroskopisch
Tumorgewebe an den Resektionsrändern nachweisbar ist. R2 bedeutet, dass
makroskopisch Tumorgewebe an den Resektionsrändern nachweisbar ist.
R0-resezierte Pankreaskarzinome werden dann als CRM-positiv klassifiziert, wenn der
Abstand der Tumorzellen zum Resektionsrand weniger als 1 mm beträgt, diesen jedoch nicht
erreicht (die korrekte Befundung lautet dann: R0 CRM-positiv oder R0 narrow). Sind die
Karzinomzellen mehr als 1 mm vom definitiven Absetzungsrand entfernt, wird eine „CRM-
negative“ R0-Situation klassifiziert [5]. Dies erlaubt standardisierte prognostische Aussagen,
24
außerdem sollen hierdurch weitere auswertbare Daten produziert werden [5]. Dies ist wichtig,
um die aktuelle Rezidivrate zu senken. Nach kurativer Resektion eines Pankreaskarzinoms
kommt es aktuell bei den meisten Patienten zu einem Rezidiv. Es wird spekuliert, dass das die
Folge möglicher, makroskopisch zum Zeitpunkt der Operation nicht detektierbarer
Mikrometastasen ist. Die Theorie ist Gegenstand der aktuellen Forschung [21].
Adjuvante Therapie
Der Begriff adjuvante Therapie beschreibt eine onkologische Therapie, welche nach einem
geplanten operativen Eingriff durchgeführt wird. Die chirurgische Therapie ist, wie bereits
dargelegt, die einzig potenziell kurative Therapieoption beim Pankreaskarzinom. Trotzdem ist
das Langzeitüberleben, z. B. aufgrund von Rezidiven und Fernmetastasen, im unteren
zweistelligen Prozentbereich anzusiedeln. Für die adjuvante Therapie stehen in der Onkologie
im Allgemeinen die Chemotherapie, die Strahlentherapie und die Strahlenchemotherapie zur
Verfügung. Multimodale Therapiestrategien sind potenziell sinnvoll, um das
Langzeitüberleben zu verbessern.
Nach alleiniger chirurgischer Therapie lag das 5-Jahresüberleben bei etwa 10%. Nach
Kombination von chirurgischer Therapie mit adjuvanter Chemotherapie lag dieses in
randomisierten Studien bei etwa 20%. Die Kombination von chirurgischer Therapie und
adjuvanter Chemotherapie ist daher sinnvoll [5]. Hartwig et al. analysierten die für das
postoperative Langzeitüberleben prognostischen Faktoren über das Staging System des
American Joint Committee on Cancer (AJCC). Hierzu gehörten unter anderem Alter,
Zusatzerkrankungen wie zum Beispiel Diabetes mellitus, Tumorgrading oder Fernmetastasen.
Die Risikofaktoren wurden in Wichtungen von +1 und -1 Punkten eingeteilt. In der Subgruppe
von Patienten mit < 0 Risikofaktoren wurde sogar ein 5-Jahresüberleben von 59,8% berechnen
[22].
Die adjuvante Chemotherapie erfolgt in der Regel in erster Linie mit Gemcitabin oder 5-
Fluoruracil/Folinsäure über 6 Monate. Eine Altersbeschränkung für Patienten gibt es hierbei
keine. Zum Ausschluss führen allgemeine Kontraindikationen, wie z. B. schwere internistische
Grunderkrankungen oder mangelnde Compliance. Die Chemotherapie soll innerhalb von 6
Wochen nach der Operation begonnen werden. Wenn es möglich ist, sollen die Patienten dabei
in klinische Studien eingeschlossen werden. So kann im wissenschaftlichen Rahmen die
25
optimale Art und Dauer der adjuvanten Therapie weiter verbessert werden [5]. Hierbei gibt es
Ansätze mit verschiedenen Wirkstoffkombinationen, unter anderem XELOX (Capecitabine
und Oxaliplatin), FOLFOX (Folinsäure, 5-Fluorouracil und Oxaliplatin) oder FOLFIRI
(Folinsäure, 5-Fluorouracil und Irinotecan), welche in klinischen Studien initial meist als
Zweitlinientherapie geprüft werden [23]. Vergleicht man die Ansätze von Gemcitabine in
Kombination mit Nab-Paclitaxel oder FOLFORINOX (5-Fluorouracil, Irinotecan und
Oxaliplatin) mit der alleinigen Gemcitabine-Therapie, so zeigt sich eine deutlich Verbesserung
der Gesamtüberlebenszeit, bei FOLFORINOX sogar mit signifikantem Unterschied [24]. Das
Therapieschema nach FOLFORINOX ist an enge Selektionskriterien gebunden, sodass es nach
einzelner Expertenmeinung für 10-15% der Patienten zugänglich gemacht werden kann [25].
Der gute Therapieerfolg wird es zukünftig wohl auch als Erstlinientherapie etablieren und zum
Gegenstand weiterer Forschungstätigkeit machen.
Eine alleinige adjuvante Radiotherapie kann nach der aktuellen Datenlage nicht empfohlen
werden. Für eine Kombination von adjuvanter Radiotherapie und Chemotherapie kann aktuell
kein evidenzbasierter Vorteil gegenüber der alleinigen adjuvanten Chemotherapie
nachgewiesen werden. Daher sollte eine adjuvante Radiotherapie außerhalb von randomisierten
und kontrollierten Studien nicht durchgeführt werden [5].
Immuntherapeutische Therapie
Die immuntherapeutische Therapie des Pankreaskarzinoms hat in den aktuellen Leitlinien
keinen Stellenwert. Eine Anwendung immuntherapeutischer Ansätze wird außerhalb von
prospektiven, kontrollierten Studien in der adjuvanten oder neoadjuvanten Therapie des
Pankreaskarzinoms nicht empfohlen. Die Entscheidung war in den Fachgremien mit einem
starken Konsens bestätigt worden. Grund hierfür ist vor allem die unzureichende Studienlage
[5].
Supportive Therapie
Supportive Therapieansätze dienen nicht primär der Heilung einer Erkrankung. Durch die
zusätzliche Behandlung werden der Heilungsprozess unterstützt oder die belastenden
Symptome der Krankheit abgeschwächt.
26
Für die Diagnostik und Therapie von Schmerzen beim Pankreaskarzinom gelten die
allgemeinen Regeln der Tumorschmerztherapie. Das WHO-Stufenschema ist zur
medikamentösen Schmerztherapie beim Pankreaskarzinom geeignet. Intravenöse oder
rückenmarksnahe Schmerztherapien sind denkbar, wenn mit dem WHO-Stufenschema keine
ausreichende Schmerzkontrolle erreicht werden kann. Grundsätzlich kann eine
Coeliacusblockade zur Schmerztherapie indiziert sein. Eine psychoonkologische Betreuung
kann zur Schmerzlinderung beim Pankreaskarzinom sinnvoll sein.
Bei den Ernährungsempfehlungen für Patienten nach Pankreatektomie sind die Konsequenzen
einer exokrinen und endokrinen Pankreasinsuffizienz zu beachten. Bei der Behandlung der
exokrinen Pankreasinsuffizienz ist auf eine ausreichende Gabe von Pankreasenzymen zu den
Mahlzeiten zu achten. Beim Vorliegen eines pankreopriven Diabetes mellitus ist der Patient
nach den gängigen Prinzipien mit Insulin zu behandeln. Im Allgemeinen sollte bei Patienten
mit malignen Tumoren aufgrund des progredienten Gewichtsverlustes auf eine energetisch
ausreichende Nährstoffzufuhr geachtet werden.
Die tumorbedingte Cholestase ist ein Symptom, das bei Patienten mit Pankreaskarzinom häufig
eine palliative interventionelle Therapie notwendig macht. Hierbei wird in der Regel die
Implantation von Gefäßstützen (sogenannten Stents) in die Gallenwege empfohlen.
Zur Messung der Lebensqualität steht mit dem QLQ-C30 (Fragebogen „quality of life
questionnaire“ der EORTC (European Organisation for Research and Treatment of Cancer))
und dem zugehörigen spezifischen Pankreasmodul QLQ-PAN 26 ein geeignetes Instrument zur
Verfügung. Die Ergebnisse der ganzheitlichen Betreuung sollten in die individuelle Therapie
einfließen [5].
Nachsorge in der kurativen Therapie
Es gibt zurzeit keinen wissenschaftlichen Beleg dafür, dass strukturierte Nachsorgeprogramme
mit Verlaufsbildgebungen zur Rezidivfrüherkennung oder Prognoseverbesserung sinnvoll sind.
Die Durchführung regelmäßiger Staging-Untersuchungen hat nicht zu einer Verbesserung des
Gesamtüberlebens beim Pankreaskarzinom geführt. Im Rahmen einer möglichen exokrinen
oder endokrinen Insuffizienz ist eine regelmäßige klinische Anamnese und körperliche
Untersuchung erforderlich. Die Untersuchungen sollten sich nach der individuellen
Krankheitsentwicklung richten und symptomorientiert erfolgen. Die Untersuchungen können
27
grundsätzlich heimatnah beim betreuenden Hausarzt stattfinden [5]. Wenn sich ein
Handlungsbedarf für weiterführende Untersuchungen mit zu erwartender therapeutischer
Konsequenz ergibt, kann dieser dann eingeleitet werden. Manche Tumorzentren bieten im
Kontext tumorübergreifender ganzheitlicher Programme auch eine Anbindung der Patienten an
interdisziplinäre Sprechstunden an. Wenn die Behandlung im Rahmen einer klinischen Studie
erfolgt, so richtet sich die Nachsorge meist nach dem jeweiligen Studienprotokoll aus.
Palliative Therapie
Beim metastasierten oder lokal fortgeschrittenen Pankreaskarzinom sollte bei einem Index zur
Lebensqualität der ECOG (Performance Status der Eastern Cooperative Oncology Group) von
2 oder weniger Punkten eine palliative Chemotherapie durchgeführt werden. Werden durch
einen schlechteren Allgemeinzustand höhere Bewertungen erreicht, so ist der Nutzen einer
palliativen Chemotherapie als fraglich anzusehen. Alternativ kann zur Bewertung einer
Chemotherapiefähigkeit der Karnofsky-Index (Karnofsky performance status scale)
herangezogen werden. Der Karnofsky-Index bewertet mittels Prozentangaben, der Index zur
Lebensqualität der ECOG verteilt Punkte von 0-5. Beide Bewertungssysteme lassen sich
bedingt ineinander umrechnen [5, 26].
Karnofsky-Index Index zur Lebensqualität der ECOG
100 Normalzustand Normale und uneingeschränkte
Aktivität, wie vor der Erkrankung 0
90 normale Leistungsfähigkeit mit
minimalen Krankheitssymptome
80 normale Leistungsfähigkeit mit
geringen Krankheitssymptome Einschränkungen bei körperlicher
Anstrengung, erhaltene Gehfähigkeit,
leichte körperliche Arbeit möglich
1
70
Eingeschränkte Leistungsfähigkeit,
Arbeitsunfähigkeit, kann sich
eigenständig versorgen
60 Eingeschränkte Leistungsfähigkeit,
braucht gelegentlich fremde Hilfe
Selbstversorgung möglich, aber nicht
arbeitsfähig, erhaltene Gehfähigkeit, 2
28
50
Eingeschränkte Leistungsfähigkeit,
benötigt krankenpflegerische und
ärztliche Betreuung, nicht bettlägerig
kann dabei mehr als 50% der
Wachzeit aufstehen
40 Bettlägerig,
spezielle Pflege erforderlich
Nur begrenzte Selbstversorgung
möglich; 50% oder mehr der
Wachzeit an Bett oder Stuhl
gebunden
3
30 Schwer krank,
Hospitalisation erforderlich
20 Schwer krank, Hospitalisation mit
supportiven Maßnahmen erforderlich Keine Selbstversorgung möglich,
Pflegebedürftigkeit, völlig an Bett
oder Stuhl gebunden
4
10 Moribund,
rascher Krankheitsprogress
0 Tod Tod 5
Tabelle 1 - Karnofsky-Index und Index zur Lebensqualität der ECOG
Die Indices sollen den abstrakten und schwer fassbaren Begriff der Lebensqualität in eine
objektivierte und standardisierte Form bringen. Sie dienen unter anderem bei malignen
Tumoren zur Beurteilung des Allgemein- und Ausgangszustandes. Die Beurteilung kann dann
zur Definition von Therapiezielen herangezogen werden.
Die Patienten mit palliativer Chemotherapie profitieren überwiegend von einem verlängertem
Gesamtüberleben und einer verbesserten Lebensqualität. Die palliative Chemotherapie sollte
unmittelbar beim Nachweis von Fernmetastasen begonnen werden. Eine Größenprogredienz
des Tumors, subjektiv unangenehme Symptome oder sonstige Komplikationen sollten nicht
abgewartet werden. Auch Patienten mit lokal fortgeschrittenen und inoperablen
Pankreaskarzinomen sollen ab Diagnosestellung behandelt werden. Sie haben einen ähnlichen
Nutzen von der Chemotherapie, wie Patienten mit metastasiertem Tumorleiden. Lediglich bei
einem schlechten Allgemeinzustand, wie z. B. einem ECOG-Performance Status >2, ist der
Nutzen als individuell fraglich einzustufen [5]. Als Erstlinientherapie des lokal
fortgeschrittenen und/oder metastasierten Pankreaskarzinoms wird Gemcitabin eingesetzt [5].
Die 1-Jahres-Überlebensraten bei einer Therapie mit Gemcitabin betragen 18-20% [27]. 5-
Fluoruracil, mit oder ohne Folinsäure, findet ebenso wie Oxaliplatin einen Einsatz als
Zweitlinientherapie [5].
29
Eine palliative Strahlentherapie sollte nur bei symptomatischen Metastasen und Metastasen mit
drohender Symptomatik durchgeführt werden. Ziel ist die Symptomkontrolle oder die
Vermeidung von durch Metastasen bedingten Komplikationen [5].
Das murine Pankreaskarzinom
Das verwendete murine Pankreaskarzinom wurde erstmalig aus einer transgenen C57BL/6-
Maus mit einem KrasD12G-Allel isoliert. Die isolierte Zelllinie wurde als 6606PDA (Pancreatic
Ductal Adenocarcinoma) benannt und kann in vitro kontrolliert vermehrt werden [28]. Um die
Mäuse standardisiert an einem Pankreaskarzinom erkranken zu lassen, werden die Zellen der
Zelllinie 6606PDA in vitro angezüchtet und den entsprechenden Mäusen im Rahmen einer
Laparotomie in das Pankreas injiziert. Es kommt zum Wachstum eines orthotopen soliden
Pankreaskarzinoms. Durch dieses Verfahren werden reproduzierbare murine
Pankreaskarzinome induziert, welche in tumorspezifischem Verhalten und Monitoring dem
humanen Pankreaskarzinom ähnlich sind. Das Verfahren ist in der eigenen Arbeitsgruppe
entwickelt und durch diese etabliert worden [29].
30
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor und seine Liganden
Zytokine und Chemokine
Zytokine sind kleine Proteine, mit denen die Funktionen, das Wachstum und die
Differenzierung von Zellen kontrolliert werden können. Zu den Zytokinen gehören unter
anderem Interferone (IFN), Interleukine (IL), kolonie-stimulierende Faktoren (CSF),
Tumornekrosefaktoren (TNF) und Chemokine. Jede Untergruppe hat eigene funktionelle
Aufgaben, die sich aber zum Teil auch überschneiden können. Die Chemokine sind die größte
Untergruppe innerhalb der Zytokine. Zu ihrer Gruppe gehören an die 50 verschiedene Proteine.
In der menschlichen Immunphysiologie sind die Chemokine vor allem als Lockstoffe erforscht
[30]. Funktionell koordinieren und kontrollieren sie die Migration von Zellen. Auf diese Art
und Weise können z. B. Immunzellen zu ihrem Bestimmungsort finden [31]. Davon leitet sich
auch der Name ab: Chemokine als Chemotaktische Zytokine. Die Wortherkunft begründet sich
aus dem Altgriechischen: „Χημεία“ für „Chemie“; „tάξις“ für „Ordnung“ oder „Aufmarsch“;
„κύτος“ für „Gefäß“ oder „Höhlung“; „κίνηση“ für „Bewegung“.
Funktionell kann man die Chemokine in zwei Gruppen einteilen. Einerseits gibt es die
konstitutiv produzierten und sezernierten Chemokine, welche homöostatisch vorkommen.
Diese sind z. B. in lymphatischen Organen und gesundem Gewebe zu finden. Andererseits gibt
es Chemokine, die nur auf einen bestimmten Stimulus hin produziert werden. Diese können z.
B. bei inflammatorischen Reaktionen in die Immunabwehr oder Wundheilung integriert sein
[30, 31].
Strukturell werden die Chemokine anhand der Anzahl und Anordnung von Cysteinen am N-
terminalen Ende unterschieden. Es gibt die vier Gruppen C, CC, CXC und CX3C, die auch
Grundlage der systematischen Nomenklatur geworden sind [32]. Die C-Chemokine haben in
dieser Region ein einzelnes konserviertes Cystein, die CC-Chemokine zwei aufeinander
folgende Cysteine, die CXC-Chemokine zwei Cysteine, die von einer weiteren Aminosäure
getrennt sind, und die CX3C-Chemokine zwei Cysteine, die von drei anderen Aminosäuren
getrennt sind. Aufgrund dieser Strukturanordnungen werden Disulfidbrücken ausgebildet, die
die räumliche Struktur der Chemokine beeinflussen [32]. Während die dreidimensionale
Struktur aller Chemokine hochgradig identisch erscheint, weist die Quartärstruktur in den
einzelnen Gruppen jeweils Unterschiede auf. Für die Funktionsweise der Chemokine wurden
31
mehrere strukturelle Regionen identifiziert, wobei die N-terminale Region in der Regel die
dominierende ist [30]. Trotz der hohen strukturellen Ähnlichkeit kann sich die Funktion der
Chemokine sehr stark unterscheiden [31].
Über Zytokine erfolgt eine Steuerung des Immunsystems, welches unter anderem von T-
Helferzellen (Th) kontrolliert wird. Dabei unterscheidet man T1-Helferzellen (Th1) und T2-
Helferzellen (Th2). Th1-Zellen produzieren Interferon gamma (IFN-γ) und Interleukin 2 (IL-
2), wohingegen die Th2-Zellen Interleukin 4 (IL-4) und Interleukin 5 (IL-5) produzieren. Dabei
sind Th1-Zellen in die zelluläre Antwort des Immunsystems und die Th2-Zellen in die humorale
Antwort des Immunsystems involviert. Die Balance der Immunantwort wird über
regulatorische T-Zellen (Tregs) gewährleistet. Diese liegen in verschiedenen Subpopulationen
vor, wie z. B. FOXP3+-tragenden CD4+CD25+ Tregs, IL-10-prodizierende Tregs und
transforming growth factor-β (TGF-β)-produzierende Tregs. Eine Dysbalance innerhalb dieser
Subpopulationen ist in die Entstehung und Aufrechterhaltung verschiedener Krankheiten
involviert. Insbesondere eine Immunsuppression im Tumormilieu, welche eine Progression des
Tumors fördert, wird in der Literatur beschrieben [32, 33].
Chemokin-Rezeptoren
Auf molekularer Ebene können Chemokine an Chemokin-Rezeptoren andocken. Die
Chemokin-Rezeptoren sind unter anderem in die gezielte Migration von Zellen involviert und
wurden insbesondere auf verschiedenen Zellen des Immunsystems nachgewiesen. Alle
klassischen Chemokin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Sieben-
Transmembrandomänen-Rezeptoren und werden in 4 Gruppen eingeteilt. Die Namen der
Gruppen leiten sich von den entsprechenden aktivierenden Chemokingruppen ab:
1. CC-Chemokin-Rezeptoren (CCR): CCR1 bis CCR10 binden CC-Chemokine.
2. CXC-Chemokin-Rezeptoren (CXCR): CXCR1-7 binden CXC-Chemokine.
3. XC-Chemokin-Rezeptor (XCR): XCR1 bindet XC-Chemokine, Lymphotactin α und β.
4. CX3C-Chemokin-Rezeptor (CX3CR): CX3CR1 bindet Fractalkine.
In der Chemokin-Rezeptor-Superfamilie kommen, außerhalb dieser Nomenklatur, auch
atypische Mitglieder vor. Hierzu gehört z. B. der Duffy-Antigen-Rezeptor für Chemokine
(DARC) und der Decoy-Rezeptor D6. Außerdem ist zu erwähnen, dass Chemokine an
Moleküle der extrazellulären Matrix und an Transmembranmoleküle binden können. Dies
32
scheint die Beeinflussung anderer Immunzellen zu verstärken und die Effekte der
haptotaktischen Gradienten im Rahmen der Chemotaxis zu erhöhen.
Die klassischen Chemokin-Rezeptoren sind als G-Protein-gekoppelte Sieben-
Transmembrandomänen-Rezeptoren für eine pharmakologische Beeinflussung auf molekularer
Ebene sehr zugänglich und haben daher in der aktuellen Forschung einen hohen Stellenwert.
Die Aufgabe dieser Rezeptoren ist eine Signaltransduktion von extrazellulären Signalen in das
Zellinnere. Die Signalweiterleitung geschieht durch Bindung eines Liganden an den Rezeptor,
einer Konformationsänderung des Rezeptors und einer direkten Aktivierung eines
heterotrimeren G-Proteins, welches aus drei Untereinheiten (α, β und γ) besteht. Dies triggert
wiederum verschiedene Serien von Signalwegen und führt in der Regel zu einer direktionalen
Zellbewegung oder chemotaktischen Zellaktivität. Die Anzahl der synthetisierten und
exprimierten Chemokin-Rezeptoren wird über verschiedene Mechanismen reguliert. Diese
wirken unter anderem auf den Ebenen der Genexpression und Proteinbiosynthese. Zu den
beeinflussenden Umweltfaktoren gehören unter anderem Bakterien und bakterielle
Bestandteile, der Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1), Interferon Gamma
(IFN-γ), Interleukin-6 (IL-6) und Thrombin. Die Präsentation der Chemokin-Rezeptoren auf
der Zelloberfläche kann unter anderem durch monomere, dimere und komplexere oligomere
Zusammenlagerung moduliert werden. Die Gruppe der CC-Chemokine und der zugehörigen
CC-Chemokin-Rezeptoren stimulieren nach aktueller Datenlage verschiedene Zellen und
Zellvorgänge. Dazu gehören die Chemotaxis von Monozyten, Makrophagen, T-Lymphozyten,
eosinophilen und basophilen Zellen, die Aktivierung von Mastzellen und die Förderung der
Angiogenese [33].
CCR4-Chemokin-Rezeptor
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor ist ein spezifischer Rezeptor für die Liganden MDC
(Macrophage-derived chemokine) und TARC (Thymus and activation-regulated chemokine)
[34, 35]. Die Genabschnitte sind beim Menschen auf Chromosom 3 (32.99 – 33Mb) und bei
der Maus auf Chromosom 9 (114.49 – 114.5 Mb) lokalisiert [36]. Der CCR4-Chemokin-
Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor aus der Superfamilie der Sieben-
Transmembrandomänen-Rezeptoren. Der CCR4-Chemokin-Rezeptor ist in der Literatur unter
anderem auf T-Zellen, dendritischen Zellen, natürlichen Killerzellen, Monozyten und
Makrophagen beschrieben worden [37]. Der CCR4-Chemokin-Rezeptor wird bei den T-Zellen
33
selektiv auf Th2-Zellen und Tregs beschrieben, nicht jedoch auf Th1-Zellen [38]. Bei den
Makrophagen ist der CCR4-Chemokin-Rezeptor mit den M2-Makrophagen assoziiert, nicht
jedoch mit den M1-Makrophagen [37].
Es wurde nachgewiesen, dass der CCR4-Chemokin-Rezeptor die Migration von Tregs in die
allergie-induzierten Entzündungsareale ermöglicht. In deren Folge können Th2-Zellen und
eosinophile Zellen das Entzündungsgeschehen abmildern. Mäuse mit CCR4-Gendefekt zeigten
eine stärker ausgeprägte parenchymatöse allergische Entzündungsreaktion als Wildtyp-Mäuse.
Die über Th2-Zellen vermittelte Abmilderung der Entzündungsreaktion und Förderung
gewebespezifischer Umbauvorgänge scheint gestört zu sein. Ähnliche Ergebnisse wurden für
Mäuse mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung beschrieben, wobei die fehlende
Rekrutierung von CCR4-positiven Tregs zu einer verstärkten Entzündungsreaktion führte [39].
Bei Patienten mit einer adulten T-Zell-Leukämie (ATLL) konnte gezeigt werden, dass die
CCR4-positiven Tumorzellen die Rolle von Tregs simulieren und so die Tumorprogression
fördern können. Dabei wurde in Studien bewiesen, dass die überwiegende Anzahl der ATLL-
Patienten CCR4-positive Tumorzellen aufwies. Außerdem konnte mit CCR4-positiven
Tumorzellen eine erhöhte Metastasierungsrate im Sinne einer ligandenabhängigen kutanen
Infiltration nachgewiesen werden. Diese Tumorzellen können also die Migration von
Immunzellen imitieren und so die Tumorprogression beim ATLL-Patienten fördern [40].
In anderen Tumorentitäten konnte nachgewiesen werden, dass die Tumorzellen durch Sekretion
der spezifischen Liganden MDC und TARC in der Lage waren CCR4-positive Immunzellen
anzulocken. Eine erhöhte Anzahl von Tregs im peripheren Blut wurde für verschiedene solide
Tumorentitäten nachgewiesen. Hierzu gehören unter anderem das Mammakarzinom, das
kolorektale Karzinom, das Magenkarzinom und das Pankreaskarzinom. Dabei wurde die
Migration der Tregs, unter dem Einfluss des CCR4-Chemokin-Rezeptors und des Liganden
MDC, auf die Tumorzellen hin experimentell nachgewiesen. In der Folge führte die Treg-
Infiltration zu einer lokalen Unterdrückung der Immunantwort und einer Förderung der
Tumorprogression [40, 41]. Im Gegenzug konnte gezeigt werden, dass die Depletion von Tregs
im Mausmodell die körpereigene immunvermittelte Tumorabwehr unterstützen und die
Antwortrate immunbasierter Therapieansätze erhöhen konnte [40].
34
Spezifische Liganden des CCR4-Chemokin-Rezeptors
Die Chemokine MDC (Macrophage-derived chemokine, auch als CCL22 bezeichnet) und
TARC (Thymus and activation-regulated chemokine, auch als CCL17 bezeichnet) sind
hochspezifische Liganden des CCR4-Chemokin-Rezeptors [34, 35]. Die Genabschnitte für
MDC und TARC sind beide auf Chromosom 16 Band q13 lokalisiert und beide Gensequenzen
weisen hohe Übereinstimmungsraten auf [42]. Beide Liganden werden von Zellen des
Immunsystems produziert. MDC wird in vitro in absteigender Quantität von dendritischen
Zellen, Makrophagen, Monozyten, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Th2- und Th1-Zellen
produziert [43]. Der Ligand TARC kann konstitutiv und selektiv im Thymus nachgewiesen
werden, außerdem wird er von verschiedenen T-Zell-Linien und phytohemagglutinin-
aktivierten T-Zellen im peripheren Blut produziert [44].
In ihrer Rolle als Liganden des CCR4-Chemokin-Rezeptors haben sowohl MDC als auch
TARC die Fähigkeit CCR4-positive T-Zellen zur Migration zu stimulieren. Dies wurde unter
anderem anhand CD4-postitiver T-Lymphozyten gezeigt [38]. Um die unterschiedliche
Gewichtung der beiden Liganden im Prozess der Migration zu verstehen, muss man die
unterschiedliche Verteilung im Gewebe beachten. Im Rahmen der Forschung zur atopischen
Dermatitis und Psoriasis wurde gezeigt, dass im pathologischen Gewebe auf der Mehrzahl der
Endothelzellen von peripheren Blutgefäßen der Ligand TARC exprimiert ist. Der Ligand MDC
wurde dabei nicht auf den Endothelzellen exprimiert, dafür jedoch in gewebeinfiltrierenden
dendritischen Zellen nachgewiesen [45]. Durch die unterschiedliche Expression und das
Verteilungsmuster wurde eine sequenzielle und hierarchische Wirkungsweise bei der Migration
von Immunzellen ins pathologische Gewebe abgeleitet. Dabei übernimmt TARC die Funktion
der initialen Bindung der Immunzellen im Gefäß und die initiale Einwanderung. MDC
übernimmt die Leitung innerhalb des Gewebes anhand eines Konzentrationsgefälles. Diese
hierarchische Funktionsweise wurde anhand von Th2-Zellen abgebildet [46].
Im Rahmen der Erforschung des Hodgkin-Lymphoms wurde für mehre hämatologische
Tumorzelllinien die Produktion der Liganden MDC und TARC untersucht. Dabei gab es
Tumorzelllinien die MDC und TARC, Tumorzelllinien die nur TARC und Tumorzelllinien die
weder MDC noch TARC produzierten [41]. Dabei wurde sowohl in vitro, als auch in vivo eine
Migration von CCR4-positiven T-Lymphozyten auf den vom hämatologischen Tumor
sezernierten Liganden TARC nachgewiesen [41]. Dies zeigt die aktive Beeinflussung des
Immunsystems durch einen hämatologischen Tumor.
35
CCR4-Chemokin-Rezeptor als Therapieziel
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor ist, als G-Protein-gekoppelter Rezeptor, einer
pharmakologischen Beeinflussung auf molekularer Ebene sehr zugänglich. Seine Rolle in der
Beeinflussung von Entzündungsreaktionen, in der gerichteten Migration von Immun- und
Tumorzellen, in der Immunkompetenz und der Beeinflussung des Tumor-Mikromilieus lassen
auf neuartige Therapieansätze hoffen.
Vor dem Hintergrund, dass Tregs in einer CCR4-abhängigen Migration ins allergisch-
entzündliche Gewebe einwandern können, besteht hier die Hoffnung, durch gezieltes Anlocken
die Dichte der CCR4-positiven Tregs im erkrankten Gewebe zu erhöhen. Hierdurch soll in der
Folge über Th2-Zellen und eosinophile Zellen die Entzündungsreaktion abgemildert werden
[39].
Die Rolle der Immuntherapie hat in den letzten Jahren in der Behandlung von Tumoren
zunehmend an Bedeutung gewonnen. Für den experimentellen Einsatz wurden Antikörper
gegen CCR4-Chemokin-Rezeptoren entwickelt, welche in vitro und in vivo eingesetzt wurden
und hierbei nachweislich an CCR4-positive Tumorzellen binden konnten. Dies beweist, dass
CCR4-positive Tumorzellen grundsätzlich durch eine antikörperbasierte Immuntherapie
erreicht werden können. Hiervon könnten z. B. Patienten mit CCR4-positiver ATLL profitieren
[40].
Vor dem Hintergrund, dass die Depletion von Tregs im Mausmodell die körpereigene
immunvermittelte Tumorabwehr unterstützen und die Antwortrate immunbasierter
Therapieansätze erhöhen kann, sind Ansätze, welche die Anzahl der Tregs reduzieren,
therapeutisch sehr interessant. Durch den Einsatz von anti-CCR4-Antikörpern wurde
experimentell in vivo die Anzahl der Tregs im peripheren Blut reduziert. So könnten
verschiedene solide Tumorentitäten durch den gleichen immunologischen Therapieansatz
erreicht werden könnten. Im Versuch mit Mäusen und Affen konnten keine klinischen
Organtoxizitäten festgestellt werden, sodass die Hoffnung auf eine nebenwirkungsarme
Therapie bestünde. Basierend auf den Forschungsergebnissen von Takashi et al. wurde in Japan
die erste klinische Phase-I-Studie mit anti-CCR4-Antikörpern bei Patienten mit CCR4-
positiver ATLL initiiert [40]. Diese zeigte eine gute Verträglichkeit und wurde zur
multizentrischen Phase-II-Studie ausgebaut. In die Studie eingeschlossen wurden 28 Patienten
mit bisher therapieresistenter ATLL. Von diesen erhielten 27 Patienten mindestens eine
Infusion mit anti-CCR4-Antikörpern. Davon zeigten 13 Patienten ein Ansprechen des Tumors,
36
8 Patienten wiesen eine Vollremission auf. Die Autoren resümierten ein gutes
Therapieansprechen bei vertretbaren Nebenwirkungen. Diese bestanden überwiegend aus
Infusionsreaktionen und Hautreaktionen. Ein interessanter Umstand ist, dass die Wirksamkeit
der anti-CCR4 Antikörper im peripheren Blut deutlich besser als im peripheren Gewebe zu sein
scheint. Dies wird auf die Beteiligung von anderen Immunzellen im Gewebe, wie z. B.
natürlichen Killerzellen, Monozyten und Makrophagen, zurückgeführt. Eine Fortführung der
Studie und Ausweitung auf andere hämatologische Tumoren wurde angekündigt. Grundsätzlich
ist ein Einsatz bei allen Tumorentitäten denkbar, bei denen eine Progression mit erhöhter Treg-
Dichte beschrieben wurde [47].
37
Makrophagen und ihre Rolle im Tumormilieu
Makrophagen
Makrophagen entwickeln sich in mehreren Schritten aus hämatopoetischen Stammzellen des
Knochenmarks. Unter dem Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren entwickeln sich aus den
Stammzellen die Monoblasten, welche wiederum zu Monozyten heranreifen. Die Monozyten
zirkulieren im peripheren Blut und differenzieren sich durch Einwanderung in die
verschiedenen Gewebe zu Makrophagen. Je nach dem in welchem Gewebe sich die
eingewanderten Makrophagen befinden, haben diese spezifische Eigennamen und
Eigenschaften [48]. Makrophagen sind in ihrer phänotypischen Ausprägung sehr verschieden
und werden in der Literatur in den M1- und den M2-Typ unterteilt. Die Entwicklung zu einem
der beiden Phänotypen hin wird als Polarisation bezeichnet. Im Rahmen der Polarisation
verändert sich das Repertoire der auf den Makrophagen exprimierten Chemokin-Rezeptoren
und der produzierten Chemokine.
Klassischerweise wird der M1-Typ, sowohl mit als auch ohne Kontakt zu mikrobiellen Stoffen,
durch IFN-γ aktiviert. Die Polarisation in den M1-Makrophagen-Phänotyp ermöglicht eine
Produktion von proinflammatorischen CC-Chemokinen und IFN-γ-abhängigen Chemokinen.
Dies aktiviert unter anderem Th1-Zellen und natürliche Killerzellen und kann in der Folge eine
Typ-1 Immunantwort auslösen. Der M1-Makrophage kann so eine Entzündungsreaktion
triggern und ist in die Abwehr von Pathogenen und Tumorzellen involviert.
Klassischerweise wird der M2-Typ Makrophage durch Stimulation über IL-4, IL-10 und IL-13
zur Ausreifung gebracht. Die Polarisation in den M2-Makrophagen-Phänotyp ermöglicht eine
Produktion von Liganden der CCR3-, CCR4- und CCR8-Chemokin-Rezeptoren. Dies aktiviert
unter anderem eosinophile Zellen, basophile Zellen und Th2-Zellen und triggert in der Folge
eine Typ-2 Immunantwort. Der M2-Makrophage bremst die Entzündungsreaktion, fördert den
Abtransport von Zelltrümmern, initiiert die Angiogenese und unterstützt gewebespezifische
Umbauvorgänge [37, 49].
38
Tumor-assoziierte Makrophagen
Die Makrophagen, die sich im Tumorgewebe angesiedelt haben, werden als tumor-assoziierte
Makrophagen (TAMs) bezeichnet. Der Phänotyp der TAMs ändert sich mit dem Stadium der
Tumorprogression. In frühen Tumoren, welche sich aus chronisch-entzündlichen Geweben
entwickeln, dominiert der M1-Makrophage. Im Verlauf der Tumorprogression nimmt der
Anteil an M2-Makrophagen zu. Dies korreliert mit der Invasivität, der Vaskularisation und der
Metastasierungsfähigkeit des Tumors [48]. Fortgeschrittene Tumoren zeigen in der
Phänotypisierung der TAMs überwiegend eine Ausprägung als M2-Typ. Ihnen werden tumor-
fördernde Eigenschaften zugesprochen [49]. Werden Makrophagen mit Tumorzellen ko-
kultiviert, so entwickeln sie ein hochgradig ähnliches Phänotypisierungsmuster wie die TAMs
aus Tumorgewebe. Die kokultivierten Makrophagen fördern in vivo ebenfalls die
Tumorprogression und das Metastasierungsverhalten [49]. TAMs stehen in komplexer
Beziehung zu Tumorzellen und können in vivo einen erheblichen Anteil des Zellinfiltrats von
soliden Tumoren darstellen [50]. Die Anzahl von Makrophagen im Tumorgewebe variiert bei
Tumoren aus verschiedenen Ursprungsgeweben erheblich. Die Anzahl der Makrophagen in
einem spezifischen Tumortyp scheint konstant zu sein [51]. Es gilt als erwiesen, dass die TAMs
über direkte und indirekte Stimulation die Angiogenese und Lymphangiogenese im
Tumorgewebe beeinflussen. Die so geförderte Angiogenese ist mit einer erhöhten
Tumorprogression und einem verstärkten Metastasierungsverhalten vergesellschaftet [52]. Dies
deckt sich auch mit Ergebnissen aus den eigenen Arbeitsgruppen. Des Weiteren können TAMs
Zellen des Immunsystems direkt beeinflussen und, z. B. durch die Chemokine CCL13, CCL18
und MDC, über Tregs die tumor-suppressive Aktivität zytotoxischer T-Zellen unterdrücken
[37]. In der Phänotypisierung liegt überwiegend eine Ausprägung als M2-Typ vor [49]. Die
Makrophagen im Tumorgewebe sind häufig noch nicht vollständig ausdifferenziert und zeigen
ein hohes Maß an Plastizität [52]. Es fehlte bisher eine einheitliche Klassifizierung von
Makrophagen-Subtypen beim Pankreaskarzinom, was den Vergleich von Studienergebnissen
erschwert.
Makrophagen und der CCR4-Chemokin-Rezeptor
Im Verteilungsmuster der CC-Chemokin-Rezeptoren ist der CCR4-Chemokin-Rezeptor bei der
Phänotypisierung der Makrophagen mit den M2-Makrophagen assoziiert, nicht jedoch mit den
39
M1-Makrophagen [37]. In einer Studie zur Bleomycin-induzierten Lungenfibrose zeigten
CCR4-Knockout-Mäuse einen deutlichen Überlebensvorteil, da die letalen Entzündungs- und
Gewebeumbauprozesse weitestgehend ausblieben. Hier konnten Trujillo et al. einen
Zusammenhang mit der Makrophagenphänotypisierung nachweisen, welche durch den Verlust
des CCR4-Chemokin-Rezeptors in der frühen Entzündungsphase verursacht wurden. In der
Folge wurde ein makrophagenspezifischer Mechanismus in Verbindung mit dem genetischen
Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors für die gewebeprotektive Wirkung angenommen [53].
Wird der spezifische Ligand TARC zusammen mit IL-10 durch M2-Makrophagen produziert,
so konnte der M2-Makrophage die CpG-vermittelte (durch bakterielle Gensequenzen
aktivierte) Aktivierung von M1-Makrophagen unterdrücken [37]. So konnte sich das Verhältnis
von M1- zu M2-Makrophagen zugunsten der M2-Makrophagen verschieben.
Tumor-assoziierte Makrophagen als Therapieziel
In der Progression des Pankreaskarzinoms wandern verschiedene Zellen des Immunssystems,
unter anderem auch Makrophagen, in das primäre Tumorgewebe ein. Die Akkumulation der
Makrophagen im Tumorgewebe ist ein Charakteristikum des duktalen Pankreaskarzinoms und
wurde in der Literatur mit einer Tumorprogression und einem schlechteren Therapieansprechen
in Verbindung gebracht. Ein Verhältnis von M1- zu M2-Makrophagen zugunsten der M2-
Makrophagen wurde als tumorförderlich beschrieben [48]. Versuche der eigenen Arbeitsgruppe
zeigen, dass in vivo die Depletion von Makrophagen das Wachstum muriner
Pankreaskarzinome deutlich hemmte. Native Makrophagen entwickelten in vitro in einer Ko-
Kultivierung mit Pankreaskarzinomzellen eine überwiegende Polarisation zum M2-
Makrophagen. Im Gegenzug förderten M2-Makrophagen in einer Ko-Kultivierung mit
Pankreaskarzinomzellen das Wachstum der Tumorzellen. Es wurde daher von einer
gegenseitigen Beeinflussung ausgegangen [54]. Die Ergebnisse der tumorfördernden
Eigenschaften von TAMs konnten in der eigenen Arbeitsgruppen auch an murinen kolorektalen
Karzinomen nachvollzogen werden [55]. In einer Studie von Mitchem et al. mit 60 Patienten
führte eine Inhibition des CCR2-Chemokin-Rezeptor oder CSF1R (Colony stimulating factor
1-Rezeptor) zu einer deutlichen Reduktion der Anzahl der TAMs im duktalen
Pankreaskarzinom. In der Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin zeigten die
Patienten mit geringerer Makrophagendichte ein besseres Therapieansprechen [56].
Zusammengefasst kann also aktuell davon ausgegangen werden, dass die Reduktion der TAMs
40
im Pankreaskarzinomgewebe mit einer Reduktion der Tumorprogression verbunden ist. Ein
weiterer Therapieansatz ist es, die TAMs in ihrer Phänotypisierung als M2-Makrophagen zu
beeinflussen. So soll erreicht werden, dass diese ihre tumorfördernden Eigenschaften verlieren
oder sogar tumortoxische Eigenschaften entwickeln [56]. Insgesamt wäre der therapeutische
Ansatz einer pharmakologischen Beeinflussung von TAMs sehr attraktiv, da über den gleichen
Therapieansatz verschiedene Tumorentitäten erreicht werden könnten.
41
FRAGESTELLUNG DER ARBEIT
Einleitende Übersicht und Fragestellung
Die aktuelle Studienlage und die Ergebnisse der eigenen Forschungsgruppe zeigten, dass aktive
gegenseitige Beeinflussungen von Tumoren und Zellen des Immunsystems bestehen. Dies
konnte insbesondere für Immunzellen, wie z. B. TAMs, gezeigt werden. Die Anzahl der TAMs
im Tumorgewebe korrelierte mit der Tumorprogression. Der CCR4-Chemokin-Rezeptor ist vor
allem in die zielgerichtete Migration von Zellen der Immunabwehr involviert. Es sollten CCR4-
Knockout-Mäuse (Genetischer Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors) mit Wildtyp-Mäusen
(C57BL/6-Mäusen) im murinen orthotopen syngenen Pankreaskarzinommodell verglichen
werden. Es sollte untersucht werden, ob der CCR4-Chemokin-Rezeptor die Progression des
Pankreaskarzinoms beeinflusst. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollte geklärt werden, ob
der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors einen Überlebensvorteil bedingt. Des Weiteren
sollte geklärt werden, ob auf zellulärer Ebene eine Veränderung bezüglich der
Makrophagendichte im Tumorgewebe nachweisbar ist und ob die Tumorzellen murine
Makrophagen aktiv in ihrem Migrationsverhalten beeinflussen können. Die gewonnenen
Erkenntnisse könnten möglicherweise, bei Übertragung aus dem Mausmodell auf den
Menschen, die gängige leitliniengerechte Therapie von Pankreaskarzinompatienten
beeinflussen.
Versuchsplanung
Der Versuchsaufbau setzt sich aus drei Teilbereichen zusammen.
Im ersten Teil soll im Tierversuch die Progression des Pankreaskarzinoms gemessen werden.
Hierzu wurden im Rahmen des standardisierten murinen orthotopen syngenen
Pankreaskarzinommodell die Tumoren induziert. Als Messinstrument zur Beurteilung der
Progression wurde die Schnittbildgebung mittels 7-Tesla-Kleintier-
Magnetresonanztomographie ausgewählt. Die Untersuchung wurde nach 3 und 5 Wochen
durchgeführt. Es stand eine Bildauswertungssoftware zur Verfügung, mit der unter anderem die
Tumorgröße bestimmt werden konnte.
42
Im zweiten Teil sollte geklärt werden, ob sich durch den Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors eine Beeinflussung der Überlebenszeit messen lassen könnte. Hierzu wurden in
einem weiteren Tierversuch im Rahmen des standardisierten murinen orthotopen syngenen
Pankreaskarzinommodelles die Tumoren induziert. Es wurde eine Überlebenskinetik nach
Kaplan-Maier als passendes Untersuchungswerkzeug ausgewählt.
Im dritten Teil sollte das immunologische Mikromilieu der Pankreaskarzinome untersucht
werden, wobei das Augenmerk auf die eingewanderten TAMs gerichtet war. Verwendung
fanden die im ersten Teil gewonnenen Tumorproben. Zur quantitativen Messung wurde ein
Verfahren ausgewählt, in dem die explorierten Tumoren histopathologisch aufgearbeitet und
die Zielzellen angefärbt wurden. Es erfolgte eine standardisierte Auszählung, u. a. durch digital-
photographisch unterstützte Mikroskopie. Eine Software zur automatisierten standardisierten
Auswertung stand zur Verfügung.
Zudem sollte eine direkte Beeinflussung der Makrophagen durch das Pankreaskarzinom
untersucht werden. Hierzu wurde eine Migrationsanalyse durchgeführt. Es wurden
Makrophagen der Versuchstiergruppen im Verhalten bezüglich ihrer Migration auf Signalstoffe
des Pankreaskarzinoms hin verglichen.
43
MATERIAL UND METHODEN
Material
Geräte
Bruker ClinScan 7.0 Tesla Kleintier MRT Bruker, Ettlingen, Deutschland
Glasabsaugpipetten VWR, Wien, Österreich
Inkubator NUNC GmbH, Wiesbaden, Deutschland
Kulturschalen (10cm) Greiner, Frickenhausen, Deutschland
Mikroskop Karl-Zeiss-Jena, Jena, Deutschland
Mikroskopkamera Leica, Wetzlar, Deutschland
Neubauer Zählkammer Braun, Melsungen, Deutschland
Pipettierhilfe Pipetboy Hirschmann, Eberstadt, Deutschland
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Sicherheitsabsaugpumpe HLC Laborgeräte, München, Deutschland
Sterilisator Memmert, Schwabach, Deutschland
Magnetrührer/Schüttler S140 mlw, Ilmenau, Deutschland
Ultraschallhomogenisator Bandelin, Berlin, Deutschland
Magnetrührer/Schüttler Vortex, VF2 Jahnke & Kunkel, Staufen, Deutschland
Wasserbad GFL, Großburgwedel, Deutschland
Zentrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Waage Sartorius, Göttingen, Deutschland
Neubauer Zählkammer Braun, Melsungen, Deutschland
Operationsbesteck ASANUS Medizintechnik GmbH,
Neuhausen ob Eck, Deutschland
Tabelle 2 - Materialliste Geräte
Verbrauchsmaterialien
Trypanblau Gibco cell culture, Karlsruhe, Deutschland
PenStrep (Penicillin/Streptomycin) Gibco cell culture, Karlsruhe, Deutschland
RPMI 1640 Gibco cell culture, Karlsruhe, Deutschland
BSA (Fetal Bovine Serum Albumin) PAA, Pasching, Österreich
Trypsin Gibco cell culture, Karlsruhe, Deutschland
44
PBS (Phosphat Buffered Saline) PAA Laboratories, Cölbe, Deutschland
Reagenzröhrchen Haereus, Hanau, Deutschland
Ketanest S® Injektionslösung, Ampulle Pfizer Pharma, Berlin, Deutschland
Rompun® Injektionslösung, Ampulle Bayer HealthCare, Berlin, Deutschland
Buprenorphin Reckitt Benckiser Group, Berkshire,
England
Catgut Nahtmaterial Catgut, Markneukirchen, Deutschland
Matrigel™ Basement Membrane Matrix BD Bioscience, San José, Kalifornien, USA
Isofluran Gas 1% - 1.5% Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG,
Wiesbaden, Deutschland
DAKO Target Retrieval Solution S1700 DACO Deutschland, Hamburg, Deutschland
F4/80 Antibody MCA 497R Serotec, Raleigh, North Carolina, USA
Aurion-BSA-c Aurion, Binnenhaven, Holland
Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat
Anti-Rat IgG (H+L)
Jackson ImmunoSearch Laboratories, Inc.,
West Grove, Pennsylvania, USA
DAP, 3,30‘-diaminobenzidine substrate kit
SK4100
Vector Laboratories, Burlingame,
Kalifornien, USA
Hämatoxylin Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München,
Deutschland
VectaMount Permanent Mounting Medium VectorLaboratories, Inc., Burlingame,
Kalifornien, USA
M-CSF Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach,
Deutschland
ThinCertTM Tissue Culture Inserts for
Multiwell Plates, 8µm pore size
Greiner Bio-One International GmbH,
Kremsmünster, Österreich
Multiwell plates Greiner Bio-One International GmbH,
Kremsmünster, Österreich
CyQUANT® Cell Proliferation Assay Kit Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
Massachusetts, USA
Tabelle 3 - Materialliste Verbrauchsmaterial
45
Versuchstierkäfige und Käfigzubehör
Makrolonkäfig Typ II L,
Bodenfläche 530cm²,
BxHxT 207x140x365mm
EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Edelstahldeckel mit Fallbügelverschluß und
Gitterabstand 7mm
EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Trennblöcke aus Edelstahl EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Beschilderung EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Trinkflaschen EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Gestelle für Kunststoffkäfige EHRET GmbH & Co. KG, Emmendingen,
Deutschland
Einstreu LIGNOCEL® Naturholzfaserstoff J. RETTENMAIER & SÖHNE GmbH + Co
KG, Rosenberg, Deutschland
Tierfutter ssniff® M-Z Extrudat ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest,
Deutschland
Tabelle 4 - Materialliste Versuchstierkäfige und Käfigzubehör
Versuchstiere
C57BL/6-Mäuse Charles River Laboratories, Sulzfeld,
Deutschland
CCR4-Knockout-Mäuse Eigenzucht mit C57BL/6-Hintergrund
Tabelle 5 - Versuchstiere
Zelllinie
Zelllinie 6606PDA Prof. David Tuveson [28], Cold Spring
Harbor, New York, USA
Tabelle 6 - Zelllinie
46
Software
Microsoft Office Suite, Excel, Version 2010 Microsoft Corporation, Redmond,
Washington, USA
Graph Pad Prism, Version 5 GraphPad Software, Inc., La Jolla,
Kalifornien, USA
MIPAV, Medical Image Processing,
Analysis, and Visualization, Version 7.2.0
Center for Information Technology National
Institutes of Health, Bethesda, Maryland,
USA
ImageJ, Image processing and analysis
program
U. S. National Institute of Health, Bethesda,
Maryland, USA
Tabelle 7 - Materialliste Software
47
Methoden
Zelllinie und Zellkultur
Zur Induktion der Pankreaskarzinome wurde die murine Zelllinie 6606PDA (Pancreatic Ductal
Adenocarcinoma) verwendet. Diese stammte von Prof. David Tuveson (Cancer Center at Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA) und wurde ursprünglich aus dem
Pankreasadenokarzinom einer transgenen C57BL/6 Maus mit dem Allel KrasD12G isoliert [28].
Die Kultivierung erfolgte in Schalen mit jeweils 10ml RPMI-1640 Medium mit 10% FBA
(Fetal Bovine Serum Albumin) und 100µg/ml PenStrep (Penicillin/Streptomycin) im Inkubator
bei 37° Celsius und 5% CO2.
Die Zellen der Zelllinie 6606PDA wurden im Intervall von 7-10 Tagen geteilt und auf neuen
Schalen ausgesät. Dieser Vorgang wurde unter sterilen Grundbedingungen und bei „Laminar-
air-Flow“ in der Zellbank realisiert. Zur Vorbereitung wurde die Zellbank 30 min mit UV-Licht
bestrahlt und zweimal mit Desinfektionsmittel nach Herstellervorgabe desinfiziert, alle
Materialien wurden auf Zimmertemperatur gebracht. Zum Teilen der Zellen wurde der
Zellüberstand abgesaugt, die bewachsene Schale mit 10ml PBS (Phosphat Buffered Saline)
vom restlichen Zellüberstand gereinigt und die Zellen mit 1ml PBS mit 0,05% Trypsin über
einen Zeitraum von 5min abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden bei 1000 Umdrehungen pro
Minute in der Zentrifuge abzentrifugiert und das so entstandene Pellet, nach Absaugen der
Trypsinlösung, mit dem vorbereiteten RPMI-1640 Medium resuspendiert und nach Bedarf auf
neue Schalen ausgesät.
Die Kultivierung der Zelllinie 6606PDA und alle angegliederten Arbeitsschritte wurden unter
pathogenfreien Bedingungen durchgeführt. Es erfolgte eine regelmäßige Testung auf
Mycoplasmen-Spezies, welche stets negativ ausfiel. Einmalartikel für die Zellpräparation sowie
Zellkulturen wurden steril verpackt gekauft. Hitzebeständige Glas- und Plastikmaterialien,
sowie Lösungen wurden 3 Stunden im Autoklaven bei 145°C sterilisiert. Nicht hitzebeständig
Lösungen wurden vor deren Verwendung steril filtriert.
Versuchstierhaltung und Versuchstiere
Die Tierhaltung der Medizinischen Fakultät Greifswald befindet sich im Biomedizin- und
Biotechnologiezentrum in Greifswald, dem sogenannten „Biotechnikum“. Die Haltung erfolgte
48
bei einer Temperatur von 20-24° Celsius, einer Luftfeuchtigkeit von 50-60% und einem Tag-
Nacht- Rhythmus von 12 zu 12 Stunden.
Zum Einsatz kamen 8-12 Wochen alte männliche CCR4-Knockout-Mäuse, die aus C57BL/6-
Mäusen generiert worden waren, und 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (Wildtyp-
Mäuse). Das Gewicht der Tiere betrug zum Zeitpunkt der Operation zwischen 20 und 26
Gramm. Alle Mäuse hatten bis zum Zeitpunkt der Operation eine Eingewöhnungsphase von
mindestens 7-14 Tagen. Es wurde auf die Einhaltung eines möglichst minimalen Stresslevels
geachtet.
Die Kennzeichnung der Käfige erfolgte durch Käfigkarten mit Angaben zu Stamm, Geschlecht,
und Herkunft der Tiere. Die permanente Kennzeichnung der Mäuse erfolgte durch Ohrlochung.
Die Bezeichnung der Mäuse setzte sich im laufenden Versuch aus Käfignummer und
Ohrmarkierung zusammen. (Beispiel: Maus 23 = im Käfig Nummer 2 und hat die
Ohrmarkierung Nummer 3). In der Auswertung sind den Mäusen nach Abschluss der Versuche
zur einfacheren Handhabung fortlaufende Kennnummern zugeordnet worden. (Beispiel: Maus
V1-ÜK-09 aus Versuchsaufbau 1 der Überlebenskinetik (ÜK) mit der Mausnummer 9). Die
Überwachung der Tiere wurde durch tägliche Kontrollen und wöchentliches Wiegen
gewährleistet. Die bei der Kontrolle festgestellten Auffälligkeiten und das Gewicht wurden in
Verlaufsprotokollen vermerkt. Die Kriterien der Kontrolle richteten sich nach dem etablierten
„Belastungs-Score bei Mäusen mit einem Pankreaskarzinom“ der eigenen Arbeitsgruppe [57-
59].
Parameter Untersuchung Bewertung Punkte
Erscheinungsbild Inspektion
Normal, sauber gepflegtes Fell 0
Leicht gesträubtes Fell 1
Mäßig gesträubtes Fell 2
Dauerhaft gesträubtes Fell, Piloerection,
Zeichen der Dehydration 3
Atmung Inspektion
Normal 0
Beschleunigt 1
Schwer 2
schwach 3
Gewichtsverlust Waage <5% 0
<15% 1
49
<20% 2
>20% 3
Spontanverhalten Beobachtung
Normal, lebhaft, neugierig 0
Verlangsamt, sitzende Haltung 1
Träge buckelige Haltung, schwankender
Gang 2
Dauerhafte (eingefrorene)
Buckelhaltung oder Seitenlage 3
Provoziertes
Verhalten Beobachtung
Maus flieht bei Käfigöffnung 0
Maus flieht bei Annäherung der Hand 1
Fluchtversuch erst bei Berührung 2
Maus flieht gar nicht 3
Abdomenpalpation Palpation
Weich, kein Druckschmerz, keine
Resistenz 0
Weich, geringe Schmerzreaktion 1
Palpable Resistenz, deutliche Reaktion 2
Großer Tumor,
deutliche Schmerzreaktion,
Bewegungseinschränkung
3
Tabelle 8 - Belastungs-Score bei Mäusen mit einem Pankreaskarzinom
Entsprechend der Belastung wurden Punkte zugeteilt. Wenn die vierte Kategorie (3 Punkte) in
einem Parameter oder nach Addition der Punkte aller Parameter eine Summe von 9 oder mehr
Punkten wurden, ist das Versuchstier als nicht überlebensfähig eingestuft und in Narkose
geopfert worden.
Planung, Vorbereitung, Methode und Durchführung der Operation
Gemäß Tierschutzgesetz sind alle tierexperimentellen Arbeiten durch das Landesamt für
Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern genehmigt
worden. Es liegen Erlaubniserteilungen unter den Aktenzeichen 7221.3-1.1-044/11 und 7221.3-
1.2-029/12 vor.
50
Die Vorbereitung der Zellen der Zelllinie 6606PDA zur orthotopen Injektion erfolgte nach
zuvor beschriebener Vermehrung. Zunächst wurde der Überstand abgesaugt. Die bewachsenen
Schalen wurden mit 10ml PBS gewaschen. Dann die Zellen mit 1ml PBS mit 0,05% Trypsin
über einen Zeitraum von 5min abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden bei 1000 Umdrehungen
pro Minute in der Zentrifuge abzentrifugiert. Das so entstandene Pellet wurde nach dem
Absaugen der Trypsinlösung mit PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Der
Reinigungsschritt mit PBS wurde ein zweites Mal wiederholt und das Pellet im Anschluss mit
serumfreien RPMI-1640 Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde unter dem Mikroskop mit
einer Zählkammer bestimmt und die Vitalität der Zellen mit Trypanblau überprüft. Die
verwendeten Zellen hatten eine Vitalität von mindestens 95%. Die Zellen wurden auf eine
Konzentration von 2,5 x 105 6606PDA Zellen pro 1 µl RPMI-1640 Medium verdünnt und bei
37° Celsius in einem Eppendorfröhrchen zur unmittelbar im Anschluss durchgeführten
Operation transportiert.
Die Induktion des Pankreaskarzinoms wurde durch eine orthotope Injektion von 2.5 x 105
6606PDA Zellen in den Pankreaskopf realisiert. Dazu wurden die Mäuse zunächst durch eine
intraperitoneale Applikation von Narkosemittel anästhesiert. Als Anästhetikum diente eine
Mischung aus Ketanest S® und Rompun®. Die Dosis betrug 87mg/kg KG und 13 mg/kg KG.
Die Eröffnung der Bauchhöhle erfolgte mit einem 1,5cm langen transversalen Schnitt. Der
Pankreaskopf wurde mit einem Baumwollstäbchen aufgesucht und exponiert. Die Injektion von
insgesamt 20 µl Gesamtvolumen erfolgte langsam über 10 Sekunden mit einer 27 gauge Nadel.
Dabei wurde eine Mischung aus 10 µl RPMI-1640 mit 2,5x105 6606PDA Zellen und 10 µl
Matrigel benutzt. Im Anschluss wurde das Baumwollstäbchen für 30 Sekunden auf die
Einstichstelle gedrückt. Nach der physiologischen Replazierung des Pankreas wurde das
Abdomen mit einer einfachen fortlaufenden Naht verschlossen. Zur postoperativen
Schmerztherapie kam subkutan injiziertes Buprenorphin mit einer Dosierung von 0,1 mg/kg
KG zur Anwendung [29]. Zur Gewährleistung der gleichen Operationsmethode wurden alle
Operationen vom gleichen Operateur durchgeführt. Dabei erfolgte eine Verblindung, das heißt
der Operateur wusste nicht welches Tier er operierte. Die Operation erfolgte käfigweise, die
Abfolge der Käfige und damit die Operationsfolge der Gruppen wurden zufällig festgelegt. Es
erfolgte eine Randomisierung der Reihenfolge der Tiere innerhalb der Gruppe.
51
Durchführung der Volumenmessung
7-Tesla-Kleintier-MRT
Für die Volumenmessung der Pankreaskarzinome in vivo wurde der 7-Tesla-Kleintier-
Magnetresonanztomograph der Firme Bruker verwendet (Bruker ClinScan, 7 Tesla, Ultra
Shielded Refrigerated Magnet, 290 mTesla/m gradient strength, Rheinstetten, Deutschland).
Als Spule wurde die „whole mouse body coil“ von Bruker verwendet, sodass der gesamte
Körper der Maus ohne Inhomogenitäten abgebildet werden konnte. Für die Abbildung wurden
hochauflösende T2-gewichtete Bilder in der Frontalebene (Frontal plane) und Horizontalebene
(Horizontal plane) angefertigt.
Spezifikationen der Frontalebene: TR (Wiederholungszeit, Time of Repetition): ca. 1200 ms;
TE (Echoerfassung, Time of Echo): 41.0 ms; FA (Spitzenwinkel, Flip Angle): 180°; FoV
(Untersuchungsbereich, Field of View): 42 mm × 42 mm; Matrix: 240 × 320; 24 Schnitte von
0,7 mm Schichtdicke pro Schnitt, Erfassungszeitraum (Acquisition time): ca. 15 min.
Spezifikationen der Horizontalebene: TR (Wiederholungszeit, Time of Repetition): ca. 1250
ms; TE (Echoerfassung, Time of Echo): 41.0 ms; FA (Spitzenwinkel, Flip Angle): 180°; FoV
(Untersuchungsbereich, Field of View): 40 mm × 40 mm; Matrix: 240 × 320; 24 Schnitte von
0.7 mm Schichtdicke pro Schnitt, Erfassungszeitraum (Acquisition time): ca. 10 min.
Ablauf der 3-Wochen-Untersuchung
Die Narkoseeinleitung erfolgte in einer Narkosekammer mit Isofluran 2-4%. Während der
Untersuchung im MRT wurden die Mäuse direkt über einen Schlauch mit Maskenaufsatz für
die Schnauze mit Narkosegas versorgt. Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte über ein
Narkosegerät mit Isofluran 1-1,5%. Die Narkosetiefe wurde über die Atemfrequenz gemessen.
Die MRT-Sequenzen wurden nach der Atemfrequenz getriggert, wobei diese auf 40 Atemzüge
pro Minute eingestellt wurde.
Ablauf der 5-Wochen-Untersuchung und Exploration
Die Narkoseeinleitung erfolgte in einer Narkosekammer mit Isofluran 2-4%. Die Untersuchung
im MRT entsprach in technischer Hinsicht der 3-Wochen-Untersuchung. Zur Untersuchung
wurden die Tiere in narkotisiertem Zustand durch Dislokation der Halswirbel geopfert. Die
Tiere wurden direkt nach der Untersuchung im MRT exploriert. Nach der Eröffnung der
52
Bauchhöhle wurden Tumor, Pankreas, Herz, Thymus, Leber, Milz und der gesamte
Gastrointestinaltrakt inspiziert. Nach Mobilisation des Magen-Darm-Pakets wurden Tumor,
Milz und Leber reseziert und konserviert. Die Konservierung der Tumoren erfolgte gedrittelt
zu jeweils einem Teil in Formalin und zwei Teilen in Gel in flüssigem Stickstoff eingebettet.
Sehr kleine Tumoren wurden halbiert und zu jeweils zwei Teilen in flüssigem Stickstoff
konserviert. Die resezierten Lebern wurden geteilt und jeweils zu einem Teil in Formalin fixiert
und zu einem Teil in Gel gebettet in flüssigem Stickstoff eingefroren. Auffällige Organe wurden
in einem Explorationsprotokoll vermerkt. Zur Dokumentation der Exploration wurde der
Tumor am Magen-Darm-Paket mit der Maus fotografiert. Außerdem wurde zur Dokumentation
der Tumorgröße der Tumor mit einem Millimetermaß zusammen abgebildet, die Ausmessung
erfolgte mit der Schiebelehre. Aus den Daten wurden mit der Formel (LxB²)/2 die Tumorgröße
geschätzt. Die Länge (L) war der größte mögliche Durchmesser, die Breite (B) war der zur
Länge im rechten Winkel liegende größte mögliche Durchmesser.
Erstellung der Volumenmessung
In die jeweilige Volumenmessung wurden die Volumina aller operierten Versuchstiere
einbezogen, die keine Übereinstimmung mit einem Ausschlusskriterium aufwiesen. Es wurden
drei Ausschlusskriterien festgelegt: Das erste Kriterium war das Fehlen von Daten aufgrund
eines verfrühten Todeszeitpunktes des Tieres. Dies kann durch das Operationstrauma oder
dessen direkte Folgen erklärt werden. Das zweite Kriterium war das Fehlen von Daten durch
einen zum Untersuchungszeitpunkt nicht nachweisbaren Tumor. Dies kann z. B. durch eine
fehlerhaft durchgeführte Injektion oder Fehlfunktion der Spritze erklärt werden kann, sodass
die Tumorzellen nicht in das Zielorgan abgegeben wurden. Das dritte Kriterium war das Fehlen
von Daten durch einen zum Untersuchungszeitpunkt nicht vollständig abbildbaren Tumor. Ein
zu großes und über das gesamte Abdomen ausgedehntes Tumorwachstum kann z. B. durch die
disseminierte Tumorzellaussaat durch sekundäres Dislozieren aus der Injektionsstelle oder
paraparenchymale Fehlinjektion in die Bauchhöhle erklärt werden. Das Volumen der
Pankreasadenokarzinome wurde anhand der im MRT generierten Bilder gemessen. Zum Lesen
und Ausmessen der Bilder wurde das Programm MIPAV (Medical imaging processing and
visualisation) benutzt. Dabei wurde in jedem einzelnen Bild der Tumor manuell als „ROI“
(Messbereich, Region of Interest) markiert und das „VOI“ (Messvolumen, Volume of Interest)
automatisiert durch das Programm berechnet. Die Markierung und Messung wurde zweimal
durchgeführt und der entsprechende Mittelwert zum Erstellen der Datentabelle benutzt. Die
53
Verwaltung der Daten erfolgte in einer Excel-Tabelle, die Auswertung und Darstellung erfolgte
mit Graph Pad Prism 5. Als statistischer Test wurde ein ungepaarter t-Test durchgeführt.
Erstellung der Überlebenskinetik
Die Messung der Überlebenszeit begann ab dem Tag der Operation. Gezählt wurden ganze
Tage. Die Kontrolle erfolgte täglich und richtete sich nach dem „Belastungs-Score bei Mäusen
mit einem Pankreaskarzinom“. Das Wiegen der Mäuse erfolgte wöchentlich. Der Zustand, das
Gewicht und das Todesdatum wurden in Verlaufsprotokollen notiert und in einer Excel-Tabelle
verwaltet. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm Graph Pad Prism 5. In die
Messung der Überlebenszeit wurden alle operierten Versuchstiere einbezogen, die keine
Übereinstimmung mit dem Ausschlusskriterium aufwiesen. Das Ausschlusskriterium war eine
Überlebensdauer von unter 2 Wochen (14 Tagen) ab dem Zeitpunkt der Operation. Ein früher
Tod kann durch das Operationstrauma oder dessen direkte Folgen erklärt werden. Der
Ausschluss wurde vorgenommen, um Einflüsse des Operationstraumas von Einflüssen der
Tumorerkrankung abzugrenzen. Der Versuchszeitraum wurde auf 13 Wochen (91 Tagen) ab
Zeitpunkt der Operation festgelegt. Die Festlegung des Endpunktes wurde vorgenommen, um
den statistischen Einfluss von langzeitüberlebenden Tieren zu minimieren. Ein nicht
eintretender Tod kann z. B. durch eine fehlerhaft durchgeführte Tumorimplantation oder
Fehlfunktion der Spritze erklärt werden. Die Darstellung erfolgte als Kaplan-Maier-Kurve. Als
statistischer Signifikanztest zum Vergleich der beiden Überlebenskurven wurde ein Log-Rank-
Test durchgeführt.
Immunhistochemische Färbung in der Kryostat-Histologie
Die in flüssigem Stickstoff schockgefrorenen Gewebeproben wurden bei -80°C
zwischengelagert. Direkt vor dem Schneiden wurden die Gewebeproben mit
Gewebeeinbettmedium auf dem Halter des Kryostat aufgebracht. Es erfolgte das Schneiden im
Kryostat, wobei die Schnittdicke zwischen 5 und 15µm variiert wurde. Die Schnitte wurden auf
Objektträger aufgezogen und getrocknet, dann wurden sie in Methanol für 10 min fixiert. Es
erfolgte die weitere Lagerung der fixierten und trockenen Präparate gut verpackt bei -20°C.
Durch die stark fibrotische Grundstruktur des Pankreaskarzinoms und die Nekroseherde konnte
54
nur ein verzerrtes und teils disloziert-aufgefächertes Abbild des Pankreaskarzinoms erreicht
werden. Auf den probeweise angefertigten immunhistochemischen Färbungen war keine
Quantifizierung der Makrophagen möglich, sodass die immunhistochemische Färbung im
Kryostat zugunsten der immunhistochemischen Färbung im Paraffinschnitt verlassen wurde.
Immunhistochemische Färbung in der Paraffin-Histologie
Die immunhistochemische Färbung zur Quantifizierung der Makrophagen in den
Paraffinschnitten erfolgte mit dem F4/80 Antikörper. Dazu wurden die Schnitte in folgender
Reihenfolge in Vollbädern entparaffiniert: 10 Minuten Xylol, 5 Minuten Methanol, 10 Minuten
Xylol, 5 Minuten Methanol, 10 Minuten Xylol, 5 Minuten 100% Ethanol, 5 Minuten 95%
Ethanol, 5 Minuten 70% Ethanol, 5 Minuten PBS. Zur Demaskierung von Epitopen wurden die
Schnitte mit 1:10 in Aqua dest. verdünnter DAKO „Retrieval Solution“ 45 Minuten auf Stufe
8 im Dampfdrucktopf gekocht. Nach dem Abkühlen und Einrahmen der Schnitte mit einem
Fettstift, wurden diese ab nun in der Feuchtkammer weiter bearbeitet. Durch Aufbringen von
3%-igem Wasserstoffperoxid wurde die Hintergrundaktivität gewebsständiger Peroxidasen
geblockt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde für eine Stunde mit 1% Aurion-BSA-c
geblockt. Der primäre Antiköper wurde in 1% „Aurion-BSA-c“ gelöst, bei einer Konzentration
von 1:20 für F4/80 Antikörper, und über Nacht bei 4°C auf den Schnitte inkubiert. Nach
weiteren drei Waschschritten mit PBS wurde der sekundäre Peroxidase-gekoppelte IgG-
Antikörper „AffiniPure Goat Anti-Rat“ in 1% „Aurion-BSA-c“ auf die Schnitte gegeben und
für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der sekundäre Antikörper wurde wieder von
den Schnitten mittels PBS heruntergewaschen und durch DAB (3,30‘-diaminobenzidine
substrate kit SK4100) nach Anleitung des Herstellers ersetzt, die Inkubation erfolgte im
Dunkeln für 20 bis 30 min. Nach gründlichem Waschen im PBS-Bad für 5 Minuten wurden die
Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt und in einer aufsteigenden Ethanolreihe, mit
den Schritten 70%, 95% und 100% Ethanol, sowie 100% Xylol für je eine Minute pro Schritt
entwässert und mit VectaMount eingedeckelt. Die Lagerung der präparierten Objektträger
erfolgte bei Raumtemperatur und Dunkelheit.
Die Dokumentation erfolgte durch standardisierte digitale Photographie der Schnitte unter dem
Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 30ms bei der internen
Lichtquellenstärkeeinstellung 5. Hierbei wurden die nekrosefreien Areale nach
Randomisierung mit 10 verschiedenen repräsentativen Bildausschnitten pro Schnitt abgebildet.
55
Zur Auswertung der Bilddateien wurde das Programm MIPAV verwendet. Das Programm
wurde mit den Softwareerweiterungen (Plugins und Add-Ons) „Colour Space Converter“,
„Colour Deconvolution“ und „Threshold Colour“ ausgerüstet. Unter dem Bearbeitungsmenü
(„Set Measurements“) wurden die entsprechenden Einstellungen („Area“, „Area Fraction“,
„Limit to Threshold“ und „Display Label“) ausgewählt und einheitlich gesetzt. So wurde die
spezifische F4/80-positive Fläche filtriert, mittels Farbraumtrennung („RGB-Stack“) farblich
vereinheitlicht und aufgeschlüsselt. Diese wurde dann standardisiert in Prozentangaben mittels
automatisierter Berechnung ermittelt. Die Verwaltung der Daten erfolgte in einer Excel-
Tabelle, die Auswertung und Darstellung erfolgte mit Graph Pad Prism 5.
Migrationsanalyse
Die Generierung der murinen Makrophagen wurde nach einem standardisierten Protokoll der
Arbeitsgruppe vorgenommen [54, 55, 58]. Hierzu erfolgte die Extrahierung von Knochenmark
aus den Hinterläufen von männlichen CCR4-Knockout- und C57BL/6-Mäusen. Die erzeugte
Einzelzellsuspension wurde in einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml auf 6-Loch-Platten in
einem Medium aus RPMI 1640, 5% FCS (Fetales Kälberserum, Fetal Calf Serum) und
100µg/ml PenStrep zu 2,5ml/Loch bei 37° Celsius und 5% CO2 für 6 Stunden im Inkubator
bebrütet. Hiernach wurde der Zellüberstand bis auf einen flächig deckenden Rest abgesaugt und
pro Loch 2 ml Medium aus RPMI 1640, 5% FCS, 100µg/ml PenStrep und 20ng/ml M-CSF
zugeführt. Ein Austausch des Mediums wurde alle 48 Stunden nach gleicher Vorgehensweise
für insgesamt eine Woche vorgenommen. Hierbei wurde ein konstanter Spiegel von 20ng/ml
M-CSF aufrechterhalten. Am 8. Tag wurde der Zellüberstand abgesaugt, ein Waschvorgang
mit warmen PBS vorgenommen und die Zellen nach Protokoll per Zellkratzer geerntet. Es
erfolgte die Resuspension in einem Medium aus RPMI 1640, 5% FCS und 100µg/ml PenStrep.
Die Zellzahl wurde unter dem Mikroskop mit einer Zählkammer bestimmt und die Vitalität der
Zellen mit Trypanblau überprüft. Die verwendeten Zellen hatten eine Vitalität von mindestens
95%.
Die Migrationsanalyse, auch als „Migration Assay“ bezeichnet, wurde nach einem etablierten
Protokoll der Arbeitsgruppe vorgenommen. Zur Verwendung kamen Zellkultureinsätze (Tissue
Culture Inserts) mit einer 8µm-Porengröße in 12-Loch Platten. Diese wurden vor Gebrauch für
2 Stunden eingefroren und unter der Zellbank aus den sterilen Verpackungen entnommen und
eingesetzt. Es erfolgte die dreimalige Spülung der Membranen mit dem Medium RPMI 1640
56
mit jeweils 500µl. Dann folgte das Einbringen von 300µl Matrigellösung im Verhältnis
1mg/1ml und Inkubation bei 37°C, sodass die Polymerisation induziert wurde. Hiernach kamen
die Abnahme des nicht polymerisierten Matrigels und das erneutes Waschen mit dem Medium
RPMI 1640 mit jeweils 500µl. Es wurden 100.000 murine Makrophagen in 400µl pro
Zellkultureinsätze (obere Kammer) von CCR4-Knockout- oder C57BL/6-Mäusen ausplattiert.
In die Löcher (untere Kammer) werden als Anlockmittel Zellüberstand von 6606PDA-Zellen
oder frisches Nährmedium eingebracht. Der Zellüberstand wurde im Rahmen des bereits
aufgeführten Teilungsvorganges durch Abnehmen nach dem halben Splittingintervall
gewonnen. Beim Befüllvorgang wurden untere und obere Kammer stets gleichzeitig befüllt.
Die so vollständig bestückten Platten wurden im Inkubator bei 37° Celsius und 5% CO2 für 12
Stunden inkubiert. Dann erfolgte vorsichtiges randständiges Absaugen und Verwerfen des
oberen Kammerinhaltes. Der untere Kammerinhalt wurde abgenommen und in einem
Eppendorfröhrchen gesichert. Die untere Kammer wurde für 10 Minuten mit Trypsinlösung
bestückt, es erfolgte immer die gleichzeitige Bestückung eines CCR4-Knockout- und eines
C57BL/6-Lochs. Die Unterseite des Zellkultureinsätze und das Loch wurden mit dem
Zellkratzer im standardisierten Bewegungsablauf bearbeitet. Die Trypsinlösung wurde mit den
geernteten Zellen zum zugehörigen Kammerinhalt im Eppendorfgefäß hinzupipettiert. Dann
erfolgte das Zentrifugieren für 10min bei 2.500rpm und vorsichtiges Absaugen der
Trypsinlösung. Die Weiterverarbeitung erfolgte nach dem Protokoll des „CyQUANT® Cell
Proliferation Assay Kit“. Die Standardkurven wurden aus den ausgezählten
Makrophagenpopulationen rekrutiert. Die Fluoreszenzintensität wurde gemessen und auf die
Zellzahl zurückgerechnet. Die Verwaltung der Daten erfolgte in einer Excel-Tabelle, die
Auswertung und Darstellung erfolgte mit Graph Pad Prism 5.
57
Statistische Auswertung
Software
Die Sammlung und Verwaltung der Daten erfolgte mit dem Tabellenkalkulationsprogramm
Microsoft Excel 2010. Die Analyse der radiologischen Aufnahmen wurde mit der
Bildanalysesoftware MIPAV (Medical Image Processing, Analysis, and Visualization)
durchgeführt. Die Analyse der histopathologischen Aufnahmen wurde mit der
Bildanalysesoftware ImageJ durchgeführt. Die statistische Aufarbeitung, Prüfung und
graphische Ausgabe der Daten erfolgte mit der Statistiksoftware GraphPad Prism 5.
Kaplan-Meier-Kurve und Log-rank-Test
Mit Hilfe der Kaplan-Meier-Kurve lassen sich Überlebensraten bestimmen. Überlebensraten
geben an, bei wie vielen Patienten bis zu einem bestimmten Zeitpunkt noch kein bestimmtes
Ereignis eingetreten ist. Die mittlere Überlebenszeit hängt sehr stark vom Zensierungsmuster
ab, sodass bei Überlebenszeiten immer der mediane Wert angegeben wird. Die mediane
Überlebenszeit ist der Zeitpunkt, zu dem die Hälfte der Patienten ein bestimmtes Ereignis
erlitten hat. Um die Überlebenszeiten statistisch miteinander zu vergleichen, wird das
Standardverfahren, der Log-rank-Test, angewendet. Der Log-rank-Test untersucht, ob die
Überlebenszeiten in zwei Gruppen gleich lang sind. Hierzu wird nicht nur ein bestimmter
Zeitpunkt betrachtet, sondern der gesamte Beobachtungszeitraum. Vereinfacht kann man
sagen, dass die Kaplan-Meier-Kurven miteinander verglichen werden [60].
Gepaarter und ungepaarter t-Test, F-Test
Um zwei Gruppen statistisch miteinander vergleichen zu können, wird eine Nullhypothese (es
besteht kein Unterschied) und eine Alternativhypothese (es besteht ein Unterschied) aufgestellt.
Es werden Messungen erhoben, welche zwei Gruppen kontinuierlicher Variablen ergeben. Der
gepaarte t-Test vergleicht zwei gepaarte Gruppen kontinuierlicher Variablen. Diese müssen
annähernd normalverteilt sein. Dabei werden die Messwerte durch gepaarte Messungen
erhoben. Dieser Test berücksichtigt, dass intraindividuelle Messwerte in der Regel ähnlicher
sind als interindividuelle. Wenn keine gepaarten Gruppen vorliegen wird der ungepaarte T-Test
58
verwendet. Der ungepaarte t-Test vergleicht zwei unabhängige Gruppen kontinuierlicher
Variablen. Diese müssen annähernd normalverteilt sein. Letztlich wird die Wahrscheinlichkeit
berechnet, eine Differenz der Mittelwerte zu beobachten, obwohl die Nullhypothese wahr ist.
Im Vergleich zum t-Test ist der F-Test ein Testverfahren, welches das Testen mehrerer
Hypothesen bez. einer Gruppe von Parametern in linearen Einzelgleichungsmodellen erlaubt.
59
ERGEBNISSE
Einleitung
Die aktuelle Studienlage und die Ergebnisse der eigenen Forschungsgruppe zeigten, dass aktive
gegenseitige Beeinflussungen von Tumoren und Zellen des Immunsystems bestehen. Dies
konnte insbesondere für Immunzellen, wie z. B. TAMs, gezeigt werden. Der CCR4-Chemokin-
Rezeptor ist vor allem in die zielgerichtete Migration von Zellen der Immunabwehr involviert.
Für den CCR4-Chemokin-Rezeptor sind die spezifischen Liganden TARC und MDC bekannt.
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollte die Wirkung des CCR4-Chemokin-Rezeptors auf
die Progression des Pankreaskarzinoms im murinen Modell untersucht werden. Verglichen
wurden CCR4-Knockout-Mäuse (Genetischer Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors) mit
C57BL/6 Mäusen (Wildtyp). Hierzu wurden die Tumoren bei CCR4-Knockout-Mäusen und
C57BL/6-Mäusen induziert. Das Überleben der Mäuse wurde in einer Überlebenskinetik
untersucht. Die Tumorprogression wurde ebenfalls untersucht. Anschließend wurden die
Tumoren bezüglich ihrer Makrophagendichte beurteilt. Im Folgenden werden die Ergebnisse
der Versuche dargestellt:
Vorversuche
Für die solide Tumorzelllinie 6606PDA konnte in Vorversuchen auf mRNA-Ebene die
Produktion von TARC nachgewiesen werden, eine Produktion von MDC konnte nicht bestätigt
werden.
Tumorvolumen
Die Pankreaskarzinome der CCR4-Knockout-Maus (operiert n = 15) waren im Durchschnitt
kleiner als die der C57BL/6-Maus (operiert n = 15). Die Untersuchung erfolgte im 7-Tesla-
Kleintier-MRT, die Messung der Tumorgröße wurde anhand der generierten Aufnahmen
vorgenommen. Bei der Untersuchung nach 3 Wochen, gemessen ab der operativen orthotopen
Injektion der Pankreastumorzellen in den Pankreaskopf der Tiere, betrug die mittlere
Tumorgröße bei den C57BL/6-Mäusen (n=13) 204.2 ± 19.10 mm3. Bei den CCR4-Knockout-
60
Mäusen (n=15) 73.27 ± 11.68 mm3. Der t-Test ergab dabei einen p-Wert von <0,0001. Die
Größe der Tumoren war hochsignifikant unterschiedlich (***). Vor der 3-Wochen-
Untersuchung war bereits eine C57BL/6-Maus vorzeitig gestorben. Bei einer C57BL/6-Maus
konnte der Tumor im MRT wegen der zu geringen Größe nicht eindeutig vom Parenchym
abgegrenzt werden. Diese Datensätze wurden daher von der Auswertung ausgeschlossen.
Bei der Messung nach 5 Wochen betrug die mittlere Tumorgröße bei den C57BL/6-Mäusen
(n=11) 442.1 ± 57.86 mm3, bei den CCR4-Knockout-Mäusen (n=11) 114.0 ± 19.24 mm3. Der
durchgeführte t-Test ergab dabei einen p-Wert von <0,0001. Die mittleren Tumorgrößen sind
signifikant unterschiedlich (***). Vor der 5-Wochen-Untersuchung war eine CCR4-Knockout-
Maus vorzeitig gestorben. Bei drei CCR4-Knockout-Mäusen konnte der Tumor im MRT wegen
der geringen Größe nicht eindeutig vom Parenchym abgegrenzt werden. Bei drei C57BL/6-
Mäusen war der Tumor durch ausgedehnte Tumormassen im MRT nicht vollständig abbildbar.
Diese Datensätze wurden daher von der Auswertung ausgeschlossen.
Abbildung 4 - Ergebnisse der Tumorvolumenmessung im MRT nach 3 und 5 Wochen
Auf der X-Achse wird das durchschnittliche Tumorvolumen im mm³ dargestellt. Auf der Y-Achse
sind die Versuchsgruppen CCR4-Knockout-Mäuse (CCR4 KO) und die Wildtypmäuse der
Kontrollgruppe (C57BL/6) aufgetragen. Linksseitig ist die Messung im MRT nach 3 Wochen,
rechtsseitig die Messung im MRT nach 5 Wochen dargestellt.
In der abschließenden Beurteilung der Versuchsergebnisse zeigte sich, dass der Verlust des
CCR4-Chemokin-Rezeptors in der Maus zu einem signifikant verminderten Wachstum des
Pankreaskarzinoms führte.
61
Überlebenskinetik
Die am Pankreaskarzinom erkrankte CCR4-Knockout-Maus (operiert n = 22, verstorben in <14
Tagen n = 5, langzeitüberlebende Tiere n = 3) lebte länger als die erkrankte C57BL/6 Maus
(operiert n = 18, verstorben in <14 Tagen n = 3, langzeitüberlebende Tiere n = 1). Das mediane
Überleben in der Gruppe der CCR4-Knockout-Mäuse (n = 14) betrug 76 Tage. Das mediane
Überleben in der Kontrollgruppe (n = 14) betrug 33 Tage. Der p-Wert betrug 0,0039. Es bestand
ein sehr signifikanter Unterschied (**) in der Überlebenszeit der beiden Gruppen. Die CCR4-
Knockout-Maus hatte durch ihren Gendefekt beim Pankreaskarzinom eine höhere
Überlebenszeit als die C57BL/6 Maus. Dies bestätigte der Log-Rank-Test.
Abbildung 5 - Ergebnisse der Überlebenskinetik
Auf der X-Achse wird das prozentuale Überleben der Versuchstiergruppen dargestellt. Auf der
Y-Achse wird das absolute Überleben der einzelnen Tiere in Tagen dargestellt. Die CCR4-
Knockout-Mäuse (CCR4 KO) sind schwarz dargestellt, die Wildtypmäuse der Kontrollgruppe
(C57BL/6) sind grau dargestellt.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse des Versuches, dass der Verlust des CCR4-
Chemokin-Rezeptors in der Maus beim Pankreaskarzinom einen deutlichen Überlebensvorteil
bedingte.
62
Makrophageninfiltration
Die Pankreaskarzinome der CCR4-Knockout-Maus zeigten eine durchschnittlich geringere
Dichte an Makrophagen im Tumorgewebe als die Pankreaskarzinome der C57BL/6-Maus. Die
Untersuchung erfolgte mittels Formalin-fixierter und im Paraffinblock verarbeiteter
Gewebeschnitte, welche von den jeweiligen Pankreaskarzinomen angefertigt wurden. Es
erfolgte die Anfärbung der Gewebeschnitte mit F4/80-Antikörpern und die standardisierte
Quantifizierung unter dem Mikroskop. Hier zeigte sich bei den Pankreaskarzinomen der CCR4-
Knockout-Mäuse eine (n=90) 0,143 ± 0,02671 % F4/80-positive Tumorschnittfläche, bei den
Pankreaskarzinomen der C57BL/6-Maus eine (n=140) 0,3906 ± 0,06073 % F4/80-positive
Tumoroberfläche. Die Gegenkontrolle mittels Zählung der absoluten Anzahl der F4/80-
positiven Makrophagen bestätigte die Verteilung. Der durchgeführte ungepaarte t-Test ergab
einen p-Wert von 0,0019, die Verteilung von F4/80-positiven Makrophagen zwischen den
Tumoren war damit signifikant unterschiedlich (**). Der F-Test zum Vergleich der Varianzen
zeigt einen p-Wert von <0,0001, die Varianzen waren damit ebenfalls signifikant
unterschiedlich (***).
Abbildung 6 - Ergebnisse der Makrophageninfiltration im Tumorgewebe
Auf der X-Achse wird die F4/80-positive Fläche im Tumorgewebe, welche mit der
Makrophagenanzahl korreliert, dargestellt. Auf der Y-Achse sind die Versuchsgruppen CCR4-
Knockout-Mäuse (CCR4 KO) und die Wildtypmäuse der Kontrollgruppe (C57BL/6)
aufgetragen.
63
Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche zeigten, dass der Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors in der Maus zu einer signifikant geringeren Makrophageninfiltration im
Pankreaskarzinom führte.
Makrophagenmigration
Die Makrophagen der CCR4-Knockout-Mäuse zeigten eine geringere Migration auf von
Pankreastumorzellen produzierte Botenstoffe hin als die Makrophagen der C57BL/6-Maus. Die
bei der Untersuchung verwendeten Makrophagen wurden durch Stimulation mit M-CSF aus
dem Knochenmark der Versuchstiere gewonnen, als Lockstoff diente Zellüberstand von
6606PDA-Zellen, die Migration wurde in modifizierten Boyden-Kammern umgesetzt und
fluorometrisch quantifiziert. Hierbei zeigte sich, bei Verwendung von Tumorzellüberstand als
Lockstoff, eine durchschnittliche Migration von (n=8) 49.230 ± 11.080 C57BL/6-Makrophagen
und (n=8) 6.622 ± 839 CCR4-Knockout-Makrophagen. Der durchgeführte ungepaarte t-Test
zeigt einen signifikanten Unterschied von p=0,0018 (**). Im Vergleich hierzu zeigte sich bei
der Verwendung von frischem Nährmedium als Lockstoff eine durchschnittliche Migration von
(n=8) 29.030 ± 9.669 C57BL/6 und (n=8) 4.635 ± 640 CCR4-Kockout-Makrophagen. Der
ungepaarte t-Test zeigt eine Signifikanz von p=0,0246 (**). Wenn man die Migration von
C57BL/6-Makrophagen auf frisches Nährmedium und auf Zellüberstand von 6606PDA-Zellen
verglich, so war diese bei letzterem deutlich erhöht, der ungepaarte t-Test zeigt einen p-Wert
von 0,1894. Wenn man die Migration von CCR4-Knockout-Makrophagen auf frisches
Nährmedium und auf Zellüberstand von 6606PDA-Zellen verglich, so war diese bei letzterem
nur leicht erhöht, der ungepaarte t-Test zeigt einen p-Wert von 0,0808.
64
Abbildung 7 - Ergebnisse der Makrophagenmigration zu Tumorzellen
Auf der X-Achse sind die Versuchsgruppen der CCR4-Knockout-Mäuse (CCR4 KO) und der
Wildtypmäuse der Kontrollgruppe (C57BL/6) aufgetragen, jeweils mit dem entsprechenden
Lockstoff Zellkulturmedium (ME) und Zellkulturüberstand von Tumorzellen (ZK). Auf der Y-
Achse wird die durchschnittliche Anzahl der migrierten Makrophagen pro modifizierter
Boyden-Kammer dargestellt.
In Zusammenschau der Versuchsergebnisse zeigte der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors
eine signifikant reduzierte Migration von Makrophagen. Zellkulturmedium von 6606PDA-
Zellen zeigte zwar eine Erhöhung der Migration bei Wildtyp- und CCR4-Knockout-
Makrophagen, jedoch waren diese Ergebnisse nicht signifikant, wohingegen CCR4-Knockout-
Makrophagen wieder signifikant weniger migrierten als Wildtypmakrophagen.
65
Zusammenfassung der Ergebnisse
Ziel dieser Promotionsarbeit war es, die Rolle des CCR4-Chemokin-Rezeptors auf die
Progression des Pankreaskarzinoms im murinen orthotopen Pankreaskarzinommodell zu
untersuchen. Verglichen wurden CCR4-Knockout-Mäuse (Genetischer Verlust des CCR4-
Chemokin-Rezeptors) mit C57BL/6-Mäusen (Wildtyp-Maus).
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse der Versuche, dass der Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors in der Maus zu einem signifikant niedrigeren Wachstum des Pankreaskarzinoms
führte. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors in einer an
einem Pankreaskarzinom erkrankten Maus eine signifikant höhere Lebenszeit bedingte. Die
Ergebnisse der durchgeführten Versuche zeigten, dass der Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors in der Maus zu einer signifikant geringeren Makrophageninfiltration in den Tumor
führte. Außerdem zeigten die Versuchsergebnisse, dass der Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors eine reduzierte Migration von Makrophagen auf Lockstoffe von 6606PDA-Zellen
hin bewirkte.
66
DISKUSSION
Einleitung zur Diskussion
Die vorgelegte Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Immunbiologie des
Pankreaskarzinoms. In der aktuellen Literatur gibt es keine vergleichbaren Daten zur Wirkung
des CCR4-Chemokin-Rezeptors beim murinen Pankreaskarzinom. Erste vielversprechende
Erkenntnisse zur klinischen Anwendung des CCR4-Chemokin-Rezeptors wurden im Bereich
der hämato-onkologischen Tumoren erarbeitet. Möglicherweise können diese Ansätze auch im
Bereich der soliden Tumoren anderer Tumorentitäten zum Erkenntnisgewinn beitragen.
Tumor-assoziierte Makrophagen als Therapieziel
Für Makrophagen liegen unterschiedliche Nomenklatursysteme zur spezifischen Unterteilung
vor. Die gebräuchlichste ist die Unterteilung in klassisch aktivierte Makrophagen als M1-
Phänotyp und die alternativ aktivierten Makrophagen als M2-Phänotyp [61]. Das Bild der M1-
und M2-Polarisation wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen aufgegriffen und bezüglich
polarisierender Faktoren, phänotypspezifischer Oberflächenmoleküle, Morphologie,
Phagozytosefähigkeit und dem Expressionsprofil löslicher Faktoren erweitert. Im Bereich des
Pankreaskarzinoms und der TAMs hat sich das Bild der M1-und M2-Polarisation weitgehend
gehalten, feinere Charakterisierungen sind in der Entstehung. Die meisten publizierten Arbeiten
charakterisieren die TAMs über typische M2-Makrophagenmarker. Kurahara et al. führten
2009 als Erste eine Studie durch, die den Phänotyp von TAMs im Pankreaskarzinom mittels
immunhistochemischer Färbungen untersuchten. Hier wurden TAMs als rein M2-phänotypisch
definiert und über CD68 und CD163 oder CD204 detektiert. Es wurden jedoch keine M1-
assoziierten Marker zur Abgrenzung verwendet [62]. Yoshikawa et al. verwendeten in ihrer
Arbeit CD68 und CD204 zur Identifikation von TAMs im Pankreaskarzinom, ebenfalls ohne
einen M1-Marker zu bestimmen [63]. Ino et al. detektierten neben den M2-assoziierten Markern
CD163 und CD204 auch CD68/HLA-DR+ Zellen als M1-Makrophagen. Wobei hier neben
duktalen Pankreaskarzinomen auch Tumoren aus intraduktalen papillär-muzinösen Neoplasien
des Pankreas untersucht wurden, ohne zwischen den beiden Erkrankungen zu differenzieren
[64]. Helm et al. empfahlen in ihrer umfassenden Klassifizierung von Makrophagen im
Pankreaskarzinom eine differenziertere Betrachtungsweise. Die publizierten Daten dieser
67
Studiengruppe legten nahe, dass auch M1-Makrophagen malignitäts-assoziierte Effekte in
Pankreasgangepithelzellen bewirken können [65]. Daher wurden beispielsweise
Therapieansätze, welche eine Rephänotypisierung vom M2- zum M1-Phänotyp verfolgten,
kritisch beurteilt. Es wurde resümiert, dass eher die Gesamtheit der Makrophagen, als nur eine
spezielle Subpopulation ein sinnvolles Therapieziel darstellen würde [65].
Erste erfolgversprechende Ergebnisse zur Reduktion von TAMs wurden durch die Inhibition
der Wirkung der Monozyten rekrutierenden Faktoren CCL2 und M-CSF aufgezeigt [56, 66].
Ein weiterer Forschungsansatz war die Inhibition der Monozytenrekrutierung durch Blockade
von CXCL12, IL-1β und Integrin-α4β1 [67]. Ein zusätzlicher interessanter Ansatz war die
selektive Depletion der monozytären Phagozyten durch die Behandlung mit Trabectedin, einem
Zytostatikum mit antiproliferativen Eigenschaften. Hier konnte im Mausmodell eine
signifikante Reduktion der tumor-infiltrierenden Monozyten und der Tumorvaskularisierung
erreicht werden [68]. Ähnliche Ergebnisse konnten in der eigenen Arbeitsgruppe durch
Depletion der Makrophagen mittels Clodronat-bestückter Liposomen reproduziert werden [54,
55]. Auch in der vorliegenden Promotionsarbeit war der Verlust des CCR4-Chemokin-
Rezeptors mit einer geringeren Makrophagendichte im Tumorgewebe vergesellschaftet. Die
Tumoren mit weniger TAMs wuchsen langsamer und waren kleiner. Diese Erkenntnisse
gliederten sich in den aktuell herrschenden Konsens ein, dass TAMs die Entwicklung eines
bestehenden Tumors beeinflussen können. Neuartig war, dass die mit der Makrophagendichte
vergesellschaftete Modulation des murinen Pankreaskarzinomwachstums durch einen
genetischen Defekt begründet war. Zum murinen Pankreaskarzinom gibt es hierzu keine
vergleichbaren Studien. Die Erkenntnisse aus Versuchen mit anderen Tumorentitäten zeigten
Parallelen auf. Inwieweit sich bei der Makrophagenbeeinflussung die Abschaltung des Gens
mit der Wirkung der antikörpervermittelten Blockade des CCR4-Chemokin-Rezeptors
vergleichen lässt, wird Gegenstand weiterer Forschung sein. Hier zeigten sich erste gut
verträgliche und wirkungsvolle Ansätze bei hämatologischen Tumoren. Zusammenfassend
könnten wir daher auch auf neue immunologische Therapieansätze beim Pankreaskarzinom
hoffen.
68
Limitationen und technische Herausforderungen im Versuchsaufbau
Die MRT ist für die Diagnostik des Pankreaskarzinoms ein geeignetes Mittel, aber wie jede
Untersuchungsmethode in der Aussagekraft begrenzt [69]. Für die MRT wird bei der
Diagnostik des humanen Pankreaskarzinoms in einer Metaanalyse von Treadwell et al. eine
Sensitivität von 81% - 91% und eine Spezifität von 74% - 95% angegeben [70]. Diese Werte
könnten wahrscheinlich auch auf das Mausmodell übertragen werden. In dieser Arbeit wurden
standardisiert die Bilder einer einzelnen Schnittebene zur Berechnung der Tumorvolumina
verwendet. Das ist im Sinne der Fragestellung zielführend und ermöglicht einen guten
Vergleich. Werden zur Beurteilung eines Pankreaskarzinoms nur die Bilder einer einzigen
Schnittebene herangezogen, so kann die Abbildung insgesamt verzerrt und verkleinert
imponieren [71]. Daher werden bei der Diagnostik des humanen Pankreaskarzinoms stets die
Bilder mehrerer Schnittebenen in die Beurteilung einbezogen. Auch Kontrastmittelgaben
können nativ teils nicht eindeutige Abgrenzungen von Parenchym, Fettgewebe und
Tumorgewebe erleichtern und werden daher in der humanen Diagnostik verwendet [72]. In der
Volumenmessung wurde insgesamt in vier Untersuchungen kein eindeutiger Tumor
nachgewiesen. Dafür gibt es zum einen die oben genannten technischen Einschränkungen,
welche als Erklärungsansatz herangezogen werden können. Zum anderen könnten strukturelle
Veränderungen vermutet werden. Ein Tumor konnte zuerst nicht in der 3-Wochen-
Untersuchung, jedoch später in der 5-Wochen-Untersuchung nachgewiesen werden. Ein
weiterer Tumor konnte nicht in der MRT, aber in der chirurgischen Exploration nachgewiesen
werden. Zwei Tumoren konnten weder in der Bildgebung noch in der chirurgischen Exploration
nachgewiesen werden. Unwahrscheinlich, aber theoretisch möglich, wäre eine Remission, wie
sie für hämato-onkologische Tumoren beschrieben wurden [73]. Auch ein nekrotischer Zerfall
mit erschwerter Abgrenzung zum Parenchym oder Fettgewebe wäre möglich. Ein Vertauschen
der Tiere ist durch die räumliche Trennung und die Markierung mit an Sicherheit grenzender
Wahrscheinlichkeit auszuschließen. Zukünftig könnten engere Untersuchungszeiträume oder
zusätzliche Kontrastmittelgaben die Datenerhebung ergänzen, diese wären aber mit einem
hohen organisatorischem Aufwand und einer vermehrten Belastung der Tiere verbunden.
Aufgrund des Wachstumsmusters duktaler Pankreaskarzinome mit starker Fibrose und
sogenannter desmoplastischer Stromareaktion kann die histopathologische Aufarbeitung der
Resektionsränder erschwert sein. So kann die Befundung des humanen Pankreaskarzinoms
erschwert werden. Das murine Pankreaskarzinom der Zelllinie 6606PDA bildete Tumoren von
fester Konsistenz, welche durch ihre bindegewebige Grundstruktur teils fast knorpelig
69
anmuteten. Insbesondere die Tumoren der CCR4-Knockout-Mäuse zeigten eine klinisch-
palpatorisch festere Gewebekonsistenz. Es standen verschiedene Protokolle zur
histopathologischen Aufarbeitung zur Verfügung. Insbesondere die Durchflusszytometrie
(FACS / Fluorescence-activated cell sorting) stellte eine vielversprechende
Untersuchungsmethode zur Klassifizierung der zellulären Tumoranteile dar. Hier zeigten sich
technische Hürden bei Durchführung des Tumorverdaus zur Herstellung der benötigten
Einzelzellsuspension. Die etablierten Protokolle der Arbeitsgruppe brachten in Vorversuchen
keine repräsentativ standardisiert verwertbaren Ergebnisse. Insbesondere die Verarbeitung der
Tumoren der CCR4-Knockout-Mäuse konnte nicht zufriedenstellend realisiert werden. Daher
wurde auf die immunhistochemische Färbung in Paraffin-Schnitten zur standardisierten
Quantifizierung der zellulären Tumorbestandteile zurückgegriffen. Ein weiterer
Forschungsansatz sollte die Etablierung eines Protokolls zum Tumorverdau der festen
Pankreaskarzinomtumoren beinhalten [74].
Die immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten in der Kryostat-Histologie stellt eine
Methode zur Quantifizierung der zellulären Bestandteile von Tumoren dar. Ein weiterer Vorteil
ist die Zuordnungsmöglichkeit der Zellen innerhalb der architektonischen Tumorstruktur. Bei
der Anfertigung der Gewebeschnitte zeigten sich zahlreiche Rissbildungen und
gewebeverzerrende Auffiederungen, welche trotz Variation von Temperatur und Schichtdicke,
sowie der benutzten Gerätschaften persistierte. Dies trat insbesondere bei der
Gewebeaufarbeitung von Tumoren der CCR4-Knockout-Mäuse auf. Diese Gewebe waren von
zahlreichen Nekrosearealen durchzogen, welche oftmals Ausgangspunkte der Rissbildungen
waren. Die etablierten Protokolle der Arbeitsgruppe brachten in Vorversuchen keine
repräsentativ standardisiert verwertbaren Ergebnisse. Daher wurde auf die
immunhistochemische Färbung in Paraffin-Schnitten zur standardisierten Quantifizierung der
zellulären Tumorbestandteile zurückgegriffen. Ein weiterer Forschungsansatz sollte die
Etablierung eines Protokolls zur Anfertigung einer Kryostat-Histologie der
Pankreaskarzinomtumoren beinhalten.
70
Manus manum lavat – Tumorzellen und tumorassoziierte Makrophagen in
der Tumorprogression
Die gegenseitige Beeinflussung von Tumorzellen und TAMs wurde in der aktuellen Literatur
vielfach beschrieben. In Versuchen der eigenen Arbeitsgruppe wurde die Assoziation einer
geringeren Makrophagenanzahl mit einem geringeren Tumorwachstum nachgewiesen [54].
Dies wurde im Mausmodel für das murine Pankreaskarzinom in vivo durch Depletion von
Makrophagen über die Gabe Clodronat-haltiger Liposomen realisiert. Deutliche
Veränderungen konnten unter anderem auch an der Dichte der Blutgefäße nachvollzogen
werden. Ähnliche Effekte in Bezug auf die Blutgefäßdichte und die Tumoraggressivität in
Korrelation mit der Makrophagendichte konnten auch von anderen Autoren an anderen
Tumorentitäten aufgezeigt werden [75, 76]. Die Pankreaskarzinome der Mäuse mit geringerer
Makrophagenanzahl schienen durch weniger intensive Remodellierungsvorgänge im
Tumorgewebe benachteiligt zu sein [54]. Ein ähnlicher Mechanismus kann als
Erklärungsversuch für die Ergebnisse dieser Promotionsarbeit herangezogen werden. Durch die
genetische Manipulation wurde eine geringere Makrophagendichte im Tumorgewebe bewirkt.
Dies verlangsamte die Progression des murinen Pankreaskarzinoms. Möglicherweise wäre die
gezielte Beeinflussung der TAMs durch einen immunmodellierenden Ansatz eine schonendere
Variante der Therapie, als die Depletion der gesamten Makrophagenpopulation.
Die Einwanderung von Makrophagen scheint in der Frühphase der Tumorentwicklung zu
beginnen. Bereits in der Phase der präinvasiven Pankreasläsionen (PanINs) war die Invasion
von Immunzellen nachweisbar und persistierte bis zur invasiven Spätphase [48]. Stand am
Beginn der Pankreaskarzinomentwicklung ein entzündlicher Prozess, so wanderten hier bereits
zahlreiche Makrophagen ein. Diese waren überwiegend als M1-Makrophagen polarisiert und
hatten proinflammatorische Eigenschaften. Wobei den TAMs in Bezug auf die Einwanderung
von M1-Makrophagen bereits in den Frühphasen der Tumorentwicklung förderliche
Eigenschaften zugesprochen werden [77]. Hierzu gibt es Studien, welche unter anderem die
proinflammatorischen Effekte von TNF-α nachwiesen. Eine Produktion wurde sowohl für
Pankreaszellen der PanINs, als auch für M1-Makrophagen beschrieben. In dieser Frühphase
werden zahlreiche proinflammatorische Zytokine ausgeschüttet, welche eine
Entzündungsreaktion verstärken und aufrechterhalten. Die Aufrechterhaltung der
Entzündungsreaktion förderte die Entstehung von Pankreaskarzinomzellen [78]. Im Verlauf
schien sich unter dem Einfluss der Pankreaskarzinomzellen eine Verschiebung vom M1- zum
M2-Makrophagentyp zu vollziehen. Der M2-Makrophage wiederum verschaffte den
71
Pankreaskarzinomzellen ein positives Mikromilieu. Es erfolgten eine Dämpfung der
Entzündungsreaktion, ein verbesserter Anschluss an die Blutversorgung und ein Schutz vor der
körpereigenen Immunabwehr. Durch die höhere Tumorprogression wurden vermehrt M2-
Makrophagen rekrutiert, welche in der Folge auch die Tumoraggressivität, die
Invasionsbereitschaft und das Metastasierungsverhalten zu fördern schienen [48]. Ein
Therapieansatz, welcher die Invasion von Makrophagen vermindert, würde daher in allen
Entwicklungsphasen des Pankreaskarzinoms Ansatzpunkte bieten [65, 79]. Ein interessanter
Aspekt war die Beobachtung eines besseren Ansprechens der Chemotherapie, wenn
gleichzeitig pharmakologisch die Makrophagenanzahl vermindert wurde [48, 80]. Also könnte
durch eine zusätzliche Verminderung der TAMs möglicherweise eine Verbesserung der
bestehenden chemotherapeutischen Therapie erreicht werden. Als möglicher weiterführender
Forschungsansatz wäre die Kombination verschiedener Verfahren sinnvoll. Hierbei könnten
gemeinsame Endstrecken der Therapieansätze von additiven oder synergistischen Effekten
abgegrenzt werden. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte nur die Modulation eines
bestehenden Pankreastumors beurteilt werden, da der Tumor nicht spontan aus eigenem
Tumorgewebe durch Mutation entstanden, sondern durch Implantation von reifen Tumorzellen
eingebracht worden war. Dass das Wachstum von Tumorgewebe durch Immunzellen
beeinflusst werden kann, ist grundsätzlich bereits nachvollzogen worden. Die Erkenntnisse zur
immunmodulatorischen Beeinflussung des murinen Pankreaskarzinoms durch den fehlenden
CCR4-Chemokin-Rezeptor sind neu. Es gibt keine vergleichbaren Daten in der aktuellen
Literatur. Die Erkenntnisse decken sich weitgehend mit den Ergebnissen von Versuchen,
welche über andere Mechanismen zu einer Reduktion der TAMs führen.
Quid pro quo – regulatorische T-Zellen und tumorassoziierte Makrophagen
in der Tumorprogression
Die Anzahl der Tregs korrelierte beim Pankreaskarzinom mit einem kürzeren
Gesamtüberleben. Zudem korrelierte sie unter anderem mit einem Fortschreiten der PanINs,
mit einer schlechteren Differenzierung des Tumorgewebes und der Invasivität des
Pankreaskarzinoms [78]. Insbesondere eine durch Tregs vermittelte Immunsuppression im
Tumormilieu, welche eine Progression des Tumors förderte, wird in der Literatur beschrieben.
Eine erhöhte Anzahl von TAMs korrelierte beim Pankreaskarzinom mit einem kürzeren
Gesamtüberleben. TAMs konnten über direkte und indirekte Stimulation die Angiogenese und
72
Lymphangiogenese im Tumorgewebe beeinflussen. Die durch die TAMs geförderte
Angiogenese war mit einer erhöhten Tumorprogression und einem verstärkten
Metastasierungsverhalten vergesellschaftet [52]. Die M2-Makrophagen aktivierten Tregs und
rekrutierten diese über MDC ins Tumorgewebe. Eine Verminderung der TAMs könnte in dieser
Kausalkette auch eine Verminderung der Tregs bewirken. Es wurde bereits eine
Migrationshemmung von Tregs durch eine Blockade des CCR4-Chemokin-Rezeptors gezeigt.
Daher könnte auch eine direkte Hemmung der Tregs durch den genetischen Defekt des CCR4-
Chemokin-Rezeptors vorliegen [81-83].
Neben der absoluten Anzahl der Tregs wurden auch Missverhältnisse in den Subpopulationen
als tumorfördernd beschrieben [84]. Unter anderem kann sich das Verhältnis von Th1- zu Th2-
Zellen verschieben. Dabei wurde eine aktive Beeinflussung der Verschiebung vom Th1- zum
Th-2-Zelltyp durch Tregs nachgewiesen. Hier schien auch parallel eine aktive Beeinflussung
durch Stromazellen vorzuliegen. Im Verhältnis von Th1- zu Th2-Zellen war eine hohe Th2-
Zelldichte mit einer höheren Tumorprogression beim Pankreaskarzinom assoziiert [85]. Der
M2-Makrophage aktivierte unter anderem Th2-Zellen und triggerte in der Folge eine Typ-2
Immunantwort. Dabei war eine gegenseitige Interaktion von M2-Makrophagen und Th2-Zellen
nachweisbar. Eine Verminderung der TAMs könnte in dieser Kausalkette auch eine
Verminderung der Th2-Zellen bewirken. Der CCR4-Chemokin-Rezeptor wurde ebenfalls auf
Th2-Zellen nachgewiesen. Daher könnte auch eine direkte Hemmung der Th2-Zellen durch den
genetischen Defekt des CCR4-Chemokin-Rezeptors vorliegen. Eine mögliche direkte oder
indirekte Beeinflussung könnte auch andere Immunzellen, wie z. B. die natürlichen
Killerzellen, zugesprochen werden [86].
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor wurde u. a. auf M2-Makrophagen, Th2-Zellen und Tregs
beschrieben. Daher könnte die nachgewiesene Verminderung der Tumorprogression durch
genetischen Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors theoretisch auf verschiedenen Ebenen des
Immunsystems wirksam werden [87]. Ein möglicher weiterführender Therapieansatz wäre die
Quantifizierung von Treg-Zellen, Th1- und Th2-Zellen, sowie M1- und M2-Makrophagen
unter selektiver Ausschaltung der einzelnen Populationen. Hierbei könnte dann die zielführende
Ansatzebene in der immunmodulatorischen Kaskade ermittelt werden.
73
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor als Therapieziel
In ihrer Rolle als Liganden des CCR4-Chemokin-Rezeptors haben sowohl MDC, als auch der
TARC die Fähigkeit CCR4-positive Immunzellen zur Migration zu stimulieren. Dabei wurde
bereits die positive Wachstumsbeeinflussung von Tumorzellen durch beide Liganden über die
TAMs gezeigt [75, 88]. Eine Beeinflussung wurde auch unter anderem anhand von T-
Lymphozyten nachvollzogen [38]. Die Migration der Tregs auf Tumorzellen hin wurde
experimentell unter dem Einfluss des CCR4-Chemokin-Rezeptors und des Liganden MDC
nachgewiesen [40, 41]. Antikörper gegen den CCR4-Chemokin-Rezeptor werden bereits in
klinischen Studien eingesetzt und rücken auch bei nicht-hämato-onkologischen Tumorentitäten
zunehmend in den wissenschaftlichen Fokus [82, 89-93]. Im Rahmen dieser Promotion konnte
die Beeinflussung von Makrophagen durch Tumorzellen über den CCR4-Chemokin-Rezeptor
und seine Liganden gezeigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust des CCR4-
Chemokin-Rezeptors zu einer verringerten Progression des murinen Pankreaskarzinoms führte.
Daher stellte sich die Frage, auf welchen Ebenen der Immunantwort Beeinflussungen vorliegen.
Der CCR4-Chemokin-Rezeptor war in der Literatur unter anderem auf T-Zellen, dendritischen
Zellen, natürlichen Killerzellen, Monozyten und Makrophagen beschrieben worden [37]. In der
Arbeit von Ishida et al wurde beschrieben, dass die Wirksamkeit der anti-CCR4-Antikörper in
der Therapie von CCR4-positiven Tumorzellen im peripheren Blut deutlich besser als im
peripheren Gewebe zu sein schien. Dies wurde auf die Beteiligung von anderen Immunzellen
im Gewebe, wie z. B. natürlichen Killerzellen, Monozyten und Makrophagen, zurückgeführt
[47]. Daher müsste grundsätzlich von einer mehrschichtigen Wirksamkeit des Verlustes des
CCR4-Chemokin-Rezeptors ausgegangen werden. Dies gelte wahrscheinlich sowohl auf Ebene
der Immunzellen, als auch auf Ebene der Tumorzellen [76]. Ein nächster Schritt in der
Erforschung des murinen Pankreaskarzinoms sollte die qualitative und quantitative Abbildung
des Immunzellinfiltrates beinhalten. Versuche der eigenen Arbeitsgruppe zeigten bereits, dass
in vivo die Depletion von Makrophagen das Wachstum muriner Pankreaskarzinome deutlich
hemmte. Dies sollte auch auf Ebene der T-Helferzellen und der Tregs nachvollzogen werden.
So könnten eventuell parallele von synergistischen Effekten abgegrenzt werden. Als weiterer
Ansatz sollte die experimentelle Verwendung eines anti-CCR4-Antikörpers erwogen werden.
Zum einen könnten in vitro Zellpopulationen von Makrophagen, T-Helferzellen und Tregs in
ihrer Interaktion mit den murinen Tumorzellen in Bezug auf den CCR4-Chemokin-Rezeptor
untersucht werden. Zum anderen könnte in vivo die Beeinflussung durch den
immunmodulatorischen Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors im etablierten murinen
74
Pankreaskarzinommodell nachvollzogen werden. In der aktuellen Literatur gibt es keine
Versuchsanordnungen, die die Beeinflussung des CCR4-Chemokin-Rezeptors beim murinen
Pankreaskarzinom in vitro untersuchen. Daher können keine direkten Vergleiche herangezogen
werden. Die Beeinflussung von Makrophagen als onkologischer Therapieansatz ist ein
attraktives und aktuelles Forschungsgebiet. Dies wäre insbesondere vor dem
Erkenntnisfortschritt in der Antikörpertherapie von hämatologischen Tumoren mittels anti-
CCR4-Antikörpern interessant. Mit Spannung können die Ergebnisse laufender Studien in den
frühen klinischen Phasen mit anti-CCR4 Antikörpern bei soliden Tumoren erwartet werden.
Die amerikanische Gesundheitsbehörde “U.S. National Institutes of Health“ listete aktuell
bezüglich der Verwendung von anti-CCR4 Antikörpern unter anderem folgende Studien:
Anti-CCR4-Antikörper-Monotherapien unter den Versuchsnummern NCT02281409 und
NCT01929486. Kombinationstherapien mit zusätzlichen Antikörpern gegen das
Programmierter-Zelltod-Protein-1 (PD-L1) unter den Versuchsnummern NCT02476123 und
NCT02705105. Eine zusätzliche Kombinationstherapie mit Antikörpern gegen das
Zytotoxische-T-Lymphozyten-assoziierte-Protein-4 (CTLA-4) unter der Versuchsnummer
NCT02301130. Eine Kombinationstherapie mit agonistischen Antikörpern gegen den
Tumornekrosefaktor 9 (TNFRSF9) unter der Versuchsnummer NCT02444793. Eine
Kombinationstherapie mit dem Zytostatikum Docetaxel unter der Versuchsnummer
NCT02358473) [94].
Mittelfristig wäre aufgrund der Ergebnisse dieser Promotionsarbeit und bei entsprechender
Fortführung erfolgreicher Vorversuche eine präklinische Studie in Bezug auf die Wirkung des
CCR4-Chemokin-Rezeptors am humanen Pankreaskarzinom denkbar.
75
ZUSAMMENFASSUNG
Das Pankreaskarzinom weist unter allen Krebsarten eine der niedrigsten Überlebensraten auf.
Der einzige kurative Therapieansatz ist die chirurgische Resektion, unterstützt durch
chemotherapeutische Regime. In den aktuellen Leitlinien findet sich keine Empfehlung für eine
immunmodulatorische Therapie. Im Rahmen dieser Dissertation sollte Wirkung des CCR4-
Chemokin-Rezeptors auf die Progression des murinen Pankreaskarzinoms untersucht werden.
Es wurden unter Verwendung der Tumorzelllinie 6606PDA in einem murinen orthotopen
Pankreaskarzinommodell CCR4-Knockout-Mäuse und Wildtypmäuse verglichen. Der
Rezeptor ist in die gezielte Migration von Immunzellen involviert und wurde unter anderem
auf Makrophagen beschrieben. Hierzu liegen im Mausmodell keine Erkenntnisse vor. Daher
wurden die Tumoren verglichen, um die Rolle der tumorassoziierten Makrophagen zu
analysieren.
In der Tumorvolumenmessung mittels 7-Tesla-MRT zeigten die Wildtypmäuse nach 5 Wochen
größere Tumoren (442.1 ± 57.86 mm3) im Vergleich zu den CCR4-Knockout-Mäusen (114.0
± 19.24 mm3, p<0,0001). Nach Induktion orthotoper Pankreaskarzinome zeigten die CCR4-
Knockout-Mäuse in der Überlebenskinetik ein längeres medianes Überleben (76 Tage) im
Vergleich zu den Wildtypmäusen (33 Tage, p=0,0039). In der histopathologischen Auswertung
zeigte sich bei den Pankreaskarzinomen der CCR4-Knockout-Mäuse eine geringere
Makrophagendichte (0,14±0,026 %F4/80+Tumorfläche) im Vergleich zu denen der
Wildtypmäuse (0,390± 0,060 %F4/80+ Tumorfläche, p=0,0019). In vitro zeigten Makrophagen
mit Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors (6622 ± 839 Makrophagen) im Vergleich zu
Wildtyp-Makrophagen (49230 ± 11080 Makrophagen) in modifizierten Boyden-Kammern eine
geringere Migration von Makrophagen auf 6606-Tumorzellen hin (p=0,0018).
Im Rahmen dieser Dissertation konnte die Beeinflussung von Makrophagen durch das murine
Pankreaskarzinom nachgewiesen werden. Der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors führte
zu einer verlangsamten Progression des Pankreaskarzinoms, zu einem längeren Überleben der
Versuchstiere und zu einer geringeren Makrophagendichte im Tumorgewebe. Wären diese
neuen Erkenntnisse aus dem Mausmodell auf den Menschen übertragbar, so könnten
chirurgische und chemotherapeutische Therapien unterstützt und um einen
immunmodulatorischen Therapieansatz ergänzt werden. Ein anti-CCR4 Antikörper wurde in
aktuellen Studien erfolgreich bei humanen hämato-onkologischen Tumoren angewendet.
Zukünftig sollte eine Erforschung des Antikörpers beim Pankreaskarzinom erwogen werden.
76
ANHANG
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Danksagung
Zu Beginn möchte ich mich sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. med. Wolfram von Bernstorff für
das Überlassen des Promotionsthemas und die habilitierte Betreuung der vorliegenden Arbeit
bedanken. Seine Begeisterung und sein aufrichtiges Streben für die akademische Chirurgie und
die Wissenschaft ist vielen Menschen ein Vorbild.
Herrn PD Dr. med. habil. Lars Ivo Partecke danke ich sehr herzlich für die freundschaftliche
Aufnahme in unsere Arbeitsgruppen und seine außerordentliche Hilfsbereitschaft. Wir haben
viele gemeinsame Stunden in unseren Laboren und Besprechungen verbracht. Danke für die
vielen Hilfestellungen in unserer gemeinsamen Zeit.
Das gleiche gilt für Herrn Dr. med. Stephan Diedrich und Herrn André Käding. Vielen
herzlichen Dank für Rat und Tat, ich durfte viel von euch lernen.
Ein herzliches Dankeschön möchte ich Frau Antje Janetzko und Frau Doreen Biedenweg
aussprechen. Ihr habt mich in die Grundlagen der experimentellen Laborarbeit eingeführt und
wart stets freundlich und hilfsbereit an meiner Seite.
Mein besonderer Dank gilt meinen Arbeitsgruppen. Wir durften viel miteinander arbeiten und
viel voneinander lernen. Vielen herzlichen Dank für die gemeinsame Zeit. Ich danke auch
herzlich Herrn Dung Nguyen Trung, der mit Herzblut und Engagement dieses Projekt fortführt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit durfte ich auf der 32. Jahrestagung des Deutschen Pankreasclub
e. V. vorstellen. Ich möchte bekräftigen, wie wichtig und motivierend es für Doktoranden ist in
den wissenschaftlichen Diskurs treten zu dürfen. Ich danke dem Komitee für die Honorierung
und Dotierung meiner Arbeit mit dem Reisestipendium.
Im ganz Besonderen und nicht zu allerletzt möchte ich meiner ganzen Familie und all meinen
Freunden danken. Vor allem meinen Eltern und Eva Neumann. Danke, dass wir für einander
da sind.
![DER EINFLUSS DES ARYLHYDROCARBON-REZEPTORS AUF DEN ... · BisIX, Bis9 Bisindolylmaleimid IX Bmal1 Brain and muscle arnt like 1 BPIQII 8-[(3-Bromophenyl)amino]-1H-imidazo[4,5-g]-quinazolin](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5f3e4dabceec66347114dbb2/der-einfluss-des-arylhydrocarbon-rezeptors-auf-den-bisix-bis9-bisindolylmaleimid.jpg)
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