Fische und Stress –Tierschutzaspekte auf

molekularbiologischer Ebene

Dr. med. vet. Henrike Seibel

Hintergrund Tierschutzaspekt immer mehr im Fokus der Öffentlichkeit

Zunehmende Intensivierung der Fischproduktion

In wie weit sind Haltungsbedingungen tiergerecht?

Art. 20a Grundgesetz: der Staat hat in Verantwortung für

die künftigen Generationen die natürliche Lebensgrundlage und

die Tiere zu schützen

§ 2 Tierschutzgesetz: Tier muss angemessen ernährt,

gepflegt und verhaltensgerecht untergebracht sein und

Schmerzen oder vermeidbare Leiden oder Schäden müssen

vermieden werden

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Hintergrund

Etablierung von Stressparametern auf mRNA Basis aus Vollblut

Drittmittelprojekt, finanziert von der Bundesanstalt für

Landwirtschaft und Ernährung, Bundesprogramm Ökologischer

Landbau und andere Formen nachhaltiger Landwirtschaft (BÖLN)

3

Bei der Regenbogenforelle

Definition von Stress“… unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung.” (Selye, 1973)

Stressor

z.B.Organismus

Reaktion

Äußere

Anforderungsbedingung,

in deren Folge es zur

Auslösung einer

Stressreaktion kommt

„… Zustand, in dem die körpereigene Homöostase bedroht ist, bzw.

angenommen wird, dass sie bedroht ist.“ (Chrousos, 1998)

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Stressreaktion… alle Prozesse, die im Organismus als Antwort auf einen Stressor

in Gang gesetzt werden.

Gen-Expression

Stoff-wechsel

Energie-haushalt

Immun-system

Hormon-haushalt

Verhalten

Änderungen im/von …

Nerven-system

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Dauer

Intensitiät

1. Reaktion

• Neuroendokrine Ebene (Alarmreaktion)

• Ausschüttung von Stresshormonen

• z.B. plötzliche Verhaltensänderungen

2. Reaktion

• Physiologische Veränderungen (Resistenz)

• z.B. Erythrozyten ↑ oder Blutglukosespiegel ↑

• Sauerstoffaufnahme ↑ über Kiemen (Ventilation ↑)

3. Reaktion

• Gesamtkörpereinfluss (Erschöpfung)

• z.B. Wachstum ↓ oder Reproduktion ↓

• Krankheitsanfälligkeit ↑; Immunsuppression

akutMin.-Std.

chronischTage-Wochen-Monate

Stressreaktion

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Bild: GMA

Kein Stress Milder Stress Moderater Stress Hochgradiger Stress

Austausch von Fischmehl (50% in Basaldiät) durch Sojabohnenmehl um:

0 % 33 % 66 % 100 %

Fütterungsversuch mit Sojabohnenmehl (SBM)

Antinutritive Inhaltsstoffe

wie Saponine, Lectine, Phytinsäuren

Verkürzung der Darmzotten

↑ Durchlässigkeit der Darmschranke

Entzündungserscheinungen

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Bild: GMA

Untersuchte Parameter

Parameter auf molekularbiologischer Basis

Hämatologische Parameter: Hämatokrit

Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche)

andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut

Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut)

Wasserparameter (O2, NO2, pH, NH4, Temp.), täglich bestimmt

Wachstums- und Konditionsparameterz.B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme,

Mortalität, Gesundheitsstatus) Büsumer Fischtag 2016

8

https://www.aquaculture.uni-

kiel.de/de/fischtage/fischtag-2016-1

nach 4 Wochen

nach 8 Wochen

CD SBM33 SBM66 SBM100

K 0,89 ± 0,24 0,95 ± 0,29 0,94 ± 0,22 0,88 ± 0,20

SGR [%*d-1] 1,00 ± 0,12 0,87 ± 0,34 0,86 ± 0,1 0,44 ± 0,21

Cortisol und Kondition

V0 Initialbeprobung

CD Kontrolldiät

SBM Sojabohnenmehl

33,66,100 Austauschraten

K = Fulton´scher Konditionsfaktor; SGR = spezifische Wachstumsrate

n = 6

Stress konnte mit suboptimaler Futterformulierung erzeugt werden

0

5

10

15

20

25

30

35

Cort

isol [n

g/m

L]

Durchfall

Durchfall

Durchfall

V0 CD SBM33 SBM66 SBM100

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Untersuchte Parameter

Parameter auf molekularbiologischer Basis

Hämatologische Parameter: Hämatokrit

Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche)

andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut

Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut)

Wasserparameter (O2, NO2, pH, NH4, Temp.), täglich bestimmt

Wachstums- und Konditionsparameterz.B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme,

Mortalität, Gesundheitsstatus)

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Ausschüttung von

Botenstoffen

DNA

mRNA

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Bild: Seibel

DNA

mRNA

Minimal-invasive Methode zur

validen Stressdiagnostik

EDTA Vollblut

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Bild: Seibel

Molekularbiologie

Fluidigm Biomark HD-System

C3aR C3a Rezeptor

C5aR C5a Rezeptor

CCL4-1 C-C motif Ligand 4 Chemokin

CD41 Cluster of differentiation 41

ENPP3 Ectonucleotide

pyrophosphatase/phosphodi-

esterase family member 3

FGL2 Fibinogen like protein 2

Forellen-

spezifisches

CC-Chemokin

CC- Chemokin

FTH Ferritin Heavy Chain Gen

G-CSFR Granulozyten-Kolonie-

stimulierende Faktor Rezeptor

HP Haptoglobin

HSP30 Heat Shock Protein 30

HSP47b Heat Shock Protein 47b

HSP90AA1a Heat Shock Protein 90AA

Untereinheit 1a

HSP90AA1b Heat Shock Protein 90AA

Untereinheit 1b

IgM Immunglobulin M

IL1b Interleukin 1 beta

IL4 Interleukin 4

IL6 Interleukin 6

CXCL8 CXC-Motiv-Chemokine

Ligand 8, entspricht IL8

MPO Myeloperoxidase

MX1 Myxovirus 1 Gen

NCCRP1 Non-specific cytotoxic cell

receptor protein 1

NOS2 Stickstoffmonoxid-Synthase

PPARG Peroxisom-Proliferator-

aktivierte Rezeptoren

gamma

PSMB7 Proteasome subunit beta

type- 7 precursor

SAA Serum amyloid A

SOD1 Superoxid Dismutase 1

TCRB T cell receptor beta chain

Gen

TLR20 Toll like Rezeptor 20

TLR22a Toll like Rezeptor 22a

TLR3 Toll like Rezeptor 3

TLR5 Toll like Rezeptor 5

TLR9 Toll like Rezeptor 9

TNFa Tumor Nekrose Faktor alpha

TNFb Tumor Nekrose Faktor beta

UCP2 Mitochondrial uncoupling

protein 2

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Auszug

Allgemeine Ergebnisse

Die mRNA einiger Gene wurde z.Z. der Blutabnahme nicht

expremiert (CXCL12, HSP47α, IFNγ1, IL10, TCBP1)

Unterschiedlich hohe mRNA Expression

z.B. UCP2 zwischen 15 bis 100 Kopien / µg RNA

TLR20 bis 721.838 Kopien /µg RNA in der SBM100-

Gruppe

Teilweise deutliche individuelle Unterschiede zwischen

Fischen

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mRNA Expression der Myeloperoxidase (MPO)

Ko

pie

n / µ

g R

NA

Zeit

nach 4 Wochen nach 8 Wochen

n = 6

p=0.029

Wichtiges Enzym der

neutrophilen Granulozyten

H2O2

Starkes

Oxidations-

mittel

bakterizid

Regulation und

Termination von

Entzündungsprozessen

CD

SBM33

SBM66

SBM100

Maximum

Median

Minimum

15

mRNA Expression des Uncoupling Protein (UCP)

Ko

pie

n / µ

g R

NA

Zeit

nach 4 Wochen nach 8 Wochen

N = 6

Besonders von Makrophagen

expremiert

Kontrolliert die Aktivierung von

Immunzellen

Hemmt die Produktion von

reaktiven O2-Spezies

p=0.014

p=0.016

CD

SBM33

SBM66

SBM100

Maximum

Median

Minimum

n = 6

16

mRNA Expression des Serum Amyloid A (SAA)

Ko

pie

n / µ

g R

NA

Zeit

nach 4 Wochen nach 8 Wochen

N = 6

p=0.079

Während Akuter-Phase-

Reaktion ausgeschüttet

Rekrutiert Immunzellen

Wichtiger Teil des angeborenen

Immunsystems

Unspezifische

Immunreaktion bei

akuter Entzündung, auch

durch Nahrungsallergene

ausgelöst (Mensch)

CD

SBM33

SBM66

SBM100

Maximum

Median

Minimum

n = 6

17

mRNA Expression der Stickstoffmonoxid-

Synthase (NOS2) K

op

ien

/ µ

g R

NA

Zeit

nach 4 Wochen nach 8 Wochen

p=0.031

Bildet Stickoxid (NO)

Produziert von verschiedenen

Immunzellen

Potenter Immuneffektor mit

antimikrobieller Aktivität

Zu viel führt zu cytotoxischen

Effekten wie Gewebe- oder

Zellzerstörung

nach bakteriellen Infektionen

hochreguliert

CD

SBM33

SBM66

SBM100

Maximum

Median

Minimum

n = 6

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Fazit

Signifikant erhöhte mRNA Expression in der SBM100-Gruppe im vgl.

zur SBM33-Gruppe z.B. bei NOS2, SAA, UCP und MPO nach 8

Wochen

Verschiedene weitere interessante Gene noch in Auswertung

NOS2, SAA, UCP und MPO können bei Forellen auch über Blut

nachgewiesen werden

Eignung als chronische Futterstress-Anzeiger gegeben

Eignung als allgemeiner Stressparameter wird gerade noch validiert

Die hier vorgestellten Gene stehen mit, durch Sojabohnenmehl

bedingter, Unverträglichkeit und Entzündungen im Darm im

Zusammenhang

Bspw. wird IgM mit steigender Sojabohnenmehlmenge

herunterreguliert

Könnte ein Hinweis auf Immunsuppression sein

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Ausblick

Evaluierung der relevanten Stressparameter auf

molekularbiologischer Ebene in einem Fütterungsversuch auf

Haltungsbedingten Stress

Haltungsversuch nach Öko Richtlinien mit Forellen aus Starnberg

und Wielenbach in initial niedriger (2,5 kg/m3) und „hoher“ (10 kg/m3)

Besatzdichte

Ist eine der Forellenherkünfte für die niedrige/hohe Besatzdichte

besser geeignet ?

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Carsten Schulz

für das Ermöglichen des Projektes;

Helmut Wedekind, Marcus Zielasko und Kay Lübke (LfL Starnberg)

für die gute Kooperation und Zusammenarbeit;

Alexander Rebl, Tom Goldammer und Team (FBN Dummerstorf)

für Unterstützung beim Primerdesign und Austestung geeigneter Gene;

Kati Schlachter für die Beste Unterstützung bei den Laborarbeiten;

Stephanie Michl und Frederick Kaiser für statistische Unterstützung;

Jonas Müller für die Arbeit im Rahmen seiner Bachelorarbeit;

Laura Schynawa für die Arbeit im Rahmen ihrer Masterarbeit;

Michael Schlachter, Claudia Torno, Markus Griese und allen Kollegen an

der GMA für Unterstützung und Inspiration

Vielen Dank

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