Upload
ngonguyet
View
238
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN DETEKSI GEN ICE NUCLEATION
ACTIVE BAKTERI PADA TUMBUHAN BERDAUN LEBAR DI JALUR
PENDAKIAN CEMORO SEWU GUNUNG LAWU
TESIS
Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Guna Memperoleh Gelar MagisterProgram Studi Biosain
Oleh:
RIA KARNOS901302007
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2014
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iii
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI ISI TESIS
Saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa:
1. Tesis yang berjudul: “Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation
Active Bakteri pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro
Sewu Gunung Lawu” ini adalah karya penelitian sendiri dan bebas plagiat,
serta tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk
memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang
pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali secara tertulis
digunakan sebagai acuan dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber
acuan serta daftar pustaka. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam
karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai ketentuan
peraturan perundang-undangan (Permendiknas No. 17, tahun 2010).
2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi tesis pada jurnal atau forum ilmiah
lain harus seijin dan menyertakan tim pembimbing sebagai author dan PPs
UNS sebagai institusinya. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu
semester (enam bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan
publikasi dari sebagian atau keseluruhan isi Tesis ini, maka Prodi Biosain
PPs-UNS berhak mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan
oleh Prodi Biosain PPs-UNS. Apabila saya melakukan pelanggaran dari
ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik
yang berlaku.
Surakarta, Agustus 2014
Mahasiswa,
Ria Karno
S901302007
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iv
MOTTO
(Q.S. Ar-Rahman)
من خرج فى طلب العلم كان“ ”فى سبیل اللھ حتى یرحع(H.R.Tirmidzi)
“Hidup adalah kegelapan jika tanpa hasrat dan keinginan. Dan semua hasrat
serta keinginan adalah buta, jika tidak disertai pengetahuan”
(Kahlil Gibran)
Lembahlah Yang Membuat Gunung Terlihat Tinggi
“ I have no special talent. I am only passionately curious."(Albert Einstein)
“You have to endure caterpillars if you want to see butterflies”
(Antoine De Saint)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
Dengan mengucapkan syukur Alhamdulillah, kupersembahkan
karya ini untuk :
Istri tercinta, Nurrahmawati yang senantiasa menemani,
mendukung, dan memberi semangat dalam berjuang bersama.
Ayah, Ibu, Papa dan Mama mertua tercinta yang senantiasa
mengiringi tiap langkah kami dengan do’a.
Abang dan Kakak-kakak Ipar tersayang serta adik-adikku
tersayang.
Sahabat-sahabat seperjuangan, Program Studi Biosain 2013.
Almamater, Universitas Sebelas Maret.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vi
KATA PENGANTAR
Puji syukur pada sang Ilahi Robbi Allah SWT yang selalu melimpahkan
rahmat, hidayah, dan karuniaNya sehingga peneliti dapat menyelesaikan tesis
dengan judul “Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation Active Bakteri
pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung
Lawu”. Penelitian tesis ini tentunya tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak.
Untuk itu peneliti mengucapkan terima kasih kepada :
1. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS. Direktur Program Pascasarjana Universitas
Sebelas Maret, yang telah memberikan izin penelitian ini.
2. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si, Ketua Program Studi Biosain Fakultas Pascasarjana
Universitas Sebelas Maret Surakarta sekaligus selaku penguji dan
pembimbing akademik yang telah memberikan izin untuk keperluan tesis ini
dan memberikan saran dan masukan kepada penulis.
3. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc,Ph.D selaku pembimbing I yang telah memberikan
bimbingan, nasehat, saran dan bimbingan dalam penelitian tesis ini.
4. Dr. Ari Susilowati, M.Si, selaku pembimbing II yang telah begitu sabar dalam
memberikan bimbingan, nasehat dan saran dalam penelitian tesis ini.
5. Ahmad Dwi Setyawan, M.Si. dosen biologi fakultas MIPA yang telah banyak
membantu dan memberikan saran dalam penelitian ini.
6. Staf Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alamserta Staf Sub Laboratorium Biologi UPT Laboratorium Pusat MIPA,
Universitas Sebelas Maret yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan
penelitian.
7. Ayah dan ibu tercinta, istri, kakak, adik serta keluarga yang selalu mendoakan
dan memberikan dukungan.
8. Teman-teman Biosain Pascasarjana UNS yang selalu memberi semangat,
semoga tali silaturahmi kita tetap terjaga, dan semoga kesuksesan menyertai
kita semua.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vii
9. Segenap pihak yang telah membantu peneliti dari pembuatan proposal,
penelitian, sampai penelitian tesis ini yang tidak dapat peneliti sebutkan satu
persatu.
Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi peneliti pada khususnya dan
civitas akademika Fakultas Pascasarjana UNS Surakarta.
Surakarta, Agustus 2014
Peneliti
Ria Karno
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
viii
ABSTRAK
RiaKarno. NIM. S901302007. Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation Active Bakteri pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu. Pembimbing I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., Pembimbing II: Dr. Ari Susiolowati, M.Si. Tesis: Program StudiBiosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2014.
Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah bakteri filosfer yang mampumenyebabkan luka beku (frost injury) pada permukaan daun tanaman danberperan dalam biopresipitasi. Penelitian dan informasi tentang bakteri INA di daerah subtropis telah banyak dilakukan, namun di daerah tropis masih sedikit.Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat, menentukan spesiesberdasarkan gen penyandi 16S rRNA dan mengetahui hubungan kekerabatanbakteri INA yang diisolasi dari tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakianCemoro Sewu, Gunung Lawu yaitu 6 spesies tumbuhan berdaun lebar sertamengetahui gen penyandi protein pembentuk inti es bakteri INA.
Isolasi bakteri INA dilakukan dengan metode spread plate pada media Nutrient agar + gliserol (NAG) dan media King’s B. Aktivitas nukleasi esditentukan dengan metode tube nucleation test menggunakan circulating alcohol bath. Estimasi populasi ditentukan berdasarkan tabel MPN. Amplikon gen 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan 63 forward primer dan 1387 reverse primer. Hubungan kekerabatan ditentukanberdasarkan pohon filogenetik menggunakan program MEGA 5.1. Deteksi gen ina dilakukan dengan PCR menggunakan primer forward dan reverse dari inaZ, inaA, inaW serta inaX. Sekuens DNA dianalisis untuk mengetahui kemiripan dengan gen daribakteri INA lain yang ada di situs NCBI secara online.
Hasil penelitian didapatkan 3 isolat bakteri INA. Isolat A2N4 daritumbuhan Dodonae viscose Jacq memiliki similaritas 96% dengan Pseudomonas syringae. Isolat C2N9 dari tumbuhan Vaccinium laurifolium memiliki similaritas 97% dengan Pantoea sp dan isolat F1N6 dari tumbuhan Polygonum chinense L yang teridentifikasi memiliki similaritas 98% dengan Pseudomonas sp. Populasibakteri yang ditemukan tergolong rendah yakni <3 x 103/g hingga 5,4 x 103/g daun. Bakteri INA dari jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya memilki hubungan kekerabatan yang dekat.Hasil analisis sekuens gen ina menunjukkan gen pada isolat A2N4 mempunyaisimilaritas 99 % dengan gen pengkode ice nucleation protein pada Pseudomonas syringae, strain INA4.
Kata kunci: Bakteri Ice Nucleation Active (INA), deteksi gen, filogenetik, tumbuhan berdaun lebar, Cemoro Sewu, Gunung Lawu.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ix
ABSTRACT
Ria Karno. NIM. S901302007. Isolation, Identification and Detection Ice Nuclation Active Bacteria In Broadleaf Plant At Tracking Route Of CemoroSewu, Gunung Lawu. Adviser I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., Adviser II: Dr. Ari Susilowati, M.Si. . Thesis: Bioscience Study Program, Postgraduate Program, Sebelas Maret University.2014.
Ice nucleation Active Bacteria (INA) is a filosfer bacterium that can cause frost injury on the surface of plant leaves, besides, this bacteria also has a role in the process of bioprecipitation. Research and information on INA bacteria in subtropical regions have been carried out a lot, however they are still very little to be done in the tropical regions. This research aims to obtain isolates, to determine species based on 16S rRNA gene and to find out the genetics relationship of INA bacteria which is isolated from broadleaf plants in the Tracking route of Cemoro Sewu, Gunung Lawu which consists of 6 species of Lawu broadleaf plant and also to find out the protein-coding genes of ice nucleating bacteria of INA.
Isolation of INA bacteria was carried out by using spread plate method on the media of Nutrient agar + glycerol (NAG) and King's B media. The ice nucleation activity was determined by the method of tube nucleation test using circulating alcohol bath. The estimation of population were determined based on the MPN table. 16S rRNA gene amplification was done by Polymerase Chain Reaction (PCR) using 63 Forward primer and 1387 reverse primer. Genetic relationship was determined based on the phylogenetic tree in MEGA 5.1. program. Ina gene detection was done with PCR using forward and reverse primer of inaZ, inaA, inaW and inaX. DNA sequences were analyzed to find out its similarity with genes from other INA bacteria that exist in the GeneBank of NCBI online.
The results of the research obtained 3 isolates of INA bacteria. A2N4 isolates which was detected from the plants of Dodonae viscose Jacq had 96% similarity with Pseudomonas syringae. C2N9 isolates from Vaccinium laurifoliumplants had 97% similarity with Pantoeasp and F1N6 isolates from Polygonum chinense L plant identified had 98% similarity with Pseudomonas sp. The estimation of population of bacteria found were relatively low at <3 x 103 to 5.4 x 103/ g of leaf. The genetic relationship of INA positive bacteria from the Tracking route of Cemoro Sewu, Gunung Lawu and INA bacteria which was found previously had very close genetic relationship. The results ina gene sequence analysis showed that isolates A2N4 were 99% detected as ice nucleation protein coding genes in Pseudomonas syringae existing in ice4 gene, strain INA4.
Keywords: Ice nucleation Active Bacteria (INA), isolation, identification, detection of genes, phylogenetic, broadleaf plants.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL..................................................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN………………………………...................... ii
PERNYATAAN…………………………………………………….……... iv
MOTTO…………........................................................................................... v
HALAMAN PERSEMBAHAN…………........................................................ vi
KATA PENGANTAR….............................................................................. vii
ABSTRAK…………...................................................................................... ix
ABSTRACT………….................................................................................... x
DAFTAR ISI…….......................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR…………..................................................................... xiii
DAFTAR TABEL………….......................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN………….................................................................. xv
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang.................................................................................... 1
B. Rumusan Masalah................................................................................ 4
C. Tujuan Penelitian .............................................................................. 4
D. Manfaat Penelitian.............................................................................. 5
BAB II LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka……………………………………………………. 6
1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA)…………………………….. 6
2. Gunung Lawu……………………………………………………. 12
B. Kerangka Pemikiran……………………………………………….... 15
C. Hipotesis……………………………………………………………. 17
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian………………………………………. 18
B. Alat dan Bahan Penelitian…………………………………………... 18
C. Rancangan Penelitian……………………………………………….. 19
D. Analisis Data………………………………………………………... 24
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xi
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,
Gunung Lawu………………………………………………………. 25
B. Isolat bakteri ice nucleation active dari tumbuhan berdaun lebar di
Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu…………………….. 26
C. Populasi bakteri ice nucleation active .…………………………….. 28
D. Analisis Kemurnian DNA bakteri………………………………….. 30
E. Gen penyandi 16S rRNA isolat bakteri INA dari jalur Pendakian
Cemoro Sewu, Gunung Lawu……………………………………… 31
F. Sekuens gen penyandi 16S rRNA………………………………….. 33
G. Hubungan kekerabatan……………………………………………... 34
H. Amplikon gen ina…………………………………………………... 36
I. Sekuens gen ina…………………………………………………….. 41
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan penelitian……………………………………………… 43
B. Saran……………………………………………………………....... 44
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 45
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu……………. 13
Gambar 2. Bagan kerangka pemikiran………………………………… 16
Gambar 3. Tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,
Gunung Lawu……………………………………………… 25
Gambar 4. Aktivitas nukleasi es isolat dari tumbuhan berdaun lebar di
Jalur Pendakian Cemoro Sewu…………………………….. 27
Gambar 5. Estimasi populasi bakteri INA pada uji MPN……………... 29
Gambar 6. Profil amplikon gen penyandi 16S rRNA dengan primer
63f dan 1387r………………………………………………. 32
Gambar 7. Pohon filogenik bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar
di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu dan
beberapa bakteri INA yang ditemukan sebelumnya……….. 35
Gambar 8. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan
primer inaZ………………………………………………… 37
Gambar 9. Profil amplikon gen ina pada isolat A2N4 menggunakan
primer inaZ f dan inaZr dengan variasi suhu annealing…… 39
Gambar 10. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan
primer inaA………………………………………………… 39
Gambar 11. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan
primer inaX………………………………………………... 40
Gambar 12. Profil amplikon gen ina pada isolat C2N9 menggunakan
primer inaA untuk optimasi dengan variasi suhu
annealing…………………………………………………… 41
Gambar 13. Profil amplikon gen ina pada isolat F1N6 menggunakan
primer inaX untuk optimasi dengan variasi suhu
annealing…………………………………………………… 41
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Jumlah isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dari
tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu....... 27
Tabel 2. Estimasi jumlah bakteri berdasarkan tabel MP.......................... 30
Tabel 3. Konsentrasi dan Kemurnian DNA bakteri................................. 30
Tabel 4. Spesies-spesies yang mirip dengan isolat yang ditemukan
berdasarkan gen penyandi 16S rRNA bakteri INA………... .... 33
Tabel 5. Amplifikasi menggunakan empat primer spesifik gen ina ....... 37
Tabel 6 Gen ina yang memiliki similaritas dengan Sekuens DNA
menggunakan primer spesifik inaZ ……..………………….... 41
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Data isolat dari keenam sampel penelitian ………………. 52
Lampiran 2 Tabel MPN (Kombinasi estimasi bakteri) ………………. 53
Lampiran 3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen 16S
rRNA……………………………………………………... 54
Lampiran 4. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 pada
program BLAST dan Alligment urutan basa DNA dari
gen 16S rRNA ................................................................... 57
Lampiran 5. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina ……… 65
Lampiran 6. Urutan basa DNA dari gen ina pada program BLAST dan
Alligment basa DNA dari gen ina ……………………….. 66
Lampiran 7. Hasil BLASTX asam amino, alligment produk BLASTX
dan urutan asam amino isolat A2N4 …………………….. 67
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Mikroorganisme merupakan komponen penting dalam ekosistem. Jumlah
mikroorganisme melimpah dan tersebar pada banyak tempat di alam, baik pada
tubuh makhluk hidup maupun pada lingkungan di sekitarnya. Di dalam
komunitas, interaksi mikroorganisme dengan sesama mikroorganisme atau dengan
organisme lain dapat bersifat menguntungkan dan merugikan. Mikroorganisme
cenderung diasosiasikan dengan penyakit-penyakit infeksi atau pembusukan
makanan. Akan tetapi, mayoritas mikroorganisme justru memberikan kontribusi
bagi keseimbangan ekosistem lingkungan hidup (Pelczar, 2003). Salah satu dari
mikroorganisme itu adalah bakteri.
Bakteri merupakan organisme yang penyebarannya sangat luas dan
jumlahnya sangat banyak serta mampu hidup pada tempat-tempat yang ekstrim
dan tidak wajar seperti di tempat dengan suhu panas (60°C - 80°C), di tempat
dengan kondisi asam yang tinggi, miskin oksigen dan tempat ekstrim lainnya.
Bakteri juga banyak terdapat di tubuh organisme baik hewan maupun tumbuhan,
dalam tubuh atau pun bagian tubuh organisme.
Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa bakteri memiliki peranan
yang cukup besar bagi komunitas dan lingkungannya. Bakteri dari genus
Rhizobium berperan dalam menyediakan nitrogen bagi tanaman inangnya,
sedangkan bakteri Pasteuria penetrans berperan dalam pengendalian nematoda
pada tanaman. Bakteri juga memiliki pengaruh yang besar bagi lingkungan
terutama pada daun tanaman, salah satu di antaranya adalah peneltian Lindow et
al., (1982) tentang bakteri Ice Nucleation Active.
Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah salah satu bakteri yang
terdapat pada bagian organ tumbuhan yaitu pada permukaan daun. Menurut
Lindow et al., (1982), keberadaan bakteri INA pada permukaan daun mampu
meningkatkan kemungkinan terbentuknya luka beku (frost injury) pada suhu
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
2
diatas -5ºC. Penelitian Hirano & Upper (2000), juga telah membuktikan
kemampuan bakteri INA menyebabkan kerusakan beku pada beberapa tumbuhan.
Bakteri INA mampu menginisiasi pembentukan es, kemampuannya dalam
menginisiasi es didapat secara alami karena adanya substansi pembentuk inti es
(Lindow, 1983). Pembentukan inti es oleh bakteri INA dilakukan dengan
mengekspresikan jenis protein tertentu. Protein yang terdapat pada bakteri INA
misalnya pada Pseudomonas syringae, mengekspresikan protein inti es (ice
nucleation protein) yang terdapat pada membran luar selnya. Secara normal air
dingin akan membeku secara spontan apabila suhu di bawah -40ºC, dan apabila di
atas suhu -40ºC, maka air murni hanya akan menjadi super dingin (supercool).
Adanya pembentuk inti es pada bakteri INA dapat membantu mempercepat
pembekuan es. Hal ini karena inisiasi pembentukan es tergantung pada kehadiran
inti es, ukuran partikel dan bentuk inti es. Bakteri INA mampu mengkatalis
pembentukan es pada suhu di atas -10°C, bahkan beberapa di antaranya dapat
membentuk inti es pada suhu -1,5°C. Bakteri INA sebagian besar berasosiasi
dengan tanaman (Waturangi et al., 2008).
Bakteri INA umumnya tumbuh pada permukaan daun tanaman, beberapa
di antaranya yang telah ditemukan adalah Pseudomonas syringae, Pseudomonas
viridiflava, Pseudomonas fluorescens, Erwinia herbicola dan Xanthomonas
campestris (Edwars et al., 1994). Sebagian dari bakteri-bakteri ini secara potensial
memainkan peranan dalam pembentukan salju, perubahan cuaca, dan
pembentukan inti es di awan serta menstimulasi terjadinya hujan (Wahyudi,
1995).
Bakteri INA berpartisipasi dalam siklus biopresipitasi yaitu membantu
dalam mempengaruhi pembentukan awan dan hujan. Bakteri INA yang terdapat
pada daun terbawa oleh angin ke awan dan akan membantu dalam mempengaruhi
terjadinya hujan, sebaliknya hujan akan menguntungkan bagi pertumbuhan
bakteri yang terdapat pada permukaan tanaman karena kebutuhannya akan air
terpenuhi (Morris et al., 2004).
Bakteri INA melimpah pada permukaan daun, terutama pada daerah
dengan temperatur udara yang mendukung keberadaannya. Di Gunung Lawu,
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3
temperatur udaranya relatif rendah yaitu berkisar 20°C dan curah hujan yang lebih
tinggi. Menurut penelitian Setyawan (2000) jalur pendakian Cemoro Sewu
Gunung Lawu, merupakan daerah dengan tangkapan air hujan yang paling banyak
di antara lereng-lereng gunung lawu yang lainnya. Berdasarkan penelitian
Khussurur (2005) di jalur pendakian Cemoro Sewu ditemukan puluhan jenis
tumbuhan dan sebagian besar di antaranya adalah tumbuhan berdaun lebar.
Penelitian Lindow et al., (1978) menyatakan bahwa bakteri INA telah ditemukan
pada 74 spesies tanaman yang didapatkan dari California, Colorado, Florida,
Lousiana dan Wisconsin, Amerika Serikat. Penelitian ini mengindikasikan
kemungkinan terdapatnya bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar.
Tumbuhan berdaun lebar merupakan tumbuhan yang memiliki kanopi
lebih luas jika dibandingkan dengan tumbuhan lain. Dengan curah hujan yang
tinggi serta temperatur udara yang rendah di jalur pendakian Cemoro Sewu,
kemungkinan terdapatnya bakteri pengkristal es akan berpeluang sangat besar,
karena sebagian bakteri INA adalah bakteri yang banyak terdapat di udara dan air
hujan, sehingga penutupan kanopi yang luas dari tumbuhan berdaun lebar
memungkinkan peluang yang besar dalam menemukan bakteri pengkristal es.
Sebagian besar penelitian tentang bakteri INA dilakukan di daerah
subtropis, sedangkan di daerah tropis penelitian tentang bakteri INA masih relatif
sedikit, terutama pada tanaman berdaun lebar. Padahal, jumlah tanaman berdaun
lebar melimpah. Selain itu identifikasi dan karakterisasi gen bakteri juga masih
sangat sedikit. Identifikasi bakteri dan karakterisasi bakteri diperlukan untuk
mengetahui jumlah bakteri ini di alam dan memperkirakan peranannya bagi
lingkungan khususnya pada permukaan daun tumbuhan berdaun lebar di daerah
tropis.
Bakteri INA memiliki peran yang penting dalam biopresipitasi. Dengan
peranan bakteri INA itu, maka penelitian tentang isolasi, identifikasi molekuler
dan deteksi gen bakteri INA pada tanaman berdaun lebar di wilayah beriklim
tropis sangat perlu untuk dilakukan.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
4
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut dapat dirumuskan permasalahan
sebagai berikut :
1. Adakah bakteri Ice Nucleation Active (INA) yang dapat diisolasi dari
tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu?
2. Berapakah jumlah bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan
berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu ?
3. Apa saja spesies bakteri Ice Nucleation Active (INA) berdasarkan gen
penyandi 16S rRNA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar di jalur
pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu ?
4. Bagaimana hubungan kekerabatan antar bakteri Ice Nucleation Active
(INA) pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu
Gunung Lawu ?
5. Bagaimanakah karakter gen penyandi protein pembentuk inti es pada
bakteri Ice Nucleation Active (INA) yang ditemukan dari tumbuhan
berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu ?
C. Tujuan Penelitian
1. Menemukan dan mendapatkan isolat bakteri Ice Nucleation Active (INA)
pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung
Lawu.
2. Mengetahui jumlah bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan
berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu.
3. Mengetahui spesies bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan
berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu berdasarkan
gen 16S rRNA.
4. Mengetahui hubungan kekerabatan bakteri Ice Nucleation Active (INA)
pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung
Lawu.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
5
5. Mengetahui karakter gen penyandi protein pembentuk inti es pada bakteri
Ice Nucleation Active (INA) yang ditemukan dari tumbuhan berdaun lebar
di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu.
D. Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi kepada masyarakat tentang adanya bakteri Ice
Nucleation Active (INA) pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian
Cemoro Sewu Gunung Lawu.
2. Memberikan informasi tentang jenis, jumlah, karakter gen dan hubungan
kekerabatan bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan berdaun
lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu.
3. Memperkirakan kemampuan bakteri Ice Nucleation Active (INA) dalam
peranannya sebagai biopresipitasi.
4. Membantu pengolahan lahan dengan memilih vegetasi yang sesuai dalam
rangka memodifikasi cuaca.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA)
Jumlah bakteri di alam sangat melimpah, baik yang hidup di air, tanah,
tubuh organisme, tanaman atau bagian dari organ tanaman. Pada organ tanaman
khususnya daun, populasi bakteri yang paling banyak merupakan kelompok
bakteri filosfer yaitu bakteri yang berada di permukaan daun tanaman. Salah satu
diantaranya adalah bakteri yang mampu secara aktif menginisiasi pembentukan es
pada permukaan daun (Lindow et al., 1978).
Menurut Wahyudi (1995) pada umumnya organ tanaman, khususnya daun
membawa sejumlah bakteri pembentuk inti es. Adanya bakteri inti es pada daun
tanaman memungkinkan terbentuknya partikel-partikel es. Transisi pembentukan
cairan ke bentuk es ini disebut dengan nukleasi. Sedangkan zat yang memfasilitasi
transisi sehingga mengakibatkan pembekuan pada sub-nol disebut dengan
nucleator (Stephanie & Diana, 2011). Bakteri yang memiliki kemampuan dalam
nukleasi dan memiliki protein yang memfasilitasi transisi sehingga terjadi
pembekuan ini yang disebut dengan bakteri Ice Nucleation Active (INA).
Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah bakteri yang habitatnya di
permukaan daun tanaman atau sering disebut dengan bakteri filosfer. Bakteri INA
merupakan bakteri yang mampu menginisiasi pembentukan inti es pada
permukaan daun tanaman. Kemampuan bakteri INA menginisiasi pembentukan
inti es dikarenakan kandungan protein yang memungkinkan bakteri ini mengawali
pengkristal es pada suhu diatas -5˚C, bahkan ada yang mampu membentuk es
pada suhu -1,5˚C (Gurian-Sherman & Lindow, 1993). Jika bakteri INA tidak
memiliki protein nukleasi es, air dingin murni hanya dapat sebatas menjadi super
dingin dan tidak akan langsung membeku hingga suhu mencapai -40˚C.
Bakteri INA telah ditemukan pada genus dari tiga bakteri gram-negatif
yaitu : Pseudomonas, Erwinia dan Xanthomonas (Waturangi & Amelia, 2009).
Dari genus Pseudomonas ditemukan dua spesies yakni Pseudomonas syringae
6
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
7
dan Pseudomonas fluorescens. Dari genus Erwinia juga dua spesies yakni
Erwinia herbicola dan Erwinia ananas. Sedangkan Xanthomonas spesies yang
ditemukan adalah Xanthomonas translucens (Edwars et al., 1994).
Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, bakteri dari genus
Pseudomonas banyak ditemukan. Menurut Rostami (2012), bakteri INA dari
strain Pseudomonas syringae paling banyak ditemukan pada tanaman yang telah
diteliti.
a. Habitat dan Distribusi
Bakteri INA umumnya ditemukan hampir pada seluruh permukaan daun di
daerah yang memiliki suhu relatif rendah. Sebagian besar bakteri INA merupakan
bakteri filsofer yakni bakteri yang terdapat di bagian permukaan daun di antaraya
pada stomata, di sepanjang tulang daun dan dinding sel epidermi (Battie &
Lindow, 1999). Besarnya populasi bakteri nukleasi es mencapai 106 sel/g jaringan
tanaman. Jumlah populasi dapat berkurang bahkan hilang pada permukaan
tanaman. Hal ini tergantung pada kondisi lingkungan dan spesies tanaman (Hirano
& Christen, 2000). Selain itu kandungan nutrisi daun tanaman juga akan
mempengaruhi keberadaan bakteri INA. Permukaan daun yang memiliki senyawa
organik seperti fruktosa, sukrosa, asam amino dan vitamin akan dijadikan energi
dan sumber karbon bagi bakteri INA.
Menurut Beattie & Lindow (1999), kondisi stres lingkungan seperti
ketersediaan air, fluktuasi panas, stres osmotik dan paparan radiasi UV matahari
akan mempengaruhi jumlah populasi bakteri. Bakteri juga harus dapat bertahan
dari keadaan lingkungan yang berubah-ubah.
Kemampuan bakteri INA dalam pembentukan inti es dapat membantu
dalam menghadapi kondisi lingkungan yang berubah-ubah. Hal ini dikarenakan
kemampuan bakteri INA dalam mematikan sel-sel dan jaringan tanaman akibat
luka beku pada permukaan daun tanaman. Dalam hal ini bakteri pembentuk kristal
es sering dikonotasikan sebagai bakteri parasit (Morris et al., 2004). Adanya luka
beku pada sel-sel dan jaringan tanaman ini memberikan keuntungan bagi bakteri
INA karena mudah untuk diuraikan dan digunakan sebagai nutrisi bagi bakteri.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
8
Bakteri INA sangat melimpah di alam. Bakteri INA banyak ditemukan di
permukaan daun.Lindow et al., (1978) telah mendapatkan beberapa isolat bakteri
dari spesies Pseudomonas syringae dan Erwinia herbicola pada permukaan daun
tanaman. Bakteri INA juga melimpah di dalam salju dan air hujan (Morris et al.,
2004; Christner et al., 2008). Penelitian Brent Christner et al., (2008) menemukan
bahwa setiap sampel salju yang dikumpulkan ketika baru turun berisi bakteri
pembentuk inti es.
Studi tentang bakteri INA yang telah dipublikasikan lebih banyak
dilakukan di daerah subtropis. Namun, pada penelitian Waturangi et al. (2008)
ditemukan bakteri INA dari tanaman berdaun tropis yang dimakan yakni pada
tanaman poh-pohan (Pilea glaberina). Spesies bakteri yang ditemukan adalah
Pseudomonas sp. Bakteri INA dari genus Pseudomonas dan Xanthomonas juga
ditemukan oleh Ketabachi (2004), pada pohon Almond di provinsi Fars di Iran.
Ghasemi (1993), juga berhasil mengisolasi bakteri INA dari pohon Cherry dan
pohon-pohon Aprikot di wilayah Shahroud, Iran.
Isolasi bakteri dari air hujan dan udara juga pernah dilakukan di daerah
tropis. Waturangi (2011) dalam penelitiannya pada Maret hingga Mei 2008 di
Jakarta, Bogor, Bekasi, Tangerang dan Depok telah berhasil mengisolasi bakteri
INA dari air hujan dan udara. Dari hasil penelitiannya populasi bakteri INA
tertinggi ditemukan pada sampel air hujan dan udara yang diambil di Jakarta.
Sedangkan persentase bakteri INA dari air hujan lebih tinggi dari pada yang
diambil dari udara. Hal ini menunjukkan bahwa distribusi bakteri INA di daerah
tropis telah beberapa ditemukan, baik dari permukaan daun, dari air hujan maupun
dari udara.
Bakteri INA banyak ditemukan di permukaan daun tumbuhan. Arwiyanto
(2009), mengemukakan beberapa penelitian di Jepang ditemukan bakteri INA
pada tanaman teh, brokoli, murbei dan kubis. Bakteri INA juga ditemukan pada
tanaman jeruk, tomat, gandum dan beberapa tanaman keras di Amerika Serikat.
b. Gen penyandi Ice Nucleation Protein pada bakteri INA.
Pada membran bagian luar sel bakteri INA terdapat protein yang berperan
dalam pembentukan inti es dan dapat berinteraksi langsung dengan lingkungan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
9
eksternal. Protein pembentuk inti es ini diperlukan sebagai adaptasi bakteri
terhadap situasi yang berubah-ubah. Adanya protein pembentuk inti es membantu
bakteri INA dalam mempertahankan diri terhadap kondisi perubahan tersebut.
Pembentukan inti es pada bakteri dikendalikan oleh gen yang bertanggungjawab
dalam pembentukan inti espada suhu -2˚C sampai -4˚C, meskipun perannya yang
berkaitan dengan fisiologis bakteri belum diketahui (Morris et al., 2008). Hal ini
telah dibuktikan dari semua bakteri pembentuk inti es yang telah diuji, dan gen
tersebut telah diklon dari hampir semua spesies bakteri pembentuk inti es.
Kloning gen ina juga telah dilakukan. Beberapa yang telah berhasil
dikloning dan diurutkan adalah gen dari lima spesies bakteri yaitu : inaZ dari
Pseudomonas syringae (Green & Warren, 1985), inaW dari Pseudomonas
fluorescens (Warren et al., 1986), inaE dari Erwinia herbicola (Warren &
Corotto, 1989), inaA dari Erwinia ananas (Abe et al., 1989) dan inaX dari
Xanthomonas campestris pathopar translucens (Zhao & Orser, 1990).
Semua struktur gen pembentuk inti es serupa, walaupun gen
pembentuknya memiliki panjang yang berbeda. Semua gen akan menyandikan
protein yang unik dan atau khas pada ujung asam amino dan karboksilnya. Pada
bagian ujung aminonya bermuatan positif dan menyisip pada membran luar. Ini
berfungsi untuk stabilitas. Sedangkan pada ujung karboksilnya bermuatan positif
maupun negatif. Bagian tengah terdapat 16 asam amino yang diulang-ulang
hingga 120 kali ulangan (80% - 90% dari total protein) dan kaya akan asam amino
polar serin dan threonin yang berperan dalam mengorientasikan molekul-molekul
air tertata rapi hingga membentuk inti es (Kozloff et al., 1991b; Gurian-Sherman
& Lindow, 1993).
Ukuran protein pembentuk inti es pada bakteri INA berkisar antara 150 -
190.000 kilo Dalton (Govindarajan & Lindow, 1998). Sedangkan ukuran fragmen
DNA yang membawa gen ice+ yang berperan menghasilkan protein aktif
pembentuk inti es berkisar antara 3,4 sampai 4,0 kilo pasangan basa (Orser, et al.,
1985).
Protein aktif pembentuk inti es pada umumnya bersifat hidrofilik sehingga
terdapat pada permukaan membran luar bakteri. Pada Pseudomonas syringae
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
10
protein pembentuk inti es terdapat pada membran luar sel dan untuk aktivitasnya
diperlukan kesatuan dengan lipid membran (Kozloff et al., 1991b). Dengan
demikian protein INA tersebut akan menjadi aktif bila telah disisipkan pada
membran luar sel bakteri.
Berdasarkan akitivitasnya protein INA terbagi atas tiga kelas utama yaitu
kelas A (aktif membentuk inti es pada suhu -2˚C hingga -5˚C), kelas B (aktif
membentuk inti es pada suhu -5˚C hingga -7˚C ) dan kelas C (aktif membentuk
inti es pada suhu -7˚C hingga -10˚C). Adanya pembagian kelas ini dipengaruhi
oleh lipid fosfatidilinositol dan karbohidrat pada protein INA. Kelas A strukturnya
mengandung protein pembentuk inti es yang bergabung dengan fosfatidilinositol
dan manosa kompleks manan serta glukosamin. Kelas B strukturnya mengandung
protein pembentuk inti es yang bergabung dengan manan dan glukosamin, tapi
tidak bergabung dengan fosafatidilinositol. Sedangkan kelas C strukturnya
mengandung protein pembentuk inti es yang bergabung dengan beberapa residu
manosa saja (Turner et al., 1991).
c. Mekanisme pembentukan inti es
Pembentukan inti es diperlukan oleh bakteri INA sebagai cara untuk
memperoleh nutrisi dengan cara melukai tumbuhan dan digunakan untuk
menghambat bakteri lain yang menggunakan sumber nutrisi yang sama atau untuk
adaptasi perubahan cuaca seperti angin, hujan dan radiasi sinar ultraviolet
matahari (Suwanto, 1994).
Pembentukan inti es dapat dilakukan oleh bakteri INA karena adanya
protein unik yang berada pada membran luar sel bakteri pembentuknya. Protein
tersebut disandikan oleh satu gen tunggal yang disebut gen ice + atau ina.
Mekanisme pembentukan inti es dilakukan oleh protein INA yang bersifat
hidrofilik dengan cara mengkatalisis pembentukan inti es. Efektivitas protein ini
tergantung pada penataan di permukaan membran dan tingkat agregasinya. Pada
populasi bakteri yang tinggi, penataan dan agregasinya kompak sehingga jika satu
protein sudah membentuk inti es, maka protein yang lainnya akan lebih mudah
terinisiasi. Dengan terbentuknya satu pembentuk inti es maka protein yang
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
11
disusun kompak tersebut akan langsung menginisiasi air di sekitarnya menjadi es
juga (Sastry, 2005).
Pembentukan inti es oleh bakteri dipengaruhi oleh suhu, yaitu ketika suhu
rendah (kurang dari 0°C) air berada dalam keadaan metastabil. Populasi sel dari
galur-galur bakteri INA mampu mengkatalis pembentukan inti es dalam supercool
water yang suhunya antara -2°C hingga -12°C. Pada suhu hangat (-5°C) inti es
cenderung menjadi jarang dalam suatu populasi sel (Govindarajan & Lindow,
1998). Secara invitro pembentukan inti es sering dilakukan pada suhu -5°C hingga
-10˚C (Lindow et al., 1982a). Hal ini dilakukan untuk menjaga suhu pertumbuhan
atau suhu inkubasi sel sebelum diuji aktivitas pembentukan inti esnya. Selain
suhu, media kultur juga dapat mempengaruhi pembentukan inti es secara invitro.
Frekuensi pembentukan inti es dapat meningkat apabila ditumbuhkan pada
media yang sesuai di antaranya: media yang mengandung polialkohol seperti
gliserol, manitol, sorbitol dan sejenisnya (Lindow et al., 1982a). Frekuensi
pembentukan inti es pada bakteri INA dapat dipengaruhi oleh kondisi sel-sel
tumbuh dan suhu selama pertumbuhan serta pada komposisi media yang
digunakan sebagai media tumbuh (Hirano et al., 1991).
Kemampuan bakteri INA dalam pembentukan inti es terjadi karena adanya
inisiasi transisi dari bentuk cair ke es yang disebut nukleasi. Nukleasi merupakan
salah satu langkah awal yang penting dalam menciptakan es. Tanpa langkah ini,
es tidak akan pernah terbentuk atau hanya berada pada kondisi super dingin (Du et
al., 2003).
d. Peran bakteri INA dalam biopresipitasi
Biopresipitasi merupakan suatu siklus biologi berupa partisipasi bakteri
INA pada tanaman yang dapat memberikan kontribusi terhadap peningkatan curah
hujan. Bakteri INA yang berada pada kanopi-kanopi tanaman akan pindah ke
awan dan menstimulasi terjadinya hujan, sebaliknya peningkatan curah hujan
akan mempengaruhi penyebaran dan pertumbuhan bakteri INA serta
meningkatkan pertumbuhan tanaman (Morris et al., 2004). Tanpa adanya bakteri
INA, air di awan akan tetap menjadi cair hingga suhu mencapai -38°C (Attard et
al., 2012).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
12
Kemampuan bakteri INA dalam peningkatan curah hujan didasarkan pada
gagasan bahwa bakteri INA mampu mengkatalis pembentukan inti es.
Pembentukan inti es sangat diperlukan dalam pembentukan hujan pada awan
dingin (Polymenakou, 2012). Pembentukan hujan diawali dengan peristiwa
pembentukan kristal-kristal es yang berasal dari titik-titik air di dalam awan. Uap
air yang membentuk awan akan menempel pada kristal-kristal es tersebut
sehingga semakin membesar dan bertambah berat. Kristal-kristal es yang semakin
besar dan bertambah berat tidak mampu ditopang oleh angin sehingga akan jatuh
ke permukaan bumi dalam bentuk butiran-butiran air yang sering disebut hujan.
Peran bakteri INA dalam menstimulasi terjadinya hujan didasari oleh
keberadaannya yang melimpah di atmosfer. Bakteri INA terdapat dalam curah
hujan dan untuk beberapa lokasi geografis, aktivitas dan konsentasi bakteri ini
terkait dengan musim dan kimia curah hujan (Christner et al., 2008). Bakteri INA
ditemukan dalam beberapa sampel air hujan yang diambil dari Jakarta, Bogor,
Tangerang, Bekasi dan Depok (Stephanie & Waturangi, 2011).
Bakteri INA mudah menyebar ke jarak yang luas melalui pergerakan
angin. Penyebaran bakteri INA yang luas di atmosfer dapat mempengaruhi proses
meteorologi dan menyebabkan presipitasi (Morris et al., 2008).
2. Gunung Lawu
Gunung Lawu adalah gunung yang terletak di Pulau Jawa. Gunung Lawu
merupakan pegunungan vulkanik tuayang tidak aktif. Secara geografis gunung
Lawu terletak di sekitar 111˚15’ BT dan 7˚ 30’LS. Lereng di sebelah barat gunung
ini secara administratif termasuk wilayah Provinsi Jawa Tengah, meliputi
Kabupaten Karanganyar, Sragen dan Wonogiri, sedang lereng timur termasuk
Propinsi Jawa Timur, meliputi Kabupaten Magetan dan Ngawi. Gunung ini
memanjang dari utara ke selatan, dipisahkan jalan raya penghubung propinsi Jawa
Tengah dan Jawa Timur, dengan Cemoro Sewu sebagai dusun teratas. Topografi
bagian utara berbentuk kerucut dengan puncak Argo Dumilah setinggi 3.265 m
diatas permukaan laut (Setyawan & Sugiyarto, 2001).
Bagian selatan gunung Lawu memiliki topografi sangat komplek yang
terdiri dari bukit dan jurang dengan puncak Jobolarangan setinggi 2.298 m dpl. Di
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
13
lereng ini kawasannya sangat subur, karena merupakan daerah tangkapan hujan,
dimana angin tenggara yang berawan dan mengandung uap air menabrak gunung
dan terangkat ke atas, sehingga terjadi kondensasi dan titik-titik air turun sebagai
hujan. Pada lereng selatan, sepanjang tahun relatif mendapatkan curahan hujan
lebih tinggi bandingkan dengan lereng-lereng yang lain (Setyawan, 2000).
Sedangkan di sebelah utara terlihat lembah, bukit pasar dieng dan selo pundutan
(Sunarto, 2000).
Hutan di Gunung Lawu relatif beragam. Hal ini diakibatkan oleh
konsekuensi ketinggian gunung sehingga dijumpai beberapa zonasi tipe hutan
menurut ketinggian, yaitu zona hutan dataran rendah, zona hutan pegunungan
rendah, zona hutan pegunungan tinggi dan zona hutan sub-alpin (Stenis, 1972).
Pada kondisi hutan primer yang sangat lebat, sebagian besar ditumbuhi
oleh spesies-spesies herba dan jarang dijumpai rumput (Stenis, 1972,
Resosoedarmo et al., 1985). Hal ini diakibatkan karena intensitas cahaya matahari
yang relatif sedikit. Pada daerah dengan cahaya matahari yang cukup pertmbuhan
rumput, tumbuhan paku, lumut dan herba melimpah (Stenis, 1972).
Bagian dalam hutan berupa hutan primer dengan pohon-pohon tua dan
besar. Bagian luar berupa tanaman industri yang didominasi pohon Pinus, Puspa
dan Akasia.
a. Jalur pendakian Cemoro Sewu
Gambar 1. Jalur pendakian cemoro sewu, Gunung Lawu
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
14
Puncak tertinggi gunung Lawu berada pada ketinggian 3.265 m di atas
permukaan laut dengan puncak Argo (Hargo) Dumilah (Setyawan & Sugiyarto,
2001). Ada dua jalur yang sering digunakan untuk mencapai puncak gunung
Lawu. Jalur pertama dapat ditempuh melalui Jalur selatan yaitu melalui Cemoro
Sewu dan yang kedua Jalur Barat melalui Cemoro Kandang. Jalur pendakian
Cemoro Sewu dimulai pada ketinggian 1.800 m dpl. Jalur ini berada di wilayah
Magetan, Jawa Timur. Di jalur pendakian ini terdapat 5 pos pendakian yakni : Pos
I (Wesen-Wesen), Pos II (Watu Gedeg), Pos III (Watu Gede), Pos IV (Watu
Kapur) dan Pos V (Jolo Tundo).
b. Tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu
Hutan alam yang terdapat di jalur pendakian Cemoro Sewu mempunyai
tingkat keragaman jenis tumbuhan lebih sedikit bila dibandingkan dengan hutan
alam dataran rendah tetapi beberapa tumbuhan mempunyai nilai kerapatan yang
tinggi, hal ini disebabkan oleh faktor pengaruh ketinggian tempat hutan Cemoro
Sewu yang tinggi dan kelembaban yang tinggi (Stennis, 1972).
Hasil penelitian Khussurur (2005) menemukan 19 jenis tumbuhan yang
terdapat di kawasan hutan Cemoro Sewu terbagi 2 divisio yaitu divisio
Pteridophyta dan Spermatophyta. Beberapa di antaranya adalah tumbuhan
berdaun lebar. Jenis-jenis tumbuhan tersebut diantaranya adalah, Croton argiratus
BI, Melastoma malabatricum, Eugenia operculata Roxb, Willughbeia firma BI,
Cincona ledgeriana (Howard) Moens, Corchorusa cutangulus Lmh, Eupatorium
inulifolium H.B.K, Euphorbia sp, Xanthophyllum excelsum Miq, Lygodium
circinatum Swartz, Oenanthe javanica, Pandanus furcatus Roxb, Nephelium sp,
Baringtonia macrostachya Kurtz, Vemonia arborea, Drynaria sparsisora Moore
dan Drymaglossum heterophyllum.
Penelitian Setyawan & Sugiyarto (2001), memberikan data bahwa terdapat
142 spesies tumbuhan Spermatophyta di lereng selatan Gunung Lawu, sebagian
merupakan tumbuhan berdaun lebar. Beberapa di antaranya yaitu Amaranthus
gracilis, Acer laurinum, Urena lobata, plantago major, Podocarpus norifoilus D.
Don, Rubus chrysophillus Miq, Schefflera sp dan Rubus fraxinifolius Poir
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
15
B. Kerangka Pemikiran
Bakteri INA adalah bakteri yang terdapat di permukaan daun dan memiliki
kemampuan menginisiasi pembentukan inti es, sehingga dapat menyebabkan luka
beku (frost injury ) pada daun tumbuhan. Dalam perkembangannya, bakteri INA
secara potensial memiliki peranan penting di dunia klimatologi. Bakteri INA
berpartisipasi dalam siklus biopresipitasi. Christner et al., (2008), menyatakan
bahwa bakteri INA yang berada pada daun tanaman yang terbawa oleh siklus
angin dapat menstimulasi terjadinya hujan. Bakteri INA penting sebagai
nucleators troposfer.
Peran penting dan keunikan bakteri INA telah banyak diteliti dan
dipelajari di daerah-daerah subtropis, sedangkan di daerah tropis seperti Indonesia
masih sangat sedikit. Gunung Lawu adalah salah satu gunung yang terdapat di
pulau Jawa, Indonesia yang memiliki temperatur relatif rendah dan merupakan
pegunungan hujan tropis yang memiliki vegetasi hutan yang cukup beragam,
salah satunya adalah tumbuh-tumbuhan yang berdaun lebar. Kondisi ini
memungkinkan ditemukannya bakteri pembentuk inti es. Oleh karena itu perlu
dilakukan penelitian tentang identifikasi bakteri INA dan deteksi gen inaserta
hubungan kekerabatan bakteri INA yang terdapatpada jalur pendakian Cemoro
Sewu gunung Lawu, sehingga dapat digunakan dalam dunia klimatologi dan
biopresipitasi melalui pengelolaan lahan dengan vegetasi yang sesuai di masa
mendatang. Skema kerangka pemikiran dapat dilihat pada Gambar 3 berikut ini :
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
16
Gambar 2. Bagan kerangka pemikiran.
Estimasi bakteri INA
Tumbuhanberdaunlebar
Informasi dan penelitian yang masih sedikit di daerah tropis
Bakteri Ice Nucleation Active (INA)
Mampu menginisiasi pembentukan inti es
Menyebabkan luka beku (frost injury) pada daun tanaman
Berperan dalam proses biopresipitasi
Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu adalah daerah tropis
Keberadaan, jenis/spesies, estimasi dan hubungan kekerabatan bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar di Cemoro Sewu serta
peran bakteri INA di alam
Isolasi bakteri INA Identifikasi gen
Jenis-jenis bakteri INA
Gen ina bakteri
Deteksi gen
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
17
C. Hipotesis
1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA) dapat ditemukan dan diisolasi dari
tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu.
2. Identifikasi bakteri berdasarkan gen penyandi 16S rRNA yang ditemukan
pada tumbuhan berdaun lebar, memiliki identitas yang berbeda-beda.
3. Bakteri INA yang ada pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian
Cemoro Sewu, Gunung Lawu memiliki jumlah yang tinggi yaitu sekitar
106/ g daun.
4. Bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar termasuk ke
dalam beberapa gen bakteri yang telah ditemukan.
5. Bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar memiliki
hubungan kekerabatan yang dekat.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Juni 2014.
Pengambilan sampel dilakukan di jalur pendakian Cemoro Sewu Lereng Gunung
Lawu, Magetan, Jawa Timur.
Isolasi bakteri dilakukan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas
Maret. Uji aktivitas nukleasi es dilakukan di laboratorium Mikrobiologi
Universitas Atmajaya Jakarta. Identifikasi bakteri Ice Nucleation Active (INA),
deteksi dan kloning gen dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.
B. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
Tabung reaksi, cawan petri, gelas beker, erlenmeyer, Laminar Air Flow,
autoklaf, neraca analitik, bunsen burner, batang pengaduk, jarum ose, batang L,
hot plate, aluminium foil, mikropipet, tip, freezer, shaker, magnetic stirer, kapas,
kertas label, pulpen, vortex, rak tabung reaksi Polymerase Chain Reaction,
seperangkat alat elektroforesis, Biophotometer, gel doc, tabung Eppendorf dan
digital camera.
2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel tumbuhan berdaun lebar yang
berasal dari jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu, Media Nutrient Agar +
2,5% glieserol (NAG), Media King’s B, Aquades, alkohol, pepton, buffer fosfat
pH 7, Plasmid pGEM-T Easy, PrestoTMMini gDNA Bacterial Kit (Geneaid), Kapa
2G Fast Ready Mix (Kapa Biosystem), dNTP, MgCl2, Buffer PCR, 63 forward
Primer, 1387 reverse primer, agarose, buffer TAE 1X.
18
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
19
C. Rancangan Peneltian
Penelitian dilakukan dengan beberapa metode, yaitu :
1. Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung
Lawu berdasarkan titik sampling yang telah ditentukan, yaitu di stasiun I pada
ketinggian 2.200 m dpl, stasiun II pada ketinggian 2.500 m dpl dan stasiun III
pada ketinggian 2.700 m dpl. Penentuan titik sampling menggunakan metode
purposive sampling. Sampling ditetapkan berdasarkan perbedaan ketinggian dan
keberadaan sampel pada masing-masing pengambilan sampel.
Sampel daun tumbuhan berdaun lebar yang didapat dimasukkan kedalam
kantong yang dibuat dari kertas koran dan secepatnya dibawa ke Laboratorium
untuk diidentifikasi, diisolasi atau disimpan di dalam lemari pendingin sebelum
diisolasi pada hari berikutnya. Identifikasi sampel dilakukan dengan
menggunakan buku acuan Steenis (1978).
2. Sterilisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf
pada suhu 121o C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Peralatan yang disterilisasi
antara lain : tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, erlenmeyer, pipet tetes dan tip.
Bahan-bahan yang disterilisasi yaitu aquades, media NA, King’s B, buffer fosfat
dan pepton.
3. Pembuatan media
a. Media NAG
Media NAG (natrium agar gliserol) dibuat dengan mencampur 28 g bubuk
NA dengan 25 mL gliserol dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan aquades
hingga batas 200 mL. Tabung erlenmeyer diletakkan di atas hot plate dan
ditunggu hingga mendidih sampai larutan berwarna jernih. Lubang tabung
erlenmeyer ditutup kapas dan aluminium foil, disterilkan dengan menggunakan
autoklaf suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Kemudian media dituang ke
cawan petri dan dibiarkan kering pada suhu ruang 28°C.
Untuk membuat agar miring, setelah larutan mendidih dan berwarna jernih
maka media NA langsung dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 4 ml
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
20
dan diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Setelah
disterilkan tabung dimiringkan 45°C hingga media mengeras.
b. Media King’s B
Pembuatan media King’s B dilakukan dengan mencampur 20 g protease
pepton, 10 mL gliserol, 1,5 g K2HPO4, 1,5 g MgSO4.7H2O dan 15 g agar kedalam
erlenmeyer dan ditambah 1 L aquades. Erlenmeyer diletakkan diatas hot plate dan
ditunggu hingga mendidih sampai larutan berwarna jernih. Lubang tabung
erlenmeyer ditutup kapas dan aluminium foil, disterilkan dengan menggunakan
autoklaf suhu 121°C selama 20 menit. Kemudian media dituang ke cawan petri
dan dibiarkan kering pada suhu ruang 28°C.
Untuk membuat agar miring, setelah larutan mendidih dan berwarna jernih
maka media King’s B langsung dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 4
ml dan diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Setelah
disterilkan tabung dimiringkan 45°C hingga media mengeras.
c. Buffer fosfat 0,1 M pH 7 dan 0,1, pepton
Pembuatan buffer fosfat dilakukan dengan melarutkan NaH2PO4.2H2O
sebanyak 0,6 g dan Na2HPO4.2H2O sebanyak 1,6 g ke dalam 1000 mL akuades.
Kemudian ditambahkan peptone meat sebanyak 1 g dan disterilisasi dengan
menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm.
d. Isolasi Bakteri INA
Masing-masing sampel daun sebanyak 10-20 g dipotong-potong dengan
ukuran 5 cm2 selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer
berukuran 500 mL yang di dalamnya berisi 200 mL 0,1 M buffer fosfat pH 7
dengan 0,1 pepton (Difco) (Lindow, 1978). Tabung erlenmeyer yang berisi
larutan buffer fosfat dan sampel digoyang pada rotary shaker dengan kecepatan
150 rpm selama 2 jam. Sampel diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi berisi 9 mL aquades steril. Selanjutnya dilakukan 3 seri
pengenceran yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3. Dari tiap pengenceran diambil sebanyak 0.1
mL kemudian disebar pada media NA yang mengandung 2,5% gliserol (NAG)
dan media King’s B dengan teknik cawan sebar. Masing-masing pengenceran
disebar pada dua cawan petri. Setelah permukaan media cukup kering selanjutnya
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
21
dibungkus dengan kertas dan diinkubasikan pada suhu 18° - 24°C dengan posisi
terbalik selama 2 hari (Lindow et al., 1982).
e. Koleksi kultur murni isolat
Untuk mendapatkan kultur murni, isolat bakteri yang sudah tumbuh di
media NA + 2,5% gliserol dan media King’s B ditumbuhkan kembali dengan
Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke
agar miring dengan terlebih dahulu memilih koloni-koloni yang berbeda pada
media NAG dan King’s B pada cawan petri. Sel-sel bakteri tunggal ini akan
membentuk koloni tunggal yang kemudian ditumbuhkan selama 4-6 hari pada
suhu ruang, selanjutnya disimpan di freezer pada suhu -4oC (Kartika, 2009).
f. Analisis DNA dengan biofotometri
Analisis DNA dilakukan dengan menambahkan 5 µl DNA hasil isolasi
dengan aquadest sehingga volumenya mencapai 1 ml, kemudian DNA
dipindahkan kedalam kuvet biofotometer. Blanko biofotometer dengan kuvet
berisi 1 ml aquadest dibaca absorbansi sampel dengan biofotometer pada λ260
nm, kemudian dilakukan pembacaan yang ke-2 pada λ280 nm. Selanjutnya
ditentukan rasio absorbansi yang ke-2 pada λ260 nm dan λ280 nm. Kualitas DNA
yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat
dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm
terhadap 280 nm. Rasio OD260 / OD280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA
yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein.
Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA /
RNA menggunakan biofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk
mengetahui kandungan protein menggunakan biofotometri UV dengan panjang
gelombang 280 nm.
g. Uji aktivitas pembentukan inti es
Aktivitas pembentukan inti es ditentukan dengan metode tube nucleation
test yaitu dengan memasukkan 100 µL suspensi bakteri berumur 4-6 hari kedalam
supercool water (Lindow et al., 1978). Suspensi bakteri dibuat dengan mengambil
1 ose pada agar miring dan mengencerkannya dalam 2 mL aquades steril.
supercool water dibuat dengan memasukkan 3-5 mL aquades masing-masing ke
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
22
dalam tabung reaksi kemudian disimpan di dalam freezer pada suhu -5°C selama
2-3 jam. Untuk mengetahui koloni mengandung inti es, 1 ose koloni bakteri
dicampur ke dalam 40µl buffer fosfat masing-masing ke dalam tabung reaksi,
kemudian dimasukkan ke dalam circulating alcohol bath pada suhu -2°C sampai
10°C selama 5 menit. Suatu koloni dianggap mengandung inti es aktif, jika
supercool water yang ditetesi suspensi bakteri membeku dalam waktu 30 detik
pada suhu -5°C.
h. Estimasi jumlah bakteri
Estimasi jumlah bakteri INA yang terdapat pada masing-masing sampel
penelitian dilakukan dengan metode multiple tube nucleation (Cazorla et al.,
1995). Tabung reaksi yang berisi 9 mL buffer fosfat steril didinginkan pada suhu -
10°C selama 3 menit. Kemudian tabung dikocok dan semua tabung yang
mengalami pembekuan dipisahkan. Tabung berisi buffer fosfat yang tidak
membeku dihangatkan pada suhu 5°C. Masing-masing sampel penelitian
sebanyak 2 g dihomogenkan dalam 20 mL buffer fosfat dan 0,1 % peptone meat,
kemudian sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9
mL buffer fosfat steril. Selanjutnya dilakukan 3 seri pengenceran 10-1, 10-2dan 10-3
ke dalam tabung berisi fosfat yang tidak membeku. Setiap seri pengenceran
dilakukan sebanyak tiga kali ulangan sehingga didapatkan pengenceran seri 3
tabung. Setiap tabung berisi buffer fosfat yang tidak membeku dan masing-masing
sampel yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam circulating alkohol bath
selama 10 menit sehingga suhunya mencapai -3°C sampai -9°C. Jumlah bakteri
INA per gram berat segar sampel diestimasi berdasarkan metode MPN. Jumlah
tabung reaksi yang membeku dihitung untuk setiap pengenceran, kemudian
dicocokkan dengan angka pada tabel MPN seri 3 tabung sehingga diperoleh nilai
tabel. Nilai yang didapat ini dikalikan dengan faktor pengenceran untuk
mendapatkan jumlah MPN mikroba pada sampel (Fardiaz, 1993).
i. Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan PCR
DNA genom diekstraksikan dengan menggunakan kit Preston Mini 9
DNA Bacterial kit (Geneaid). Gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan
polymerase Chain Reaction (Perkin Elmer geneAmp PCR system 2400). Reaksi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
23
PCR dilakukan dengan mencampurkan 25 µl Kapa 2G Fast Ready Mix (Kapa
Biosystem), 1 µl 63 forward primer (New England BioLabs) (25pmol) (63f:5’-
CAGGCCTAACACAT-GCAAGTC-3’). 1 µl 1387 reverse primer (New England
BioLabs) (25pmol) (1387r : 5’-GGGCGGAWGTGTACAAGGCA-3’), 1 µl
DNAtemplate dan 9,5 µl ddH2O. Siklus yang digunakan terdiri dari predenaturasi
pada suhu 94°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94°C 30 detik, annealing
pada 55˚C selama 30 detik, elongasi 72°C selama 1 menit dan finalizing pada
suhu 72°C selama 5 menit dan dihentikan, kemudian disimpan pada suhu 4°C
hingga digunakan dan diperiksa dengan elektroforesis. Proses denaturasi,
annealing dan elongasi masing-masing terdiri dari 25 siklus (Marchesi et al.,
1988).
j. Analisis hubungan kekerabatan
Hubungan kekerabatan antar spesies yang ditemukan dan spesies lain yang
sudah ditemukan pada penelitian-penelitian sebelumnya dianalisis dengan
menggunakan software Mega 5.1 pada perangkat komputer.
k. Deteksi gen ina menggunakan PCR
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ina adalah:
Pseudomonas syringae menggunakan primer inaZ forward (5’ GCA GAC TGC
GGG TTA TGA GAG C 3’); primer inaZ reverese (5’CGC CGG TCA GTT TGC
TTC TAT C 3’); Erwinia ananas menggunakan primer inaA forward (5’ AGG
CTT TGA GAA CGG ACT AAC G 3’); primer inaA reverse (5’TTT CTG TCG
GCT GCG TAC TG 3’); Pseudomonas fluorescent menggunakan primer inaW
forward (5’ GCA GTA CGC AGA CGG CAC AG 3’) primer inaW reverse
(5’TTT CGT AGC CAG CAG TTG ATG TG 3’); Xanthomonas campestris
menggunakan primer inaX forward (5’GCA AGG GCA GCG ATG TCA C 3’);
primer inaX reverse (5’ TCT GCG TGC TGC CGT AAC C 3’) (Nejad et al.,
2006). Primer didapatkan dari integated DNA Technologies, Singapura.
Proses running PCR dilakukan dengan mencampurkan 12,5 µl Kapa 2G
Fast Ready Mix (Kapa Biosystem), 2 µl DNA template, 1,25 primer (inaA, , inaX,
inaW, inaZ forward dan inaA, inaX, inaW, inaZ reverse ) dan 8 µl ddH2O.
Amplifikasi gen dilakukan dengan tahapan :
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
24
1) Predenaturasi pada suhu 94˚C selama 5 menit.
2) Denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik.
3) Annealing pada suhu 55°C - 65°C selama 1 menit. Suhu annealing dipilih
yang sesuai sehingga didapatkan kondisi optimasi yang terbaik.
4) Elongasi pada suhu 72°C selama 1 menit.
5) Finalizing pada suhu 72°C selama 5 menit.
Proses denaturasi, annealing, dan elongasi terjadi sebanyak 35 siklus.
Selanjutnya produk PCR disimpan pada suhu -20°C dan diperiksa dengan
elektroforesis (Nejad et al., 2006).
l. Analisis sekuens DNA
DNAdisekuensing menggunakan ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Kit.
Sekuen DNA dianalisis secara bioinformatika di pusat data GeneBank yang
dilakukan dengan progam Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang
terdapat di National Center for Biotechnology Information (NCBI),
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (Waturangi et al., 2008).
D. Analisis Data
Data isolat dan data uji aktivitas pembentukan es diamati secara deskriptif,
Amplikon hasil amplifikasi gen 16S rRNA diperiksa dan dianalisis dengan
melihat adanya band-band pada gel elektroforesis. Sekuens gen 16S rRNA
dianalisis dengan bioinformatika untuk mendapatkandata identifikasi spesies
bakteri INA.
Sekuen DNA gen ina dan gen 16S rRNA yang diperoleh dianalisis
menggunakan perangkat BLAST pada NCBI. Hubungan kekerabatan dianalisis
dengan menggunakan software MEGA (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis) 5.1. untuk mendapatkan struktur pohon phylogenetic yang
menggambarkan hubungan kekerabatan bakteri INA kemudian di analisis secara
deskriptif.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,
Gunung Lawu
Tumbuhan berdaun lebar yang digunakan dalam penelitian ini adalah
sebagian dari beberapa jenis tumbuhan berdaun lebar yang ditemukan di jalur
pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu. Tumbuhan berdaun lebar yang
digunakan diperoleh berdasarkan hasil pengamatan dan keberadaan tumbuhan
pada tiga stasiun penelitian sehingga ditemukan enam spesies. Keenam spesies
yang dijadikan sampel penelitian disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3. Tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian cemoro sewu, Gunung Lawu.Keterangan :
(A) Dodonae viscosa Jacq(B) Rubus fraxinifolius(C) Vaccinium larifolium(D) Chromolaena odorata(E) Conodopsis javanica (B) Hook F(F) Polygonum chinense
25
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
26
Keenam spesies tumbuhan berdaun lebar yang dijadikan sumber utama
untuk isolasi bakteri Ice Nucleation Active (INA) diambil dengan jarak yang tidak
berjauhan.
B. Isolat bakteri Ice Nucleation active dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur
Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu
Isolasi bakteri INA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan
media selektif untuk isolasi bakteri yaitu Nutrient Agar (NA) dan KING’S B yang
masing-masing ditambahkan dengan 2,5% dan 1,5% gliserol. Penambahan
gliserol digunakan sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri terutama
bakteri Ice Nucleation Active (Lindow, 1990). Menurut Waturangi & Tjhen
(2009) Media NA dan King’s B yang mengandung gliserol merupakan media
selektif yang diharapkan memiliki kandungan nutrisi yang hampir sama dengan
nutrisi pada dan tanaman yang menjadi habitat bakteri.
Bakteri yang ditumbuhkan pada media NAG dan King’s B menunjukkan
adanya koloni-koloni bakteri yang berbeda-beda dari penampakan morfologi dan
pigmentasi yang kemudian dimurnikan. Dari masing-masing sampel penelitian
yang diperoleh dari ketiga stasiun penelitian ditemukan beberapa isolat bakteri.
Masing-masing isolat yang didapat dari keenam sampel penelitian, setelah
dilakukan uji aktivitas nukleasi es dengan menggunakan circulating alkohol bath
diperoleh 3 isolat positif bakteri INA di antaranya terlihat pada Tabel 1 dan tube
yang menunjukkan hasil positif INA disajikan pada Gambar 4. Data isolat yang
didapat dari keenam tumbuhan berdaun lebar secara lengkap disajikan pada
Lampiran 1.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
27
Tabel 1. Jumlah isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur pendakian Cemoro Sewu
Sampel Penelitian Jumlah Isolat /stasiun
Jumlah isolat positif
INA/Stasiun
Kode Isolat
I II III I II IIIDodonae viscose Jacq,
5 8 7 - 1 - A2N4Rubus fraxinifolius
6 6 5 - - - -Vaccinium laurifolium
6 6 8 - 1 - C2N9Chromolaena odorata L
8 5 4 - - -Conodopsis javanica (B) Hook F 6 6 8 - - - -
Polygonum chinense L7 7 9 1 - - F1N6
Keterangan : A2N4,A: Nama Spesies Penelitian (A: Dodonae viscose Jacq; B: Rubus
fraxinifolius; C: Vaccinium laurifolium; D: Chromolaenaodorata; E: Conodopsis javanica (B) Hook F dan F; Polygonumchinense L).
2: Stasiun PenelitianN: Media Pertumbuhan (K: King’s B dan N: NAG)4: Nomor Isolat
Gambar 4. Media beku akibat Aktivitas nukleasi es hasil isolasi dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu
Keterangan : a : Tube isolat A2N4; b : Tube isolat C2N9; c : Tube isolat F1N6K : Kontrol
a b c K
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
28
Berdasarkan hasil uji aktivitas nukleasi es 2 isolat diklasifikasikan ke
dalam kelas C yaitu isolat A2N4 dan isolat F1N6 yaitu dengan suhu pembentukan
inti es -10°C, sedangkan isolat C2N9 diklasifikasikan ke dalam kelas B yaitu pada
suhu -7°C. Pengklasifikasian isolat positif INA ke dalam kelas A, B dan C
dilakukan berdasarkan suhu pembentukan inti es. Menurut Rugless et al., (1993),
kelas A aktif membentuk inti es pada suhu >-2°C hingga -5°C, kelas B >-5 hingga
-7 dan kelas C aktif membentuk inti es pada suhu >-7 hingga -10°C.
Hasil uji aktivitas nukleasi es juga menunjukkan bahwa tiga dari enam
sampel tumbuhan berdaun lebar tidak didapatkan isolat positif bakteri INA. Hal
ini dimungkinkan karena tidak adanya bakteri INA di permukaan daun atau
populasi rata-rata bakteri INA yang sangat rendah. Rata-rata populasi bakteri INA
dapat dilihat berdasarkan estimasi tabel MPN (Tabel 2).
C. Populasi bakteri Ice Nukleation Active
Estimasi populasi bakteri INA dilakukan dengan metode Most Probable
Number yaitu suatu metode untuk mengestimasi jumlah inti es dari suspensi
bakteri maupun populasi bakteri INA pada bagian tanaman (Cazorla et al., 1995).
Metode Most Probable Number (MPN) mengasumsikan bahwa dalam satu tabung
yang beku mengandung paling sedikit satu inti es (Govindarajan & Lindow,
1988). Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam sampel yang berbentuk cair atau berbentuk padat dengan terlebih dahulu
membuat suspensi 1:10 dari sampel penelitian (Fardiaz, 1993).
Menurut Anon (1975), the tube nucleation test digunakan untuk
menghitung jumlah bakteri INA yang berasosiasi dengan tanaman yang
didasarkan dan dikembangkan dari metode MPN yaitu suatu metode yang
digunakan untuk menentukan jumlah koliform pada air. Pengggunaan uji tabung
untuk menentukan jumlah inti es didasarkan pada jumlah tabung yang membeku
pada setiap pengenceran (Montesinos & Viraldell, 1991). Hasil uji metode MPN
adalah nilai MPN yaitu perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit
pembentuk koloni dalam sampel. Nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan
jumlah individu bakteri. Estimasi populasi bakteri dilakukan dengan metode
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
29
multiple tube nucleation test pada suhu -5°C selama 10 menit dalam circulating
alkohol bath, sesuai dengan pendapat Hirano et al., (1985) dan Baertlein et al.,
(1992). Demikian juga dengan penelitian Cazorla et al., (1995) yang
menggunakan suhu -5°C sebagai suhu optimum untuk melakukan uji estimasi.
Hasil uji estimasi dapat dilihat pada Gambar 5 dan estimasi jumlah bakteri
pada Tabel 2.
Gambar 5. Media beku pada uji estimasi bakteri INA.
Keterangan : a) Kombinasi tabung 0-1-0; b) Kombinasi tabung 1-1-0;
c) Kombinasi tabung 0-0-1; d) Kombinasi tabung 1-0-0
10-1 10-2 10-3
+
a) b)
+ +
10-1 10-2 10-3
d)c)
10-1 10-2 10-3
+
10-1 10-2 10-3
+
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
30
Tabel 2. Estimasi Jumlah Bakteri Berdasarkan Tabel MPN
Sampel Penelitian
Ulangan 1 Estimasi Bakteri
Jumlah/g daun10-1 10-2 10-3
Dodonae viscose Jacq, 0 1 0 3 x 103
Rubus fraxinifolius 0 0 0 <3 x 10
Vaccinium laurifolium 1 0 0 3,6 x 103
Chromolaena odonata L 1 0 0 3 x 103
Conodopsis javanica (B) Hook F 0 0 1 3 x 103
Polygonum chinense L 1 1 0 5,4 x 103
Berdasarkan hasil perhitungan, nilai MPN bakteri INA tertinggi yang ada
pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu
khususnya pada keenam sampel penelitian yakni sebesar 5,4 x 103/g, sedangkan
nilai rata-rata MPN terendah yaitu < 3 x 103/g. Nilai ini menunjukkan jumlah
bakteri yang rendah apabila dibandingkan dengan beberapa penelitian
sebelumnya. Beberapa penelitian telah dilakukan di antaranya oleh Lindow (1993)
yang menyatakan bahwa populasi bakteri INA mencapai 106 sel/g jaringan
tanaman. Rendahnya jumlah bakteri INA yang ada pada keenam sampel penelitian
dimungkinkan akibat faktor perbedaan lingkungan. Penentuan rata-rata estimasi
populasi bakteri didapatkan berdasarkan tabel MPN (Lampiran 2).
D. Analisis Kemurnian DNA Bakteri
Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan kemurnian DNA sehingga
memenuhi syarat untuk analisis molekuler. Konsentrasi dan Kemurnian DNA
setelah dianalisis dengan biofotometer didapatkan hasil seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Konsentrasi dan kemurnian DNA bakteri
Isolat Bakteri Konsentrasi DNA (µg/ml)Kemurnian (Ratio
A260/A280)A2N4 24,9 2,00C2N9 45,0 2,00F1N6 41,9 1,90
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
31
Hasil isolasi DNA (Tabel 3) menunjukkan bahwa DNA ketiga bakteri INA
berhasil diisolasi dengan baik. Hal ini dikarenakan nilai rasio A260/280 DNA hasil
isolasi berkisar antara 1,90-2,00. Menurut Sambrook et al., (1989), isolat DNA
dapat dikatakan murni dan memenuhi syarat untuk dilanjutkan ke analisis
molekuler apabila nilai rasio A260/280 berkisar 1,8-2,0.
E. Gen Penyandi 16S rRNA dari Isolat Bakteri INA di Jalur Pendakian
Cemoro Sewu, Gunung Lawu
Masing-masing DNA bakteri INA yang didapat selanjutnya diamplifikasi
menggunakan PCR untuk memperoleh gen 16S rRNA. 16S rRNA merupakan satu
dari tiga jenis RNA ribosomal yang digunakan sebagai penanda molekuler pada
prokaryota. 16S rRNA paling sering digunakan untuk penentuan spesies pada
prokaryota. Analisis sekuen 16S rRNA merupakan metode yang biasa digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri dalam bidang molekuler (Case et al., 2006; Amann
et al., 1995).
Menurut Pangastuti (2006), 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda
molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitas, sedangkan menurut Madigan et
al., (1997), dasar penggunaan gen 16S rRNA dengan berbagai alasan mendasar
yaitu ; (1) bersifat universal : protein synthesis machninery (2) sekuen basa-
basanya bersifat konservatif; (3) jumlahnya melimpah dalam sel; (4) memenuhi
ukuran untuk perhitungan secara statistik (tidak terlalu panjang dan tidak terlalu
pendek); (5) ketersediaan informasi (database di GeneBank). Salah satu faktor
penting yang mempengaruhi kualitas deteksi molekuler berbasis PCR yakni
pemilihan primer yang sesuai (Rychlic, 1995). Menurut Marchesi et al., (1998)
primer 63f dan 1387r digunakan karena dapat mengamplifikasi gen 16S rRNA
dengan baik dibandingkan dengan jenis primer lainnya dan konsisten
mengamplifikasi gen 16S rRNA dari berbagai organisme.
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan PCR dianalisis dengan
elektroforesis gel agarosa 1 % (b/v) selama 60 menit pada tegangan 90 volt dan
arus 400 mA. Profil amplikon dari amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR dapat
dilihat pada Gambar 6.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
32
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
1500 bp
Gambar 6. Profil amplikon dari gen penyandi 16S rRNA dengan menggunakan primer 63f dan 1387r Keterangan: a) isolat A2N4; b) isolat C2N9; c) isolat F1N6,M: Marker DNA.
Profil amplikon (Gambar 6) menunjukkan bahwa DNA bakteri yang
diamplifikasi berhasil teramplifikasi dengan baik. Hal ini ditunjukkan dengan
adanya pita (band) yang terang dan tebal. Hal ini mengindikasikan bahwa primer
yang digunakan menempel pada situs spesifik pada template DNA dengan suhu
optimum yang digunakan untuk annealing primer. Suhu optimum primer untuk
dapat melakukan annealing pada template DNA dapat diketahui dengan melihat
informasi yang terdapat pada kemasan primer. Pada amplifikasi gen penyandi 16S
rRNA pada penelitian ini menggunakan suhu annealing 55°C.
Berdasarkan profil amplikon (Gambar 5) juga diketahui bahwa pada
penelitian ini semua produk PCR yang didapat berukuran sekitar 1.300 bp dengan
konsentrasi sekitar 92 ng/5 . Hal ini dapat diketahui dengan membandingkan
pita DNA dengan DNA marker yang digunakan. Produk PCR dapat diketahui
ukurannya dengan membandingkan panjang migrasi pita DNA dengan DNA
marker yang telah diketahui ukuran dan konsentrasinya. Menurut Marchesi et al.,
(1998) hasil amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer 63f dan 1387r adalah
a) b) c) M
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
33
sekitar 1.300 bp. Oleh karena itu pada penelitian ini menggnakan DNA marker
yang berukuran 1 Kb.
F. Sekuens gen penyandi 16S rRNA
Sekuensing (DNA Sequencing) merupakan metode yang digunakan untuk
menentukan urutan nukleotida arginin(A), sitosin(C), guanin(G), timin(T) pada
molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuen DNA, yang merupakan
informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi
yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA
dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen
DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA
lain yang sudah diketahui (Madigan et al., 1997).
Urutan basa nukleotida gen penyandi 16S rRNA dan gen ina (hasil
sekuensing pada Lampiran 3) dianalisis dan dibandingkan dengan database pada
GeneBenk menggunakan program BLAST untuk mengetahui identitas dengan
spesies yang telah diketahui sebelumnya. Menurut Stephen et al., (1990) BLAST
merupakan software algoritma untuk membandingkan informasi primer sekuens
biologis, seperti sekuens asam amino dari protein yang berbeda atau sekuens
DNA dilihat dari basa nukleotida. Hasil analisis dengan BLAST dapat dilihat pada
Tabel 4 (hasil BLAST lebih lengkap dapat dilihat pada Lampiran 4).
Tabel 4.Spesies-spesies yang mirip dengan isolat yang ditemukan berdasarkan gen penyandi 16S rRNA bakteri INA
Isolat sampel Kerabat terdekat No. Akses % Similaritas
A2N4 Pseudomonas syringae KC311253 96 %
C2N9 Pantoea sp FJ357836 97 %
F1N6 Pseudomonas sp FJ652623.1 98%
Berdasarkan analisis sekuens dari database yang ada pada GeneBenk, dua
dari tiga isolat memiliki similaritas dengan bakteri INA yang berasal dari
beberapa negara subtropis. Isolat A2N4 memiliki similaritas 96% dengan
Pseudomonas syringae, isolat C2N9 memiliki similaritas 97% dengan Pantoea sp.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
34
Sedangkan isolat FIN6 teridentifikasi memiliki similaritas 98% dengan
Pseudomonas sp.
Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp yang teridentifikasi dari
isolat A2N4 dan F1N6 merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas dan
merupakan genus bakteri INA yang paling terkenal. Di daerah tropis jenis lain
dari genus Pseudomonas yakni Pseudomonas mosselii, dan Pseudomonas lurida
juga terdeteksi sebagai bakteri INA yang diisolasi dari air hujan (Waturangi et al.,
2011).
Dari Tabel 4 juga diketahui bahwa isolat C2N9 teridentifikasi memiliki
similaritas 97% dengan Pantoea sp. Pantoea sp merupakan bakteri Gram-negatif
dari keluarga Enterobacteriaceae. Bakteri ini adalah bakteri anaerob fakultatif
yang kebanyakan berbentuk batang dengan katalase-positif dan oksidase-negatif.
Bakteri ini ditemukan di tanah, air dan permukaan daun tumbuhan serta beberapa
juga terdapat pada hewan mulai dari serangga hingga manusia (Paradis et al.,
2005).
Pantoea sp juga diklasifikasikan sebagai bakteri INA yang teridentifikasi
sebagai bakteri inaA (Watanabe & Sato, 1998). Bakteri ini pertama kali
dilaporkan sebagai patogen dari tanaman nanas sehingga menyebabkan
pencoklatan dan busuk pada akar. Jenis Pantoea agglomerans dilaporkan
terdeteksi sebagai bakteri INA di daerah tropis (Waturangi et al., 2011).
Hasil analisis BLAST yang terlihat dari Tabel 4, menunjukkan beberapa
spesies dan genus bakteri berhasil teridentifikasi berdasarkan gen penyandi 16S
rRNA. Namun, definisi spesies berdasarkan urutan basa gen 16S rRNA tidak
cukup untuk menggambarkan satu spesies yang identik. Urutan basa 16S rRNA
yang menunjukkan similaritas yang rendah belum dapat ditentukan deskripsi
taksonnya secara lengkap. Biasanya deskripsi takson secara lebih lengkap bisa
dianggap paling mendekati keidentikannya, jika similaritas lebih dari 97%
(Stackebrandt & Goebel, 1995).
G. Hubungan kekerabatan
Hubungan kekerabatan bakteri INA antar isolat pada penelitian ini dan
beberapa bakteri INA yang pernah ditemukan sebelumnya dapat diketahui dengan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
35
Pseudomonas syringae
ISOLAT A2N4
Pseudomonas sp
Pseudomonas mosselii
ISOLAT F1N6
Xanthomonas sp
Pantoea agglomerans
ISOLAT C2N9
Pantoea ananatis
Bacillus cereus
92
100
71
99
98
54
100
0.02
menggunakan pohon filogenetik dengan melihat jarak genetik. Pohon filogenetik
dibuat dengan menggunakan program MEGA. Pohon filogenetik berdasarkan gen
16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Pohon filogenetik bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu dan beberapa bakteri INA yang ditemukan sebelumnya.
Keterangan: A2N4, C2N9 dan F1N6 : Isolat bakteri INA dari Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu; Pseudomonas syringae, Pseudomonas sp & Xanthomonas sp : Isolat bakteri INA subtropis; Pseudomonas mosselii, Pantoea agglomersans, dan Pantoea ananatis: Isolat bakteri INA Tropis yang ditemukan sebelumnya. Out Group : Bacillus cereus : bakteri gram positif (Accession Number : AJ277908.1)
Berdasarkan pohon filogenik pada Gambar 7, bakteri INA isolat A2N4
berada satu group dengan Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp,
sedangkan isolat F1N6 berada satu group dengan Pseudomonas mosselii yang
diketahui mampu membentuk inti es. Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp
adalah jenis bakteri ini yang pernah terdeteksi di daerah subtropis, sedangkan
Pseudomonas mosselii yang berada dalam satu group dengan bakteri INA isolat
F1N6 dilaporkan terdeteksi pada air hujan di daerah tropis. Isolat C2N9 memiliki
hubungan kekerabatan yang dekat dengan Pantoea agglomerans dan Pantoea
anantias. Dari Gambar 7 dapat disimpulkan bahwa ketiga isolat yang ditemukan
pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
36
memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan beberapa bakteri INA yang
ditemukan sebelumnya, baik dari daerah tropis maupun subtropis.
Analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogenik yang terlihat
pada Gambar 7, menunjukkan bahwa semua isolat bakteri INA yang ditemukan
pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu
dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya, di daerah subtropis dan daerah
tropis tidak berada satu group dengan bakteri gram positif sebagai out group
yakni Bacillus cereus. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat bakteri INA yang
ditemukan tergolong pada bakteri dari kelompok gram negatif.
H. Amplikon gen ina
Amplifikasi Gen ina dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen ina.
Untuk mendeteksi keberadaan gen ina dibutuhkan primer yang spesifik sehingga
masing-masing gen dapat terdeteksi keberadaannya karena gen ina yang dimiliki
bakteri INA yang telah berhasil diidentifikasi berbeda-beda sesuai dengan
jenisnya. Beberapa gen yang telah diketahuidan diidentifikasi antara lain inaA
pada Erwinia ananas (Abe et al., 1989), inaW pada Pseudomonas fluorescens
(Warren et al., 1986), inaZ pada Psedomonas syringae (Green & Warren, 1985)
dan inaX pada Xanthomonas campestris (Zhao & Orser, 1990).
Pada penelitian ini digunakan empat pasang primer yakni inaZ, inaA, inaW
dan inaX (Nejad et al., 2006). Hasil amplifikasi gen ina menunjukkan bahwa
ketiga isolat bakteri INA dapat teramplifikasi menggunakan tiga dari empat
pasang primer spesifik gen ina. Keempat primer spesifik mengandung gen ina
diujikan pada penelitian ini. Hasil uji menggunakan empat primer spesifik gen ina
dapt dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Amplifikasi menggunakan empat primer spesifik gen ina
Primer Isolat Produk PCR (bp)A2N4 C2N9 F1N6
inaA - √ - 300inaW - - - -inaX - - √ 400inaZ √ - - 657
Keterangan : - (tidak terdeteksi gen ina); √ (terdeteksi gen ina)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
37
250 bp500 bp
1000 bp
Berdasarkan Tabel 5, isolat A2N4, C2N9 dan F1N6 teramplifikasi sebagai
bakteri INA, masing-masing dengan menggunakan primer inaA, inaX dan inaZ
dengan variasi produk PCR. Panjang produk PCR dapat diketahui dengan
membandingkan pita pada profil amplikon dengan DNA marker yang digunakan.
Profil amplikon amplifikasi gen ina menggunakan primer spesifik pada masing-
masing isolat dapat dilihat pada Gambar 8 (isolat A2N4), Gambar 10 (isolat
C2N9) dan Gambar 11 (isolat F1N6).
Gambar 8. Profil amplikon gen ina ketiga isolat menggunakan Primer inaZ.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6
Berdasarkan profil amplikon pada Gambar 8, terlihat bahwa DNA pada
isolatbakteri INA dengan kode A2N4 berhasil teramplifikasi dengan baik. Hal ini
terlihat pada pita (band) yang terlihat jelas dan terang. Menurut Zein &
Prawiradilaga (2013), terbentuknya pita (band) DNA pada amplikon
menunjukkan bahwa primer yang digunakan sesuai dalam mengamplifikasi gen
yang diinginkan. Untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang baik, selain harus
menemukan primer yang spesifik juga diperlukan optimasi kondisi PCR yang
sesuai. Optimasi PCR yang dilakukan mengacu pada saran yang diberikan oleh
Kapabiosystem selaku produsen penyedia master mix untuk amplifikasi dengan
menggunakan PCR.
a) b) c)
M
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
38
250 bp
500 bp
1000 bp
Optimasi kondisi PCR yang dilakukan sehingga gen ina dapat
teramplifikasi dengan primer inaZ ini yaitu pre-denaturation pada suhu 95°C
selama 3 menit, denaturation pada 95°C selama 30 detik, annealing pada 56°C
selama 15 detik, extention pada 72°C selama 1 menit dan post-extention pada
72°C selama 10 menit dengan Siklus PCR berlangsung selama 35 siklus. Kondisi
ini berbeda dengan kondisi PCR sebelumnya dengan primer inaZ, inaA, inaW dan
inaX, peneliti menggunakan PCR dengan pengaturan program antara lain pre-
denaturation pada 94°C selama 5 menit, pos-extention pada 72°C selama 5 menit,
denatration pada 94°C selama 45 detik, annealing pada 60°C selama 45 detik dan
extention pada 72°C selama 1 menit. Siklus PCR berlangsung sebanyak 35 siklus.
(Nejad et al., 2006). Adapun hasil perbandingan penggunaan suhu pada
optimalisasi PCR untuk menentukan suhu annealing terbaik dalam
mengamplifikasi gen ina menggunakan primer inaZ dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Profil amplikon gen ina pada isolat A2N4 menggunakan primer inaZ dengan variasi suhu annealing.
Keterangan: M:Marker DNA ; a)55°C; b)56°; c)57°C; d)58°C
a) b) c) d)
M
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
39
250 bp
500 bp
1000 bp
250 bp
500 bp
1000 bp
Berdasarkan profil amplikon (Gambar 9), diketahui bahwa suhu annealing
terbaik pada amplifikasi gen inaZ adalah suhu annealing 55°C dan 56°C. Kondisi
PCR ini sangat berbeda dengan yang pernah digunakan pada penelitian Nejad et
al., (2006).
Gambar 10. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan Primer inaA.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6.
Berdasarkan Gambar 10, diketahui gen pada isolat C2N9 berhasil
teramplifikasi dengan baik, sedangkan isolat A2N4 dan F1N6 tidak dihasilkan
produk amplifikasi sesuai dengan yang diinginkan. Demikian juga yang terlihat
pada Gambar 11, gen pada isolat A2N4 dan C2N9 tidak teramplifikasi, sedangkan
isolat F1N6 teramplifikasi dengan baik. Dari gambar juga terlihat perbedaan
produk PCR yang dihasilkan. Produk PCR isolat C2N9 (gambar 10) dan isolat
F1N6 (Gambar 11) berkisar antara 250 hingga 500 bp. Panjang produk PCR pada
gen isolat C2N9 dan F1N6 memiliki panjang produk PCR yang terdapat pada
database untuk bakteri INA Pantoea sp yakni berkisar antara 250 hingga 350 bp
dan Pseudomonas sp yang berkisar antara 400 hingga 750 bp.
a) b) c)
M
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
40
250 bp
500 bp
1000 bp
Gambar 11. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan Primer inaX.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6
Hasil perbandingan penggunaan suhu pada optimalisasi PCR untuk
menentukan suhu annealing terbaik dalam mengamplifikasi gen ina menggunakan
primer inaA dan inaX dapat dilihat pada Gambar 12 dan 13.
Gambar 12. Profil amplikon gen ina isolat C2N9 menggunakan primer inaA untuk optimasi PCRdengan variasi suhu annealing.
Ket. M: Marker; a) 55°C; b) 56°C; c) 57°C; d) 58°C
M
a) b) c) d)
M
a) b) c) d)
Gambar 13. Profil amplikon gen inaisolat F1N6 menggunakan primer inaX untuk optimasi PCR dengan variasi suhu annealing.
Ket. M: Marker; a) 55°C; b) 56°C; c) 57°C; d) 58°C
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
41
Optimasi PCR dengan variasi suhu annealing yang terlihat pada profil
amplikon pada Gambar 12 dan 13 menunjukkan bahwa suhu annealing terbaik
pada isolat C2N4 menggunakan primer inaA adalah aneealing dengan suhu 55°C
hingga 56°C, sedangkan pada isolat F1N6 pada suhu annealing 57°C.
I. Sekuens gen ina
Sekuen gen ina yang diperoleh dari isolat A2N4, selanjutnya dianalisis
dengan melakukan BLAST sehingga diperoleh similaritas sekuen DNA dengan
yang ada di database (Tabel 6).
Tabel 6. Gen ina yang memiliki similaritas dengan sekuens DNA menggunakan primer spesifik inaZ
Isolat sampel Teridentifikasi No. Akses % Similaritas
A2N4 Pseudomonas syringae
ice4 gen for ice nucleation
protein
FN650702.1 99 %
C2N9 - - -
F1N6 - - -
Hasil BLAST seperti yang ada pada Tabel 6 (hasil sekuensing lebih
lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5 dan hasil BLAST pada Lampiran 6),
Sekuens DNA menggunakan primer inaZ yang didapat dari isolat A2N4 memiliki
similaritas sebesar 99% dengan gen pengkode ice nucleation protein yang ada
pada Pseudomonas syringae. Hal ini dapat diketahui berdasarkan database di
GeneBenk (No. Akses FN650702.1) pada urutan basa 3030 hingga 3686 dan
terletak di bagian tengah dari ice nucleation protein Pseudomonas syringae strain
INA4. Hasil BLAST untuk asam amino juga menunjukkan bahwa asam amino
isolat A2N4 memiliki similaritas 99 % dengan ice nucleation protein pada
Pseudomonas syringae (accession number WP_024664696.1) (hasil Blast lengkap
dapat dilihat pada Lampiran7).
Pseudomonas syringae merupakan isolat bakteri yang telah didapatkan
dari udara saat hujan di hutan pinus Manitou Forest, Colorado, Usa. Gen
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
42
pengkode ice nucleation protein pada isolat A2N4 mengarah pada jenis gen inaZ.
Gen dari bakteri ini dapat membekukan air pada suhu sekitar -4oC (Hill et al.,
2013). Namun pada penelitian ini berdasarkan uji aktivitas nukleasi es, gen isolat
A2N4 yang terdapat pada media membeku dengan suhu -10oC.
Beberapa spesies bakteri dari genus ini yang telah dilaporkan dapat
membentk inti es antara lain Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens
(Maki et al.,1974) dan Pseudomonas viridiflava (Obata et al., 1989). Beberapa
spesies dari genus ini merupakan bakteri patogen terhadap tanaman dan biasa
ditemukan di permukaan daun. Bakteri ini memiliki habitat yang beragam di
antaranya di permukaan daun, tanah, air dan udara. Bakteri ini diduga dapat
berada pada udara sekitar tanaman dan berkontribusi sebagai sumber pembentuk
inti es (Waturangi & Tjhen, 2009).
Hasil BLAST (Tabel 6), juga menunjukkan bahwa potongan DNA yang
teramplifikasi pada isolat C2N9 dan F1N6 tidak memiliki similaritas dengan DNA
yang ada pada bakteri INA yang ditemukan sebelumnya. Hal ini dimungkinkan
karena primer yang digunakan tidak sesuai dengan yang diinginkan. PCR akan
menghasil produk yang baik apabila memiliki primer yang baik (Diaffenbach &
Dveksler, 1995).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
43
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan dapat diperoleh kesimpulan sebagai
berikut:
1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA) dapat diisolasi dari tumbuhan
berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu yakni
sebanyak 3 isolat. Ketiga isolat yang berhasil diisolasi diperoleh dari
tumbuhan berdaun lebar jenis Dodonae viscosa Jacq, Vaccinium
laurifolium dan Polygonum chinense L.
2. Jumlah bakteri INA yang ada pada tumbuhan berdaun lebar yang
ditemukan di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu yakni < 3
x 103/g hingga 5,4 x 103/g, menunjukkan jumlah bakteri yang rendah.
3. Spesies bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar di
Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu berdasarkan gen 16S
rRNA masing-masing yakni isolat A2N4 96% similarity dengan
Pseudomonas syringae, C2N9 97% similarity dengan Pantoea sp.
F1N6 98% similarity Pseudomonassp.
4. Bakteri INA yang ditemukan di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,
Gunung Lawu dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya memiliki
hubungan kekerabatan yang dekat.
5. Karakter gen penyandi protein pembentuk inti es bakteri INA pada
tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung
Lawu yang berhasil diamplifikasi menggunakan primer inaZ dari
isolat A2N4 memiliki similaritas sebesar 99% dengan gen inaZ dari
Pseudomonas syringae dan berada di bagian tengah dari ice
nucleation protein Pseudomonas syringae strain ina4.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
44
B. Saran
Berdasarkan kesimpulan diberikan beberapa saran yakni (1) Perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut pada tumbuhan lain dan pada daerah yang
berbeda untuk mendapatkan bakteri INA yang lebih bervariasi serta jumlah
bakteri yang lebih tinggi (2) diperlukan penelitian dengan menggunakan primer
yang berbeda untuk mengamplifikasi gen ina agar didapatkan produk amplifikasi
yang lebih baik.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
45
DAFTAR PUSTAKA
Abe, K., Watabe, Y., Emori, M., Watanabe, S. and Arai, 1989. An ice nucleation
active gene of Erwinia ananas: sequences similarity to those of
Pseudomonas species and regions required for ice nucleation activity.
FEBS Lett. 258:297-300.
Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K. H. 1995. Phylogenetic identification
and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbial. Rev. 59:143-169
Anon. 1975. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
14th edn. Washington, DC: American Public Health Association. 913-
927.
Arwiyanto, T. 2009. Bakteri Penyebab Penyakit Tumbuhan sebagai Lawan dan
sebagai Kawan. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Attard, E., Yang, H., Delort, A.M., Amato, P., Poschl, U., Glaux, C., Koop, T. and
Morris, C.E. 2012. Effects of atmosphere conditions on ice nucleation
activity of Pseudomonas syringae in buds and leave of Manggo. J Appl
Bacteriol 79:341-346.
Baertlein, D. A., Lindow, S. E., Panapoulos, N. J.M., Lee, S. P., Min-drinos, M.
N. and Chen, T. H.H. 1992. Expression of bacterial ice nucleation gene
in plants. Plant Physiology 100:1730-1736.
Beattie, G.A. and Lindow, S.E. 1999. Bacterial Colonization of Leaves: A
Spectrum of Strategies. University of California, Berkeley.
Case, R. J., Boucher, Y., Dahllöf, I., Holmström, C., Doolittle, W. F., Kjelleberg, S. 2007.”
Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial
ecologystudies”. Appl. Environ. Microbiol. 73 (1), 278–88.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
46
Cazorla, F. M., Olalla, L., Tores, J. A., Perez-Garcia, A., Codina, J. C., and de
Vicente, A. 1995. A method for estimastion of population densities of ice
nucleation active Pseudomonas syringae in buds and leaves of mango. J.
Appl Bacteriol 79:341-346.
Christner, B.C., Cai, R., Morris, C.E., McCarter, K.S., Foreman, C.M., Skidmore,
M.L., Montross, S.N. and Sands, D.C. 2008. Geographic, Seasonal, and
precipitation chemistry influence on the abundance and activity of
biological of ice nucleators in rain and snow. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
58:1334-1338.
Diaffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. 1995. PCR Primer A Laboratory Manual.
Curtiba.
Du, N., Liu, X.Y. and Hew, C.L. 2003. Ice Nucleation Inhibition Mechanism of
Antifreeze by Antifreeze Protein. Issue 278:36000-36004.
Edwars, A.R., Ronald, A., Wichman, H.A., and Orser C.S. 1994. Unusual pattern
of bacterial ice nucleation gene evolution. Mol. Biol. Evol. 11:911-920.
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT. Raja Grafindo.
Govindarajan, A.G. and Lindow, S.E. 1998. Size of Bacterial Ice Nucleation Sites
Measured in Situ Low Radiation Inactivation Analysis. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 58:1334-1338.
Green, R. L. and Warren, G. J. 1985. Physical and fuctional repetition in a
bacterial ice nucleation gene. Nature 317:645-648.
Gurian-Sherman, D. and Lindow, S.E. 1993. Bacterial ice nucleation :
significance and moleculer basis. FASEB J. 7:1338-1343.
Hill, T. C. J, Baker, L. T., and DeMott, P. J. Georgakopolous, D. G., Stump, W.
L., and Franc, G. D. 2013. Measurement of ice nucleation-active bacteria
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
47
on plants and in precipitation by qantitative PCR. App.Env. Microbiology
80(4): 1256-1267.
Hirano, S.S., Baker, L.T., and Christian, D.U. 1985. Ice nucleation of individual
leaves in relation to populatioan sizes of ice nucleation active bacteria
and frost injury. Plant. Physiol. 77:259-265.
Hirano, S.S., and Upper, C.D. 2000. Bacteria in the leaf ecocsystems with
emphasis on Pseudomonas syringae a pathogen, ice nucleus, and
epiphyte. Mol. Microbio. Biol. Rev. 64:624-653
Hirano, S.S. and Christen, D.U. 2000. Bacteria in the leaf ecosystem with
emphasis on Pseudomonas syringae- a pathogen, Ice Nucleus and
Epiphyte. Microbiolgy and Moleculer Biology Reviews 64(3): 624-653.
Khussurur, M. 2005. Identifikasi Tumbuhan Penyusun Hutan Cemoro Sewu
Kabupaten Magetan Jawa Timur. Skripsi. Universitas Muhammadiyah
Malang.
Kozloff, L.M., Turner, M.A. and Arellano, F. 1991b. Formation of bacterial
membrane ice nucleating lipo glycoprotein Complexes. J. Bacteriol
173:6528-6536.
Lindow, S.E., Arny, D.C., and Upper, C.D. 1978. Distribution of ice nucleation
active on plants in nature. Appl. Environ. Microbiol. 36:831-838.
Lindow, S.E. Aray, D.C. and Upper, C.D. 1982. Bacterial ice nucleation : A factor
in frost injury to plants. Plant Physiol 70:1084-1089.
Lindow, S.E., Hirano, S.S., Barchet, W.R., Arny, D.C., and Upper, C.D.1982.
Relationship beetween ice nucleation frequency of bacteria and frost
injury. Plants Physiology 70: 1090-1093.
Lindow, S.E. 1983. The role of bacterial ice nucleation in frost injury to plant.
Ann. Rev. Phytopathol. 21:363-384.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
48
Lindow, S. E. 1993. Novel method for identifying bacterial mutant with reduced
epiphytic fitness. Appl. Environ. Microbiol. 59:1586-1592.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., and Parker, J. 1997. Brook, the Biology of
microorganisms. Ed ke-8. New Jersey. Prentice Hall. Upper saddle
River.e
Marchesi, J. R., Sato, T., Weightman, A.j., Martin, T. A.,Fry, J. C., Hiom, S. J.,
and Wade, W. G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium
specific pcr primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA.
Appl. Environ. Microbiol 64:795-764
Montesinos, E. and Viraldell, P. 1991. Relationships among population levels of
Pseudomonas syringae, amount of the nuclei, and incidence of blast
dormant fllower in commercial pear orchards in Catalunya, Spain.
Phytopathology 81:113-119.
Morris, C.E., Georgakopoulus, D.G. and Sands, D.C. 2004. Ice nucleation active
bacteria and their potential role in precipitation. J Phys IV France
121:87-103.
Morris, C.E., Sands, D.C., Vinatser, B.A., Glaux, C., Guilbaud, C., Buffere, A.,
Yan, S., Dominguez, H. And Thompson, B.M. 2008. The life history of
the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.
International Society for Microbial Ecology (ISME) Journal 2:321-334.
Nejad, P., Ramstedt, M., Granhall, U., Roos, S. and Mcivor, I. 2006. Biochemical
caharacterization and identification if ice-nucleation-active (INA)
Willow Pathogens by Means of BIOLOG® Microplate, INA Gene
Primers and PCR Based 16S rRNA Gene Analyses. J. Plant. Dis. Prot.
113:97-106.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
49
Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen
Penyandi 16S rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas 7 (3):292-
296.
Paradis, S., Boissinot, M., Paquette, N., Bélanger, S. D., Martel, E. A., Boudreau,
D. K., Picard, F. J., Ouellette, M., Roy, P. H., Bergeron, M. G. 2005.
Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding
elongation factor Tu and F-ATPase β-subunit. Int J Syst Evol Microbiol
55:2013-2025
Pelczar, M.J., Krieg, N. R., Roop, R. M, and Chan, E. C. S., 2003. The Microbial
Universe: An Introduction to Microbiology. John Wiley & Sons
Incorporated.
Polymenakou, P. N. 2012. Atmosphere: A Source of Pathogenic or beneficial
Microbs. Atmosphere 3:87-102
Rostami, M. 2012. Isolation and Identification of Ice- Nucleating- Active Bacteria
and Their Antagonistic bacteria from Pistachio Tress in Rafsanjan
Region. Advances in Environmental Biology, 6(4): 1460-1467.
Rugless, J. A., Marshall, M. N., and Fall, R. 1993. Kinetics of Appearance and
Dissappearance of Classes of Bacterial Ice Nucleation Support and
Agregation Model for Ice Nucleus Assembly. J. Bacteriol. 175:7216-
7221.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. Texas:
Cold Spring Harbor Press. Uniersity of Texas South Western Medical
Centre.
Sastry, S. 2005. Ins and outs of ice nucleation. Nature 438:746-747.
Setyawan, A. D. 2000. Tumbuhan Epifit pada Tegakan Pohon Schima wallichi
(DC) Korth di gunung Lawu. Biodiversitas 2(1):14-20
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
50
Setyawan, A. D. and Sugiyarto, 2001. Keanekaragaman Flora Hutan Jobolarangan
Gunung Lawu : 1. Cryptogamae. Biodiversitas 2(1):115-122
Stephanie and Waturangi, D. E. 2011. Distribution of Ice Nucleation Active (INA)
Bacteria from Rain-Water and Air. Hayati Journal of Biosciens 18 (3)
108-112.
Sunarto, 2000. Penyelamatan Biodiversitas Dalam Pandangan Masyarakat
Setempat. Dalam Setyawan, A.D. dan Sunarto (Ed). Menuju Taman
Nasional Gunung Lawu. Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta.
Suwanto, A. 1994. Iptek dan Kesehatan : Membuat Hujan dengan Bakteri.
Kompas, hal 11
Turner, M. A., Arellano, F. and Kozloff, L. M. 1991. Component of Ice
Nucleation Structures of Bacteria. J. Bacteriol 173:6515-6527.
Wahyudi, A. T. 1995. Pembentukan Inti Es oleh Bakteri. Hayati 2:55-59.
Watanabe, K,. Sato, M. 1998. Detection of variation of the domain structure of ice
nucleation genes in Erwinia herbicola group bacteria by PCR-RFLP
analysis. Curr Microbiol 37:201- 209.
Waturangi, D. E., Meicy, V. and Suwanto, A. 2008. Isolation and identification of
Ice-Nucleating active Bacteria From Indonesian Edible plant poh-pohan.
Microbiol. Indones, 1(2):8-10.
Waturangi, D. E., and Amelia, T. 2009. Isolation, Characterization and genetic
diversity of ice nucleation active bacteria on various plant. Hayati
16(2):54-58
Zhao, J. and Orser, C. S. 1990. Conserved repetition in the ice nucleation gene
inaX from Xanthomonas campestris pv. translucens, Mol. Gen. Genet.
223:163-166.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
51
LAMPIRAN
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
52
Lampiran 1. Data isolat dari keenam sampel penelitian
Jumlah isolat pada keenam sampel penelitian
Stasiun Sampel Penelitian
Jumlah Isolat/Pengenceran
Jumlah MediaNAG King's B
-1 -2 -3 -1 -2 -3
I
Dodonae viscosa Jacq 2 1 1 (-) 1 (-) 5Rubus fraxinifolius 1 2 2 1 (-) (-) 6Vaccinium laurifolium 2 1 1 1 (-) 1 6Chromolaena odonata 2 1 3 1 (-) 1 8Conodopsis javanica (B) Hook F 1 2 1 1 1 6Polygonum chinense L 1 1 2 (-) 2 1 7
Jumlah 9 6 11 4 4 4 38
II
Dodonae viscosa Jacq 1 2 2 1 (-) 2 8Rubus fraxinifolius 1 1 3 (-) 1 (-) 6Vaccinium laurifolium 2 2 2 (-) (-) (-) 6Chromolaena odonata 1 2 (-) 2 (-) (-) 5Conodopsis javanica (B) Hook F 1 3 1 (-) (-) 1 6Polygonum chinense L 3 1 2 1 (-) (-) 7
Jumlah 9 11 10 4 1 3 38
III
Dodonae viscosa Jacq 1 2 1 2 (-) (-) 6Rubus fraxinifolius 2 2 (-) (-) 1 (-) 5Vaccinium laurifolium 1 2 2 (-) 2 1 8Chromolaena odonata 1 1 2 (-) (-) (-) 4Conodopsis javanica (B) Hook F 3 (-) 3 (-) (-) 2 8Polygonum chinense L 2 1 2 2 1 1 9
Jumlah 10 8 10 4 4 4 40Total 116Keterangan : (-)= Kontaminasi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
53
Lampiran 2. Tabel MPN (Kombinasi estimasi bakteri)
Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum
95% Confidence intervals
Tabung PositifMPN
/ g
Conf. Lim Tabung positifMPN/
g
Conf. Lim
0.1
0.01
0.001
Bawah Atas 0.10.01
0 Bawah Atas
0 0 0 <3.0 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3>110
0420
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
54
Lampiran 3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA
1. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4
GCCAACGGGTCTTGTACTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGGTTGGGCACTCTAAGGAAACTGCCGGTGACAAACCGGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACNGCCTGGGGCTAACACCGTGCTTACAATGGTCCGGTACAAAAGGGTTGCCAAGCCCCCGAGGTTGGAGCTAAATCTCCAAAAACCGAACNGTATCCCGGGATCCGANTCTGGCAATTCAACTGGCTTGAAATCCGGAATCCTNTAGAATCCCGAAATCTAATATTGCCCCGTGATAAACGTTCCCGGGGGCTNTGGATAACCCCGCACAA
2. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat
C2N9
AAACGAGAGCTGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCT
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
55
CTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTCGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCACCAAGTAATGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGGCCCTTACAAGTAAGGGCTACACCCGTGCTACAATGGCGCCATACAAAGGAGAACGGACCTCCCGAGAGCAAACCGGACCTCACAAAAGTGGGTCGTAATTCCGGATCGGAATTCGCAATTNGACTCCGGGAAATCCGGATCCCTAGAAAACCTGGGAATCAAAATGCCCCGGGGAAAACTTTCCCTCGCGGCTTTTTAAACCCCCCACAAGGCAN
3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat
F1N6
NNCCNNCGNNGCCTGGCGGAGAAAGGAGCTTGCCTCCGGGTTTANCG
GGCCGACNGGGTGAGNTAACCCTTAGGAATTTCCCCTGTANATGGGG
GGAAAACGTTTCGGAAAGGGACCGCTAATTCCGGCATACGTCCTACG
GGAGAAAACCAGGGGACCTTCGGCCCTTGCGTTATCAGATGAGCCTA
GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAT
CCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG
GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGG
ATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATATCTT
GCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCA
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
56
GCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG
GCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCC
GGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGG
TAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA
GGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACA
CTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA
GTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGGTCCTTGAGACTT
TAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCC
GCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTT
GACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCT
GACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG
GTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGT
TATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG
TGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACAC
GTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGC
TAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGAC
TGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATCGCNNNNN
NNA
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
57
Lampiran 4. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4, C2N9 dan F1N6 pada program BLAST dan Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA
1. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 pada program BLAST
.
DescriptionMax
score
Total
score
Query
cover
E
valueIdent Accession
Pseudomonas tremae
partial 16S rRNA gene,
strain MWM-03
2158 2158 97% 0.0 96% HE716923.1
Pseudomonas syringae
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2158 2158 97% 0.0 96% KC311253.1
Pseudomonas sp. Tigray 2
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2158 2158 97% 0.0 96% KC150861.1
Pseudomonas syringae
strain SQYB-1 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2158 2158 97% 0.0 96% JX876901.1
Pseudomonas syringae
gene for 16S rRNA,
partial sequence, strain:
NBRC 14076
2158 2158 97% 0.0 96% AB680548.1
Pseudomonas tremae
strain Ht3-25 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2158 2158 97% 0.0 96% JF899280.1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
58
2. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat C2N9 pada program BLAST
DescriptionMax
score
Total
score
Query
cover
E
valueIdent Accession
Pantoea sp. SB547 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
2196 2196 97% 0.0 97% FJ357836.1
Uncultured bacterium clone
ncd460h07c1 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2191 2191 97% 0.0 97% HM326435.1
Uncultured bacterium clone
ncd459g01c1 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2191 2191 97% 0.0 97% HM315275.1
Uncultured bacterium clone
ncd864h02c1 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2185 2185 97% 0.0 97% HM306352.1
Pantoeaagglomerans isolate
PSB26 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2183 2183 97% 0.0 97% HQ242739.1
Pantoea sp. 3DT5 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
2183 2183 97% 0.0 97% HQ849996.1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
59
3. Urutan basa gen penyandi16S rRNA isolat F1N6 pada program BLAST
DescriptionMax
score
Total
score
Query
cover
E
valueIdent Accession
Pseudomonas sp. CMR5c 16S
ribosomal RNA (rrsA) gene,
partial sequence
2233 2233 98% 0.0 98% FJ652623.1
Pseudomonas sp. HMPB1 16S
rRNA gene2228 2228 98% 0.0 98%
AM745260
.1
Pseudomonas sp. HYY0512-PK05
gene for 16S rRNA, partial
sequence
2228 2228 98% 0.0 98%AB269776.
1
Pseudomonas sp. ICB476 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
2217 2217 98% 0.0 97%GU990089.
2
Uncultured bacterium clone Ap.ba-
F-DM-HN-1-15 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2211 2211 98% 0.0 97%HQ639445.
1
Pseudomonas sp. CMR12a 16S
ribosomal RNA (rrsA) gene,
partial sequence
2211 2211 98% 0.0 97% FJ652622.1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
60
1. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 bakteri INA dengan Pseudomonas syringae
Pseudomonas syringae 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KC311253.1|Length: 1391Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 22 to 1332
Score Expect Identities Gaps Strand2158 bits(1168) 0.0 1281/1332(96%) 26/1332(1%) Plus/Plus
Query 9 ACGGGT-CTTGTA-CTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT 66 |||||| |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 22 ACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT 81
Query 67 GGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAA 126 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 82 GGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAA 141
Query 127 GCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTG 186 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 142 GCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTG 201
Query 187 AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACT 246 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 202 AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACT 261
Query 247 GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG 306 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 262 GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG 321
Query 307 GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT 366 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 322 GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT 381
Query 367 TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAAT 426 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 382 TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAAT 441
Query 427 AAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCG 486 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 442 AAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCG 501
Query 487 GAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGG 546 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct 502 GAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGG 561
Query 547 CTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAAT 606 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 562 CTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAAT 621
Query 607 TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA 666 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 622 TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA 681
Query 667 CCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC 726 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 682 CCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC 741
Query 727 TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGC 786 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 742 TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGC 801
Query 787 GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG 846
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
61
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 802 GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG 861
Query 847 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA 906 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 862 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA 921
Query 907 ACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAAC 966 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 922 ACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAAC 981
Query 967 ATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC1026 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 982 ATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC1041
Query 1027 CGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGGTTGGGCACTCTAAGGA1086 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||Sbjct 1042 CGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGG-TGGGCACTCTAAGGA1100
Query 1087 AACTGCCGGTGACAAACCGGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA1146 |||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1101 GACTGCCGGTGACAAACCGGA-GGAAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA1158
Query 1147 CNGCCTGGGGCTA-ACACCGTGCTTACAATGGTCCGGTACAAAAGGGTTGCCAAGCCCCC1205 | ||||||| ||| |||| ||||| ||||||||| |||||| |||||||||||||| | Sbjct 1159 CGGCCTGGG-CTACACAC-GTGCT-ACAATGGTC-GGTACAG-AGGGTTGCCAAGCCGC-1212
Query 1206 GAGGTTGGAGCTAAATCTCCAAAAACCGAACNGTATCCCGGGATCCGANTCTGGCAATTC1265 ||||| |||||||| |||| |||||||| | ||| |||| ||| | |||| ||| ||Sbjct 1213 GAGGT-GGAGCTAA-TCTCACAAAACCGATC-GTAGTCCGG-ATCGCAGTCTG-CAACTC1267
Query 1266 AACTGGCTTGAAATCCGGAATC-CTNTAG-AATCCCGAAATCTAATATTGCCCCGTGATA1323 |||| | |||| || |||||| || || |||| |||| || | || | | |||| |Sbjct 1268 GACTG-CGTGAAGTC-GGAATCGCT--AGTAATCGCGAA-TCAGA-ATGTCGCGGTGA-A1320
Query 1324 AACGTTCCCGGG 1335 |||||||||||Sbjct 1321 TACGTTCCCGGG 1332
2. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat C2N9 bakteri INA dengan Pantoea sp
Pantoea sp. SB547 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|FJ357836.1|Length: 1478Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 59 to 1365
Score Expect Identities Gaps Strand2196 bits(1189) 0.0 1275/1316(97%) 10/1316(0%) Plus/PlusQuery 10 GAGAGC-TGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCG 68 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 59 GAGAGCTTGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCG 118
Query 69 ATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG 128 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 119 ATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG 178
Query 129 AGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGG 188 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 179 AGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGG 238
Query 189 GGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG 248
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
62
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 239 GGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG 298
Query 249 GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG 308 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 299 GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG 358
Query 309 CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT 368 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 359 CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT 418
Query 369 TCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGA 428 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 419 TCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGA 478
Query 429 AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG 488 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 479 AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG 538
Query 489 AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGC 548 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 539 AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGC 598
Query 549 TTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATT 608 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 599 TTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATT 658
Query 609 CCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC 668 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 659 CCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC 718
Query 669 CTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT 728 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 719 CTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT 778
Query 729 GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCG 788 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 779 GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCG 838
Query 789 GAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGA 848 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 839 GAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGA 898
Query 849 ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA 908 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 899 ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA 958
Query 909 CCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTCGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACC 968 ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 959 CCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTTGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACC1018
Query 969 GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC1028 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1019 GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC1078
Query 1029 GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCACCAAGTAATGTCGGGAACTCAAAGGAGA1088 |||||||||||||||||||||||||||||||| | ||| |||||||||||||||||||||Sbjct 1079 GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGAGTCATGTCGGGAACTCAAAGGAGA1138
Query 1089 CTGCCGGTGATAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGGCCCTTACAA1148 ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| |Sbjct 1139 CTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT-GGCCCTTACGA1197
Query 1149 GTAAGGGCTACACCCGTGCTACAATGGCGCCATACAAAGGAGAACGGACCTCCCGAGAGC1208 || |||||||||| |||||||||||||||| |||||||| |||| |||||| |||||||Sbjct 1198 GT-AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGC-ATACAAAG-AGAAGCGACCTCGCGAGAGC1254
Query 1209 AAACCGGACCTCACAAAAGTGGGTCGTAATTCCGGATCGGAATTCGCAATTNGACTCCGG1268 || |||||||||| |||||| |||||| ||||||||||| | |||| | ||||||| Sbjct 1255 AAG-CGGACCTCAC-AAAGTGCGTCGTAG-TCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGT1311
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
63
Query 1269 GAAATCCGGATCCCTAGAAAACCTGGGAATCAAAATGCCCCGGGGAAAACTTTCCC 1324 ||| || | ||| |||| || | ||| |||| |||||| ||| ||| || |||||Sbjct 1312 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGG--ATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCC 1365
3. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat F1N6bakteri INA dengan Pseudomonas sp
Pseudomonas sp. CMR5c 16S ribosomal RNA (rrsA) gene, partial sequence Sequence ID: gb|FJ652623.1|Length: 1459Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 39 to 1332
Score Expect Identities Gaps Strand2233 bits(1209) 0.0 1274/1304(98%) 12/1304(0%) Plus/MinusQuery 12 ATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATC 71 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1332 ATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATC1273
Query 72 CGGACTACGATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACC 131 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1272 CGGACTACGATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACC1213
Query 132 GACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCC 191 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1212 GACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCC1153
Query 192 CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTA 251 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1152 CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTA1093
Query 252 ACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG 311 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1092 ACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG1033
Query 312 ACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAG 371 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1032 ACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAG 973
Query 372 TTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT 431 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 972 TTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT 913
Query 432 CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC 491 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 912 CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC 853
Query 492 CAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGTCTCAAGGACCCCAACGGCTAG 551 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 852 CAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGTCTCAAGGACCCCAACGGCTAG 793
Query 552 TTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 611 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 792 TTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 733
Query 612 CGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTAT 671 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 732 CGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTAT 673
Query 672 ATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGC 731 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 672 ATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGC 613
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
64
Query 732 CAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCA 791 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 612 CAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCA 553
Query 792 CCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCG 851 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 552 CCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCG 493
Query 852 GCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGATAT 911 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 492 GCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGATAT 433
Query 912 TAGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACAC 971 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 432 TAGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACAC 373
Query 972 ACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCC1031 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 372 ACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCC 313
Query 1032 GTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTAC1091 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 312 GTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTAC 253
Query 1092 GGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCT1151 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 252 GGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCT 193
Query 1152 GATAACGCAAGGGCCGAAGGTCCCCTGGTTTTCTCCCGTAGGACGTATGCCGGAATTAGC1211 |||| ||||||| |||||||||||||| ||| |||||||||||||||||| || ||||||Sbjct 192 GATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTT-CTCCCGTAGGACGTATGC-GGTATTAGC 135
Query 1212 GGTCCCTTTCCGAAACGTTTTCCCCCCATNTACAGGGGAAATTCCTAAGGGTTANCTCAC1271 | ||||||| ||||||||| |||||| | ||| || | ||||||| | ||| |||||Sbjct 134 G-TCCCTTT-CGAAACGTTATCCCCC-AC-TACCAGGCAGATTCCTAGGCATTA-CTCAC 80
Query 1272 CCNGTCGGCCCGNTAAACCCG-GAGGCAAGCTC-CTTTCTCCGC 1313 || ||| ||| | |||| ||| ||| ||||||| ||| |||||Sbjct 79 CC-GTCCGCC-GCTAAATCCGTGAG-CAAGCTCACTTCATCCGC 39
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
65
Lampiran 5. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina
Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina isolat A2N4 dengan Pseudomonas syringae
NNNANGAGCGGTCGGCAGCACGCAACCGCACAGGAAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTCCACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTATAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACTCACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGTTATGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCTGATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCATTCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTTGATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAAGGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACAACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGACCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAATGGAACCCGGCGA
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
66
Lampiran 6. Urutan basa DNA dari gen ina pada program BLAST dan alligment urutan basa DNA dari gen ina.
1. Urutan produk sekuen parsial DNA dari gen ina isolat A2N4 pada program BLAST
DescriptionMax
score
Total
score
Query
cover
E
valueIdent Accession
Pseudomonas syringae ice4 gene for ice nucleation protein, strain INA4 1190 1190 97% 0.0 99% FN650702.1
Pseudomonas syringae ice nucleation protein (inaK) gene, complete cds 1190 1190 97% 0.0 99% AF013159.1
Pseudomonas syringae S203 ice nucleation gene 1184 1184 97% 0.0 99% X03035.1
Pseudomonas syringaepv. syringae strain MB03 ice nucleation protein (inaQ) gene, complete cds
1112 1239 97% 0.0 97% EU360731.1
Pseudomonas sp. HCh1a ice nucleation protein gene, partial cds 1101 1101 97% 0.0 97% KC311276.1
Pseudomonas sp. PCa2a ice nucleation protein gene, partial cds 1096 1096 97% 0.0 97% KC311275.1
Pseudomonas syringaeinaV gene1068 1068 97% 0.0 96% AJ001086.1
Pseudomonas sp. GCh5Fc ice nucleation protein gene, partial cds 1062 1062 97% 0.0 96% KC311278.1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
67
2. Alligment urutan basa DNA dari gen ina isolat A2N4 dengan
Pseudomonas syringae ice-4 gene for ice nucleation protein strain
INA4
Pseudomonas syringae ice4 gene for ice nucleation protein, strain INA4 Sequence ID: emb|FN650702.1|Length: 3987Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 3030 to 3686
Score Expect Identities Gaps Strand
1190 bits(644) 0.0 653/657(99%) 2/657(0%)Plus/Plus
Query 13 CGGCAGCACGC-AACCGCACAGG-AAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTC 70 ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3030 CGGCAGCACGCAAACCGCACAGGAAAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTC 3089
Query 71 CACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTA 130 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3090 CACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTA 3149
Query 131 TAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACT 190 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3150 TAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACT 3209
Query 191 CACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGTTA 250 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||Sbjct 3210 CACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGCTA 3269
Query 251 TGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCT 310 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3270 TGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCT 3329
Query 311 GATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCAT 370 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |Sbjct 3330 GATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCGT 3389
Query 371 TCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTT 430 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3390 TCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTT 3449
Query 431 GATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAA 490 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3450 GATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAA 3509
Query 491 GGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACA 550 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3510 GGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACA 3569
Query 551 ACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGA 610 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3570 ACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGA 3629
Query 611 CCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAA 667 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3630 CCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAA 3686
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
68
Lampiran 7. Hasil BLASTX asam amino, alligment produk BLASTX dan urutan asam amino isolat A2N4
1. Hasil BLASTX asam amino pada isolat A2N4
2. Alligment produk blastx isolat A2N4
Alignment statistics for match #1Score Expect Method Identities Positives Gaps Frame
353 bits(907) 5e-119 Compositional matrix adjust. 191/192(99%) 191/192(99%) 0/192(0%) +3
Query 93 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSG 272 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSGSbjct 27 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSG 86
Query 273 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESI 452 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESISbjct 87 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESI 146
Query 453 QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAG 632
Sequences producing significant alignments:
DescriptionMax score
Total score
Query cover
E value Ident Accession
hypothetical protein [Pseudomonas syringae]
353 776 84% 4e-119 99% WP_003405688.1
hypothetical protein PSYPI_24104 [Pseudomonas syringae pv. pisi str. 1704B]
352 853 84% 4e-119 99% EGH45241.1
ice nucleation protein [Pseudomonas syringae]
353 869 84% 5e-119 99% WP_024664696.1
hypothetical protein [Pseudomonas syringae]
352 776 84% 8e-119 99% WP_003368365.1
hypothetical protein [Pseudomonas syringae]
353 1076 84% 9e-119 99% WP_025168256.1
ice-nucleation protein s octamer repeat protein [Pseudomonas syringae]
353 1172 84% 5e-118 99% WP_003409544.1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
69
QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAGSbjct 147 QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAG 206
Query 633 NNSYLTAGDRSN 668 NNSYLTAGDRS Sbjct 207 NNSYLTAGDRSK 218
3. Urutan asam amino isolat A2N4
LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLI
AGYGSSLTSGIRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYG
SNQIASYGSSLIAGHESIQVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQ
LAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAGNNSYLTAGDRS
Urutan asam amino Pseudomonas syringae
STQTAQENSSLTTGYGSTSTAGFASSLIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQ
TAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSGIRSFLTAGYGSTLIAGL
RSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESIQVAGNKSML
IAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLA
GNNSYLTAGDRSKLTGGHDCTLMAGDQSRLTAGKNSILTAGARSKLIGSE
GSTLSAGEDSTLIFRLWDGKRYRQLVARTGENGVEADIPYYVNEDDDIVD
KPDED DDWIEVE
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user