Digitaalinen kuvaustekniikka optisessa

mikroskopiassa

LuK-tutkielma

Turun yliopisto

Informaatioteknologian laitos

Elektroniikka ja tietoliikennetekniikka

2005

S. Sormunen

Tarkastaja:

lehtori Risto Punkkinen

Sisällys

1. Johdanto……………………………………………………………………... 1

2. Digitaalikameralla varustetun optisen mikroskoopin toiminta ……………... 2

2.1. Lyhyt kuvaus digitaalikameralla varustetun mikroskooppijärjestelmän

kokoonpanosta…………………………………………………………… 2

2.2. Digitaalikameran ohjaaminen tietokoneohjelmistolla ……………… 3

3. CCD-kenno………………………………………………………………….. 4

3.1. CCD-kennon määritelmä……………………………………………..4

3.2. Tarkempi katsaus ICX205AK:n toimintaan………………………… 7

3.2.1. Interline-tyyppisen CCD-kennon kokoonpano…………………...8

3.2.2. Elektroniset sulkimet……………………………………………...9

3.2.3. Kuvapisteiden yhdistäminen…………………………………...... 10

3.2.4. Tulostustavat…………………………………………………….. 10

3.2.4.1. Peräkkäispyyhkäisytulostus……………………………….. 11

3.2.4.2. Korkeakuvataajuustulostus………………………………... 11

3.2.5. Spektriherkkyys ja kvanttihyötysuhde…………………………...12

3.3. Kohina ja viilennyksen merkitys……………………………………. 15

3.4. CCD-kennon lineaarisuus…………………………………………… 16

4. Koesarja: vääristyneiden näytekuvien yhdistäminen………………………... 17

5. Yhteenveto ja johtopäätökset……………………………………………….. 19

Lähteet…………………………………………………………………………..21

1

1. Johdanto

Muutaman viime vuoden aikana optinen mikroskopia on miltei syrjäyttänyt perinteiset

mikrovalokuvauksen menetelmät. Emulsiokalvoihin perustuvien filmien tilalle ovat tulleet

digitaaliset kuvaustekniikat. Huiman kehityksen myötä 2000-luvun alkuvuosiin mennessä

digitaaliset kuvat ovat kehittyneet melkein perinteisille filmeille otettujen vertaisiksi

erottelukykynsä ja tarkkuutensa puolesta. [1]

Mikroskopiakuvaus on ala, jolla kameroilta vaaditaan suurta erottelukykyä ja värien

toistotarkkuutta hyvin vähävaloisissa olosuhteissa. Tällaiset seikat ovat suuria haasteita

jopa perinteisille filmipohjaisille valokuvauskeinoille. Miksi sitten digitaaliset

kuvaustekniikat ovat saavuttamassa entistä suuremman suosion tällä vaativalla

tieteenalalla? [2]

Verrattuina perinteisiin menetelmiin digitaaliset kuvaustekniikat ovat huomattavasti

helppokäyttöisempiä, nopeampia ja tarjoavat avarammat jälkikäyttömahdollisuudet. Koska

sähköinen tietoliikenne on jo arkipäiväistä, kuvamateriaalikin kulkee yksinkertaisemmin

ykkösinä ja nollina. Digitaalisia kuvia voi esimerkiksi helposti lähettää sähköpostitse

jatkotutkintaan, sisällyttää digitaalisiin dokumentteihin tai siirtää muihin

ohjelmistopohjaisiin kuva-analyysijärjestelmiin. Niitä on myös vaivatonta kopioida ja

arkistoida. Perinteisten valokuvaustekniikoiden haittapuoli on lisäksi se, että niiden

hallintaan tarvitaan rutkasti asiantuntemusta. Käyttäjän täytyy ymmärtää esimerkiksi

erilaisten filmimateriaalien edut ja haitat sekä linssiapertuurien väliset eroavaisuudet.

Tällaista seikkaperäistä tietoa ei tarvita digitaalikuvauksessa, vaan suurin osa

kuvausprosessiin liittyvistä operaatioista on melko yksinkertaisia. [2]

Yksi digitaalikuvauksen eduista on myös kustannusten tasoittuminen pitkällä tähtäimellä.

Ensikäteen digitaalilaitteisto saattaa olla kallis investointi hankkijalle. Ajan mittaan

kuitenkin säästetään: ei ole esimerkiksi lainkaan filminkehityskustannuksia. Kuvaaminen

on myös lähes reaaliaikaista: otokset voidaan hetkessä siirtää tietokoneelle jatkokäsittelyyn

2

tai tarkastukseen. Ei tarvitse odottaa filmin valmistumista, jotta nähtäisiin, onko jokin kuva

onnistunut. [2]

Kuvaamislaite ja sen ominaisuuksien edistyneisyysaste ovat luonnollisesti

mikroskopiakuvauksen ratkaisevimmat tekijät. Laitteen tekniikka yksistään määrää, kuinka

tarkkaan mitattavia näytteitä voidaan kuvata, minkälaisia rakenteita voidaan erottaa ja

millaista dynamiikkaa voidaan kuvantuottamiseen käyttää. Tässä tutkielmassa tarkastellaan

optiseen mikroskopiaan tarkoitettua mikroskooppijärjestelmää, joka on varustettu yhdellä

alan suosituimmista digitaalikameramalleista, Olympuksen DP50:llä. Pääpaino on kameran

CCD-kennon (charge-coupled device eli varauskytketty laite) ominaisuuksien tutkimisessa.

CCD-kennon tekniikka ensi sijassa määrää, kuinka korkeatasoisia digitaalikuvia saadaan

tuloksena. [1]

2. Digitaalikameralla varustetun optisen mikroskoopin toiminta

2.1. Lyhyt kuvaus digitaalikameralla varustetun mikroskooppijärjestelmän

kokoonpanosta

Optiseen mikroskopiaan tarkoitettu mikroskooppijärjestelmä koostuu useammasta toisiinsa

kytketystä laitetasosta (kuva 1). Alimpana tasona on perinteinen mikroskooppi. Seuraavalla

tasolla on standardimallinen C-mount-adapteri, jolla digitaalikamerayksikkö kiinnitetään

mikroskoopin kuvaputkeen (phototube). C-mount-adapteri on tavallinen mekaaninen

adapteri, joka ei sisällä erityisiä optisia elementtejä. [3], [4]

Ylimmällä tasolla on Olympuksen DP50-kamerayksikkö. Kamera käyttää puolen tuuman ja

1,5 miljoonan kuvapisteen värillistä CCD-kennoa tuottaakseen lähes 5,8 miljoonan

kuvapisteen tasoisia kuvia. Tämä data käsitellään jälkikäteen värinkorjausalgoritmin kautta,

jolloin tulokset ovat lähes 35 millimetrin kameralla otettujen kuvien luokkaa. Efektiivisten

tallennuskuvapisteiden määrä voidaan valita kolmesta eri erottelutarkkuudesta

käyttötarkoituksen mukaan: 2776·2074, 1392·1040 tai 640·480 kuvapistettä. Keskeinen osa

DP50:n hyötysuhdetta on Peltier-laite, joka viilentää CCD-kennoa ja siten vähentää

3

tehokkaasti kohinaa. Täten varmistetaan hyvä kuvanlaatu sekä hehku- että

fluoresenssikentässä. [3]

Kyseistä mikroskooppijärjestelmää ohjataan pääasiallisesti tietokoneavusteisesti. DP50:een

kuuluu oheislaitteena tietokoneen PCI-väylään asennettava liitäntäkortti, johon

kamerayksikkö kiinnitetään sopivalla kaapelilla. Varsinaisen kuvankaappaus tehdään

ohjelmiston välityksellä. [1], [3]

Kuva 1. Optiseen mikroskopiaan tarkoitetun digitaalikamerajärjestelmän kokoonpano.

Alinna vasemmalla on mikroskooppi, jonka päälle asetetaan C-mount-adapteri ja itse

DP50-kamerayksikkö. Oikealla on karkea kaavio tietokoneliitännäisistä oheislaitteista. [5]

2.2. Digitaalikameran ohjaaminen tietokoneohjelmistolla

DP50-kamerayksikön toimintaa ohjataan Viewfinder Lite -nimisellä ohjelmistolla

(valmistaja Pixera Corporation), joka on saatavilla Windows- ja MacOS-

käyttöjärjestelmille. Ohjelmiston pääasiallisiin toimintoihin kuuluvat muun muassa kuvien

kaappaus tietokoneelle, väritasapainon, tasojen ja valotuksen määrittäminen sekä kameran

herkkyyden säätäminen. Kuvankaappauksen jälkeen valmis kuva voidaan ohjata

jälkikäsittelyyn joko perinteiselle kuvankäsittelyohjelmalle (esimerkiksi Adobe Photoshop

4

tai vastaava) tai DP50-ohjelmistopaketin mukana tulevalle Studio Lite -ohjelmalle.

Tarkemmat käyttöohjeet ovat saatavilla valmistajan tarjoamassa käsikirjassa. [1]

3. CCD-kenno

CCD-kenno on digitaalikameran varsinainen ydin. Olympuksen DP50-kamerayksikkö

sisältää Sonyn valmistaman kennon, joka on mallia ICX205AK. Seuraavassa perehdytään

aluksi lyhyesti CCD-kennon toimintaan ja sen jälkeen erikoistutaan pohtimaan

ICX205AK:n ominaisuuksia.

Huomautuksena mainittakoon, että kaikkialla tekstissä käytetään termiä valodiodi

(photodiode) puhuttaessa CCD-kennon sensoriyksiköstä eli kuvapisteestä. Kyseessä ei siis

ole perinteinen LED (Light-Emitting Diode) eli monokromaattista valoa tuottava

puolijohdekomponentti. Tekstissä esiintyvä valodiodi on sen sijaan p-n-liitokseen perustuva

optiselle signaalille herkkä valonilmaisin. [6], [7]

3.1. CCD-kennon yleinen määritelmä ja fysikaalinen toiminta

CCD-kennot ovat piipohjaisia integroituja piirejä. Ne koostuvat tiheästä

valodiodimatriisista, jossa alimmalla tasolla toiminnallisina yksikköinä ovat hyvin

lähekkäin asetellut MOS-kondensaattorit (metal-oxide-silicon capacitor) valodiodien

yhteydessä. Näissä fotonien energiaa muutetaan sähkövaraukseksi. Kennot valmistetaan

piikiekolle hyvin samankaltaisesti kuin muutkin vastaavat puolijohdepiirit.

Valmistusprosessiin kuuluvat esimerkiksi sellaiset vaiheet kuin syövytys, ioni-istutus,

ohutfilmikasvatus, metallointi ja passivointi. Piisubstraatti piristetään p-tyyppiseksi, ja

jokaiselle kiekolle rakennetaan useita maskeja. Tämän jälkeen ne leikataan timanttisahalla,

testataan ja pakataan keraamiseen tai polymeeriseen kuoreen, jossa on lasi- tai kvartsi-

ikkuna. Ikkunan kautta fotonit pääsevät valmiin kennon sisään valottamaan sen pinnalla

olevaa valodiodimatriisia. [8], [9]

5

Kun ultravioletti-, näkyvä tai infrapunafotoni iskeytyy valodiodin uumenissa tai sen

lähistöllä sijaitsevaan piiatomiin, tuloksena yleensä syntyy vapaa elektroni-aukkopari.

Vapaa elektroni kerätään tämän jälkeen potentiaalikaivoon tyhjennysalueelle. Aukko

pakotetaan pois ja syrjäytetään piisubstraattiin. Yksittäiset valodiodit on eristetty

naapureistaan elektronisesti kanavasulun avulla, joka on muodostettu sekoittamalla boori-

ioneja maskin kautta substraattiin. Siten eri valodiodien potentiaalit pidetään erossa

toisistaan. [8], [9]

Eräs CCD-kennon pääasiallisista kokoonpano-ominaisuuksista on valtava matriisi

johtavalla polypiikerroksella muodostettuja sarjasiirtorekistereitä. Jälkimmäisiä kutsutaan

porteiksi. Polypiikerros on erotettu substraatista ohuella ja eristävällä piioksidikalvolla. Sen

jälkeen, kun elektronit on koottu valodiodien kaivoihin, portteihin tuodaan

jännitepotentiaali, jolla muutetaan alla olevan piin sähköstaattista potentiaalia. Tällöin

suoraan porttielektrodien alla olevaan substraattiin muodostuu siirtopotentiaalikaivo, joka

kykenee keräämään paikallisesti muodostettuja elektroneja. Naapuriportit auttavat sitomaan

elektroneja siirtopotentiaalikaivoon muodostamalla korkeamman potentiaalin alueita eli

sulkuja sen ympärille (kuva 2). Moduloimalla portteihin tuotua jännitettä ne voidaan

biasoida joko muodostamaan potentiaalikaivoja tai -sulkuja. [8], [9]

Kuva 2. Karkea kaaviokuva potentiaalikaivojen ja porttien sijainnista CCD:n sisällä. [8]

6

Kennon dynamiikka-alueen ylärajan määrää se, kuinka suuren elektronimäärän jokaisen

valodiodin potentiaalikaivo kykenee sitomaan. Käsitteellä dynamiikka-alue tarkoitetaan

maksimissaan saavutettavaa signaalia jaettuna sillä kohinalla, joka muodostuu signaalia

luettaessa. Tässä kohina on lähtövahvistimen kohinan ja muun laitteiston lämpökohinan

summa. [8], [10], [11]

Sen jälkeen, kun elektronit on koottu potentiaalikaivoihin valotusajan eli integroinnin

aikana, niiden rinnakkaissiirto aloitetaan pystysuorissa rekistereissä. Tämä tapahtuu yksi

rivi kerrallaan pystysuoran siirtorekisterin kellosignaalin tahdistuttamana. Elektronit

kuljetetaan jokaisen valodiodin läpi useampiasteisessa prosessissa. Siirto saadaan aikaan

muuttamalla varausta säilyttävän kaivon potentiaali negatiiviseksi, kun taas samanaikaisesti

kasvatetaan viereisen elektrodin biasointi positiivisarvoiseksi. Tämä tapahtuu sykleissä

vierekkäisten elektrodien jännitteitä vaihdellen, pystysuoran siirtorekisterin kellon

tahdistamana. [8], [9]

Sen jälkeen, kun varaus on matkannut rinnakkaissiirtorekisterin läpi, se saavuttaa

erikoistuneen rivin portteja, jota kutsutaan sarjasiirtorekisteriksi. Siellä jokaista kuvapistettä

edustavat elektronipaketit siirretään vaakasuuntaisesti, peräkkäisessä järjestyksessä, kohti

lähtövahvistinta ja edelleen sirusta pois kellosignaalin tahdistamana.

Vaakasarjasiirtorekisterin koko sisältö siirretään lähtösolmuun, ennen kun se täyttyy jälleen

uudella rinnakkaisrekisteristä saapuvalla varauspakettiryöpsäyksellä. Lähtövahvistimessa

elektronipaketit rekisteröivät sen varauksen määrän, jonka peräkkäiset valodiodit,

vasemmalta oikealle ensimmäisestä rivistä alkaen ja viimeiseen päättyen, ovat tuottaneet.

Edellistä toimitusta voidaan kutsua koko valodiodimatriisin keräytyneen varauksen

analogiseksi viivaskannaukseksi. Analoginen signaali muutetaan lopulta digitaaliseksi

sopivalla muuntimella. Lopputuloksena on digitaalinen kuva. [8], [12], [13]

CCD:itä on olemassa useampaa erilaista mallia. Kolme yleisintä muunnelmaa ovat full-

frame-, frame-tansfer- ja interline-tyyppiset kennot. Full-frame-tyyppisessä kennossa on

hyvin tiheä valodiodimatriisi, jolla voidaan tuottaa kuvia erittäin suurella

7

erottelutarkkuudella. Frame-transfer-tyyppinen CCD on hyvin samankaltainen kuin

edellinen malli, joskin siinä on kahteen identtiseen osaan jaettu rinnakkaisrekisteri. Toista

näitä kutsutaan kuvamatriisiksi ja toista varastomatriisiksi. Interline-tyyppisen kennon

rakenteeseen tutustutaan tarkemmin luvussa 3.2.1. [10]

3.2. Tarkempi katsaus ICX205AK:n toimintaan

Sonyn ICX205AK on luonnollisesti pääpiirteittäin edellä kuvatun yleis-CCD:n kaltainen,

joskin sillä on oma erikoistunut särmikkyytensä (kuva 3). ICX205AK on interline-

tyyppinen kiinteäaine-kuvasensori. Sen valopistematriisi on nelikulmainen, ja siinä on noin

1,5 miljoonaa neliskanttista kuvapistettä. Efektiivisiä kuvapisteitä on noin 1,45 miljoonaa ja

aktiivisia 1,4 miljoonaa. Yhden sellaisen koko on noin 4,65·4,65 neliömikrometriä. [5]

Kuva 3. Sonyn ICX205AK-mallinen CCD. Kenno noudattelee pääpiirteittäin luvun 3.1.

kuvausta. Neliöllä kuvataan yhtä valodiodia (photo sensor). Kuvaan on merkitty

8

rinnakkaissiirtorekisterit (vertical register) ja sarjasiirtorekisteri (horizontal register) sekä

varauksen kulun suunta (parallel charge transfer eli rinnakkainen varauksensiirto ja serial

charge transfer eli sarjavarauksensiirto). Vasemmalla on lähtövahvistin, johon elektronit

ohjataan (output amplifier). [5]

Tämä CCD-kenno tukee kahdentyyppistä tulostusmuotoa eli sekä peräkkäispyyhkäisyä

(progressive scan) että korkeakuvataajuustulostusta (high frame rate scanning).

Siruun on rakennettu elektroniset sulkimet, jotka mahdollistavat kokoalaisen pysäytetyn

kuvan muodostuksen ilman mekaanisia sulkimia. Suuri erottelutarkkuus ja runsas

värintuotto saadaan aikaan RGB-mosaiikkisuotimilla (RGB eli red, green ja blue, käytetään

yleisenä väristandardina). Sirussa on myös HAD-sensoreita (Hole-Accumulation Diode),

joilla vähennetään kohinaa ja parannetaan herkkyysastetta. Substraattimateriaalina

käytetään piitä. Kennon dynamiikka-alue on kymmenen bittiä, ja säädettävät valotusajat

vaihtelevat 1/10000 sekunnista minuuttiin. [1], [5]

3.2.1. Interline-tyyppisen CCD-kennon kokoonpano

Interline-tyyppinen CCD suunniteltiin korvaamaan monia frame-transfer-kennon

heikkouksia. Interline-kennot koostuvat hybridirakenteesta, jossa jokaiseen valodiodiin on

liitetty erillinen varastoalue rinnakkaistulostuksen kautta. Näiden kahden eri alueen

toiminnot on eristetty metallimaskirakenteen avulla, joka on kiinnitetty valosuojattujen

rinnakkaistulostuselementtien päälle koko CCD:n pituudelta. Sen jälkeen, kun

valodiodimatriisi on kerännyt mikroskoopin linssiltä projisoidut fotonit ja muuttanut ne

sähköpotentiaaleiksi, varaukset kuljetetaan nopeasti rinnakkaissiirrolla jokaisen

kuvapisteen vieressä sijaitsevaan varastoalueeseen. Tämän jälkeen tulostus tapahtuu

tavallisesti, luvun 3.1. kuvauksen mukaan. [12]

Varastoalue ja kuvapiste muodostavat yhdessä pitkät pystysuorat sarakkeet, jotka alkavat

alhaalta sarjasiirtorekisteristä ja päättyvät matriisin yläosaan (kuva 3). ICX205AK:ssa

kuvapisteet on aseteltu Bayer-järjestelyllä lomittain kunkin valodiodin värisuotimen värin

(sininen, punainen tai vihreä) mukaan. Bayer-järjestely on sellainen värien erottelutapa,

9

jossa kussakin kuvapisteessä on yksivärinen värisuodin. Vihreälle värille on kaksi erilaista

suodinta. Neljän kuvapisteen ryhmä asetellaan niin, että lävistäjän suuntaisesti ryhmässä on

joko sinisiä suodinyksiköitä (B) vastaavan vihreän yksikön (Gb) kanssa tai punaisia (R)

vihreän suotimen kanssa (Gr) (kuva 4). [5], [12], [14]

Kuva 4. Väreille tehty Bayer-järjestely. [5]

3.2.2. Elektroniset sulkimet

Sinä aikana, kun rinnakkaisvarastomatriisia luetaan, varsinainen kuvamatriisi integroi eli

valottaa varausta seuraavaa kuvakehystä varten. Valotusaikaa säädellään sulkimilla.

Interline-arkkitehtuurin pääetu on siinä, että CCD voi mekaanisten sulkimien sijaan

turvautua elektronisiin vastineisiin. Elektronisia sulkimia käytettäessä koko valodiodin

potentiaalikaivon varaus juoksutetaan tyhjiin hetkeksi kokonaisvalotusajan aikana.

Elektroniset sulkimet toimivat yleensä porrastetusti, jolloin kerääntynyt valaistus

puolitetaan joka askeleella. [12], [15], [16]

Elektronien integraatiota valodiodin potentiaalikaivossa kontrolloi valotuksenhallintaportti.

Se kääntää elektronien kulun kohti huuhteludiodia, kun CCD:n kellopiiri on biasoinut

valotuksenhallintaportin ’päällä’-tilaan. Suljinjärjestely sallii sen, että kaikki aktiiviset

valodiodit voidaan samanaikaisesti pyyhkiä vaikuttamatta tummennettuihin

10

siirtorekistereihin. Näin hallitaan diodien potentiaalikaivojen tyhjennyksen ja

tulostusprosessin aloituksen välistä aikaa. [15]

Olosuhteissa, joissa CCD on altistettu hyvin korkeaintensiteettiselle valaistukselle,

potentiaalikaivojen varastointikyky saattaa ehtyä. Kun näin käy, ylijäämävaraus purkautuu

viereisen valodiodin kaivoihin. Tuloksena on kuvakorruptio siinä kohdassa, jossa varaus

purkautuu. Edellä mainittua haittatekijää kutsutaan linssisumentumaksi (blooming).

Sellaisia voidaan tehokkaasti vähentää sulkimien avulla, kuten myös ylivalotusta ja

suttuisuutta, kun kaapataan kuvaa mikroskooppinäytteen liikkuvista kohteista joko

taantuvaa tai täysliikkuvaa videokuvaa käyttäen. [10], [15], [16]

3.2.3. Kuvapisteiden yhdistäminen

Kuvapisteiden yhdistämisellä tarkoitetaan kellotusmenetelmää, jolla kootaan yhteen

useampien viereisten kuvapisteiden keräämä varaus. Tuloksena on vahvistettu signaali.

Menetelmän avulla vähennetään kohinaa ja parannetaan signaali-kohinasuhdetta sekä

kuvataajuutta, joskin avaruuserottelukyvyn kustannuksella. Sillä voidaan myös vähentää

valotusaikaa ja edelleen välttää mikroskooppinäytteestä otetun kuvan nuhruisuutta. CCD:n

kellopiiri kontrolloi kuvapisteiden yhdistämisprosessia. Valittujen sarja- ja

rinnakkaissiirtorekisterien analogista signaalia vahvistetaan synkronisesti.

Yhdistämisalueen kokoa säädetään muun muassa kellon ja biasvirtojen avulla, ja sen koon

ylärajana on lähinnä valodiodimatriisin pinta-ala. Jotta ei päädyttäisi kuvavääristymiin, alue

on yleensä neliönmallinen (2·2, 4·4, jne.). [17], [18]

3.2.4. Tulostustavat

Sonyn ICX205AK tukee kahta erilaista tulostustapaa: peräkkäispyyhkäisyä ja

korkeakuvataajuustulostusta. Näin ollen sitä voidaan tarpeen mukaan säätää tuottamaan

joko reaaliaikaista digitaalista videokuvaa tai normaaleja pysäytettyjä kuvia. [1], [5]

11

3.2.4.1. Peräkkäispyyhkäisytulostus

Peräkkäispyyhkäisytulostustilassa valodiodimatriisi pyyhkäistään koko sen pituudelta

jatkuvassa sarjassa. Tämä ei tarkoita sitä, että matriisin alimmat rivit tulostettaisiin ennen

ylempiä. Pikemminkin ensin valotetaan fotonivuo yli koko matriisikentän ja sitten nopeasti

siirretään kertynyt varaus valolta suojatulle varastoalueelle ja edelleen kuljetuskanavaan

(kuva 5). Kaikkien kuvapisteiden signaalit tulostetaan ei-limittäisessä (non-interlace)

muodossa noin 0,13 sekunnissa. Pystysuora erottelutarkkuus on tässä tilassa noin 800 TV-

raitaa. Kaikki valopistesignaalit, joilla on sama valotusaika, luetaan samanaikaisesti. Tämä

tulostustapa on sopiva kuvakaappaukseen, jossa vaaditaan suuri erottelutaajuus. [5], [11]

3.2.4.2. Korkeakuvataajuustulostus

Korkeakuvataajuustulostus vastaa videokuvatasoista tulostusta. Valodiodeihin koottu

varaus luetaan ja tulostetaan noin 16,7 millisekunnin välein, jolloin yhden sekunnin

kuluessa saadaan aikaan 30 videokehystä. Tällainen kuva koostuu kahdesta limitetystä

kuvakentästä. Jokainen kuvakenttä, joka sisältää 50 prosenttia kokonaisen kehyksen

informaatiosta, kaapataan sarjassa. Tällöin perättäisten parillisten ja parittomien

skannauslinjojen välillä kokonaisessa kuvassa on 16,7 millisekunnin ero. [11]

CCD:n kaikkia kuvapisteitä ei siis lueta tässä tulostustilassa, vaan osa on mustattu (kuva 5).

Tulostus alkaa ensimmäiseltä riviltä. Kahdeksaa riviä kohti luetaan vain kaksi

(ensimmäinen, neljäs, yhdeksäs, kahdestoista, jne.). Pystysuora erottelutaajuus on suurin

piirtein 200 TV-raitaa. Tämä lukutila painottaa ennemminkin kuvankäsittelyn nopeutta kuin

erottelutaajuutta. Korkeakuvataajuustulostuksen avulla voidaan tuoda

mikroskooppinäytteestä reaaliaikaista kuvaa tietokoneen näytölle. Maksimissaan

videokuvan ruutunopeus on kymmenen kehystä sekunnissa. [1], [5]

12

Kuva 5. ICX205AK:n tulostustavat. Vasemmalla kuvataan peräkkäispyyhkäisytulostus ja

oikealla korkeakuvataajuustulostus. Oikeanpuoleisessa kuvassa ne kuvapisteet, joita ei lueta,

on mustattu. [5]

3.2.5. Spektriherkkyys ja kvanttihyötysuhde

CCD:n kvanttihyötysuhde (annettu yleensä prosentuaalisina osuuksina) kuvaa kennon

kykyä muuntaa valodiodien keräämät fotonit elektronisiksi varauksiksi. Valojännitteen

vaste määritellään yksittäisen fotonin luomien niiden elektroni-aukkoparien määränä, jotka

laite onnistuneesti lukee. Kvanttihyötysuhteen arvo on erityisen tärkeä sellaisessa

kuvaamisessa, jossa työskennellään vähävaloisessa ympäristössä (Esimerkiksi

fluoresenssikuvaus: näissä olosuhteissa emissiofotonien aallonpituudet ovat yleensä 275–

13

550 nanometrin luokkaa ja niillä on kohtuullisen suuri absorptiokerroin piihin.).

Standardimalliset CCD:t, jotka valaistaan laitteen etuosan elektrodiporttien ja

oksidipeitteiden kautta, ovat herkimpiä vihreille ja punaisille aallonpituuksille 550–900

nanometrin alueella. ICX205AK on herkimmillään punaisen valon alueella 600

nanometristä alkaen aina infrapunataajuuksille asti (kuva 6). [5], [13], [18], [19]

Kuva 6. ICX205AK:n spektriherkkyys suhteellisen vasteen ja aallonpituuden funktiona.

CCD on herkimmillään punaisen valon alueella ja heikoimmillaan sinisen valon

aallonpituuksilla. [5]

CCD:n spektriherkkyys eroaa tavallisen piivalodiodi-ilmaisimen vastaavasta

ominaisuudesta. Näin on siksi, että CCD:n pinnalla on varausten siirtoon tarkoitettuja

kanavia, jotka on suojattu polypii-porttielektrodeilla, ohuilla piidioksidikalvoilla ja

piinitridipassivointikerroksella. Nämä rakenteet, joita käytetään varauksen kuljettamiseen

kuvausalueelta sekä suojaamaan kennoa kosteudelta ja sähköstaattisilta purkauksilta,

absorboivat lyhyempiä aallonpituuksia (450 nanometriä ja sitä pienemmät aallonpituudet)

ja huonontavat laitteen siniväriherkkyyttä. Polypiin läpäisysuhde alkaa heiketä 600

nanometrin aallonpituustason alapuolella. Absorptio riippuu kuitenkin myös porttien

14

paksuudesta ja CCD:n pinnalla olevien ohuiden kalvojen läpi kulkevan valon

interferenssistä. Interline-CCD sisältää normaalista polypii-porttirakenteesta eroavia

valodiodeja. Tämä seikka vähentää interferenssiä sekä tuottaa ihanteellisemman ja

yhtenäisemmän spektrivasteen. Tämäntyyppisissä kennoissa on yleensä pystysuoria

linssisumentumien estoon tarkoitettuja juoksutuskanavia, jotka alentavat pidemmän

aallonpituuden fotonien vastetta. Sellaiset fotonit, joiden aallonpituus on yli 700

nanometriä, porautuvat syvälle substraattiin lähelle haudattua juoksutuskanavaa. Näillä on

suuri todennäköisyys vapauttaa elektroneja, jotka hajaantuvat juoksutuskanavaan ja tulevat

siten heti poistetuiksi. Kvanttihyötysuhde riippuu myös porttijännitteestä. Pienet jännitteet

tuottavat pieniä tyhjennysalueita ja päinvastoin. [13], [19]

Päinvastoin kuin CCD:t, tavanomaiset kalvoemulsiot ovat yliherkkiä siniselle valolle. Tämä

johtaa usein väri-eroavaisuuksiin filmille tallennettujen ja CCD:llä kaapattujen kuvien

välillä. Kuvasensorin sinisen valon herkkyysvaste heikkenee nopeasti valodiodin koon

pienentyessä. Siten sininen valokin absorboituu entistä huonommin. Tämä on tietyssä

määrin havaittavissa ICX205AK:nkin rakenteessa, jonka kuvapistekoko on muutaman

neliömikrometrin kertaluokkaa. Sinisen värin spektrialueella laite havaitsee herkimmin

noin 460 nanometrin aallonpituuden. Tämän arvon alapuolella oleville aallonpituuksille

spektriherkkyyskäyrä alkaa dramaattisesti laskea. Jo 400 nanometrin kohdalla vaste on

melko huono. Ekstrapoloimalla lineaarisesti käyrää nähdään, että ICX205AK kykenee

havaitsemaan jonkin verran ultraviolettialueen säteilyä, joskin vaste näillä paikoin on jo

surkea (kuva 6). [5], [19]

Tavanomaisen CCD:n spektriherkkyyskäyrää luettaessa havaitaan, että sen

kvanttihyötysuhteen huippuarvo on huomattavasti yksittäisen valodiodin

huippuarvolukemaa pienempi. Spektrikäyrässä tapahtuu aaltoilua CCD:n pinnan ohuiden

kalvojen interferenssi-ilmiöiden takia. Suurin osa fotoneista, joiden aallonpituus on 450–

700 nanometrin luokkaa, absorboituvat joko tyhjennysalueelle tai substraattiin. Näillä

tyhjennysalueelle absorboituneilla fotoneilla on lähes sadan prosentin kvanttihyötysuhde.

Sitä vastoin niillä elektroneilla, joiden diffuusiopituus on pieni, kvanttihyötysuhde on miltei

15

mitätön. Varauskaivon saavuttavat sellaiset elektronit, joiden vastaavat pituudet ovat suuria.

[19]

CCD-kennot on yleensä pakattu kuorimateriaaliin, jolloin sisään syöksähtävien fotonien

täytyy tunkeutua lasi- tai kvartsi-ikkunan läpi saavuttaakseen substraatin. Kaikilla

aallonpituuksilla tapahtuu heijastumishäviöitä ikkunoiden pinnasta, ja fotonien

läpäisysuhde laskee räjähdysmäisesti 400 nanometrin alapuolella. Siksi tieteelliseen

käyttöön tarkoitetuissa CCD:issä käytetään kvartsipeitteitä heijastusongelmien

vähentämiseksi. [19]

3.3. Kohina ja viilennyksen merkitys

Digitaalikamerassa ja CCD-kennossa syntyy monentyyppistä kohinaa, joka luonnollisesti

huonontaa laitteiston herkkyyttä. Digitaalisen kuvan kohina sisältää sekä signaalin että

kameran tekniikan aiheuttamaa kohinaa. Näistä jälkimmäinen koostuu edelleen

pimeäkohinasta (dark noise) ja tulostuksen kohinasta. Signaalin kohina on valon luontaista

kohinaa, joka johtuu fotonivuon stokastisesta luonteesta ja on suoraan verrannollinen

intensiteetin neliöjuureen. Signaalin kohinaa voidaan vähentää kuvapisteitä yhdistämällä

(ks. luku 3.2.3.). [13], [18]

Pimeäkohina eli terminen kohina johtuu valodiodien virranvaihtelusta valottomassa tilassa.

Pimeäkohina on pimeävirran ja valotusajan geometrinen keskiarvo. Koska se on

riippuvainen lämpötilasta, sitä on helppo eliminoida viilennyksen avulla. Jo 8-10 asteen

pudotus lämpötilassa vähentää pimeäkohinaa puolella. DP50:ssä viilennykseen käytetään

Peltier-elementtejä. Pidemmät valotusajat ovat nyt mahdollisia, koska pimeäkohina ei

valloita varauksen varastointiin tarkoitettuja alueita integrointijakson aikana. Viilennettyjä

kameroita kutsutaan hidastulosteisiksi, koska niiden kuvataajuus on tavanomaista

videokameraa hitaampi. [11], [13], [18]

Tulostuskohina aiheutuu yksistään kameran elektroniikasta. Yleensä sirun esivahvistin

tuottaa sitä kvantisoidessaan signaalia. Tulostuskohinalla on merkitystä

16

mikroskopiakuvauksessa, koska valaistus on näissä olosuhteissa niukka. Nykytekniikalla

tulostuskohina on vähennetty noin kymmeneen elektroniin kuvapistettä kohden. [11], [18]

3.4. CCD-kennon lineaarisuus

Tärkeä ominaisuus tieteellisessä kuvausjärjestelmässä on lineaarisuus, eritoten kun on

kyseessä kvantitatiivinen valonmittausanalyysi. CCD-kennon pääasiallinen toiminto on

muuttaa fotonien kantamaa kuvainformaatiota sähköiseksi signaaliksi. Digitoinnin jälkeen

signaalin lähdön tulisi olla lineaarisesti verrannollinen sensorin havaitsemaan valoon. [20]

Siirtofunktio, joka käsittää sensorin havaitsemien fotonien määrän ja vastaavan digitaalisen

ulostulon arvon, määritellään monivaiheisessa prosessissa. Se alkaa varaustenkuljettajien

luonnista ja siirrosta aktiivisilla kuvapistealueilla. Tätä seuraa varausten muuntaminen

vahvistetuiksi jännitesignaaleiksi. Tuloksena saatu analoginen signaali käy läpi useita

prosessointiaskeleita, ja sitä vahvistetaan edelleen, ennen kuin se digitoidaan näyttöä,

kuvaprosessointia ja varastointia varten. Huolellisella laitesuunnittelulla siirtofunktio

tuottaa lineaarisen muunnoksen. CCD:n lineaarisuuden mittaustavassa on huomattavia

eroja riippuen laitevalmistajasta. Yleisin tapa on esittää lähtösignaali valotusajan funktiona

graafisesti. Käyrä jatkuu potentiaalikaivon kapasiteetin huippuarvoon asti. Spesifikaatiossa

saatetaan verrata lineaarisuuspoikkeaman prosentuaalista osuutta signaalin maksimi-

intensiteettiin kaivopotentiaalin täyskapasiteettia käytettäessä. [20]

Kamerasysteemin lineaarisuus määräytyy sekä CCD:n että muiden

signaaliprosessointiketjussa olevien osien mukaan. Käytännössä mikä tahansa

epälineaarisuus aiheuttaa poikkeaman laitteen vahvistusvakioon. Kvantitatiiviset

kuvankäsittelyoperaatiot, kuten aritmeettiset suhdemittaukset, lineaarimuunnokset,

varjostuskorjaukset ja muut prosessointialgoritmit, pohjautuvat absoluuttisiin

signaalimittauksiin ja vaativat, ettei kameran vahvistuksen ja signaalin intensiteetin välillä

saa olla merkittävää riippuvuussuhdetta. Suurihyötysuhteiset CCD:t ovat huomattavasti

lineaarisempia verrattuna tavanomaisiin kuvauslaitteisiin. Tieteelliseen käyttöön

17

tarkoitetuilla CCD:illä on yleensä vain noin muutaman kymmenesosaprosentin

epälineaarisuusarvoja yli neli- tai viisinkertaisen signaalialueen. [20]

Vaikka CCD:t toimivat hyvin lineaarisesti leveällä dynamiikka-alueella, epälineaarinen

vaste yleensä havaitaan, kun keskimääräinen valaistusintensiteetti on korkea käytettäessä

potentiaalikaivon täyskapasiteettia. Jos valaistus on tarpeeksi kirkas, värikyllästystä ja

linssisumentumia ilmenee koko valodiodimatriisin alueella. Värikyllästystä esiintyy, kun

intensiteetin kasvu ei tuota enää lisää muutosta tallennettuun signaaliin. Epälineaarisuutta

voi myös tapahtua hyvin alhaisilla valaistustasoilla sensoritekniikasta riippuen, joskin

epälineaaristen alueiden vaste voidaan tällöin yleensä kalibroida. Paras keino on kuitenkin

rajoittaa valotus lineaariselle alueelle kunkin sensorimallin mukaan, koska

värikyllästysasteeseen loikkaus voi olla nopeaa ja ennustamatonta. Yksi keino välttää

värikyllästystä kirkkaalla valaistuksella on kaapata sarja kuvia lyhyemmällä valotusajalla.

Lyhyempien valotusaikojen summa vastaisi kestoltaan haluttua pidempää integraatioaikaa.

Nämä lyhyen valotusajan kuvat voidaan yhdistää prosessin aikana. [20]

4. Koesarja: vääristyneiden näytekuvien yhdistäminen

Huolimatta CCD:hen kehitetyistä teknisistä parannuksista käytännössä koenäytteistä

otetuissa kuvissa ilmenee aina tietty määrä vääristymiä; luvussa 3.4. käsiteltiin lyhyesti

epälineaarisuudesta johtuvaa värikyllästystä ja luvussa 3.2.5. sinisen värin

absorboitumisongelmaa. Jotta päädyttäisiin mahdollisimman virheettömään lopputulokseen,

mikroskooppinäytteistä kehitettyjä otoksia täytyy usein jälkikäsitellä jollakin

kuvankäsittelyohjelmalla. Seuraavassa lyhyessä koesarjassa esitetään, kuinka kahdesta

vääristyneestä näytekuvasta tehdään kaikki kuvapisteet oikealta näyttävä versio pienellä

kuvanmuokkauksella.

Koesarjassa käytettiin mikroskopoitavana näytteenä valaistua, kiekosta w511 otettua

puolijohdepalaa. Siitä otettiin kaksi kuvaa: toinen kirkaskentässä (kuva 7) ja toinen

pimeäkentässä (kuva 8). Käytetty linssisuurennos oli 5x ja herkkyys ISO 400. Valotusaika

18

oli sama molemmilla. Kuvassa 7 havaitaan taustalla joukko tummia pisteitä, joiden

periaatteessa pitäisi olla identtisiä kuvan 8 vaaleiden pisteiden kanssa. Kuitenkin voidaan

havaita, että osa kuvan 7 kriittisistä pisteistä ei ole näkyvissä kuvassa 8 ja päinvastoin.

Kuva 9 on uudelleenkerrostettu muokkaus kuvista 7 ja 8. Alempana kerroksena on käytetty

kuvaa 7 normaaliasetuksin (normal layer) ja ylempänä kuvaa 8 käännetyin värein

sulautettuna alempaan (exclusion layer). Molempien kuvien tärkeät pisteet näkyvät nyt

lopputuloksessa.

Kuva 7. Näyte puolijohdepalasta (kiekko w511) kirkaskentässä (brightfield).

19

Kuva 8. Sama näyte kuvattuna pimeäkentässä (darkfield) samalla valotusajalla. Osa niistä

pisteistä, jotka näkyvät tummana kuvassa 7, eivät ole havaittavissa. Sama pätee päinvastoin

tässä otoksessa havaittuihin vaaleampiin pisteisiin.

Kuva 9. Kirkas- ja pimeäkenttäotokset yhdistettyinä. Kaikki tärkeät pisteet ovat nyt

näkyvissä.

5. Yhteenveto ja johtopäätökset

Nykyaikana digitaalikuvaustekniikat ovat syrjäyttäneet perinteiset filmipohjaiset

kuvausmenetelmät mikroskopiassa. Mikroskopoitavia näytteitä on pystyttävä kuvaamaan

tarkasti hyvin vähävaloisissa olosuhteissa, joten digitaalikameralta vaaditaan hyvin tarkkaa

erottelukykyä ja lineaarisuutta. Kameran hyötysuhde on suoraan verrannollinen sen

sisältämän CCD-kennon toimintaan. Jotta voitaisiin tuottaa tarkkoja digitaalikuvia,

kuvapisteen koon on oltava tarpeeksi pieni ja kuvamatriisin pyyhkäisytavan tehokas.

Lisäksi on huomioitava kohinan, ylivalotuksen ja tahattomien heijastusten aiheuttamat

ongelmat. Linssisumentumia, ylivalotusta ja suttuisuutta voidaan tehokkaasti vähentää

elektronisilla sulkimilla. Kuvapisteitä yhdistämällä voidaan vahvistaa signaalia ja parantaa

signaali-kohinasuhdetta. Peltier-viilennyksellä voidaan eliminoida pimeäkohinaa ja

pidentää valotusaikoja. Interline-tyyppisen CCD-kennon sisältävä digitaalikamera on

20

rakenteeltaan erinomainen tarkkaan kuvaukseen, sillä se ottaa huomioon edellä mainitut

optimointiominaisuudet.

Kaikkia ongelmia ei siltikään voida poistaa. Näistä ovat muun muassa CCD-kennon huono

siniväriherkkyys ja epälineaarinen vaste käytettäessä yhtä aikaa suurta

valaistusintensiteettiä ja potentiaalikaivojen täyskapasiteettia. Tuloksena saatavissa kuvissa

voi esiintyä epämieluisaa värikyllästystä ja linssisumentumia. Yksi värivääristymistä

aiheutuva ongelma on esimerkiksi tärkeiden yksityiskohtien puuttuminen näytekuvista.

Tämän vuoksi näytekuvasarjoja täytyy usein jälkikäsitellä jollakin kuvankäsittelyohjelmalla,

jotta lopputuloksesta saataisiin oikeanlainen. Tässä nähdään digitaalisen kuvamateriaalin

etu filmipohjaiseen nähden: materiaalin uudelleenkäsittely ja varastointi on melko

vaivatonta.

21

Lähteet

[1] DP50 Microscope Digital Camera System, Instruction Manual, Pixera Corporation

(2001).

[2] P. Drent, Digital Imaging - New Opportunities for Microscopy, Nikon Microscopy

(2000–2005)

http://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/drentdigital.html. Luettu 22.1.2005.

[3] Olympus DP50 Brochure

http://resources.olympus-

europa.com//micro/catalogs/C12567B6003775C70958BCE87E4DBBD4412568DC005C1

B52_DP50.pdf. Luettu 18.10.2004.

[4] Camera Adapters for Photomicrography

http://www.geologynet.com/micro/adaptors.htm. Luettu 10.11.2004.

[5] SONY ICX205AK Specification Sheet, WfineCCD, Sony

http://www.eureca.de/pdf/sony/ICX205AK.pdf. Luettu 18.10.2004.

[6] LED, Wikipedia (2005)

http://en.wikipedia.org/wiki/LED. Luettu 10.11.2004.

[7] Photodiode, Wikipedia (2005)

http://en.wikipedia.org/wiki/Photodiode. Luettu 10.11.2004.

[8] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:

Anatomy of a Charge-Coupled Device, (2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdanatomy.html.

Luettu 7.11.2004.

22

[9] R. S. Muller and T. I. Kamins, Device Electronics for Integrated Circuits, Second

Edition (Singapore, 1986), p. 409–417.

[10] M. Abramowitz et al, Concepts in Digital Imaging Technology (2000-2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/concepts.html.

Luettu 10.11.2004.

[11] K. R. Spring and M. W. Davidson, Electronic Imaging Detectors (2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/digitalimagingdetectors.html.

Luettu 18.10.2004.

[12] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:

Interline Transfer CCD Architecture, (2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/interline.html.

Luettu 7.11.2004.

[13] P. Magnan, Detection of Visible Photons in CCD and CMOS: A Comparative View,

Elsevier Science B. V. 2003.

[14] D. L. Gilblom, S. K. Yoo, and P. Ventura, in Proceedings of SPIE, Orlando, FL, USA,

21 April 2003, edited by B. F. Andresen and G. F. Fulop, September 2003, pp. 318–331.

[15] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:

Electronic Shutters

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/electronicshutter.ht

ml. Luettu 10.11.2004.

[16] T. Engdahl, Digikameroiden sirutekniikat: Elektroniikkaa tosi tiukasti, Prosessori 6–7

2004, p. 26–31.

23

[17] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Pixel

Binning

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/binning.html. Luettu

10.11.2004.

[18] Olympus BioSystems Glossary, Olympus BioSystems (2003–2004)

http://www.olympus-biosystems.com/templates_eng/bio_imaging/glossary.html. Luettu

10.11.2004.

[19] K. R. Spring and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Quantum

Efficiency (2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/quantumefficiency.h

tml. Luettu 11.11.2004.

[20] T. J. Fellers and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Charge-

Coupled Device (CCD) Linearity, (2004)

http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdlinearity.html.

Luettu 10.11.2004.