DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGAseminarska naloga z naslovom Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom pri mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek avtorsko delo

Univerza v Mariboru

Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Oddelek za biologijo

DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGA

Sandra ZVONAR

Maribor, 2011

Univerza v Mariboru


Oddelek za biologijo

Sandra ZVONAR

Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom

DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGA

Kvantitative determination of reductive sugars with DNS reagent

GRADUATION SEMINAR THESIS

Mentorica: doc. dr. Jana AMBROŢIČ DOLINŠEK

Maribor, 2011

Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska

naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.

II

Univerza v Mariboru


MENTORSTVO

Diplomska seminarska naloga je nastala pod mentorstvom doc. dr. Jane Ambroţič

Dolinšek s Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru. Delo sem

opravljala v laboratoriju za fitofiziologijo oddelka za biologijo na Fakulteti za naravoslovje

in matematiko Univerze v Mariboru.



III

Univerza v Mariboru


IZJAVA

Podpisana Sandra Zvonar, rojena 31. 1. 1988, študentka Filozofske fakultete Univerze v

Mariboru, študijskega programa biologija in geografija, izjavljam, da je diplomska

seminarska naloga z naslovom Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS

reagentom pri mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek avtorsko delo. Diplomska

seminarska naloga je nastala kot rezultat lastnega dela. Vsi privzeti podatki so citirani

skladno z mednarodnimi pravili o varovanju avtorskih pravic.

Maribor, 10. 6. 2011 Sandra Zvonar



IV

Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom.

Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in

matematiko, Oddelek za biologijo, 2011.

POVZETEK

Redukcijski sladkorji so primarni produkt fotosinteze in se uporabljajo za transport

molekul za energijo. So vir materialov za tvorbo proteinov, polisaharidov, lipidov in

celuloze. Vsebujejo karbonilne skupine, kar pomeni, da delujejo v različnih reakcijah kot

redukcijsko sredstvo. Namen te diplomske seminarske naloge je bil poiskati in preizkusiti

metodo za kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu s pomočjo

spektrofotometra SpectroVis. V diplomski seminarski nalogi so podane teoretične osnove

o ogljikovih hidratih in spektrofotometriji ter rezultati, analiza in evalvacija preizkusa

izbrane metode, ki je najprimernejša za izvajanje na srednjih šolah in fakultetah zaradi

izjemne natančnosti, preprostosti in dostopnosti vseh potrebnih materialov in

pripomočkov.

Ključne besede: ogljikovi hidrati, redukcijski sladkorji, spektrofotometrija, DNS reagent.



V

Zvonar, S.: Kvantitative determination of reductive sugars with DNS reagent.

Graduation Seminar Thesis. University of Maribor, Faculty of Natural Sciences and

Mathematics, Department of Biology, 2011.

ABSTRACT

Reductive sugars are the primary product of photosynthesis and are used to transport

molecules for energy. They are a source of materials to form proteins, polysaccharides

lipids and cellulose. They contain carbon groups, which means that they work in different

reactions as a reductive medium. The purpose of this dissertation is to show and test the

method for kvantitative determination of reductive sugars in vegetation tissue with the help

of a spectrophotometer SpectroVis. In this graduation seminar thesis we give the

theoretical background of carbohydrates and spectroscopy, with the results, analysis and

the evaluation of the test of the chosen method. This method is suitable for secondary

schools and universities because of its precision, simplicity and accessibility of all

necessary materials and equipment.

Key words: carbohydrates, reductive sugars, spectroscopy, DNS reagent.



VI

KAZALO

Kazalo vsebine

1 UVOD ............................................................................................................................ 1

1.1 Namen diplomske seminarske naloge ..................................................................... 3

1.2 Cilji diplomske seminarske naloge ......................................................................... 4

1.3 Hipoteza .................................................................................................................. 4

2 TEORETIČNE OSNOVE ............................................................................................. 5

2.1 Ogljikovi hidrati v rastlinah .................................................................................... 5

2.1.1 Monosaharidi ................................................................................................... 5

2.1.1.1 Redukcijski sladkorji ................................................................................ 8

2.1.2 Disaharidi ........................................................................................................ 9

2.1.3 Polisaharidi .................................................................................................... 11

2.1.3.1 Rezervni polisaharidi.............................................................................. 11

2.1.3.2 Strukturni polisaharidi ............................................................................ 12

2.2 Sinteza ogljikovih hidratov v Calvinovem ciklu .................................................. 14

2.3 Spektrometrija ....................................................................................................... 17

2.3.1 Elektromagnetno valovanje ........................................................................... 17

2.3.2 Kvantitativno vrednotenje ............................................................................. 19

3 MATERIAL IN METODE .......................................................................................... 23

3.1 Kvantitativna ocena redukcijskih sladkorjev po metodi z DNS reagentom (3,5-

dinitrosalicilno kislino) .................................................................................................... 23

3.1.1 Priprava na izvedbo metode in varnostni ukrepi ........................................... 23

3.1.2 Material .......................................................................................................... 24

3.1.3 Postopek ........................................................................................................ 25

3.1.3.1 Priprava DNS reagenta (reagenta iz 3,5-dinitrosalicilne kisline) ........... 25

3.1.3.2 Priprava umeritvene krivulje .................................................................. 26

3.1.3.3 Priprava ekstrakta iz rastlinskega materiala ........................................... 36

4 REZULTATI ............................................................................................................... 38

4.1 Rezultati preizkusa metode ................................................................................... 38

4.2 Rezultati anketnega vprašalnika ........................................................................... 42

5 RAZPRAVA ................................................................................................................ 45

5.1 Analiza rezultatov preizkusa metode .................................................................... 45

5.2 Analiza rezultatov anketnega vprašalnika ............................................................ 46



VII

6 ZAHVALA .................................................................................................................. 49

7 LITERATURA IN VIRI .............................................................................................. 50

8 PRILOGE ...................................................................................................................... 1

Kazalo slik

Slika 1: Monosaharidi (a) fruktoza, (b) glukoza, (c) galaktoza ............................................. 5

Slika 2: (a) Dihidroksiaceton, (b) D-gliceraldehid in (c) L-gliceraldehid ............................. 6

Slika 3: Shematski pregled D-aldoz ...................................................................................... 7

Slika 4: D-sedoheptuloza in D-manoheptuloza ..................................................................... 7

Slika 5: Shematski pregled D-ketoz ...................................................................................... 8

Slika 6: Fehlingov test z glukozo .......................................................................................... 9

Slika 7: Saharoza ................................................................................................................. 10

Slika 8: Laktoza ................................................................................................................... 10

Slika 9: Maltoza ................................................................................................................... 10

Slika 10: Škrob in glikogen ................................................................................................. 12

Slika 11: Celuloza ................................................................................................................ 12

Slika 12: Zgradba rastlinske celične stene ........................................................................... 14

Slika 13: Calvinov cikel ...................................................................................................... 15

Slika 14: Spekter elektromagnetnega valovanja .................................................................. 18

Slika 15: Prehajanje svetlobe skozi kiveto .......................................................................... 20

Slika 16: Shematski prikaz spektrofotometra ...................................................................... 22

Slika 17: SpectroVis ............................................................................................................ 30

Slika 18: Program LoggerPro – Experiment ....................................................................... 31

Slika 19: Program LoggerPro – Calibrate – Spectrometer: 1 .............................................. 31

Slika 20: Program LoggerPro – Calibrate Spectrometer ..................................................... 32

Slika 21: Program LoggerPro – Finish Calibration ............................................................. 32

Slika 22: Program LoggerPro – OK .................................................................................... 33

Slika 23: Zbiranje podatkov – Collect ................................................................................. 34

Slika 24: Ustavitev zbiranja podatkov – Stop Collection .................................................... 34

Slika 25: Moţnosti grafa – Graph Options .......................................................................... 35

Slika 26: Moţnosti osi – Axes Options ............................................................................... 35

Slika 27: Zbriši in nadaljuj – Erase and Continue ............................................................... 36

Slika 28: Umeritvena krivulja za glukozo ........................................................................... 40

Slika 29: Umeritvena krivulja za fruktozo .......................................................................... 40



VIII

Slika 30: Odgovori anketirancev na 7. točko: "Metoda mi je pripomogla k laţjemu

razumevanju snovi." ............................................................................................................ 42

Slika 31: Odgovori anketirancev na 8. točko: "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega

gradiva pri predmetu Fitofiziologija." ................................................................................. 43

Slika 32: Odgovori anketirancev na 9. točko: "Metoda je dosegla moja pričakovanja." .... 43

Slika 33: Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo .................................. 44

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Priprava DNS reagenta ................................................................................ 26

Preglednica 2: Priprava standardnih raztopin glukoze ........................................................ 28

Preglednica 3: Priprava standardnih raztopin fruktoze ....................................................... 28

Preglednica 4: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za glukozo .................................. 29

Preglednica 5: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za fruktozo ................................. 30

Preglednica 6: Absorbance različnih masnih koncentracij glukoze .................................... 38

Preglednica 7: Absorbance različnih masnih koncentracij fruktoze ................................... 39

Preglednica 8: Rezultati vzorcev ......................................................................................... 41



1

1 UVOD

Ogljikovi hidrati so najbolj pogoste organske molekule v naravi in so primarne molekule

za shranjevanje energije, poleg tega pa lahko tvorijo različne strukturne komponente ţivih

celic (Raven in Echhorn, 2005, str. 16). V večini rastlin sta škrob in saharoza glavna

končna produkta fotosinteze, mesto in potek njunega nastanka pa sta prostorsko ločena

(Jha in Dubey, 2005, str. 342). Škrob (prehodna ali začasna oblika škroba oziroma

primarni škrob) se sintetizira v kloroplastih, saharoza pa v citoplazmi. Podnevi se ogljik,

asimiliran v procesu fotosinteze, porabi za sintezo škroba v kloroplastu ali pa je

transportiran v citosol za sintezo saharoze. Ta je lahko transportirana v nefotosintetske dele

rastline. Trioza fosfati iz Calvin-Bensonovega cikla se lahko v kloroplastih sintetizirajo v

ADP-glukozo, iz katere se sintetizira škrob, lahko pa se preko Pi translokatorja

transportirajo v citosol, kjer se sintetizirajo v saharozo. Ponoči se škrob v kloroplastu

razcepi na maltozo in glukozo, ki se preko maltoza-glukoza translokatorja transportirata v

citosol. Tu se pretvorita v heksoza fosfate, iz katerih se sintetizira saharoza. Saharoza se

kot vir energije porablja za rast in kot zaloţni sladkor skladišči v nefotosintetskih delih

rastlin. Tu se tvori škrob v obliki gostih granul, imenovanih amiloplasti, ki predstavljajo

posebno vrsto plastidov (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224). Škrob je torej zaloţna oblika

rezervnega sladkorja, saharoza pa transporta oblika sladkorja (Jha in Dubey, 2005, str.

342).

Redukcijska sladkorja glukoza in fruktoza ter neredukcijski sladkor saharoza se

sintetizirajo v procesu fotosinteze v listih. Iz listov (vir) so nato transportirani v preostale

rastlinske organe (ponor), kot so korenine, plodovi, gomolji, kjer se uporabijo kot vir

energije v respiratornem metabolizmu ali za rast oziroma sintezo kompleksnih ogljikovih

hidratov, kot je škrob, in biosintezo strukturnih polisaharidov, kot je celuloza (Jha in

Dubey, 2005, str. 342). Rezultati številnih analiz kaţejo na to, da se po floemu rastlin

transportirajo predvsem neredukcijski sladkorji. Redukcijska sladkorja, kot sta glukoza in

fruktoza, vsebujeta redukcijsko aldehidno ali keto skupino, ki je v saharozi spremenjena v

alkoholno skupino ali kombinirana s podobno skupino drugega sladkorja. Saharoza je

glavna transportna oblika sladkorja najverjetneje zato, ker je manj reaktivna kot njene

redukcijske komponente (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224).



2

Saharoza, trekaloza, glukoza, fruktoza in majhne količine drugih substanc, kot so

aminosladkorji, sladkorni alkoholi, sladkorni fosfati in uronska kislina, so topni sladkorji v

rastlinah. Škrob in celuloza pa sta netopni obliki ogljikovih hidratov (Prado in sod., 1998,

str. 58).

Sladkorji so jeseni in pozimi shranjeni v obliki zaloţnih sladkorjev za nadaljnjo uporabo

spomladi, ko se začne rast. Takrat se saharoza transportira na mesto porabe (ponor), kjer se

hidrolizira v redukcijske oblike sladkorjev, ki se nato uporabijo v metaboličnih procesih in

tako zagotovijo potrebno energijo za rast. Zato je jeseni v rastlinskih tkivih veliko

zaloţnega sladkorja, redukcijskih sladkorjev pa zelo malo. Spomladi, ko poganjajo

poganjki, pa je v rastlinah prisotna velika količina redukcijskih sladkorjev.

Eden večjih izzivov za rastlinske biokemike je vprašanje, kako nastajajo produkti

fotosinteze v kloroplastih in kako je njihova biosinteza povezana z metabolizmom v celici

in v drugih rastlinskih organih (Taiz in Zeiger, 2010, str. 224). Danes vemo, da je

poznavanje statusa ogljikovih hidratov v rastlinah zelo pomembno za razumevanje

številnih biokemičnih procesov, ki se odvijajo v rastlinah (Prado in sod., 1998, str. 58).

Zanimivo je, da stres vpliva na nivo redukcijskih sladkorjev v rastlinah. Različni okoljski

stresni dejavniki vplivajo na metabolizem sladkorjev in razporejanje fotoasimilatov v

rastočih rastlinah, kar vodi v akumulacijo topnih sladkorjev v tkivih. Akumuliranje

sladkorjev pod vplivom stresa prispeva k osmoregulaciji in ima pomembno vlogo pri

zaščiti biomolekul in membran (Jha in Dubey, 2005, str. 342). Tretiranje kalic s teţko

kovino arzenom povzroči povečano akumulacijo topnih sladkorjev, tudi redukcijskih. Tako

stresni dejavniki, kot so slanost, navzočnost teţkih kovin, npr. arzena ali kadmija, povečajo

akumulacijo topnih sladkorjev in s tem prispevajo k vzdrţevanju osmotskega ravnovesja v

celicah, mobilizirane rezerve ogljikovih hidratov pa naj bi omogočale podporo bazalnega

metabolizma v stresnem okolju (Jha in Dubey, 2005, str. 346).

Namen diplomske seminarske naloge je vpeljava metode za določanje redukcijskih

sladkorjev v rastlinskem tkivu. Redukcijski sladkorji poleg saharoze spadajo med topne

sladkorje in so tisti sladkorji, ki so prvi produkti fotosinteze ali se sproščajo iz zaloţnih

sladkorjev. Zanje je značilno, da imajo prosto aldehidno (glukoza na 1. C atomu) ali keto

(fruktoza na 2. C atomu) skupino. Ta aldehidna skupina je reducent, ki reducira baker



3

(Cu2+

+ e- → Cu

+) v bazičnem okolju, zato morajo biti ti sladkorji sposobni preiti v

aciklično obliko (Boyer, 2005, str. 186).

Glukozo, ki ima aldehidno skupino, uvrščamo med aldoze in jo je mogoče oksidirati v

karboksilno kislino (Gros in sod., 2010). Sposobnost redukcije ogljikovih hidratov je

odvisna od prisotnosti aldehidne ali keto skupine, to pa lahko dokaţemo s preprostim

kemijskim preizkusom s Fehlingovim reagentom. Ta vsebuje bakrove(II) ione (Cu2+

), ki se

reducirajo do bakrovega(I) oksida (Cu+), ki ga prepoznamo po rjavo-oranţni oborini

bakrovega oksida (Cu2O) (Bavec in sod., 2008, str. 25). Saharoza spada med neredukcijske

sladkorje. Ti lahko imajo namesto ketonske aldehidno funkcionalno skupino, ki ne more

reducirati bakrovih(II) ionov, zato ti sladkorji pri uporabi Fehlingove raztopine ne

povzročijo nastanka obarvane oborine (Gros in sod., 2010).

Na vajah pri predmetu Fitofiziologija smo do sedaj izvajali samo kvalitativen dokaz za

prisotnost redukcijskih sladkorjev. V naši nalogi pa smo ţeleli poleg kvalitativne metode

uvesti metodo za kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev, in sicer takšno, ki jo je

mogoče izvesti s pomočjo obstoječe opreme. Pri tem smo imeli v mislih spektrofotometer

SpectroVis proizvajalca Vernier, ki ga pogosto vključujejo v laboratorijsko delo v srednjih

šolah.

Izmed metod za določanje redukcijskih sladkorjev z uporabo spektrofotometra (Nelson-

Somogyijeva metoda, antronska metoda, metoda z DNS reagentom) smo se odločili za

vpeljavo take, ki čim bolje ustreza naslednjim kriterijem: ni omejena na določeno skupino

sladkorjev, kot so aldoze, pentoze, ketoze, uronska kislina; ne vsebuje strupenih kemikalij,

ki so jedke in draţilne; ne zahteva časovno potratne ter teţavne priprave vzorcev. Zaradi

potrebe po hitri, enostavni, natančni, varni in finančno nezahtevni metodi za določanje

koncentracije redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu je namen te diplomske

seminarske naloge poiskati in razviti najustreznejšo metodo z uporabo spektrofotometra.

1.1 Namen diplomske seminarske naloge

Namen diplomske seminarske naloge je poiskati kvantitativne metode za določanje

redukcijskih sladkorjev in izmed najdenih metod izbrati tisto, ki je v vseh pogledih

najprimernejša za izvajanje v gimnaziji in na fakulteti. Biti mora dovolj natančna, ne



4

preveč dolga in zahtevna, sistematična, z uporabo manj strupenih kemikalij in

instrumentov, ki so dosegljivi vsaki gimnaziji in fakulteti.

1.2 Cilji diplomske seminarske naloge

Cilji diplomske seminarske naloge so:

poiskati kvantitativno metodo za določanje redukcijskih sladkorjev v rastlinskem

tkivu, jo preizkusiti in dodelati;

preizkusiti najdeno metodo pri vajah iz Fitofiziologije skupaj s študenti 4. letnika

smeri Biologija in ... ter študenti 3. letnika programa Ekologija z naravovarstvom;

na podlagi anketnega vprašalnika, ki so ga izpolnili študenti, vključeni v raziskavo,

narediti evalvacijo metode.

1.3 Hipoteza

Pred samim preizkusom metode smo postavili dve delovni hipotezi:

metoda je dovolj natančna, da zazna redukcijske sladkorje poleg čebule tudi v travi;

med redukcijskima sladkorjema glukozo in fruktozo bo prve v rastlinskih ekstraktih

bistveno več.



5

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 Ogljikovi hidrati v rastlinah

Ogljikovi hidrati so najbolj pogoste organske molekule v naravi in so primarne molekule

za shranjevanje energije v večini ţivečih organizmov. Poleg tega lahko tvorijo različne

strukturne komponente ţivih celic (Raven in Echhorn, 2005, str. 16).

Ogljikovi hidrati so naravne organske snovi, zgrajene iz ogljika, vodika in kisika v

razmerju 1 : 2 : 1. Njihova splošna formula se glasi (CH2O)n, kjer je n ≥ 3 (Voet in sod.,

2002, str. 196).

Najenostavnejši ogljikovi hidrati so majhne molekule, poznane pod imenom sladkorji.

Večji ogljikovi hidrati so sestavljeni iz več sladkorjev. Razlikujemo med tremi glavnimi

skupinami ogljikovih hidratov, ki so klasificirane glede na število enot sladkorja:

monosaharidi ali enostavni sladkorji, kot so riboza, glukoza in fruktoza, ki so

sestavljeni iz ene same molekule sladkorja;

disaharidi ali sestavljeni sladkorji iz dveh sladkorjev, kot so saharoza (pesni ali

trsni sladkor, tudi namizni sladkor), maltoza (sladni sladkor) in laktoza (mlečni

sladkor), ki so sestavljeni iz dveh kovalentno povezanih molekul sladkorja, in

polisaharidi ali sestavljeni sladkorji iz več molekul sladkorjev (Raven in Echhorn,

2005, str. 16).

2.1.1 Monosaharidi

Monosaharidi ali enostavni sladkorji so najenostavnejši ogljikovi hidrati. So aldehidni ali

ketonski derivati iz linearne verige polihidroksi alkoholov, ki vsebuje vsaj tri ogljikove

atome (Boyer, 2005, str. 180). Slika 1 prikazuje molekularno shemo fruktoze, glukoze in

galaktoze.

Slika 1: Monosaharidi (a) fruktoza, (b) glukoza, (c) galaktoza

(Medical Physiology/Basic Biochemistry/Sugars: Reference. (2010). Prevzeto 24. april 2011 iz The Full Wiki:

http://www.thefullwiki.org/Medical_Physiology/Basic_Biochemistry/Sugars)



6

Aldehid je spojina, pri kateri je C atom karbonilne skupine vezan na vsaj en H atom, keton

pa je spojina, pri kateri je C atom karbonilne skupine vezan na dve ogljikovi skupini.

Klasificirani so glede na kemijsko naravo njihove karbonilne skupine, to je ogljikov atom z

dvojno vezjo, vezan na kisikov atom, in število C atomov, ki jih sestavljajo. Če je

karbonilna skupina aldehid, se sladkor imenuje aldoza, če pa je karbonilna skupina keton,

se sladkor imenuje ketoza (Voet in sod., 2002, str. 196). To so torej spojine z empirično

formulo (CH2O)n, ki imajo eno samo aldehidno skupino ali keto skupino ter več

hidroksilnih skupin. Med najmanjše ogljikove hidrate sodijo trioze, ki imajo 3 atome

ogljika. V to skupino ogljikovih hidratov uvrščamo gliceraldehid (GA) (ogljikov hidrat z

aldehidno skupino) in dihidroksiaceton (DHA) (ogljikov hidrat s keto skupino). Slika 2

prikazuje obe obliki trioz. Večina monosaharidov ima eno hidroksilno skupino na vsakem

ogljikovem atomu razen na tistem, ki ima karbonilno skupino (aldehid ali keton).

Gliceraldehid obstaja v dveh stereoizomerih, kar označujeta predponi D- in L-, ki

predstavljata absolutno konfiguracijo. V naravi je gliceraldehid v konfiguraciji D- in ga

uporabljamo kot standard za določanje konfiguracije D- in L- pri drugih molekulah s

kiralnim centrom (Boyer, 2005, str. 180).

Slika 2: (a) Dihidroksiaceton, (b) D-gliceraldehid in (c) L-gliceraldehid

(Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext: http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-

chemistry/2923)

Pri tetrozah s 4 atomi ogljika poznamo dve aldozi, eritrozo in treozo ter eno ketozo,

eritrulozo. Monosaharidi s 5, 6 in 7 atomi ogljika se imenujejo pentoze, heksoze oziroma

heptoze. Tudi pri njih ločimo aldoze in ketoze. Z naraščanjem števila ogljikovih atomov

narašča tudi število moţnih stereoizomerov. Slika 3 prikazuje vse moţne stereoizomere D-

aldoz od n = 3 do n = 6. D-riboza in D-2-deoksiriboza sta najbolj razširjeni aldopentozi in

sta komponenti RNA in DNA. D-glukoza, D-manoza in D-galaktoza so najbolj razširjene

aldoheksoze. D-manoza in D-galaktoza sta epimera glukoze, saj se od D-glukoze

stereokemijsko razlikujeta samo pri enem kiralnem centru, in sicer C2 za manozo in C4 za

galaktozo. Najpomembnejša hektoheptoza je D-sedoheptuloza, ki jo prikazuje Slika 4 (a)



7

(Boyer, 2005, str. 181). Ima enako strukturo kot fruktoza, le da ima dodaten ogljikov atom.

Najdemo jo v korenju. D-manoheptulozo najdemo v avokadu (Zamora, 2011).

Slika 3: Shematski pregled D-aldoz


chemistry/2923)

Slika 4: D-sedoheptuloza in D-manoheptuloza

(Zamora, A. (2011). Carbohydrates – Chemical Structure. Prevzeto 24. april 2011 iz Scientific Psychic:

http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates.html)



8

Slika 5 prikazuje vse moţne stereoizomere D-ketoz od n = 3 do n = 6. Vse prikazane

ketoze imajo ob tistem kiralnem centru, ki je najbolj oddaljen od karbonilne skupine,

enako absolutno konfiguracijo kot D-gliceraldehid (D-GA) na C2. D-fruktoza je v naravi

najbolj razširjena ketoza (Boyer, 2005, str. 181).

Slika 5: Shematski pregled D-ketoz


chemistry/2923)

2.1.1.1 Redukcijski sladkorji

Ogljikovi hidrati vstopajo v številne oksidoredukcijske reakcije. Mnoge od njih so del

metabolične razgradnje do CO2 in H2O in so biološko pomembne, nekatere pa lahko

uporabljamo za identifikacijo in analizo ogljikovih hidratov (Boyer, 2005, str. 186).

Mnogi oksidanti, med katerimi je najbolj poznan Fehlingov reagent, se uporabljajo za

identifikacijo redukcijskih sladkorjev. Slika 6 prikazuje oksidacijo glukoze s Fehlingovim



9

reagentom. Pri vseh sladkorjih je za oksidacijo najbolj občutljiva aldehidna skupina, saj

imajo aldehidi na karbonilno skupino poleg radikala vezan še vodikov atom, medtem ko

imajo ketoni vezana le dva radikala. Redukcijski sladkorji so tisti, ki imajo prosto

aldehidno ali keto skupino. Ta skupina je reducent, zato morajo biti ti sladkorji sposobni

preiti v aciklično obliko (Boyer, 2005, str. 186).

Slika 6: Fehlingov test z glukozo

(Tausch, M. W. (brez datuma). Hydrolysis of β-Cyclodextrin and Detection of the Degradation Product. Prevzeto 24. april 2011 iz

Chemie und ihre Didaktik: http://www.chemiedidaktik.uni-wuppertal.de/disido_cy/cyen/exp/03_hydrolyse.htm)

V celici encimi za katalizacijo redukcijskih ogljikovih sladkorjev potrebujejo koencim

NADH ali NADPH. Deoksisladkorji so ena od oblik reduciranih ogljikovih hidratov. Ti

imajo vodik namesto kakšne od hidroksilnih skupin. Nastajajo v celici pri redukciji s

pomočjo NADPH in encimov oksidoreduktaze oziroma dehidrogenaze. Najpomembnejša

je 2-deoksiriboza, ki je sestavni del DNA (Boyer, 2005, str. 187).

2.1.2 Disaharidi

Disaharid saharoza je transportna oblika sladkorja v rastlinah. Čeprav je glukoza

večinoma transportni sladkor v mnogih ţivalih, so sladkorji v rastlinah pogosto

transportirani kot disaharidi. Saharoza je sestavljena iz glukoze in fruktoze (Raven in

Echhorn, 2005, str. 17). Glukoza in fruktoza vsebujeta redukcijsko aldehidno ali keto

skupino, ki je v saharozi spremenjena v alkoholno skupino ali kombinirana s podobno

skupino drugega sladkorja. Saharoza je glavna transportna oblika sladkorja najverjetneje

zato, ker je manj reaktivna kot njene redukcijske komponente (Taiz in Zeiger, 2010, str.

224). To je oblika, v kateri so sladkorji v rastlinah transportirani iz fotosintetskih celic

(primarno v listih), kjer so sintetizirani, do drugih delov rastlin. Saharoza, ki jo uţivamo

kot namizni sladkor, je komercialno pridelek iz sladkorne pese in sladkornega trsa, kjer se

kot zaloţna oblika sladkorja ne akumulira škrob, ampak kar saharoza (Raven in Echhorn,

2005, str. 17).



10

Pri sintezi disaharida iz dveh molekul monosaharida se odcepi voda in formira nova vez

med molekulama monosaharida. Kemično reakcijo, pri kateri nastane disaharid iz dveh

monosaharidov (na primer saharoza iz glukoze in fruktoze), imenujemo dehidratacijska

sinteza ali kondenzacijska reakcija. Formacija večine organskih polimerov iz njihovih

podenot je povzročena z dehidracijsko sintezo (Raven in Echhorn, 2005, str. 17).

Pri obratni reakciji, na primer, ko se disaharid razcepi na svoje monosaharidne podenote,

se doda molekula vode. Ta cepitev, ki se zgodi, kadar je disaharid uporabljen kot vir

energije, je poznana pod imenom hidroliza. Hidrolizne reakcije so energijsko potratni

procesi, ki so pomembni pri energijskemu transferu v celicah (Raven in Echhorn, 2005, str.

17). Slika 7, Slika 8 in Slika 9 prikazujejo molekularno shemo treh najpogostejših

disaharidov: saharoze, laktoze in maltoze.

Slika 7: Saharoza


chemistry/2923)

Slika 8: Laktoza


chemistry/2923)

Slika 9: Maltoza


chemistry/2923)



11

Maltoza je disaharid, zgrajen iz dveh podenot glukoznih monomerov. Prisotna je v

kalečem ţitu, koruznem sirupu in je produkt deloma hidroliziranega škroba. Je redukcijski

sladkor in jo lahko tako kot glukozo in fruktozo uporabimo kot standard za določanje

redukcijskih sladkorjev v neznanem vzorcu (Construction of maltose standard curve by

DNS method, 2010).

2.1.3 Polisaharidi

Polisaharidi so dolge linearne ali razvejane molekule z več sto ali tisoč monosaharidnimi

enotami. Razlikujemo med rezervnimi in strukturnimi polisaharidi (Bavec in sod., 2008,

str. 23).

2.1.3.1 Rezervni polisaharidi

Rastlinski škrob in ţivalski glikogen sodita med v naravi najbolj razširjene rezervne

polisaharide (Bavec in sod., 2008, str. 23). Ta dva polisaharida sta v celicah shranjena kot

citosolni delci, imenovani granule. Škrob je v kloroplastih rastlinskih celic, kjer nastaja z

uporabo energije, ki jo celica pridobi pri fotosintezi, glikogen pa najdemo v jetrih in

mišičnih celicah ţivali. Oba polisaharida imata veliko hidroksilnih skupin, zato z

vodikovimi vezmi veţeta veliko vode (Boyer, 2005, str. 193). Med rezervne polisaharide

sodita še dekstran in inulin, ker pa se ta diplomska seminarska naloga tiče rastlinskih

ogljikovih hidratov, bomo v nadaljevanju podrobneje opisali le škrob.

Škrob je primarni zaloţni polisaharid v rastlinah. Glede na količino ga prekaša samo

celuloza. Kloroplasti so mesto sinteze škroba v listih (Taiz in Zeiger, 2010, str. 225).

Zgrajen je iz verig glukoznih molekul, kar prikazuje Slika 10. Sestavljata ga dve

komponenti:

amiloza, ki je nerazvejan polimer D-glukoz, ki so povezane z α(1→4) O-

glikozidnimi vezmi, in

amilopektin, ki je razvejan polimer D-glukoz, ki so povezane z α(1→4) O-

glikozidnimi vezmi, vsakih 24–30 glukoznih enot pa še z α(1→6) O-glikozidno

vezjo.

Amiloza in amilopektin se skladiščita v obliki škrobnih zrn znotraj rastlinskih celic (Raven

in Echhorn, 2005, str. 17).



12

Slika 10: Škrob in glikogen


chemistry/2923)

V ţitu, kot so na primer pšenica, rţ in ječmen, so polimeri fruktoze, imenovani fruktani,

glavni zaloţni polisaharidi v listih in steblih. Ti polimeri so vodotopni in se lahko

skladiščijo v veliko večjih koncentracijah kot škrob (Raven in Echhorn, 2005, str. 17).

Polisaharidi morajo biti hidrolizirani v monosaharide in disaharide, preden so lahko

uporabljeni kot vir energije ali transportirani po ţivih sistemih. Rastline razcepijo svoje

škrobne rezerve, ko potrebujejo monosaharide in disaharide za svojo rast in razvoj (Raven

in Echhorn, 2005, str. 17).

2.1.3.2 Strukturni polisaharidi

Polisaharidi so prav tako pomembni strukturni gradniki. V rastlinskem svetu je najbolj

razširjen strukturni polisaharid celuloza. Je glavna strukturna komponenta lesa in

rastlinskih vlaken (Boyer, 2005, str. 196). Kar polovica vsega organskega ogljika ţivega

sveta vsebuje celulozo, kar jo uvršča med najbolj razširjene organske komponente, kar jih

poznamo. Les je na primer iz 50 % celuloze, bombaţna vlakna pa so skoraj čista celuloza

(Raven in Echhorn, 2005, str. 17). Med strukturne polisaharide sodijo še agar, hitin,

peptidoglikan, hialuronska kislina in hondroitin, več pozornosti pa bomo namenili celulozi,

ki je pomemben gradnik celičnih sten rastlinskih celic. Strukturo celuloze prikazuje

Slika 11.

Slika 11: Celuloza


chemistry/2923)



13

Celuloza je polimer, zgrajen iz monomerov glukoze, kot sta škrob in glikogen, vendar med

njimi obstaja pomembna razlika. Škrob in glikogen sta lahko takoj uporabljena kot vir

energije za skoraj vse vrste ţivečih organizmov, a le nekaj mikroorganizmov (nekateri

prokarioti, protozoi in fungi) ter le redke ţivali, kot je na primer srebrna ribica (Lepisma

saccharina), so sposobni sami hidrolizirati celulozo. Govedo, termiti in ščurki lahko

uporabijo celulozo kot vir energije le zato, ker je ta razgrajena s pomočjo

mikroorganizmov, ki ţivijo v njihovih prebavnih trakovih (Raven in Echhorn, 2005, str.

17).

Da bi razumeli razliko med strukturnimi polisaharidi, kot je celuloza, in rezervnimi

polisaharidi, kot je škrob ali glikogen, moramo ponovno pogledati zgradbo molekule

glukoze. Molekula glukoze je pravzaprav veriga šestih atomov ogljika, in kadar je v

raztopini, kot je to na primer v celici, prevzame obliko obroča. Ena oblika obroča je

poznana kot α-glukoza, druga pa kot β-glukoza. α in β obliki sta v ravnovesju z določenim

številom molekul, ki ves čas spreminjajo obliko iz ene v drugo, ter z verigo kot

posrednikom. Škrob in glikogen sta oba v celoti zgrajena iz α-glukoznih podenot, medtem

ko je celuloza v celoti zgrajena iz β-glukoznih podenot. Ta na pogled majhna razlika ima

velik učinek na tridimenzionalno strukturo molekul celuloze, ki so dolge in nerazvejane.

Kot rezultat tega je celuloza nerazgradljiva za encime, ki zlahka razgradijo škrob in

glikogen. Ko so molekule glukoze enkrat vgrajene v rastlinsko celično steno v obliki

celuloze, niso več dosegljive rastlinam kot vir energije (Raven in Echhorn, 2005, str. 18).

Molekule celuloze tvorijo fibrilni del rastlinske celične stene. Dolge, toge molekule

celuloze se veţejo v mikrofibrile. Vsaka mikrofibrila sestoji iz na stotine verig celuloze. V

celičnih stenah rastlinskih celic so celulozne mikrofibrile vgrajene v matriks, ki vsebuje še

dve drugi sestavini, hemicelulozo in pektin (Raven in Echhorn, 2005, str. 18).

Hemiceluloze so polisaharidi, ki zapolnjujejo celulozno ogrodje ter so na celulozne

mikrofibrile vezani z vodikovimi vezmi. Hemiceluloze poveţejo mikrofibrile v mreţo in

tako stabilizirajo celično steno. Pektini so zelo heterogeni, razvejeni in močno hidrirani

polisaharidi z veliko galakturonske kisline. Pektini določajo poroznost stene, zagotavljajo

nabito površino, regulirajo povezovanje med celicami v območju osrednje lamele in

delujejo kot prepoznavne molekule, ki opozorijo celico na prisotnost simbiontskih

organizmov, patogenov ali ţuţelk (Dermastia, 2007, str. 42). Zgradbo rastlinske celične

stene prikazuje Slika 12.



14

Slika 12: Zgradba rastlinske celične stene

(Sticklen, M. B. (2008). Scitable. Nature Education. Prevzeto 23. maj 2011 iz Plant genetic engineering for biofuel production: towards

affordable cellulosic ethanol. Nature Reviews Genetics 9, 433–443: http://www.nature.com/scitable/content/plant-plasma-membrane-

and-cell-wall-structure-14713218)

2.2 Sinteza ogljikovih hidratov v Calvinovem ciklu

Zelene rastline porabljajo ATP in NADPH, ki sta produkta svetlobne reakcije fotosinteze,

za pretvorbo anorganskega ogljika iz CO2 v preproste organske spojine v ogljikovih

reakcijah fotosinteze. Te nato uporabijo za sintezo glukoze, saharoze, škroba in drugih

ogljikovih hidratov. Za ogljikove reakcije fotosinteze neposredno ni potrebna svetloba,

pomembna pa sta produkta svetlobnih reakcij fotosinteze – ATP in NADPH, pri čemer

med ogljikovimi atomi nastanejo nove vezi, anorganski CO2 pa se reducira in vgradi v

novonastajajoče sladkorje aldehide in alkohole. Reakcije, ki sestavljajo te metabolične

procese, imenujemo Calvinov cikel, ki ga prikazuje Slika 13 (Boyer, 2005, str. 478).



15

Slika 13: Calvinov cikel

(Cellular Processes. Step 2: Calvin Cycle. (brez datuma). Prevzeto 23. maj 2011 iz Cellupedia:

http://library.thinkquest.org/C004535/calvin_cycle.html)

3-fosfoglicerat (3P-GA) nastaja v reakciji, ki jo katalizira encim ribuloza-1,5-bifosfat-

karboksilaza/oksigenaza (RuBisCO). Encim katalizira adicijo CO2 na ribuloza-1,5-

bifosfatu in s tem omogoči vezavo anorganskega ogljika v organske molekule. Nastane

nestabilni intermediat s šestimi ogljikovimi atomi, ki razpade na dve molekuli 3-

fosfoglicerata, spojine s tremi ogljikovimi atomi. To fazo Calvinovega cikla imenujemo

faza karboksilacije (Boyer, 2005, str. 478–479).

Druga faza Calvinovega cikla se imenuje faza redukcije. 3-fosfoglicerat, ki nastaja v stromi

kloroplastov, se v metabolični poti, ki je podobna obratni poti glikolize, porabi za sintezo

glukoze. Pri fosforilaciji karboksilne skupine (C1) 3-fosfoglicerata nastane 1,3-



16

bifosfatglicerat (1,3-P-GA). Ta se reducira z reakcijo, ki jo katalizira encim gliceraldehid-

3-fosfat-dehidrogenaza (GA-3-P-dehidrogenaza), ki potrebuje koencim NADPH. Ta

koencim je v analogni reakciji pri glukogenezi, ki poteka v citosolu, NADH. Nastane

gliceraldehid-3-fosfat (GA-3-P) (Boyer, 2005, str. 479).

Sinteza ogljikovih hidratov iz gliceraldehid-3-fosfata poteka tako kot pri glukogenezi. Med

ogljikovimi hidrati, ki jih sintetizirajo rastline, so pomembnejši monosaharida glukoza in

fruktoza, disaharid saharoza, rezervni polisaharid škrob in strukturni polisaharid celuloza.

Glukoza in fruktoza nastajata kot fosforilirana derivata glukoza-1-fosfat (G-1-P) ali

glukoza-6-fosfat (G-6-P) in fruktoza-6-fosfat (F-6-P). Fosforilirani monosaharidi se

porabijo za sintezo disaharida saharoze ali za sintezo škroba. Saharoza nastane iz UDP-

glukoze in fruktoza-6-fosfata. Večina saharoze nastaja v citosolu rastlinskih celic iz DHA-

P, ki se v citosol prenese iz strome kloroplastov. Škrob se sintetizira s postopnim

dodajanjem aktivirane glukoze (ADP-glukoza) na ţe obstoječe polisaharidne verige škroba

(Boyer, 2005, str. 480).

Calvinov cikel se zaključi v zadnji vazi regeneracije ribuloze-1,5-bifosfata. Da

nadomestimo šest ogljikovih atomov, ki so se porabili za sintezo ene molekule glukoze, se

mora Calvinov cikel šestkrat ponoviti. Pri tem v cikel vsakokrat vstopi nova molekula

CO2. Za vsako molekulo CO2, ki se vgradi v ogljikov hidrat, se porabijo tri molekule ATP

in dve molekuli NADPH. Le dve od dvanajstih molekul gliceraldehid-3-fosfata zapustita

ciklus in se porabita za sintezo nove molekule glukoze. Preostalih deset molekul

gliceraldehid-3-fosfata pa se v seriji reakcij porabi za regeneracijo šestih molekul ribuloza-

1,5-bifosfata. V reakciji transketolacija pride do prenosa enote z dvema ogljikovima atoma

s ketoze na aldozo. Tako nastane nova aldoza in ketoza (Boyer, 2005, str. 480).

Vse reakcije Calvinovega cikla lahko zapišemo v obliki spodnje enačbe (Boyer, 2005, str.

481):

6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP + 12 H2O C6H12O6 + 12 NADP

+ + 18 ADP + 18 Pi



17

2.3 Spektrometrija

Vse metode, ki nam dajo določene odgovore o kvaliteti in kvantiteti izoliranih molekul in

njihovih lastnostih, navadno prištevamo med fizikalnoanalitske metode. Te metode so

različne vrste kromatografije, elektroforeze in spektrometrije (Turk in sod., 1997, str. 68).

Spektrometrija izkorišča razliko v optičnih lastnostih molekul v različnih področjih

elektromagnetnega spektra. Med te metode uvrščamo (Turk in sod., 1997, str. 68):

ultravijolično (UV) spektrometrijo,

vizualno (VIS) spektrometrijo (kolorimetrijo),

infrardečo (IR) spektrometrijo,

ramensko spektrometrijo,

cirkularni dikroizem (CD) in optično rotacijsko disperzijo (ORD),

fluorescenco.

Najbolj uporabni in razširjeni med njimi sta UV in VIS spektrometriji, s katerima merimo

absorpcijo svetlobe neke čiste snovi v področju ultravijoličnega in vidnega dela

svetlobnega spektra (Sepčić, 2004, str. 59).

Pojav same absorpcije temelji na dejstvu, da molekule absorbirajo svetlobo, kar pa je

odvisno od njihove strukture in okolja, ki jih obdaja (Anderluh in sod., 2009, str. 93).

2.3.1 Elektromagnetno valovanje

Svetlobo lahko opišemo kot elektromagnetno valovanje. Ti elektromagnetni valovi se

sinusno širijo skozi prostor. Kadar tako valovanje zadene ob molekulo, se svetloba odkloni

ali absorbira (Anderluh in sod., 2009, str. 93). Slika 14 prikazuje spekter

elektromagnetnega valovanja.



18

Slika 14: Spekter elektromagnetnega valovanja

(Sašo. (24. oktober 2004). Kvarkadabra. Časopis za tolmačenje znanosti. Prevzeto 24. maj 2011 iz Spekter elektromagnetnega

valovanja: http://www.kvarkadabra.net/mediagallery/popup.php?s=20060326214527911&sort=0)

Frekvenca elektromagnetnega valovanja (ν) je v relaciji z njegovo valovno dolţino (λ) in s

hitrostjo svetlobe (c) (Pingoud in sod., 2002, str. 239):

kjer je:

λ valovna dolţina (cm),

c hitrost svetlobe (3 · 1010

cm/s),

ν frekvenca (št./s ali Hz).

Človeško oko lahko zazna svetlobo v razmeroma kratkem obsegu valovnih dolţin, in sicer

med 400 nm in 800 nm. Energija valovanja enega fotona je podana z enačbo (Pingoud in

sod., 2002, str. 240):

ki jo v skladu z enačbo



19

preuredimo in dobimo:

kjer je:

h Planckova konstanta (6,6 · 10-34

Js),

c svetlobna hitrost (3,0 · 108 m/s),

λ valovna dolţina (nm).

Iz tega je razvidno, da ima svetloba s krajšo valovno dolţino večjo energijo od svetlobe z

daljšo valovno dolţino.

Hmelak Gorenjakova (2010, str. 43) navaja: »Osnova spektrometrične metode je, da vzorec

raztopine absorbira elektromagnetno valovanje iz izvora energije.« Količina absorbirane

energije je sorazmerna koncentraciji snovi v raztopini (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 43).

2.3.2 Kvantitativno vrednotenje

Del svetlobnega valovanja, ki ga absorbira neka snov v raztopini, lahko poveţemo s

koncentracijo te snovi v raztopini (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 46). Na podlagi teh

zakonitosti lahko s pomočjo spektrometra kvantitativno določimo koncentracijo snovi v

raztopini. Raztopina mora biti pri tem popolnoma bistra.

Skozi kiveto, v kateri imamo neko raztopino, vodimo svetlobo točno določene valovne

dolţine z intenziteto I0. Del te svetlobe se bo v raztopini absorbiral, del pa preseval skozi

kiveto. Slepi vzorec pripravimo zato, da umerimo intenziteto vhodnega ţarka (I0), saj pri

prehodu svetlobe skozi raztopino prihaja poleg absorpcije svetlobe še do drugih fizikalnih

pojavov (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 46).

Če presvetlimo raztopino določene snovi z monokromatsko svetlobo intenzitete I0 in če

snov svetlobo absorbira, bo imela prepuščena svetloba manjšo intenziteto I (glej Sliko 15),

to razmerje med intenzitetama prepuščene in vpadne svetlobe pa imenujemo transmitanca

(T) (Anderluh in sod., 2009, str. 94).



20

Slika 15: Prehajanje svetlobe skozi kiveto

(Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 6. junij 2011 iz Plant Physiology:

http://5e.plantphys.net/image.php?id=70)

Transmitanca je torej del svetlobe, prepuščene skozi homogeni vzorec. Enaka je razmerju

med intenziteto izhodnega ţarka oziroma intenziteto vpadne svetlobe (I) in intenziteto

vhodnega ţarka oziroma intenziteto prepuščene svetlobe (I0) (Hmelak Gorenjak, 2010, str.

46):

kjer je:

T transmitanca,

I intenziteta izhodnega ţarka,

I0 intenziteta vhodnega ţarka,

k konstanta,

l dolţina poti svetlobe v raztopini.

To enačbo lahko v logaritemski obliki zapišemo kot:

( )

Leta 1852 sta Beer in Bernard ugotovila, da tudi ob upoštevanju koncentracije (c) velja

podobna odvisnost. Beerov zakon opisuje povezavo transmitance s koncentracijo raztopine

in dolţino poti (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47):



21

( )

Eksponentno zvezo lahko z logaritmiranjem in uvedbo pojma absorbance (A)

pretvorimo v linearno obliko (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47). Dobljeno zvezo

imenujemo Beer-Lambertov zakon, ki opisuje zvezo med absorbanco in koncentracijo

snovi v kiveti. Pravi, da je velikost absorbance (A) premo sorazmerna s koncentracijo snovi

(c), dolţino optične poti svetlobnega ţarka (l) in molarnim ekstinkcijskim koeficientom (ε),

ki je značilen za določeno snov (Anderluh in sod., 2009, str. 94).

Absorbanca je brez enote. Dolţina optične poti (l), ki jo merimo v cm, in molarni

ekstinkcijski koeficient (ε) [cmˉ1 molˉ

1 L] sta pri določanju koncentracije neke snovi

konstantna (Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47).

Absorbanca je s transmitanco povezana:

Če ţelimo izmeriti koncentracijo neke snovi v raztopini, moramo prej pripraviti standardne

raztopine, narisati umeritveno krivuljo in iz nje odčitati koncentracijo snovi, saj nam

podatek o absorbanci neke snovi v vzorčni raztopini še ne da podatka o njeni koncentraciji

(Hmelak Gorenjak, 2010, str. 47).

Slika 16 prikazuje shemo spektrofotometra. Njegove komponente so vir svetlobe,

monokromator s prizmo, s katerim izbiramo valovno dolţino, nosilec za vzorec,

fotodetektor in snemalnik ali računalnik. Valovno dolţino svetlobe spreminjamo z

obračanjem prizme v monokromatorju. Graf absorbance (A) v odvisnosti od valovne

dolţine (λ) imenujemo spekter (Taiz in Zeiger, 2010, str. 166).



22

Slika 16: Shematski prikaz spektrofotometra

(Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 7. junij 2011 iz Plant Physiology:

http://5e.plantphys.net/image.php?id=71)



23

3 MATERIAL IN METODE

Predmet raziskave v tej diplomski seminarski nalogi je določanje redukcijskih sladkorjev v

rastlinskem tkivu. Z omenjeno metodo smo ţeleli kvantitativno določiti količino

redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu. Ker je ta metoda nestandardna, deloma

improvizirana in pravzaprav temelj obravnave v tem delu, smo natančno napisali protokol

same izvedbe od materialov do rezultatov, tako da je to razumljivo tako dijakom in

študentom, ki imajo s to temo neposreden stik, kot tudi ostalim, ki bi jih stvar zanimala in

bi ţeleli metodo tudi sami preizkusiti. Metode od pridobivanja materiala do raziskovalnih

tehnik so tekom tega poglavja natančno opredeljene.

Klasična in najbolj uporabljana je Nelson-Somogyijeva metoda. Pri tej metodi redukcijski

sladkorji, ki jih segrevamo z alkaličnim bakrovim tartratom, reducirajo baker v bakrov

oksid. Posledica delovanja arzenmolibdenove kisline na bakrov oksid je redukcija

molibdenove kisline v molibden, ki je modre barve. Modro barvo nato primerjamo s

standardi raztopin v kolorimetru pri 620 nm (Sadasivam in Manickam, 2007, str. 5).

Alternativa Nelson-Somogyijevi metodi za kvantitativno oceno redukcijskih sladkorjev je

metoda z reagentom 3,5-dinitrosalicilne kisline (DNS reagentom), ki je preprosta,

občutljiva in sprejemljiva ter primerna za obdelavo večjega števila vzorcev v danem času

(Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6), zato smo se odločili, da vpeljemo to metodo.

3.1 Kvantitativna ocena redukcijskih sladkorjev po metodi z DNS reagentom

(3,5-dinitrosalicilno kislino)

3.1.1 Priprava na izvedbo metode in varnostni ukrepi

Pred vsakim preizkusom se je nanj treba dobro pripraviti in se seznaniti z varnostnimi

ukrepi. V prilogi so zato priloţena navodila za varno delo z napravami, ki jih bomo

uporabili tekom preizkusa te metode, in sicer Navodilo za varno delo z analitsko tehtnico

(glej Prilogo A), Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto (glej Prilogo B) in Navodilo

za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis (glej Prilogo C). Obvezen del laboratorijske

opreme so zaščitne rokavice in zaščitna halja.

Ker je ta metoda zelo natančna in občutljiva, je treba steklovino, pipete, tipse in ostali

pribor po koncu vsakega preizkusa dobro očistiti z detergentom, ga dobro sprati z vodo,



24

nazadnje pa tudi splakniti z destilirano vodo. Prav tako ne smemo pozabiti na čiščenje

delovne površine.

Na koncu preizkusa metode vse uporabljene raztopine zlijemo v posodo za posebne

odpadke, saj so nekatere izmed njih strupene in škodujejo okolju.

3.1.2 Material

Analizirani vzorec:

trava,

mesnati luskolisti čebule.

Pripomočki:

spektrofotometer SpectroVis (Vernier),

program LoggerPro3,

računalnik,

kivete,

vata,

puhalka z destilirano vodo,

1000 ml čaša za odpadno tekočino,

epruvete,

stojalo za epruvete,

pipete,

tipsi,

erlenmajerice s pokrovčki,

čaše,

lij,

filtrirni papir,

terilnica s pestilom,

noţek,

podlaga za rezanje,

vodna kopel (1000 ml čaša napolnjena z vodo do oznake 500 ml),

kuhalnik,

analitska tehtnica,



25

steklene palčke,

dozirne ţličke,

papirnate brisače,

alkoholni flomaster.

Kemikalije:

destilirana voda (H2O),

glukoza v prahu (C6H12O6),

fruktoza v prahu (C6H12O6),

3,5-dinitrosalicilna kislina (C7H4N2O7) (draţilno, Xi, Irritant),

natrijev hidroksid (NaOH) (strupeno, T, Toxic), (jedko, C, Corrosive),

kristalni fenol (C6H5OH) (strupeno, T, Toxic), (jedko, C, Corrosive),

natrijev sulfit (Na2O3S),

kalij-natrijev tartrat (C4H4KNaO6*4H2O).

3.1.3 Postopek

3.1.3.1 Priprava DNS reagenta (reagenta iz 3,5-dinitrosalicilne kisline)

V prvo 50 ml čašo natehtamo 1 g 3,5-dinitrosalicilne kisline, v drugo 200 mg

kristalnega fenola in v tretjo 50 mg natrijevega sulfita. Z alkoholnim flomastrom na

čaše napišemo njihovo vsebino. V 100 ml čašo natehtamo 1 g natrijevega

hidroksida in dopolnimo z destilirano vodo do oznake 100 ml. Dobro premešamo.

Tako dobimo 1% raztopino NaOH. Nekaj te raztopine vlijemo v čaše, v katere smo

prej natehtali kemikalije, in dobro premešamo. Raztopine iz vseh treh čaš vlijemo v

100 ml bučko. Vse tri čaše splaknemo z 1% raztopino NaOH in vse skupaj

prelijemo v 100 ml bučko. Preostanek 1% raztopine NaOH prelijemo v 100 ml

bučko. Bučko označimo z nalepko, na katero napišemo DNS reagent in datum.

Raztopino hranimo pri temperaturi 4 °C. V primeru daljšega hranjenja raztopine

lahko natrijev sulfit dodamo, ko bomo raztopino uporabili, saj natrijev sulfit ob

dolgem hranjenju poslabša kakovost reagenta (Sadasivam in Manickam, 2007, str.

6).

40% raztopino Rochellejeve soli (kalij-natrijevega tartrata) pripravimo tako, da v

50 ml čašo natehtamo 20 g kalij-natrijevega tartrata, dopolnimo z destilirano vodo

do oznake 50 ml in dobro premešamo. Raztopino hranimo v 50 ml bučki, ki jo

označimo z nalepko, na katero napišemo 40% Rochellejeva sol in datum



26

(Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6). Preglednica 1 prikazuje natančna razmerja

kemikalij za pripravo DNS reagenta in Rochellejeve soli.

Preglednica 1: Priprava DNS reagenta

Kemikalije Količina

1% raztopina

NaOH

natrijev hidroksid 1 g

destilirana voda do oznake 100 ml

3,5-dinitrosalicilna kislina 1 g

kristalni fenol 200 mg

natrijev sulfit 50 mg

40% raztopina

Rochellejeve soli

kalij-natrijev tartrat 20 g

destilirana voda do oznake 50 ml

(Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec 2011 iz New Age International:

http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf)

Rochellejeva sol, ki je sestavni del DNS reagenta, ovira proaktivno delovanje sulfita,

vendar je nujno potrebna za obstojnost barve. Iz tega razloga jo dodamo mešanici

redukcijskih sladkorjev in DNS reagenta šele po tem, ko se razvije barva po tretiranju v

vreli vodni kopeli. Rochellejeva sol prepreči nastajanje reagenta iz raztopljenega kisika.

Fenol poveča intenziteto nastale barve, najboljši učinek pa ima pri 0,2% koncentraciji.

Natrijev sulfit najučinkoviteje stabilizira barvo, pridobljeno s pomočjo fenola, pri 0,05%

koncentraciji. Dinitrosalicilna kislina najbolje reducira glukozo pri 1% koncentraciji, za

kar pa je potrebno bazično okolje, ki ga dobimo z 1% raztopino natrijevega hidroksida

(Lorenz Miller, 1959, str. 426).

3.1.3.2 Priprava umeritvene krivulje

S pomočjo umeritvene krivulje lahko ocenimo koncentracijo redukcijskih sladkorjev v

nekem vzorcu. Umeritvene krivulje za glukozo in fruktozo (lahko tudi za maltozo)

naredimo s pomočjo 3,5-dinitrosalicilne kisline, iz katere je DNS reagent. Glukoza,

fruktoza ali maltoza reducirajo rumeno obarvano alkalno 3,5-dinitrosalicilno kislino v

oranţno do rdeče obarvano 3-amino-5-nitrosalicilno kislino. Intenziteta barve je odvisna

od koncentracije redukcijskih sladkorjev v raztopini (Construction of maltose standard

curve by DNS method, 2010). Razliko v intenzivnosti barve izmerimo s

spektrofotometrom pri valovni dolţini 512 nm. Različni avtorji navajajo različne valovne



27

dolţine, pri katerih naj bi merili absorbanco vzorcev. Večina jih navaja valovno dolţino

540 nm, ker pa smo mi pripravo DNS reagenta povzeli po Sadasivam in Manickam (2007,

str. 6), smo upoštevali njuno navedbo 510 nm, ki smo jo zaradi laţjega odčitavanja

spremenili na 512 nm. Vernierjev program LogerPro pri meritvah s spektrofotometrom

SpectroVis rezultate merjenja poda v obliki tabele in grafa (glej Prilogo D, E in F). Tabela

prikazuje absorbance, odčitane pri valovnih dolţinah 507,5 nm, 512 nm, 515 nm, 518,1

nm, ne pa tudi pri 510 nm. To bi sicer lahko odčitali iz grafa, vendar smo se zaradi

velikega števila meritev in manjše moţnosti za napako pri odčitavanju odločili, da

odčitamo absorbanco pri valovni dolţini 512 nm. To je tudi območje, kjer se oranţno-

rdeča barva absorbira. Serijo standardnih raztopin glukoze in fruktoze v epruvetah z znano

količino DNS reagenta 5 min segrevamo v vreli vodni kopeli, nato pa s spektrofotometrom

izmerimo njihovo absorbanco. Na koncu izdelamo umeritveno krivuljo za glukozo in za

fruktozo, kjer na osi x navedemo podatke za masno koncentracijo glukoze oziroma

fruktoze v mg/ml, na osi y pa podatke za absorbanco v nm.

Osnovna standardna raztopina glukoze (1 mg/ml)

V 100 ml merilno bučko natehtamo 100 mg glukoze in z destilirano vodo dopolnimo do

oznake 100 ml. Dobro premešamo (Gros in sod., 2010).

Osnovna standardna raztopina fruktoze (1 mg/ml)

V 100 ml merilno bučko natehtamo 100 mg fruktoze in z destilirano vodo dopolnimo do

oznake 100 ml. Dobro premešamo.

Priprava standardnih raztopin glukoze

Pripravimo 8 erlenmajeric z volumnom 100 ml in jih označimo s črkami od Ag do Hg. V

vsako erlenmajerico odpipetiramo drugo količino raztopine glukoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0,

8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml. Vseh 8 erlenmajeric z destilirano vodo dopolnimo do

oznake 50 ml in dobro pretresemo. Dobimo raztopine glukoze z masnimi koncentracijami

0,04 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,16 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,24 mg/ml, 0,28 ml/mg in

0,32 mg/ml. Preglednica 2 prikazuje razmerja raztopin za pripravo standardnih raztopin

glukoze (Gros in sod., 2010).



28

Preglednica 2: Priprava standardnih raztopin glukoze

Erlenmajerica Ag Bg Cg Dg Eg Fg Gg Hg

Volumen osnovne standardne

raztopine glukoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0

Masna koncentracija glukoze γg.r.

(mg/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32

(Gros, N., Harrison, T., Štrumbelj Drusany, I. in Kapun Dolinar, A. (3. avgust 2010). Science In School. Prevzeto 30. marec 2011 iz

Spektrometrija v šoli: eksperimenti z izkustvenim pristopom: http://www.scienceinschool.org/2010/issue14/spectrometer/slovene)

Priprava standardnih raztopin fruktoze

Pripravimo 8 erlenmajeric z volumnom 100 ml in jih označimo s črkami od Af do Hf. V

vsako erlenmajerico odpipetiramo drugo količino raztopine fruktoze, in sicer 2,0, 4,0, 6,0,

8,0, 10,0, 12,0 14,0 in 16,0 ml. Vseh 8 erlenmajeric z destilirano vodo dopolnimo do

oznake 50 ml in dobro pretresemo. Dobimo raztopine fruktoze z masnimi koncentracijami

0,04 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,16 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,24 mg/ml, 0,28 ml/mg in

0,32 mg/ml. Preglednica 3 prikazuje razmerja raztopin za pripravo standardnih raztopin

fruktoze.

Preglednica 3: Priprava standardnih raztopin fruktoze

Erlenmajerica Af Bf Cf Df Ef Ff Gf Hf

Volumen osnovne standardne

raztopine fruktoze (ml) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

Volumen destilirane vode (ml) 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0 38,0 36,0 34,0

Masna koncentracija fruktoze γf.r.

(mg/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32

Priprava raztopin glukoze za merjenje s spektrofotometrom SpectroVis

V slepo epruveto nalijemo 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete,

označene s številkami od 1g do 8g, dodamo 3 ml ustrezne standardne raztopine glukoze in 3

ml DNS reagenta. Vse epruvete damo za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladimo,

da so še vedno tople, ter dodamo v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro

pretresemo. V vse epruvete dodamo še 3 ml destilirane vode, jih pretresemo in ohladimo

na sobno temperaturo. Preglednica 4 prikazuje razmerja raztopin za pripravo umeritvene

krivulje za glukozo (Sadasivam in Manickam, 2007, str. 6).



29

Preglednica 4: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za glukozo

Epruveta Slepag 1g 2g 3g 4g 5g 6g 7g 8g

Standardna raztopina

glukoze (merilna bučka) / A B C D E F G H


glukoze (ml)

3,0 ml

destilirane

vode!

3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Raztopina Rochellejeve

soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Destilirana voda (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

(Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec 2011 iz New Age International:

http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf)

Priprava raztopin fruktoze za merjenje s spektrofotometrom SpectroVis

V slepo epruveto nalijemo 3 ml destilirane vode in 3 ml DNS reagenta. V ostale epruvete,

označene s številkami od 1f do 8f, dodamo 3 ml ustrezne standardne raztopine fruktoze in 3

ml DNS reagenta. Vse epruvete damo za 5 min v vrelo vodno kopel, nato pa jih ohladimo,

da so še vedno tople, ter dodamo v vsako po 1 ml Rochellejeve soli. Epruvete dobro

pretresemo. V vse epruvete dodamo še 3 ml destilirane vode, jih pretresemo in ohladimo

na sobno temperaturo. Preglednica 5 prikazuje razmerja raztopin za pripravo umeritvene

krivulje za fruktozo.



30

Preglednica 5: Priprava raztopin za umeritveno krivuljo za fruktozo

Epruveta Slepaf 1f 2f 3f 4f 5f 6f 7f 8f


fruktoze (merilna bučka) / A B C D E F G H


fruktoze (ml)

3,0 ml

destilirane

vode!

3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

DNS reagent (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Raztopina Rochellejeve

soli (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Destilirana voda (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Merjenje absorbance s spektrofotometrom SpectroVis

S spektrofotometrom SpectroVis izmerimo absorbanco raztopine v vsaki epruveti posebej

pri valovni dolţini 512 nm (A512).

Priključitev naprave SpectroVis na računalnik: napravo SpectroVis, ki jo

prikazuje Slika 17, poveţemo z računalnikom.

Slika 17: SpectroVis

(SpectroVis Spectrophotometer. (2008). Prevzeto 22. maj 2011 iz The Caliper. Vernier: Measure. Analyze. Learn:

http://www.vernier.com/caliper/spring08/svis.html)

Zaženemo program LoggerPro: z dvojnim klikom na ikono zaţenemo program

LoggerPro.

Umeritev SpectroVisa: kiveto napolnimo do ¾ z destilirano vodo in jo postavimo v

nosilec za kivete SpectroVis. V programu LoggerPro kliknemo jeziček Experiment (glej

Sliko 18) in nato Calibrate ter Spectrometer: 1 (glej Sliko 19). Nato počakamo, da steče

kalibracija. Potem kliknemo gumb Finish Calibration (glej Sliko 21). Ko je kalibracija

končana, kliknemo gumb OK, kot prikazuje Slika 22 (Vernier, 2008, str. 1).



31

Slika 18: Program LoggerPro – Experiment

Slika 19: Program LoggerPro – Calibrate – Spectrometer: 1



32

Slika 20: Program LoggerPro – Calibrate Spectrometer

Slika 21: Program LoggerPro – Finish Calibration



33

Slika 22: Program LoggerPro – OK

Merjenje absorbance: kiveto napolnimo do ¾ z vzorčno raztopino in jo vstavimo

v nosilec za kivete v SpectroVis. Kliknemo Collect, kot prikazuje Slika 23, in po

pribliţno 5 sekundah kliknemo Stop, kot prikazuje Slika 24. S klikom na desni

gumb miške se nam odpre pogovorno okno, kjer kliknemo na Graf Options, kot

prikazuje Slika 25. Odpre se pogovorno okno Graph Options, kjer kliknemo na

jeziček Axes Options, kot prikazuje Slika 26. V okvirčku Y – Axis pri okenčku Top

vtipkamo 2,500 in shranimo nastavitve s klikom na Done. Tako smo os y

prilagodili našim meritvam. Ko ţelimo opraviti novo meritev, kliknemo Collect in

odpre se pogovorno okno Erase Data?. Kliknemo Erase and Continue (glej Sliko

27) in nadaljujemo z zbiranjem novih podatkov. Grafe sproti shranjujemo. To

naredimo za vse standardne raztopine glukoze in fruktoze ter odčitamo absorbanco

pri valovni dolţini 512 nm (A512) (Vernier, 2008, str. 4–6). Opozorilo: Na začetku

meritev s spektrofotometrom SpectroVis opravimo dve poskusni meritvi, da se

naprava ogreje, sicer lahko dobimo napačne rezultate.



34

Slika 23: Zbiranje podatkov – Collect

Slika 24: Ustavitev zbiranja podatkov – Stop Collection



35

Slika 25: Možnosti grafa – Graph Options

Slika 26: Možnosti osi – Axes Options



36

Slika 27: Zbriši in nadaljuj – Erase and Continue

Priprava umeritvene krivulje: pripravimo umeritveno krivuljo – glukozno

specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije glukoze in fruktozno

specifično absorbanco v odvisnosti od koncentracije fruktoze.

3.1.3.3 Priprava ekstrakta iz rastlinskega materiala

Natehtamo 1 g trave in jo ob dodajanju destilirane vode stremo v terilnici. Ekstrakt

prefiltriramo v 100 ml čašo. Čašo napolnimo z destilirano vodo do oznake 100 ml in jo

označimo. Enako naredimo za mesnate luskoliste čebule, le da jih natehtamo 0,100 g, saj

čebula vsebuje mnogo več sladkorja kot trava.

Merjenje absorbance vzorcev s spektrofotometrom SpectroVis

V eno epruveto odpipetiramo 3 ml ekstrakta trave, v drugo pa 3 ml ekstrakta mesnatih

luskolistov čebule. V obe epruveti dodamo 3 ml DNS reagenta. Epruveti 5 min segrevamo

v vreli vodni kopeli in ju nato ohladimo pod tekočo vodo iz pipe, tako da sta še vedno

topli. V obe epruveti dodamo 1 ml Rochellejeve soli ter ju dobro pretresemo. Dodamo še 3

ml destilirane vode in epruveti pretresemo. Epruveti ohladimo na sobno temperaturo in



37

izmerimo absorbanco pri valovni dolţini 512 nm (A512) (Sadasivam in Manickam, 2007,

str. 6).

Račun

S kriţnim računom izračunamo koncentracijo glukoze in fruktoze, prisotne v obeh vzorcih,

z uporabo standardnega grafa.



38

4 REZULTATI

4.1 Rezultati preizkusa metode

Pri kvantitativnem določanju redukcijskih sladkorjev v rastlinskem tkivu smo se

osredotočili na determinacijo koncentracije glukoze in fruktoze v travi in čebuli. Da smo

lahko določili koncentracijo redukcijskih sladkorjev v vzorcu trave in čebule, smo morali

najprej narediti umeritveni krivulji različnih masnih koncentracij glukoze in fruktoze. Ker

ima čebula veliko več sladkorja kot trava, smo se odločili, da naredimo ekstrakt iz 1 g trave

in iz 0,1 grama čebule, sicer bi morali narediti bistveno obseţnejši umeritveni krivulji.

Posameznim vzorcem z različnimi masnimi koncentracijami glukoze in fruktoze smo po

dodanem DNS reagentu in tretiranju v vreli vodni kopeli s spektrofotometrom SpectroVis

izmerili absorbanco. Zaradi ţelje po natančnosti smo naredili po tri serije meritev in

izračunali povprečno absorbanco, rezultate meritev pa smo prikazali v Preglednici 6 in 7.

Preglednica 6: Absorbance različnih masnih koncentracij glukoze

Masna

koncentracija

glukoze γg.r.

(mg/ml)

Absorbanca (A) Glukozno

specifična

absorbanca

(A – Aslepa)

1. meritev 2. meritev 3. meritev

Povprečna

absorbanca

(Ā)

0,00 0,551 0,527 0,524 0,526 0,000

0,04 0,537 0,528 0,527 0,528 0,002

0,08 0,538 0,532 0,528 0,533 0,007

0,12 0,648 0,641 0,636 0,642 0,116

0,16 0,765 0,763 0,757 0,762 0,236

0,20 0,892 0,889 0,882 0,888 0,362

0,24 0,981 0,971 0,971 0,974 0,448

0,28 1,007 1,069 1,082 1,053 0,527

0,34 1,117 1,123 1,116 1,119 0,593



39

Preglednica 7: Absorbance različnih masnih koncentracij fruktoze

Masna

koncentracija

fruktoze γf.r.

(mg/ml)

Absorbanca (A) Fruktozno

specifična

absorbanca

(A – Aslepa)

1. meritev 2. meritev 3. meritev

Povprečna

absorbanca

(Ā)

0,00 0,505 0,501 0,501 0,502 0,000

0,04 0,505 0,505 0,505 0,505 0,003

0,08 0,492 0,509 0,509 0,503 0,001

0,12 0,585 0,584 0,583 0,584 0,082

0,16 0,704 0,725 0,730 0,720 0,218

0,20 0,832 0,816 0,820 0,823 0,321

0,24 0,952 0,944 0,945 0,947 0,445

0,28 1,097 1,083 1,083 1,088 0,586

0,32 1,187 1,172 1,181 1,180 0,678

Po opravljenih meritvah smo v obliki grafa v MS Excelu izdelali umeritveni krivulji za

glukozo in fruktozo. Na abscisni osi so v mg/ml prikazane vrednosti masnih koncentracij

glukoze oziroma fruktoze, na ordinatni osi pa so prikazane vrednosti glukozno oziroma

fruktozno specifičnih absorbanc, ki smo jih izračunali tako, da smo povprečno absorbanco

vzorca z masno koncentracijo glukoze oziroma fruktoze 0,00 mg/ml odšteli od povprečnih

absorbanc vseh ostalih vzorcev različnih masnih koncentracij. Slika 28 in Slika 29

prikazujeta umeritveno krivuljo za glukozo in umeritveno krivuljo za fruktozo. Tako smo

dobili podatke, na podlagi katerih smo lahko določili koncentracijo glukoze in fruktoze v

travi in čebuli.



40

Slika 28: Umeritvena krivulja za glukozo

Slika 29: Umeritvena krivulja za fruktozo

Po izdelavi umeritvenih krivulj smo izmerili še absorbanco vzorca trave in čebule.

Rezultati so prikazani v Preglednici 8. Iz umeritvenih krivulj smo odčitali koncentracijo

glukoze oziroma fruktoze v mg/ml glede na izračunano glukozno oziroma fruktozno

specifično absorbanco obeh vzorcev. Sledil je izračun koncentracije glukoze in fruktoze v

1 g trave in v 1 g čebule. Izračun smo izvedli po sklepnem računu, znani podatki pa so bili

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28 0,32

Glu

ko

zno

sp

ecif

ičn

a a

bso

rba

nca

(A

– A

slep

a)

Koncentracija glukoze (mg/mL)

Glukozno specifična absorbanca v odvisnosti od masne

koncentracije glukoze

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28 0,32

Glu

ko

zno

sp

ecif

ičn

a a

bso

rba

nca

(A

– A

slep

a)

Koncentracija fruktoze (mg/mL)

Glukozno specifična absorbanca v odvisnosti od masne

koncentracije fruktoze



41

1 g vzorec trave, 0,1 g vzorec čebule in koncentracija glukoze oziroma fruktoze v mg/ml.

Postopek računanja prikazujejo izračuni (1), (2), (3) in (4).

Preglednica 8: Rezultati vzorcev

Vzorec

Absorbanca (A) Glukozno

specifična

absorbanca

(A – Aslepa)

Fruktozno

specifična

absorbanca

(A – Aslepa)

1.

meritev

2.

meritev

3.

meritev

Povprečna

absorbanca

(Ā)

Trava 0,627 0,671 0,678 0,659 0,133 0,157

Čebula 0,548 0,551 0,546 0,548 0,022 0,046

Izračuni

(1) Koncentracija glukoze v 1 g trave (2) Koncentracija fruktoze v 1 g trave

0,13 mg/ml … 1 g 0,12 mg/ml … 1 g

X … 1 g X … 1 g

X =

X =

X = 0,13 mg/ml X = 0,12 mg/ml

(3) Koncentracija glukoze v 1 g čebule (4) Koncentracija fruktoze v 1 g čebule

0,09 mg/ml … 0,1 g 0,10 mg/ml … 0,1 g

X … 1 g X … 1 g

X =

X =

X = 0,90 mg/ml X = 1,00 mg/ml



42

4.2 Rezultati anketnega vprašalnika

Namen te diplomske seminarske naloge ni bil samo poiskati ustrezno metodo za

kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev in jo dodelati, temveč jo tudi preizkusiti in

evalvirati skupaj s študenti 4. letnika študijske smeri Biologija in … ter s študenti 3. letnika

študijske smeri Ekologija z naravovarstvom pri laboratorijskih vajah predmeta

Fitofiziologija. Pri izvedbi in evalvaciji metode je sodelovalo 10 študentov. Za potrebe

evalvacije izbrane metode smo sodelujoče študente anketirali in naredili analizo anketnih

rezultatov. Anketni vprašalnik se nahaja v Prilogi G. V tem poglavju so predstavljeni le

tisti rezultati, ki jih je bilo smiselno prikazati v obliki grafa, ostali pa so komentirani v

naslednjem poglavju. Slike 30, 31, 32 in 33 podajajo odgovore anketirancev v obliki

grafičnega prikaza. Rezultati anketnega vprašalnika so sluţili kot pomoč pri objektivni

evalvaciji izbrane metode. Analiza rezultatov je podana v naslednjem poglavju.

Slika 30: Odgovori anketirancev na 7. točko: "Metoda mi je pripomogla k lažjemu razumevanju snovi."

40%

50%

0% 10%

0%

Odgovori anketirancev na 7. nalogo: "Metoda mi je pripomogla k

lažjemu razumevanju snovi."

popolnoma se strinjam

se strinjam

ne vem

se ne strinjam

popolnoma se ne strinjam



43

Slika 31: Odgovori anketirancev na 8. točko: "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega gradiva pri

predmetu Fitofiziologija."

Slika 32: Odgovori anketirancev na 9. točko: "Metoda je dosegla moja pričakovanja."

30%

50%

20%

0% 0%

Odgovori anketirancev na 8. nalogo: "Metoda je uporabna pri

študiju izpitnega gradiva pri predmetu Fitofiziologija."


se strinjam

ne vem

se ne strinjam


50% 50%

0%

0%

0%

Odgovori anketirancev na 9. nalogo: "Eksperiment je dosegel moja

pričakovanja."


se strinjam

ne vem

se ne strinjam




44

Slika 33: Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo

20%

10%

50%

10%

10%

Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo

ne vem

ne razumem navodil

reduktivne sladkorje v plodovih

reduktivne sladkorje v različnih

rastlinskih organih

količino plastidov v zelenih

rastlinah



45

5 RAZPRAVA

Rezultati kvantitativne metode za določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom so

bili pričakovani. Na koncu lahko potrdimo prvo zastavljeno hipotezo, da je izbrana metoda

resnično zelo natančna in da zazna redukcijske sladkorje tudi v travi. Drugo hipotezo o

tem, da bo v vzorcih bistveno večja količina glukoze kot fruktoze, pa smo ovrgli. Izkazalo

se je namreč, da je v obeh vzorcih podobna količina tako glukoze kot fruktoze, vendar pa

je slednje več v vzorcu mesnatih luskolistov čebule kot v vzorcu trave.

5.1 Analiza rezultatov preizkusa metode

Na sploh smo bili presenečeni, da smo lahko s to metodo resnično zaznali redukcijske

sladkorje tudi v travi, pa če prav je bilo le-teh zelo malo. Rezultate merjenja absorbance v

vzorcu ekstrakta trave in mesnatih luskolistov čebule prikazujeta Preglednica 8 in

Priloga F. Na podlagi vnaprej pripravljene umeritvene krivulje za glukozo (glej Sliko 28)

in fruktozo (glej Sliko 29) smo določili masno koncentracijo glukoze in fruktoze v obeh

vzorcih. Koncentracijo glukoze in fruktoze v 1 g trave in 1 g mesnatih luskolistov čebule

smo izračunali po sklepnem računu, kar prikazujejo računi (1), (2), (3) in (4). V 1 g trave je

bilo pribliţno 0,13 mg/ml glukoze in 0,12 mg/ml fruktoze. V 1 g mesnatih luskolistov

čebule pa je bilo pribliţno 0,90 mg/ml glukoze in 1,00 mg/ml fruktoze.

Preglednica 6 in Preglednica 7 prikazujeta rezultate merjenja absorbance vzorcev z

različnimi masnimi koncentracijami glukoze in fruktoze, s pomočjo katerih smo izdelali

umeritveni krivulji. Vsi rezultati so v obliki slik priloţeni na koncu diplomske seminarske

naloge v Prilogi D in Prilogi E. Ker so namenjeni izključno izdelavi umeritvene krivulje,

jih ne bomo posebej interpretirali, lahko pa sluţijo kot vodilo tistim, ki bodo to metodo

sami preizkušali.

Prvi dve polji prvega sklopa meritev absorbance masnih koncentracij glukoze, ki jih

prikazuje Preglednica 6, smo označili sivo. To smo storili zato, ker ta dva rezultata močno

odstopata od ostalih dveh in nista zanesljiva, zato ju tudi pri izračunu povprečne

absorbance nismo upoštevali. To se nam je dogajalo redno na začetku vsakega poskusa,

vendar vselej le pri prvih dveh meritvah. Sklepamo, da je do tega prišlo zato, ker smo

merili prehitro, preden se je aparat ogrel. Menimo, da spektrofotometer potrebuje določen

čas, da se meritve stabilizirajo. Zaradi ţelje po čim večji natančnosti smo tudi izvedli po tri



46

serije meritev in izračunali povprečno absorbanco, v navodilih pa dodali, da je treba na

začetku opraviti dve poskusni meritvi, da se spektrofotometer SpectroVis ogreje.

5.2 Analiza rezultatov anketnega vprašalnika

Pri izpolnjevanju anketnega vprašalnika (glej Prilogo G), namenjenem oceni kvantitativne

metode za določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom, so sodelovali študentje 4.

letnika študijske smeri Biologija in … ter študentje 3. letnika študijske smeri Ekologija z

naravovarstvom, oboji s Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru.

Anketni vprašalnik so izpolnili po preizkusu omenjene metode, pri katerem smo jih

usmerjali in jim pomagali. Dobili so natančna navodila in morali v sklopu vaj pri predmetu

Fitofiziologija iz tega pripraviti poročilo, ki je obsegalo rezultate in njihovo analizo.

V prvem sklopu vprašanj (od 3. do 6. točke, Priloga G) so študentje ocenjevali vajo z

ocenami od 1 do 10, pri tem je ocena 1 pomenila najslabše, ocena 10 pa najboljše.

Razumljivost navodil so študentje ocenili v povprečju z oceno 8,9, teţavnost metode s 7,1;

dolţino metode s 7,8 in natančnost metode z 8,8. Iz ocen sklepamo, da so navodila dobro

razumljiva. Teţave z razumevanjem navodil so nastopile, če študenti niso bili zbrani in

pripravljeni, saj so le-ta zelo obseţna in podrobna, ravno to pa je tudi vzrok za niţje

ocenjeno teţavnost metode.

Z najniţjo oceno so študentje ocenili trajanje metode. Trajanje priprave in izvedbe metode

je zares časovno obseţno, saj sama izvedba od mešanja reagentov do čiščenja steklovine

traja okoli 6 ur. Dolţino metode poveča sprotno spiranje kivete, saj je na razpolago le ena

in ne moremo vnaprej pripraviti vseh vzorcev za merjenje absorbance, vsakega posebej v

svoji kiveti, kar bi deloma skrajšalo dolţino metode. Zamudna je tudi priprava reagenta in

priprava različnih masnih koncentracij glukoze in fruktoze, vendar ta problem lahko

rešimo tako, da vnaprej namešamo večjo količino reagenta in masnih koncentracij glukoze

in fruktoze, saj ti ob hranjenju v hladilniku ne izgubijo kvalitete. Tako se lahko skupina

študentov v primeru pomanjkanja časa osredotoči samo na izvedbo metode, brez

predhodnih priprav. Če pa ţelimo metodi dati večjo didaktično vrednost, je smiselno, da se

študenti naučijo pripravljati reagent in masne koncentracije glukoze in fruktoze, saj s tem

razvijajo sposobnosti in veščine dela z analitsko tehtnico, avtomatsko pipeto, računanja

masnih koncentracij in različnih razmerij kemikalij. Natančnost metode so ocenili precej

visoko, vendar menimo, da bi lahko bila ocena višja, saj se je metoda izkazala za zelo



47

natančno, ker zazna tudi minimalne količine redukcijskih sladkorjev. Povprečno oceno

niţa študent, ki ni v celoti razumel navodil in namena metode.

Drugi sklop nalog (od 7. do 9. točke, Priloga G) je od anketirancev zahteval, da glede na

trditev obkroţijo, ali se z njo strinjajo ali ne. Med izbranimi moţnostmi so bili odgovori:

Se popolnoma ne strinjam, Se ne strinjam, Ne vem, Se strinjam, Se popolnoma strinjam.

S trditvijo (točka 7, Priloga G): "Metoda mi je pripomogla k lažjemu razumevanju snovi."

se je 50 % študentov strinjalo, 40 % se jih je popolnoma strinjalo, 10 %, torej eden, pa se s

tem ni strinjal. Rezultate prikazuje Slika 30. Študentom, ki so razumeli navodila, je ta

preizkus pomagal pri razumevanju snovi, saj so pred tem določali redukcijske sladkorje le

s kvalitativno metodo s Fehlingovim reagentom in niso imeli občutka, koliko teh

sladkorjev se dejansko nahaja v izbranem rastlinskem tkivu. Tako so videli, da jih je nekaj

tudi v travi, čeprav sam kvalitativen test tega ni dokazal. Naučili so se tudi delati

umeritveno krivuljo.

S trditvijo (točka 8, Priloga G): "Metoda je uporabna pri študiju izpitnega gradiva pri

predmetu Fitofiziologija." se je 50 % študentov strinjalo, 30 % se jih je s tem popolnoma

strinjalo, dva študenta (20 %) pa tega nista ovrednotila in sta obkroţila Ne vem. Rezultate

prikazuje Slika 31. Ta snov je poleg vsega drugega predvidena tudi na kolokviju in izpitu

iz predmeta Fitofiziologija in večina študentov se strinja, da je bila metoda uporabna pri

študiju za ta predmet.

Na trditev (točka 9, Priloga G): "Metoda je dosegla moja pričakovanja." so rezultati

odgovorov študentov razvidni iz Slike 32. 50 % študentov se s tem popolnoma strinja,

50 % pa se jih s tem strinja. Vsi so potrdili svojo hipotezo, da bo metoda dokazala količino

glukoze in fruktoze v travi in mesnatih luskolistih čebule.

Tretji sklop nalog (od 10. do 11. točke, Priloga G) je anketirance spraševal o tem, ali so

pričakovali takšne rezultate in ali so imeli pri izvedbi metode teţave. Na vprašanji so

morali odgovoriti z da ali ne. Vsi študenti so na prvo vprašanje odgovorili pritrdilno. Nihče

ni imel teţav pri izvajanju metode.

Noben od študentov se nikoli prej ni srečal s to metodo, niti ne bi ničesar spreminjal.



48

Namen, za katerega bi anketiranci še uporabili to metodo, je razviden iz Slike 33. Polovica

študentov bi si ţelela to metodo preizkusiti za določanje redukcijskih sladkorjev v različnih

plodovih. Eden izmed študentov je prišel na idejo, da bi na ta način lahko določali

koncentracijo plastidov v zelenih rastlinah, drugi pa bi to metodo uporabil za določanje

redukcijskih sladkorjev v različnih rastlinskih organih. Eden izmed študentov ni predlagal

ničesar, saj ni razumel navodil, dva pa nista imela nobene ideje.

Anketni vprašalnik je pripomogel h kritičnosti do izbrane metode in načina dela. Na

splošno je bila študentom všeč in so jo razumeli, bi pa si ţeleli nekoliko krajša navodila,

glede na to, da so skoraj vsi imeli poleg študijske smeri biologija za vezavo kemijo.

Študentoma študijske smeri biologija in filozofija pa so se navodila zdela zelo dobro

razumljiva, saj nimata veliko kemijskega znanja. Verjetno bi bili rezultati ankete nekoliko

drugačni, če bi bil nabor sodelujočih anketiranih študentov večji in bolj pester glede na

njihove študijske smeri. Kemikom metoda v splošnem naj ne bi delala večjih teţav,

nekemiki pa bi lahko pri manj natančnih navodilih imeli teţave pri razumevanju postopka.

Metodo smo tekom izvajanja s študenti sproti izpopolnjevali in jo v dveh mesecih

izpopolnili. Preden smo jo prvič preizkusili skupaj s študenti, smo jo izvedli sami, da smo

preverili samo ustreznost metode. Rezultati, zbrani v istoimenskem poglavju, so rezultati

zadnjega poskusa, ki smo ga izvedli brez študentov. Imeli smo precejšnjo srečo, da nam je

v tako kratkem času uspelo izpopolniti metodo, je pa res, da smo se na poskus predhodno

dobro pripravili in ga oblikovali s pomočjo različnih virov.

Po vsej verjetnosti bi se dalo metodo še izboljšati, morda s samo pripravo rastlinskega

ekstrakta, ki ne bi vseboval drugih primesi, ali z izbiro natančnejšega spektrofotometra.

Vendar pa namen te metode ni strogo raziskovalni, ampak je v največji meri namenjena

izvajanju dijakov pri pouku biologije in študentov pri vajah iz predmeta Fitofiziologija.

Zato izpolnjuje vse zahteve, saj je dovolj natančna, ni preveč zahtevna in ne vsebuje zelo

strupenih kemikalij ter ne zahteva uporabe kompliciranih naprav.



49

6 ZAHVALA

Mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek se zahvaljujem za nasvete in pomoč z lastnimi

izkušnjami. Za pomoč pri izvajanju metode in usmerjanju pri kemijskih postopkih se

zahvaljujem mag. Tereziji Ciringer. Za vso podporo tekom študija, tako moralno kot

finančno, se zahvaljujem atiju Joţetu in mamici Brigiti ter svoji sestri Nataši in fantu

Dejanu. Za moralno podporo in pomoč pri študiju pa se posebej zahvaljujem sošolcema

Maji Dragšič in Mihi Knehtlu.



50

7 LITERATURA IN VIRI

Carbohydrates and their chemistry. (2008). Prevzeto 23. april 2011 iz Tutornext:

http://www.tutornext.com/carbohydrates-their-chemistry/2923

SpectroVis Spectrophotometer. (2008). Prevzeto 22. maj 2011 iz The Caliper. Vernier:

Measure. Analyze. Learn: http://www.vernier.com/caliper/spring08/svis.html

Construction of maltose standard curve by DNS method. (2010). Prevzeto 10. junij 2011 iz

VALUE @ Amrita. Virtual & Accessible Laboratories Universalizing Education:

http://sakshat.amrita.ac.in/VirtualLab/?sub=BIOTECH&brch=BIC&sim=Construct

ion_of_Maltose_By_DNS_Method&cnt=theory

Medical Physiology/Basic Biochemistry/Sugars: Reference. (2010). Prevzeto 24. april

2011 iz The Full Wiki:

http://www.thefullwiki.org/Medical_Physiology/Basic_Biochemistry/Sugars

Ambroţič Dolinšek, J. (2010). Fitofiziologija. Navodila za vaje. Maribor: Univerza v

Mariboru. Fakulteta za naravoslovje in matematiko.

Anderluh, G., Maček, P., Sepčić, K. in Turk, T. (2009). Eksperimentalne metode v

biokemiji. Ljubljana: Študentska zaloţba.

Bavec, A., Zorko, M. in Stojan, J. (2008). Navodila za laboratorijske vaje iz biokemije s

teoretičnim dodatkom. Ljubljana: Študentska zaloţba.

Boyer, R. F. (2005). Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska zaloţba.

Cellular Processes. Step 2: Calvin Cycle. (brez datuma). Prevzeto 23. maj 2011 iz

Cellupedia: http://library.thinkquest.org/C004535/calvin_cycle.html

Dermastia, M. (2007). Pogled v rastline. Ljubljana: Nacionalni inštitut za biologijo.

Gros, N., Harrison, T., Štrumbelj Drusany, I. in Kapun Dolinar, A. (3. avgust 2010).

Science In School. Prevzeto 30. marec 2011 iz Spektrometrija v šoli: eksperimenti z

izkustvenim pristopom:

http://www.scienceinschool.org/2010/issue14/spectrometer/slovene

Hmelak Gorenjak, A. (2010). Prevzeto 23. maj 2011 iz Ţivilska kemija z analizo ţivil in

analiza ţivil. Zavod IRC. Ljubljana: http://www.impletum.zavod-

irc.si/docs/Skriti_dokumenti/Zivilska_kemija_z_analizo_in_Analiza_zivil-

Hmelak.pdf

Jha, A. B. in Dubey, R. S. (2005). Effect of arsenic on behaviour of enzymes of sugar

metabolism in germinating rice seeds. Acta Physiologiae Plantarum. Vol. 27. No.

3B, 341–347.



51

Likar, M. (2011). Priročnik za varno delo v laboratorijih. Katedra za rastlinsko fiziologijo.

Ljubljana: Univerza v Ljubljani. Biotehnična fakulteta.

Lorenz Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 456–428.

Pingoud, A., Urbanke, C., Hoggett, J. in Jeltsch, A. (2002). Biochemical Methods. A

Concise Guide for Students and Researchers. Weinheim: Wiley-VCH Verlag

GmbH.

Prado, F. E., Gonzalez, J. A., Boero, C. in Sampietro, A. R. (1998). A Simple and Sensitive

Method for Determining Reducing Sugars in Plant Tissues. Application to Quantify

the Sugar Content in Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) Seedlings.

Phytochemical Analysis, Vol. 9, 58–63.

Raven, P. H. in Echhorn, S. E. (2005). Biology of Plants. New York: W. H. Freeman and

Company.

Sadasivam, S. in Manickam, A. (avgust 2007). Biochemical Methods. Prevzeto 30. marec

2011 iz New Age International:

http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf

Sašo. (24. oktober 2004). Kvarkadabra. Časopis za tolmačenje znanosti. Prevzeto 24. maj

2011 iz Spekter elektromagnetnega valovanja:

http://www.kvarkadabra.net/mediagallery/popup.php?s=20060326214527911&sort

=0

Sepčić, K. (2004). Biokemijski praktikum za pedagoge. Ljubljana: Študentska zaloţba.

Sticklen, M. B. (2008). Scitable. Nature Education. Prevzeto 23. maj 2011 iz Plant genetic

engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol. Nature

Reviews Genetics 9, 433–443: http://www.nature.com/scitable/content/plant-

plasma-membrane-and-cell-wall-structure-14713218

Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Plant Physiology (5th ed izd.). Sunderland, MA: Sinauer

Associates Inc., Publishers.

Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 6. junij 2011 iz

Plant Physiology: http://5e.plantphys.net/image.php?id=70

Taiz, L. in Zeiger, E. (2010). Principles of Spectrophotometry. Prevzeto 7. junij 2011 iz

Plant Physiology: http://5e.plantphys.net/image.php?id=71

Tausch, M. W. (brez datuma). Hydrolysis of β-Cyclodextrin and Detection of the

Degradation Product. Prevzeto 24. april 2011 iz Chemie und ihre Didaktik:

http://www.chemiedidaktik.uni-wuppertal.de/disido_cy/cyen/exp/03_hydrolyse.htm



52

Turk, T., Maček, P., Sepčić, K. in Anderluh, G. (1997). Biokemijski praktikum. Ljubljana:

Študentska organizacija univerze v Ljubljani.

Vernier. (2008). Vernier SpectroVis. Spectrofotometer. Beaverton, OR: Vernier Software

& Technology.

Voet, D., Voet, J. G. in Pratt, C. W. (2002). Fundamentals of biochemistry. New York: J.

Wiley, cop.

Zamora, A. (2011). Carbohydrates – Chemical Structure. Prevzeto 24. april 2011 iz

Scientific Psychic: http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates.html



1

8 PRILOGE

Kazalo prilog

Priloga A: Navodilo za delo z analitsko tehtnico .................................................................. 2

Priloga B: Navodilo za delo z avtomatsko pipeto ................................................................. 3

Priloga C: Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis ................................... 5

Priloga D: Rezultati meritev umeritvene krivulje za glukozo ............................................... 7

Priloga E: Rezultati meritev umeritvene krivulje za fruktozo ............................................. 12

Priloga F: Rezultati meritev rastlinskega tkiva.................................................................... 17

Priloga G: Anketni vprašalnik ............................................................................................. 18



2

Priloga A: Navodilo za delo z analitsko tehtnico

Navodilo za varno delo z analitsko tehtnico

Območje uporabe Analitsko tehtnico uporabljamo v laboratoriju.

Nevarnost Analitska tehtnica je med delovanjem priključena na električno

omreţje.

Lahko pride do razlitja raztopine ali razsutja trdnih snovi, ki jih

tehtamo.

Uporaba 1. Preden začnemo tehtati, se prepričamo, da analitska tehtnica

kaţe vrednost 0.

2. Maso embalaţe je vedno treba odšteti od mase snovi, ki jo

tehtamo. To naredimo s pritiskom na gumb tara.

3. Na površino za tehtanje ne pritiskamo z roko.

4. Pazimo, da ne tehtamo količin, teţjih od najvišje dovoljene

obremenitve tehtnice.

Ukrepi ob

motnjah

Analitsko tehtnico izklopimo.

Razliti ali razsuti material previdno odstranimo s površine za

tehtanje in analitsko tehtnico obrišemo z mehko krpo.

Vzdrževanje Pazimo, da se snovi, ki jih tehtamo, ne polivajo in razsujejo po

površini za tehtanje.

Po vsaki uporabi analitsko tehtnico izklopimo, površino za tehtanje

pa obrišemo z mehko krpo.

Analitske tehtnice ne izpostavljamo agresivni ali vlaţni atmosferi.

Neupoštevanje

navodil

Poškodbe analitske tehtnice.

Nenatančne meritve.

Ogroţanje zdravja.

(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 64 in Likar, 2011, str. 10)



3

Priloga B: Navodilo za delo z avtomatsko pipeto

Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto

Območje uporabe Avtomatske pipete uporabljamo za prenos tekočine.

Nevarnost Nevarnost predstavljajo le tekočine, ki se pipetirajo.

Uporaba 1. Izberemo avtomatsko pipeto za ustrezno velikostno območje.

Nikoli ne pipetiramo volumnov, večjih ali manjših od

predpisanih. Minimalni volumni so običajno 10–20 %

celotnega volumna pipete.

2. Z vrtenjem gumba na vrhu avtomatske pipete v levo ali desno

smer nastavimo ţeleni volumen.

3. Konico pipete narahlo potisnemo v eno od zamenljivih

plastičnih konic (tips), zloţenih v posebnih nosilnih škatlah.

Vedno izberemo konico ustrezne velikosti. Tesno prileganje

zagotovimo z nekaj neţnimi pritiski v ustje konice.

4. Pipeto vedno držimo s konico navpično navzdol. Pritisnemo

gumb na vrhu pipete do prve stopnje in potopimo konico v

tekočino, ki jo pipetiramo. Gumb počasi sprostimo, tako da se

konica počasi napolni s tekočino. Počakamo še trenutek, da se

konica popolnoma napolni. Sproščanje in pritiskanje gumba

za pipetiranje naj bo vedno počasno in nežno, v konici ne

smejo nastajati zračni mehurčki.

5. Če pri pipetiranju pomotoma napolnimo tudi konec pipete,

poiščemo pomoč laboranta.

6. Pipeto z raztopino dvignemo nad gladino tekočine in z očmi

grobo ocenimo, ali višina raztopine v konici ustreza izbranemu

volumnu. Še vedno velja, da pipeto držimo s konico

navpično navzdol.

7. Pipeto s tekočino prenesemo v drugo posodo. S konico pipete

se pod kotom 10–15º od navpične stene dotaknemo posode. S

počasnim in neţnim pritiskom na vrhnji gumb pipete konico

izpraznimo. Počakamo trenutek, da izteče vsa tekočina, in s

pritiskom do naslednje, končne stopnje dodatno izpihamo

morebitne ostanke tekočine. Nato vzamemo pipeto iz posode.



4

Navodilo za varno delo z avtomatsko pipeto

8. S pritiskom na stranski, manjši in nekoliko niţji gumb

odstranimo plastično konico s pipete. Preden odstranimo

konico, se vedno prepričamo, da je popolnoma prazna.

9. Pred vsako uporabo novega nastavka moramo nastavek sprati

(po zgornjih korakih). Pri tem se v nastavku vzpostavi tanek

film tekočine. Ta film lahko predstavlja napako pri pipetiranju

(v primeru, da izpustimo pranje nastavka), hkrati pa preprečuje

kapljanje tekočine iz nastavka.

Pipeto preizkusimo tako, da ustrezni volumen destilirane vode

stehtamo. Predvidoma 1 mg destilirane vode ustreza 1 µl

oziroma 1 mm³ destilirane vode. Masa izbranega volumna ne

sme odstopati za več kot 1 %. Če vrednosti odstopajo, pipeta ni

natančna in jo je treba umeriti (kalibrirati) ali servisirati.

Ukrepi ob

motnjah Takoj prenehamo pipetirati.

Vzdrževanje V primeru, da je v avtomatsko pipeto prišla tekočina, takoj

obvestimo laboranta.

Neupoštevanje

navodil

Poškodbe avtomatskih pipet.


(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 65 in Likar, 2011, str. 14)



5

Priloga C: Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis

Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis

Območje uporabe Spektrofotometer SpectroVis uporabljamo za določanje

koncentracije snovi v raztopinah in snemanje absorpcijskih

spektrov.

Nevarnost Spektrofotometer SpectroVis je med delovanjem priključen v

računalnik, ki je priključen na električno omreţje.

Lahko pride do razlitja raztopine v kiveti.

Uporaba Kalibracija

1. Kiveto napolnimo do ¾ z destilirano vodo in jo postavimo v

nosilec za kivete SpectroVis.

2. V programu LoggerPro kliknemo jeziček Experiment in nato

Calibrate ter Spectrometer: 1.

3. Počakamo, da steče kalibracija. Potem kliknemo gumb Finish

Calibration.

4. Ko je kalibracija končana, kliknemo gumb OK.

Merjenje s spektrofotometrom SpectroVis

1. Kiveto napolnimo do ¾ z vzorčno raztopino in jo vstavimo v

nosilec za kivete v SpectroVis.

2. Kliknemo Collect in po pribliţno 5 sekundah kliknemo Stop.

3. S klikom na desni gumb miške se nam odpre pogovorno okno,

kjer kliknemo na Graf Options.

4. Odpre se pogovorno okno Graph Options, kjer kliknemo na

jeziček Axes Options.

5. V okvirčku Y – Axis pri okenčku Top vtipkamo 2,500 in

shranimo nastavitve s klikom na Done. Tako smo os y

prilagodili našim meritvam.

6. Ko ţelimo opraviti novo meritev, kliknemo Collect in odpre se

pogovorno okno Erase Data?. Kliknemo Erase and Continue

in nadaljujemo z zbiranjem novih podatkov.

7. Grafe sproti shranjujemo.



6

Navodilo za varno delo s spektrofotometrom SpectroVis

Raztopine, ki jih damo v merilno kiveto, morajo biti popolnoma

bistre.

Površina kivete mora biti suha in čista – če ni, jo očistimo s

kosmom vate in malo acetona.

Kivete prijemamo s prsti na obrušenih straneh, in ne na straneh,

skozi katere potuje svetlobni ţarek.

Kiveto napolnimo največ 1/3 do roba. Ko kiveto vstavimo v

spektrofotometer, zapremo pokrov.

Ukrepi ob

motnjah

Če absorpcija zelo niha, vzamemo kiveto ven, jo izpraznimo in

skrbno očistimo ter posušimo.

O razlitju raztopine v spektrofotometru takoj obvestimo laboranta.

Vzdrževanje Pazimo, da ne polivamo raztopin iz kivete znotraj in izven

spektrofotometra SpectroVis.

Kivete po uporabi skrbno speremo in posušimo.

Neupoštevanje

navodil


Uničenje SpectroVis-a zaradi morebitnega razlitja tekočin.

(Ambrožič Dolinšek, 2010, str. 64; Likar, 2011, str. 12 in Vernier, 2008)

Zvonar, S.: Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom. Diplomska seminarska naloga. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in


7

Priloga D: Rezultati meritev umeritvene krivulje za glukozo

Slika 31: Prva meritev absorbance v epruveti 1g

Slika 32: Druga meritev absorbance v epruveti 1g

Slika 33: Tretja meritev absorbance v epruveti 1g






8









9









10









11

Slika 55: Prva meritev absorbance v slepi epruvetig

Slika 56: Druga meritev absorbance v slepi

epruvetig

Slika 57: Tretja meritev absorbance v slepi

epruvetig



12

Priloga E: Rezultati meritev umeritvene krivulje za fruktozo

Slika 58: Prva meritev absorbance v epruveti 1f

Slika 59: Druga meritev absorbance v epruveti 1f

Slika 60: Tretja meritev absorbance v epruveti 1f






13









14









15









16

Slika 82: Prva meritev absorbance v slepi epruvetif

Slika 83: Druga meritev absorbance v slepi

epruvetif

Slika 84: Tretja meritev absorbance v slepi epruvetif



17

Priloga F: Rezultati meritev rastlinskega tkiva

Slika 85: Prva meritev absorbance v ekstraktu

čebule

Slika 86: Druga meritev absorbance v ekstraktu

čebule

Slika 87: Tretja meritev absorbance v ekstraktu

čebule

Slika 88: Prva meritev absorbance v ekstraktu trave

Slika 89: Druga meritev absorbance v ekstraktu

trave

Slika 90: Tretja meritev absorbance v ekstraktu

trave



18

Priloga G: Anketni vprašalnik

ANKETNI VPRAŠALNIK

Pozdravljeni!

Pri diplomski seminarski nalogi z naslovom Kvantitativna metoda za določanje

redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom moram narediti evalvacijo metode, ki sem jo pri

vajah iz Fitofiziologije opravila z vami. Zato vas lepo prosim, da si vzamete čas in

odgovorite na nekaj vprašanj v povezavi z omenjeno metodo. Anketa je anonimna in bo

uporabljena izključno za evalvacijo pri moji diplomski seminarski nalogi.

1. Smer študija:

2. Letnik:

Na vprašanja od 3 do 6 odgovorite tako, da obkrožite številko – 1 za najslabše ocenjeno in

10 za najboljše.

3. Razumljivost navodil: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4. Teţavnost metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5. Dolţina metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

6. Natančnost metode: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Na vprašanja od 7 do 9 odgovorite tako, da obkrožite podane odgovore glede na

ustreznost navedenih trditev.

7. Metoda mi je pripomogla k

laţjemu razumevanju snovi. Popolnoma se

ne strinjam

Se ne

strinjam

Ne

vem

Se

strinjam

Popolnoma

se strinjam

8. Metoda je uporabna pri študiju

izpitnega gradiva pri predmetu

Fitofiziologija.

Popolnoma se

ne strinjam

Se ne

strinjam

Ne

vem

Se

strinjam

Popolnoma

se strinjam

9. Metoda je dosegla moja

pričakovanja. Popolnoma se

ne strinjam

Se ne

strinjam

Ne

vem

Se

strinjam

Popolnoma

se strinjam

Na vprašanji 10 in 11 odgovorite z obkrožitvijo odgovora Da ali Ne.

10. Ali ste pričakovali takšne rezultate? Da Ne

11. Ali ste imeli kje teţave pri izvedbi? Da Ne

12. Ali ste se ţe kdaj srečali s to metodo? Če ste odgovorili z da, kje ste jo spoznali?



19

13. Kaj bi spremenili?

14. Načrtujte raziskavo, v kateri bi uporabili to metodo.

Hvala za sodelovanje.

Sandra Zvonar, absolventka biologije in geografije

Documents

DIPLOMSKA SEMINARSKA NALOGAseminarska naloga z naslovom Kvantitativno določanje redukcijskih sladkorjev z DNS reagentom pri mentorici doc. dr. Jani Ambroţič Dolinšek avtorsko delo