Directriz Validacion -OUA

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE DE ENSAYO

Código: OUADOC033 Rev. Nro. 2 Página 1 de 18 Fecha Emisión: 05/09/12

Resumen de Modificaciones

Revisión Nro. Fecha de emisión Breve descripción de las modificaciones

1 04/03/2010 Emisión del documento.

2 05/09/12

Se reordenan numerales y se unifica con criterios de armado de documentos OUAPRO001. Se ordena alfabéticamente punto 4 Definiciones. Se nombran y numeran tablas según aparición. Se ordenan los pasos de la validación. Se actualizan los conceptos de veracidad y exactitud. Se ordenan los conceptos de precisión. Se agrega linealidad y no linealidad de un método.

Fecha Cargo Nombre Firma

Elaborado 28/06/12 Asistente Técnico Mauricio Roldán

Revisado 04/07/12 Directora Ejecutiva Liliane Somma

Aprobado 05/09/12 Comité de Acreditación --------- Acta Nº 123

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1. OBJETIVO Establecer una directriz para sistematizar el desarrollo de las actividades de los laboratorios para la validación de métodos de ensayo.

2. ALCANCE Esta directriz es aplicable a todos los métodos de ensayo incluidos en el alcance de los laboratorios de ensayo acreditados ante el OUA y los laboratorios que solicitan su acreditación. Nota 1: Esta directriz debería ser utilizada por los evaluadores y expertos técnicos que actúan en los procesos de acreditación y por los responsables de los laboratorios. Nota 2 : Esta directriz es aplicable a los métodos de ensayo. No se establece consideraciones para el muestreo, la manipulación y el transporte de muestras.

3. REFERENCIAS

CEA-ENAC-LC/02 Expresión de la incertidumbre de medida en las calibraciones.

G-ENAC-09 Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos.

G-ENAC-04 Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos.

ISO/IEC Guide 43-1 a 2. Proficiency testing by interlaboratory comparisons.

JCGM 100:2008 GUM 1995 with minor corrections. Evaluation of measurement data – Guide to the expression of uncertainty in measurement.

JCGM 101:2008 Evaluation of measurement data – Supplement 1 to the “Guide to the expression of uncertainty in measurement” – propagation of distributions using a Monte Carlo method.

JCGM 102:2011 Evaluation of measurement data – Supplement 2 to the “Guide to the expression of uncertainty in measurement” – Extension to any number of output quantities.

JCGM 104:2009 Evaluation of measurement data – An introduction to the “Guide to the expression of uncertainty in measurement” and related documents.

JCGM 200:2008 International vocabulary of metrology – Basic and general concepts and associated terms (VIM).

JCGM 200:2008 Corrigendum International vocabulary of metrology – Basic and general concepts and associated terms (VIM).

JCGM 200:2012 International vocabulary of metrology – Basic and general concepts and associated terms (VIM) 3rd edition 2008. Version with minor corrections.

Bureau International des Poids et Mesures. The International System of Units (SI). 8th edition 2006.

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UNIT-ISO 9000. Sistemas de Gestión de la Calidad. Fundamentos y vocabulario.

UNIT-ISO/IEC 17025 Requisitos generales para la competencia de los laboratórios de ensayo y de calibración.

UNIT-ISO 15189 Laboratorio de análisis clínicos – Requisitos particulares para la calidad y la competencia.

UNIT-ISO/IEC 17043 Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para los ensayos de aptitud.

4. DEFINICIONES 4.1 Característica de desempeño: parámetro de calidad que puede atribuirse a un método de ensayo. 4.2 Criterio de desempeño: requisito para una característica de desempeño de acuerdo a la cual puede juzgarse que el método de ensayo satisface con el propósito y genera resultados confiables 4.3 Especificidad: capacidad de un método para medir solamente lo que se intenta medir. 4.4 Exactitud: proximidad entre el resultado de una medición y el valor del mensurando. Exactitud = Veracidad + Precisión 4.5 Incertidumbre: parámetro, no negativo, caracterizando la dispersión de los valores atribuibles al mensurando, basándose en la información utilizada. 4.6 Intervalo de trabajo: conjunto de los valores de magnitudes de una misma naturaleza que un método de ensayo puede medir con una incertidumbre especificada, en condiciones determinadas.

Se denomina, también, intervalo de medición o rango 4.7 Límite de cuantificación: es la menor cantidad de mensurando que puede ser determinada con un nivel aceptable de veracidad y precisión. 4.8 Límite de detección: es la menor cantidad que puede ser distinguida del blanco con cierto nivel de confianza especificado. 4.9 Linealidad: capacidad de un método para obtener resultados de ensayos proporcionales a la cantidad de mesurando, en un rango de operación determinado. 4.10 Material de referencia (MR): material con una o más propiedades con valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un equipo, la evaluación de un método de ensayo o la asignación de valores a materiales. 4.11 Material de referencia certificado (MRC): material de referencia, acompañado de un certificado otorgado por una autoridad, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente. 4.12 Mensurando: magnitud particular sometida a medición.

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4.13 Método alternativo: método que ha sido validado por comparación con el método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado y es reconocido formalmente como equivalente al método de referencia por un organismo competente de acuerdo a datos experimentales obtenidos, por ejemplo mediante ensayos colaborativos. 4.14 Método basado en norma: método descrito en un procedimiento interno del laboratorio, que está basado claramente en un método normalizado y que no supone una modificación técnica respecto del método de referencia que ponga en cuestión su validez técnica. Debe mantenerse actualizado en relación con el método de referencia en que se fundamentan. 4.15 Método desarrollado: método de ensayo desarrollado por el laboratorio o por un fabricante o proveedor de equipos, de medios de cultivo etc., de forma unilateral y que no dispone del reconocimiento de los métodos normalizados o de los métodos alternativos. 4.16 Método de referencia: método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o más propiedades y que ha demostrado tener una exactitud y precisión apropiadas para el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros métodos empleados para realizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un material de referencia. En general se trata de un método normalizado. 4.17 Método normalizado: método publicado como norma internacional, regional o nacional, o por organizaciones técnicas reconocidas (Ej: ISO, IEC, COPANT, AMN, UNIT, AOAC, APHA, etc.). 4.18 Modificación de método normalizado o alternativo: método normalizado o alternativo que es modificado significativamente para atender a requisitos específicos. 4.19 Precisión: proximidad entre valores obtenidos por medición de replicados en el mismo o similar material bajo condiciones especificadas.

Nota: Precisión es un término general para evaluar la dispersión de resultados entre ensayos independientes, que son repetidos sobre una misma muestra, muestras semejantes o patrones, en condiciones definidas.

4.20 Repetibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de un mismo mensurando, efectuadas bajo las mismas condiciones de ensayo. Se puede definir como la precisión bajo condiciones de repetibilidad.

Condiciones de repetibilidad: condiciones bajo las cuales resultados de ensayos independientes son obtenidos con el mismo método, en materiales presumiblemente idénticos, en el mismo lugar, con el mismo equipo, por el mismo operador, en intervalos cortos de tiempo. 4.21 Precisión intermedia: se refiere a la precisión evaluada sobre la misma muestra, muestras idénticas al patrón, utilizando el mismo método, en el mismo laboratorio, pero definido exactamente cuales son las condiciones a variar (Ver 6.1.2). La precisión intermedia se puede definir como una medida bajo un conjunto de condiciones de precisión intermedia de medición.

Condiciones de precisión intermedia: condiciones bajo las cuales se obtiene los resultados de réplicas con el mismo método, en materiales presumiblemente idénticos y uno o más factores como tiempo, equipo, operador, varían dentro de un mismo laboratorio.

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4.22 Reproducibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados de las mediciones de un mismo mensurando, efectuadas bajo condiciones variadas de ensayo. Se puede definir como la reproducibilidad bajo condiciones de reproducibilidad.

Condiciones de reproducibilidad: condiciones bajo las cuales se obtiene resultados replicados en materiales presumiblemente idénticos, en diferentes lugares, con diferentes operadores utilizando equipos diferentes. 4.23 Recuperación: fracción de analito que se agrega a una muestra de ensayo antes del análisis.

Nota: El objetivo de la recuperación es evaluar la eficiencia del método para detectar todo el analito presente en una muestra. 4.24 Robustez: sensibilidad que presenta un método ante pequeñas variaciones en las condiciones de ensayo. 4.25 Selectividad: capacidad de un método para determinar con un nivel aceptable de exactitud y precisión el mensurando de interés en la presencia de otros componentes en una matriz bajo las condiciones de ensayos establecidos. 4.26 Sensibilidad: Es una característica que demuestra la variación de la respuesta en función de la concentración del mensurando. 4.27 Sesgo: estimación del error sistemático de medición, determinado como la diferencia entre el valor más probable y el valor experimental. 4.28 Validación: confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. 4.29 Valor verdadero convencional (de una magnitud): valor atribuido a una magnitud particular, y aceptado a veces por convención, porque la representa, con una incertidumbre apropiada, para un fin dado. 4.30 Veracidad: concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado por convención como verdadero. 4.31 Verificación: confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados.

5. DESCRIPCIÓN

Es fundamental que los laboratorios dispongan de criterios objetivos para demostrar, por medio de la validación, que los métodos de ensayo que ejecutan conducen a resultados confiables y adecuados a las características de desempeño establecidas. La realización de actividades de validación de los métodos de ensayo utilizados por el laboratorio, contempla la satisfacción de las necesidades del cliente y la adecuación para realizar los ensayos previstos. El objetivo de la validación es confirmar la aptitud de los métodos, así como la capacidad del laboratorio, para la ejecución de ciertos ensayos bajo sus condiciones operativas habituales. Ello

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significa que la validación debería realizarse para confirmar que el laboratorio puede aplicar correctamente el método de ensayo antes de utilizarlo como método de ensayo de rutina. La validación se basa en la comparación de los resultados obtenidos con los criterios de desempeño establecidos para el procedimiento empleado para las características seleccionadas. La metodología y la extensión de la validación no son siempre las mismas y deberían ser establecidas individualmente. A continuación se presenta un detalle de las distintas consideraciones a realizar para llevar a cabo la validación de un método de ensayo, en cuanto al personal, la extensión de la validación, planificación y pasos posteriores de la validación, e informe de validación. 5.1 Personal El laboratorio debería designar a una persona en carácter de Responsable Calificado para la supervisión del trabajo y con la autoridad necesaria para tomar las decisiones apropiadas durante la realización de la validación o a quien le asignen la responsabilidad de la validación. El operador que lleva a cabo las actividades de validación debería ser competente en el área de estudio y necesitaría tener conocimiento suficiente sobre la matriz de ensayo en estudio. 5.2 Extensión de la validación La extensión de la validación debería ser determinada por el Responsable Calificado (Ver 5.1) de manera confiable y científica. La siguiente tabla establece la extensión de las actividades de validación de acuerdo al método de ensayo a emplear por el laboratorio.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDACIÓN REQUERIDA

Métodos normalizados publicados o métodos alternativos

Confirmación de las características de desempeño publicadas de acuerdo con el requisito del apartado 5.4.2 de la norma UNIT-ISO/IEC 17025 Puede requerirse validación solamente si se han hecho algunos cambios, de acuerdo con el requisito del apartado 5.4.4 de la norma UNIT-ISO/IEC 17025 para métodos no normalizados

Método desarrollado por el laboratorio Validación completa

Método publicado en la literatura científica sin ninguna información de desempeño

Validación completa

Métodos publicados en la literatura científica con información de desempeño

Confirmación de las características de desempeño publicadas, pero se requiere una validación más completa que la establecida por el apartado 5.4.5 de la norma UNIT-ISO/IEC 17025

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Cambios en la implementación de un método previamente validado – por ej.: cambios en el equipo, en los reactivos, en el ambiente del laboratorio o en el personal

La extensión de la validación variará para demostrar que los cambios no tienen un impacto significativo en las características de desempeño

Método normalizado publicado que se aplica a diferentes matrices, para diferentes rangos de concentración, para diferentes mensurandos o método normalizado publicado usado para un propósito similar pero condiciones diferentes

Se requiere validación y la extensión variará, por ej.: si se tiene propiedades similares a las de las matrices y de los mensurandos representativos

Método normalizado publicado no vigente o previamente validado que vuelve a usarse

Confirmación de las características de desempeño previamente establecidas

Ensayos ad hoc o especiales

La extensión de la validación está fijada por las circunstancias

Kits de ensayo comerciales – evaluados mediante ensayos colaborativos

Confirmación de las características de desempeño publicadas pero puede requerirse una validación completa si se efectúa cualquier cambio en el uso

Kits de ensayo comerciales cuya información de desempeño no está disponible, es incompleta o no es aplicable

Validación completa

Tabla I 5.3 Planificación de la validación En el desarrollo de las actividades de validación, se recomienda la siguiente secuencia de trabajo:

definir la aplicación, objetivo y alcance del método de ensayo

establecer las características de desempeño a evaluar

especificar los criterios que debe cumplir el método de ensayo

verificar si las especificaciones de los equipos a utilizar son compatibles con lo exigido por el método de ensayo en estudio

Nota: Los equipos empleados para las actividades de validación deben cumplir con las especificaciones pertinentes para el método de ensayo, funcionar correctamente y estar confirmados metrológicamente.

seleccionar los materiales (por ejemplo, patrones y reactivos) de la calidad requerida

elaborar un procedimiento para la validación 5.4 Pasos posteriores a la planificación de la validación A continuación se resume de manera esquemática los pasos siguientes a la planificación de la validación, necesarios para llevar a cabo la validación propiamente dicha.

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hacer los ensayos preliminares de validación

ajustar los requisitos, de ser necesario (por ejemplo: puede obtenerse una repetibilidad del 7 % en vez del 5 % establecido y, de todas maneras, se considera el método adecuado)

realizar los ensayos completos de validación

realizar los cálculos relacionados con el ensayo (Ver Anexos 6.1).

realizar un análisis de errores (Ver Errores de medición 5.5).

elaborar el informe de validación (Ver 5.6).

redactar un procedimiento operacional que permita la implantación del método, de manera clara y sin ambigüedades, en la rutina diaria del laboratorio. 5.5 Errores de medición Cada ensayo tiene asociado errores de medición, dadas por las condiciones de operación y manipulación, condiciones ambientales, errores instrumentales, de apreciación en la medida, etc. 5.6 Informe de validación Las actividades de validación de cada método de ensayo deberían estar debidamente documentadas, a través del informe de validación, de forma de posibilitar la trazabilidad de todas las actividades realizadas. Cada validación debería ir acompañada de un informe cuyo título se debería redactar de una forma similar a la siguiente: “Informe de validación de (designación del mensurando) en (tipo de matriz .mediante (metodología de ensayo que se ha validado)”. Dicho informe debería ser preparado por el operador que ha realizado la validación, mientras que el Responsable Calificado sería quien lo revise y apruebe. El Informe de Validación debería considerar los siguientes puntos, cuando corresponda:

objetivo y alcance del método

material a ensayar

acondicionamiento de las muestras

detalle de insumos, reactivos y materiales de referencia

lista de equipos, instrumentos y dispositivos

resultados de las características de desempeño estudiadas

registro de las condiciones de los ensayos, gráficos representativos (curva de calibración, registros de correlación) y cálculos necesarios

personal involucrado en las actividades de validación del método

evaluación de los resultados de la validación, de la cual resultan conclusiones y la decisión sobre la aptitud del método para su aplicación

justificación, por parte del Personal Responsable Calificado del método de ensayo, de los cambios a los criterios fijados

fijación de criterios para la revalidación.

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5.7 Ejecución de los resultados de validación Es esencial establecer criterios objetivos para la aceptación de un estudio de validación y luego llevar a cabo el mismo según una secuencia apropiada. Básicamente cada validación de un método de ensayo consta de cuatro etapas:

1. Especificación de los requisitos que debe cumplir el método de ensayo (por ejemplo: límite de detección <1 mg/L, intervalo lineal mayor a 2 órdenes de magnitud, incertidumbre de los resultados <20%).

2. Determinación de las características de desempeño del método de ensayo bajo las condiciones establecidas.

3. Comparación de los resultados obtenidos por las actividades de validación con los requisitos

especificados. 4. Decisión sobre la aptitud del método de ensayo para el uso previsto.

Nota: Para facilitar la decisión final de las características a evaluar se recomienda tener en cuenta la información establecida en las Tablas.

6. ANEXOS 6.1 ANEXO I – Estudio particular de las características de las desempeño a evaluar Es necesario considerar que las características de desempeño que deberían evaluarse durante las actividades de validación varían de acuerdo con el tipo de método de ensayo con la finalidad de facilitar la decisión final de considerar el método como validado. La totalidad de las características de desempeño que pueden ser evaluadas en una validación completa para un método de ensayo son las siguientes:

veracidad

precisión (repetibilidad, (precisión) reproducibilidad intermedia, reproducibilidad)

exactitud (exactitud = veracidad + precisión)

especificidad

selectividad

linealidad

intervalo de trabajo

sensibilidad

límite de detección

límite de cuantificación

robustez

incertidumbre

recuperación Para cada método de ensayo se seleccionarán las características a evaluar. Se puede tomar como orientación la siguiente tabla:

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Características de desempeño a evaluar en base al tipo de ensayo

Característica Tipo de ensayo

Cualitativo Cuantitativo

Exactitud X

Precisión X

Especificidad / selectividad X X

Robustez X X

Sensibilidad / linealidad y no-linealidad / intervalo de

trabajo X

Límite de detección X X

Límite de cuantificación X

Incertidumbre X

Tabla II 6.1.1 Veracidad Las metodologías habitualmente utilizadas para evaluar la veracidad son, entre otras:

uso de materiales de referencia (MR)

participación en comparaciones interlaboratorios (CIL) para LE / control externo para LA

realización de ensayo de recuperación

uso de métodos normalizados (previamente validados con los requisitos de la ISO/IEC 17025) La veracidad, cuando se aplica a una serie de resultados de ensayo, implica una combinación de componentes de errores aleatorios y sistemáticos; se cuantifica con el sesgo, y se puede evaluar la veracidad del método, por medio del cálculo del error relativo, expresado en porcentaje. (La veracidad puede demostrarse mediante la aplicación de test estadísticos como la prueba Z, dependiendo de la cantidad de determinaciones que se realizaron para el estudio de la misma). La determinación del sesgo es importante en el establecimiento de la trazabilidad a los patrones reconocidos. 6.1.2 Precisión Habitualmente se determina para circunstancias específicas de ensayo. En general se estudia mediante la repetibilidad, la reproducibilidad y la precisión intermedia, siendo usualmente expresadas por la desviación estándar. (Se puede considerar la posibilidad de expresar a la precisión en sus tres condiciones como %RSD). Tanto la repetibilidad como la reproducibilidad son, generalmente, dependientes de la concentración del mensurando y, de este modo, deberían ser determinadas para un rango de concentraciones. En algunos casos debe establecerse la relación entre la precisión y la concentración del mensurando.

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La repetibilidad toma en cuenta las condiciones de ensayo bajo las cuales se efectúan los análisis, que son: - mismo procedimiento de ensayo - mismo operador - mismo equipo usado bajo las mismas condiciones - mismo local - repeticiones efectuadas en un corto intervalo de tiempo. La repetibilidad puede ser expresada cuantitativamente en términos de la característica de la dispersión de los resultados y puede ser determinada por medio del ensayo de patrones, material de referencia o adición a blanco en varias concentraciones en el intervalo de trabajo. Se sugieren 7 o más repeticiones para el cálculo de la desviación estándar para cada concentración, llamado desviación estándar de repetibilidad. Se puede expresar como %RSD de repetibilidad.

La reproducibilidad es considerada importante cuando un laboratorio busca la verificación del desempeño de sus métodos en relación a los datos de validación obtenidos por medio de comparación interlaboratorios.

Las condiciones específicas de operación para determinar la precisión intermedia son las siguientes: - diferentes operadores - diferentes equipos - diferentes tiempos. No se tiene porque cambiar todas estas condiciones a la vez, dependiendo de las condiciones con la que cuenta el laboratorio o tal vez la rutina con la cual se realiza el ensayo. Por ej.: no todos los laboratorios tienen distintos equipos para la determinación del mismo analito. Por lo tanto con solo cambiar uno de estos factores se estaría en condiciones de precisión intermedia. Esta medida de la precisión es reconocida como la más representativa de la variabilidad de los resultados en un laboratorio y, como tal, más aconsejable para ser usada. Para determinar la precisión intermedia de un método, se efectúan mediciones por duplicado, o en ensayo único, sobre la muestra, en las condiciones predefinidas, pues existen varios métodos para estudiar este tipo de precisión. Cuando es aplicable, este procedimiento es repetido sobre otras muestras, abarcando otros niveles de concentración. Se determina un RSD% de precisión intermedia y se define un criterio de aceptación, quedando a criterio del laboratorio utilizarlo Un método simplificado para estimar la precisión intermedia se basa en la ejecución de n mediciones (n ≥ 15), en condiciones predefinidas, sobre: - una misma muestra - muestras presumiblemente idénticas - patrones o materiales de referencia.

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En la siguiente tabla, se presenta un resumen de la determinación de la repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia.

.Repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia

Ensayar: Patrones, materiales de referencia o

muestras blanco fortificadas a varias

concentraciones a lo largo del intervalo de trabajo

Repeticiones independientes

¿Qué calcular a partir de los datos?

Comentarios

a) Mismo operador, equipo, laboratorio, período corto

≥ 7

Determinar la desviación estándar de cada concentración

Determinar la desviación estándar de la repetibilidad de cada concentración (RSD%rep)

b) Operadores y equipos diferentes, mismo laboratorio, período extendido (precisión intermedia)

≥ 7


Determinar la desviación estándar de la (precisión intermedia) reproducibilidad intralaboratorio de cada concentración (RSD%repro)

c) Operadores, equipos y laboratorios diferentes, período extendido

≥ 7


Determinar la desviación estándar de la reproducibilidad interlaboratorio de cada concentración. Requiere estudio de colaboración

Tabla III 6.1.3 Especificidad y selectividad Una muestra, de manera general, está constituida por los mensurandos, la matriz y otros componentes que pueden tener algún efecto en la medición, pero que no se desea cuantificar. La especificidad y la selectividad están relacionadas con la detección.

La selectividad es la aptitud de un método para medir o evaluar selectivamente un mensurando dentro de una matriz compleja.

La especificidad es la aptitud de un método para medir exclusivamente el mensurando. Para poder diseñar la metodología de evaluación más apropiada es necesario comprender los diferentes mecanismos que causan interferencias cuando se determina el mensurando de interés. El método de ensayo puede tener diferentes desempeños debido a que los reactivos, la matriz u otros componentes alteran la sensibilidad del sensor que mide el mensurando de interés o porque estos componentes afectan directamente a la respuesta. Al mismo tiempo pueden ocurrir errores constantes debido a interferencias y errores proporcionales debido al denominado efecto matriz.

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Las metodologías empleadas para evaluar la especificidad y la selectividad son: - adición de patrón - ensayo de múltiples componentes o - cambios en el pretratamiento, la separación o la detección. 6.1.4 Linealidad y No – Linealidad de un método La relación entre el mesurando y la respuesta genera un tipo determinado de relación, que puede ser lineal o no-lineal, incluso puede haber casos en los que se presenten rangos determinados dentro del intervalo de operación lineales y el resto no serlo. Es preciso determinar la relación entre el mensurando y su respuesta, a través de todos los parámetros involucrados, así como del coeficiente de correlación involucrado en cada relación de dependencia ensayado. Cualquiera sea el caso de relación encontrada para el ensayo en particular, es preciso determinar:

La ecuación de relación

El coeficiente de correlación ( r)

El gráfico A continuación se presentan algunas relaciones posibles a ensayar, con: y la variable dependiente o

respuesta, x la variable independiente o mensurando, y las constantes: ia R siendo i = 1 a n N U

{0} y b R.

Relación lineal: 01 axayb

Relación cuadrática: 01

2

2 axaxayb Notar que si 02 a , se convierte en la

ecuación lineal presentada en el caso anterior.

Relación polinómica: n

i

i xayb0

Notar que si n=2 se convierte en ecuación

cuadrática y si n=1 lineal. Por lo tanto, es el caso más genérico que abarca los dos primeros casos presentados.

Relación exponencial: n

x

i

i

eayb0

Notar que es el caso más genérico, al igual

que la relación polinómica presentada.

Relación logarítmica: n

i

ic xayb0

log El logaritmo puede ser en base neperiana

(e), en base 10, o cualquier otra considerada. Para esto, es importante el sumando a la derecha cumpla la definición de logaritmo, de manera de tener significado la expresión presentada.

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6.1.5 Intervalo de trabajo Para cualquier método cuantitativo, existe un intervalo de concentraciones del mensurando en el cual el método puede ser aplicado. En el límite inferior del intervalo de concentración, los factores limitantes son los valores de los límites de detección y de cuantificación. En el límite superior, los factores limitantes dependen del sistema de respuesta del equipo de medición. Dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo de respuesta lineal y dentro de éste la respuesta de la señal tendrá una relación lineal con el mensurando. La extensión en este intervalo puede ser establecida durante la evaluación del intervalo de trabajo. El intervalo lineal de trabajo de un método de ensayo es el intervalo de trabajo en el que la relación entre la concentración del mensurando y la respuesta presentan linealidad, con la precisión y exactitud ensayadas, bajo las condiciones especificadas para el ensayo. Para ensayos de detección, el límite inferior del rango está dado por el límite de detección, en tanto que para ensayos de cuantificación, el límite inferior está dado por el límite de cuantificación.

Metodologías para la determinación del intervalo de trabajo e intervalo lineal

Nº de Replicas

Matriz Procedimiento

Etapa (1): ≥ 7 (siete)

- Blanco con adición de concentraciones variadas del mensurando o, - Blanco de la muestra con adición de concentraciones variadas del mensurando. Observación: preparar diferentes concentraciones de modo independiente y las alícuotas de la misma solución madre.

Objetivo: identificar inicialmente, el intervalo lineal aproximado y los límites superior e inferior del intervalo de trabajo. - Colocar en el eje x las concentraciones del mensurando y en el eje y las respuestas de las mediciones. - Ir a la etapa (2).

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Etapa (2): ≥ 7 (siete) en el intervalo lineal

- Materiales de referencia (diferentes concentraciones), en el intervalo lineal o - Blanco de la muestra con adición de concentraciones variadas del mensurando, en el intervalo lineal.

Objetivo: determinar el intervalo de trabajo y confirmar la linealidad. - Colocar en el eje x las concentraciones del mensurando y en el eje y las respuestas de las mediciones. - Verificar visualmente la existencia de valores dispersos que puedan interferir en la regresión (antes de remover los dispersos hacer determinaciones en las proximidades de las concentraciones). - Calcular los coeficientes de la recta de regresión. - Calcular y hacer el gráfico de los valores de los residuos para cada valor de x (residuo es la diferencia entre el valor observado y el valor calculado por la ecuación de la recta de regresión). La distribución aleatoria en torno de la línea recta confirma la linealidad. - Ir a etapa (3).

Etapa (3): ≥ 7 (siete)

Blanco de la muestra con adición de concentraciones variadas del mensurando, próximas al LD

Objetivo: determinar el límite de cuantificación (LQ), que efectivamente forma el límite más bajo del intervalo de trabajo. - Expresar el LQ como la concentración más baja del mensurando que puede ser determinada con un nivel aceptable de incertidumbre.

Tabla IV Observaciones: Blanco: agua destilada o desionizada Blanco de la muestra: matriz de la muestra sin el mensurando de interés. 6.1.6 Sensibilidad Para una respuesta lineal dentro del intervalo de trabajo, la sensibilidad puede ser expresada por la pendiente de la recta de regresión de calibración, y se determina simultáneamente con las metodologías para la evaluación de la linealidad. La sensibilidad depende de la naturaleza del mensurando y de la técnica de detección utilizada. 6.1.7 Límite de detección Para la validación de un método de ensayo, es normalmente suficiente proporcionar una indicación del nivel en que la detección del mensurando puede realizarse. En general esto puede obtenerse a partir de la curva de calibración y corresponde con: “blanco + 3s” y “0 + 3s” (en la cual s es la desviación estándar). En la siguiente tabla se presentan las metodologías para las evaluaciones cuantitativas del límite de detección.

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Evaluación del límite de detección (LD)

Nº de Replicas

Matriz Cálculos Observaciones

≥ 7 Blanco de la muestra

LD = X + ts donde: X = media de los valores de los blancos de la muestra; t es la abscisa de la distribución de Student, dependiente del tamaño de la muestra y del grado de confianza y, s = desviación estándar de los blancos de la muestra

La media y la desviación estándar de los blancos de la muestra son dependientes de la matriz. Válido solamente cuando los valores de los blancos presentan una desviación estándar diferente de cero.

Tabla V Se calcula la varianza (s2) y la desviación estándar (s) de las mediciones por duplicado. La fórmula para el cálculo del LD es: LD = t(n−1, 1−α ) . (s) El LD para cada mensurando debe ser expresado en las unidades apropiadas, de acuerdo con lo establecido en el método de ensayo. Se debe identificar la matriz usada para evaluar el LD. 6.1.8 Límite de cuantificación Para los ensayos cuantitativos es necesario asegurar que el método de ensayo informa resultados que sólo son atribuibles al mensurando. El límite de cuantificación (LQ) se toma como 10 veces la desviación estándar. Algunas veces es también denominado “límite de determinación”. En la práctica, corresponde normalmente al patrón de calibración de menor concentración (excluido el blanco). Este límite, después de haber sido determinado, debe ser ensayado para averiguar si la exactitud y la precisión conseguidas son satisfactorias, a través del método de adiciones de concentraciones conocidas. La siguiente tabla presenta un resumen del método de determinación del límite de cuantificación.

Evaluación del límite de cuantificación (LQ)

N º Replicas Matriz Determinación

≥ 7 Blanco de la muestra LC = X + 10s, donde: X = media de los valores de los blancos s = desviación estándar de los blancos

Tabla VI

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6.1.9 Robustez La robustez evalúa la sensibilidad que el método de ensayo presenta a las pequeñas variaciones en las condiciones operativas. Un método se dice robusto si se revela prácticamente insensible a pequeñas variaciones que puedan ocurrir cuando éste está siendo ejecutado. Para determinar la robustez de un método de ensayo, se puede recurrir al test de Youden. Se trata de un test que permite no sólo evaluar la robustez del método, sino también ordenar la influencia de cada una de las variaciones en los resultados finales, indicando cuál es el tipo de influencia de cada una de esas variaciones. La siguiente tabla presenta un ejemplo de los efectos de las modificaciones en diversos factores de influencia. Para esto se realiza 8 ensayos separados para determinar los efectos de la variación de las 7 diferentes etapas, en el método de ensayo. Las 8 mediciones pueden ser realizadas en un orden aleatorio.

Ejemplo de variación en los factores para la determinación de la robustez

Factor Nominal Variación

Tiempo de agitación 10 min 12 min

Tamaño de muestra 5 g 10 g

Concentración ácida 1M 1,1M

Temperatura de calentamiento 100 ºC 95ºC

Tiempo de calentamiento 5 min 10 min

Agitación si no

pH 6,0 6,5

Tabla VII 6.1.10 Incertidumbre de los resultados La incertidumbre caracteriza la dispersión de los valores atribuibles al mensurando, basándose en la información utilizada para obtener los resultados. En los documentos presentados en el Anexo II se encuentra informaciones detalladas sobre incertidumbre de las mediciones.

6.2 ANEXO II – Herramientas alternativas y adicionales para la validación En algunas oportunidades no es económica o técnicamente factible llevar a cabo los estudios de validación, por lo cual el laboratorio debe emplear herramientas alternativas y adicionales que le permitan demostrar que ha efectuado la confirmación de que los métodos empleados son aptos para el uso específico. 6.2.1 Comparación de métodos (Utilizado para determinación de veracidad) Consiste en la comparación de los resultados obtenidos por un nuevo método con los conseguidos con un método de referencia. El objetivo es estudiar el grado de proximidad de los resultados obtenidos por los dos métodos de ensayo.

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Los ensayos son efectuados por duplicado, utilizando los dos métodos de ensayo, por separado, sobre las mismas muestras, en un intervalo restringido de concentraciones o en todo el intervalo de concentraciones en que se pretende validar el método. Existen varias técnicas estadísticas para comparar los resultados obtenidos. 6.2.2 Programas interlaboratorios La Guía ISO/IEC 43-Parte 1 distingue entre los usos de comparaciones interlaboratorios para ensayo de aptitud para la determinación del desempeño del laboratorio, como para otros propósitos tales como: - establecer la eficacia y la comparabilidad de nuevos métodos de ensayo - comprobar el desempeño de métodos establecidos - determinar las características de desempeño de un método.

Los ensayos de colaboración son una forma especial de ensayo para evaluar el desempeño de un método en las condiciones normales de trabajo en varios laboratorios, por medio de ensayo de muestras homogéneas preparadas cuidadosamente.

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Directriz Validacion -OUA