DNA 抽取和质粒 DNA制备

提取 DNA 总的原则1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的

污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶

剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如 RNA ，也应尽量去除。

核酸分子抽提的技术设计核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的

方法）核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液

核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀可去除部分杂质与某些盐离子

加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）

少数盐类可使用 70-75% 的乙醇洗涤

鉴定与保存

（一）核酸的鉴定

浓度鉴定

纯度鉴定

完整性鉴定

浓度鉴定1 紫外分光光度法：测定 DNA 在 A260nm 的光吸收值。 如计算 DNA 浓度

A260×稀释倍数 ×50 ＝ μg/ml

紫外分光光度法只用于测定浓度大于 0.25ug/ml 的核酸溶液。

(A 值等于 1 时，相当于 50μg/ml 双链 DNA ， 40μg/ml 单链 DNA或 RNA ， 33 μg/ml 单链寡核苷酸）

2 荧光光度法

荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发

出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。

适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（ 1-

5ng）

纯度鉴定1 紫外分光光度法：

在 260nm 和 280nm 处测定 DAN 溶液的光吸收，纯的

DNA ，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此

值表明有 RNA 的残留量。

A260与 A280 之比应在 1.80 ；纯的 RNA A260与 A280 之比

应在 2.0 。

A260/A280 比值是纯度检测的重要指标。

• 2 荧光光度法• 核酸电泳结果进行评定。

完整性鉴定凝胶电泳法： 基因组 DNA 电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，

可出现电泳图谱脱尾现象；

总 RNA 电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA 降解；如加样槽中存在条带，可能是 DNA 污染。

                                                                                

正常时， 28S

RNA 的荧光强度

约为 18S RNA

的 2 倍，否则提

示 RNA 的降解

核酸的贮存—— DNA 保存 1 、短期贮存：

4℃ 或 -20℃ 存放于 TE （ tris 和 EDTA ）缓冲液中。

TE 缓冲液的 PH 与 DNA 贮存有关， PH 为 8 时，可减少DNA 脱氨反应， PH 低于 7.0 时 DNA 容易变性。

2 、长期贮存：

TE 缓冲液中 -70℃ 保存数年；在 DNA 溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。

核酸的贮存—— RNA 保存• RNA 可溶于 0.3mol/L 的醋酸钠溶液或双蒸水，

在 -70℃ 保存。

• RNA 可溶于 70% 的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶

液中，可在 -20 ℃ 保存。

• RNA 如果以 DEPC （焦碳酸二乙酯）可以抑制

RNA 酶对 RNA 的降解

基因组 DNA 的分离与纯化

DNA 样品准备

常见的标本：

血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等

生物组织：

最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存

－ 70℃ 或液氮

DNA 提取

1 酚抽提法：

先用 EDTA 、 SDS 、蛋白酶 K 破碎细胞，消化蛋白，然后用 pH8 的 Tris饱和酚或酚 - 氯仿抽提 DNA ，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获 DNA 大小为 100－ 150kb 。

主要试剂的作用：

EDTA ： 1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；

2 降低细胞膜的稳定性

SDS 的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；

2 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸

释放出来；

3 对 RNA 、 DNA 酶有抑制作用；

4 与蛋白质形成 R-O-SO3 ….R 蛋白质复合物，使蛋白质变性。

蛋白酶 K ：

水解蛋白质的作用，消化 DNA 酶和细胞中的蛋白质。

蛋白酶 K 与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能

力，而且在 SDS 、 EDTA 存在时仍保持较高活性，可

同时使用。

• 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制 DNA 酶活性。• PH8.0 的 Tris 溶液可以似的抽提出的 DNA

进入水相，减少在蛋白质层滞留。• 在酚或酚 - 氯仿中加入少许的异戊醇，是可以

减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。

• 2 甲酰胺解聚法：

• 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与 DNA

的结合，再透析获得DNA 。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白

质与 DNA 的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次

抽提的步骤

• 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的 DNA 样品。

可得DNA 200kb左右。

• 3 玻璃棒缠绕法：

• 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇

上，然后用带钩或 U 型玻璃棒在界面轻

搅， DAN 沉淀液绕于玻棒。生成 DNA

约 80kb 。

• 4 异丙醇沉淀法：基本同 1 法，仅用二倍容积异丙醇替

代乙醇，可去除小分子 RNA （在异丙醇中可溶状态）。

• 5 表面活性剂快速制备法：用 Triton X-100 或 NP40

表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，

乙醇沉淀或透析。

• DNA 样品的纯化：透析、层析、电泳及选择性沉淀。

• 电泳法简单、快速，是 DNA 样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。 PAGE

分辨率高，适用于 5-500bp 大小的片段。

琼脂糖含量％（W/V） 线性 DNA分离范围（ Kb）

0.3  5 - 60

0.6 1 - 20

0.7 0.8 - 10

0.9 0.5 - 7

1.2 0.4 - 6

1.5 0.2 - 3

2.0 0.1 – 2

DNA 的浓缩

• 1 、 固体聚乙二醇（ PEG ）浓缩：用透析袋外敷 PEG至合适量。

• 2 、 丁醇抽提浓缩： DNA 溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但 DNA 不会。因此重复几次可显著减少 DNA体积。

DNA 的检测

溴乙锭染色 ：在 254nm 紫外光下检测，如需回收

最好在 300nm 紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在 1cm宽带上可检到 10ng DNA 。

银染法 ： Ag+ 与 DNA形成复合物，在甲醛还原下

可染成黑褐色，灵敏度高 200 倍，但不能回收。

DNA 分析

通常与已知分子量的标准 DNA片段一起电泳，经比较可获知 DNA 标本大小，如条带拖尾，系加入 DNA 量太多或凝胶未制好，如分子量小或一片糊状，表示 DNA 有降解。

DNA回收

主要是从电泳中分离回收 DNA片段。

回收原则：尽量提高回收率

去除回收 DNA 样品中的污染物

电泳到 DEAE-纤维素膜 ：

DEAE 是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的 DNA 分子。

在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带 DNA都到膜上，取出

洗下。

500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过 10kb

和单链DNA。

透析袋电洗脱 ：

切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲

液后继续电泳， DNA 出胶后进行抽提 DNA

回收。

低熔点琼脂糖凝胶：

切下胶，加热到 65℃熔化胶，然后抽提回收

DNA 。

方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶

等。

玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度

的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合

DNA ，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液

中将 DNA 洗脱下。

琼脂水解酶：将含 DNA 的凝胶进行消化，

琼脂糖水解成二糖，释放 DNA ，后使

用酚抽提方法回收 DNA