DNA REPLİKASYONU

(DNA EŞLEŞMESİ)

Prof. Dr. Turgut Ulutin

DNA REPLİKASYONU

• Replikasyon genetik materyelin tamamen kendi

benzeri yeni bir molekül oluşturma işlemidir.

• DNA kendini eşleyebilen yegane biyomoleküldür

• Replikasyon sonrası ana DNA molekülü ile tüm

nukleotid dizisi tamamen aynı olan DNA

molekülü ortaya çıkar.

• Böylece DNA da taşınan genetik bilgi her

replikasyon olayı ile dölden döle aktarılır.

• Ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonu

mitoz veya mayoz bölünmeye hazırlanan

hücrelerin hücre siklusunun sentez

fazında gerçekleşir.

• DNA replikasyonu yarı koruyucu bir model ile açıklanır.

• Bu model iki zincirli sarmal DNA nın her bir ipliğinin kalıp görevi yaparak kendine yeni bir eş DNA ipliği oluşturması işlemidir.

• Böylece bir ana molekülden yeni oluşan her bir yavru molekül, ana DNA nın bir zincirini taşıyacaktır

• İlk kez Meselson ve Stahl (1958)

deneyleri ile DNA nın yarı koruyucu tipte

bir replikasyon gerçekleştirdiğini

kanıtlamişlardır.

DNA Replikasyonunun Temel

Mekanizmaları:

Hem prokaryotik hemde ökaryotik hücrelerde replikasyonun temel mekanizmaları aynıdır.

• Replikasyon başlangıç noktalarının tayini

• DNA çift ipliğinin çözünmesi

• Replikasyon çatalının oluşması

Replikasyon başlangıç noktalarının

tayini:

• Replikasyonun gerçekleştiği genom birimine replikon denir.

• Her replikonda bir başlangıç ve bir bitiş noktası vardır.

• Prokaryotlarda çembersel DNA da bir başlangıç ve bir bitiş noktası,

• Ökaryotik hücrede ise çok sayıda başlangıç ve bitiş noktaları vardır.

• Ökaryotiklerde her bir başlangıç noktası

arasında 30-300 kilobazlık bir mesafe bulunur.

(1 kilobaz=1000 baz).

• Başlangıç noktaları özel nukleotid dizilerinden oluşur ( A ve T den zengin tekrarlayan nukleotid dizileri)

• ve “diziye özel olan DNA ya bağlanan proteinler = başlatıcı proteinler” tarafından tanınır.

• Bu proteinlerin başlangıç noktalarına bağlanması ile replikasyonun ilk adımı atılır.

Saccoromyces cerevisia da;

Replikasyon orijin noktalarında 11

nukleotidlik bir dizinin tekrarı

saptanmıştır.

(A veya T)TTTAT(A veya G)TTT(A veya T)

DNA çift ipliğinin çözünmesi

• Replikasyonun başlıyabilmesi için DNA çift

zincirinin sarmal yapısının çözülmesi

gereklidir.

• Çözülme işlemi başlatıcı protein

kopleksinde yer alan DNA helikazlar ile

gerçekleştirilir.

Replikasyon çatalının oluşması

• Helikaz aktivitesi ile açılan

çift zincirde replikasyonun

olduğu bölgeye

replikasyon çatalı denir.

• Replikasyon olayı

“replikasyon çatalı”nın ana

DNA molekülü boyunca

ilerlemesi ile gerçekleşir.

Replikasyon çatalında replikasyonda iş gören 4 temel yapı vardır;

• DNA helikaz, DNA sarmalını çözen enzim

• Primaz, DNA sentezinin başlıyabilmesi için gerekli olan RNA primerlerini (RNA öncül molekül) sentezleyen enzim

• DNA Polimerazlar, kalıp zincire komplamenter yeni DNA zincirini sentezleyen enzim

• Tek zincire bağlanan (SSB) proteinler, replikasyon çatalının sürekliliğini saglayan ,tek DNA ipliğine bağlanarak katlanmayı önleyen proteinler

DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen

zincirin yönü) 5’ 3’ ucuna doğrudur

DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen

zincirin yönü) 5’ 3’ ucuna doğrudur

DNA molekülü birbirize zıt yönde paralel iki zincir içerdiginden (biri 5’ 3’ diğeri 3’ 5’) sentezin aynı anda ve devamlı olarak ilerlemesi mümkün değildir.

• Bu nedenle replikasyon çatalında iki farklı sentez tipi ortaya çıkar.

1- Devamlı iplik (DNA) sentezi

( 3’ 5´ kalıbına uygun sentez )

2- Kesikli iplik (DNA) sentezi

( 5´ 3´ kalıbına göre yapılan sentez)

• Kesikli DNA zincirlerinin

oluşumunu deneysel

olarak gösteren Okazaki

ve Ark.(1968) dan dolayı

bunlara

Okazaki Parçaları

adı verilmiştir.

(ökaryotlarda 100-200

nukleotidlik parçalar)

• Her bir Okazaki

parçasınında

başlangıcında RNA

primerleri bulunmaktadır.

Kesikli zincir

Devamlı zincir

• Replikasyon ilerledikçe RNA primerleri

kesilip çıkarılır

• ortaya çıkan boş alanlar DNA polimerazlar

tarafından kalıp DNA ya uygun olarak

sentezlenir

• ve iki DNA ucu ligaz enzimi ile

birleştirilerek bir bütün DNA ipliği oluşur.

• Ökaryotiklerde replikonlarda tamamlanan

DNA parçalarıda yine ligaz enzimi ile

birleştirilir.

• Ökaryotik DNA polimerazlar

• α, β, δ, γ, ve ε.

γ : mitokondriumda bulunur .

mtDNA replikasyonunda iş görür

• Diğerleri nukleusta bulunur.

• α: kesikli ipliğin sentezi.

• β: DNA tamiri.

• δ: devamlı ipliğin sentezi.

• ε: DNA tamiri.

• Ökaryotiklerde DNA molekülünün

prokaryotlardan daha büyük olması ve

histon proteinleri ile kromatin yapı

oluşturmaları nedeniyle farklı sentez

aşamaları gözlenir.

Ökaryotik hücrelerde replikasyon adımları

• Replikasyon orijin noktalarının tayini

• DNA çift ipliğinin çözünmesi

• Replikasyon çatalının oluşması

• DNA polimeraz aktivitesi, sentez ve uzama

• Replikasyon kabarcıklarının oluşması

• Yeni sentezlenen DNA parçalarının birleştirilmesi

• Kromatin yapısının yeniden oluşumu

• Ökaryotik DNA da replikasyon orijinleri, 20 ila

80 orijinlik gruplar şeklinde (bir

replikon=replikasyon ünitesi) aktiflenirler.

• Tüm DNA replike oluncaya kadar S fazı

boyunca yeni replikasyon orijinleri aktiflenmeye

devam eder.

• Bir replikasyon ünitesi içinde , her bir başlangıç

noktası birbirinden yaklaşık 30 000 - 300 000

nukleotidlik aralıklarla bulunur.

• Replikasyon orijin noktasından başlayan ve zıt

yönde ilerleyen replikasyon çatalları replikasyon

kabarcıkları oluşturur.

Replikasyon uç problemi

Telomer-telomeraz

• DNA replike oldukça yeni sentezlenen

histonlar ile kromatin şeklinde yeniden

düzenlenir.

• Histonlarda hücre siklusunun S fazında

sentezlenir.

• S fazı boyunca aynı kromozomun farklı

bölgeleri farklı zamanlarda replike olur.

• Kondens kromatin (heterokromatin) geç S

fazında replikasyona uğrar

• Aktif kromatin (ökromatin) erkan S fazında

replikasyona uğrar

örneğin; aktif X kromozomu S fazı boyunca,

inaktif X kromozomu geç S fazında

replike olur

DNA Repliasyonunda Topoizomerazlar

• Replikasyon çatalında ortaya çıkan

Süperkıvrımların açılması-çözülmesinde iş

görürler

• topoizomeraz l ;Tip I tek iplikli DNAyı keser

topoizomeraz ll ;Tip II çift iplikli DNAyı keser

DNA TAMİRİ

DNA TAMİRİ

• DNA molekülünün yapısında meydana

gelen bir değişiklik şifrelerinde değişikliğe

yol açacagından hatalı protein

üretilmesine çeşitli mutasyonların, farklı

fenotiplerin veya hastalıkların ortaya

çıkmasına neden olur.

• DNA molekülünün içerdiği bilginin

değişmeden aktarımı-devamlılığı için,

replikasyon sırasında veya çevresel

faktörler ile DNA da oluşan hatalar bir seri

enzim tarafından düzeltilir.

DNA da oluşan hasarlar iki şekilde olabilir

• Replikasyon sırasında

• Çevresel etkilerle

**Fiziksel (UV ışınları veya radyasyon)

**Kimyasal ajanlar

• Her iki etkiylede ortaya çıkabilecek hatalar

DNA nın bazyapısında bir değişim veya

yapısında ortaya çıkan bir değişim şeklinde

olabilir.

Hasar Tipleri:

1-Tek baz değişimleri;

• Depurinasyon

• Deaminasyon (sitozinin urasile, adeninin hipoksantine dönüşümü)

• Nukleotid kaybı veya kazanımı

• Baz analogları ile yer değişimi

2- İki baz değişimi ;

• Timin-timin dimeri (U.V.etkisi ile)

3- Zincir kırıkları ( İyonizan ışınlar , X-ışını, etkisi ile)

4- Zıt bağlantılar kurulması;

• Aynı veya zıt ipliklerdeki bazlar arasında

• DNA ve protein molekülleri arasında (örn:histonlar)

• DNA üzerindeki hasarlı bölgeler

3 mekanizma ile düzeltilir;

1- Hatalı eşleşmenin tamiri ile

2- Baz çıkarımı ile

3- Nukleotid çıkarılması ile

Mekanizma Problem

• Hatalı eşleşmenin tamiri *Kopyalama hatası

(1,2 veya 5 bazlık hatalı eşleşmeden

dolayı DNA da ki hasar)

• Baz çıkarımı *Spontan, kimyasal veya radyasyon

etkisi ile tek bazdaki hasar

• Nukleotid çıkarımı *Spontan, kimyasal veya radyasyon

etkisi ile bir DNA segmentindeki hasar

DNA tamir mekanizmasında ki ( örneğin

deaminasyon için) işlem dizisi sırası ile;

• Anormal bazın tanınması ; N-glikozilaz enzimi ile

• Apurinik veya aprimidinik endonukleaz ile kesim

(hatalı bölgenin kesilip atılması)

• DNA polimeraz beta ile DNA sentezi ( boşluğun

doldurulması)

• Ligaz ile iki DNA ucunun birleştirilmesi

DNA tamir sendromları

• DNA tamir mekanizmasındaki yetersizlik

veya eksiklikler insanda önemli kalıtsal

hastalıklara yol açar.

• Tamir mekanizmasına katılan enzim veya

proteinlerin gen defektlerine bağlı olarak

insanda otosomal ressesif kalıtım

gösteren DNA tamir sendromları vardır.

• Xeroderma pigmentosum (XP) ;

DNA nın UV ışığa aşırı hasasiyetine bağlı olarak

gelişen bir genetik temelli deri hastalığıdır.

Kişilerde güneşe aşırı hassasiyet, UV den

etkilenen bölgelerde çeşitli deri kanserlerinin

oluşumuna yatkınlık gözlenir.

Moleküler mekanizmasında,UV ile hasarlanan

DNA nın onarılamaması , bozuk eksizyon (kesip-

çıkarma) enzimi veya bozuk helikaz enzimi

olduğu tespit edilmiştir.

DNA tamir genleri • ilk kez mayalarda radyasyona hassasiyet genleri olarak

bulunmuş ve RAD genleri olarak isimlendirilmiştir.

• İnsanda da DNA tamir genleri olarak bilinen ve hasarlandığı zaman yukarıda verilen sendromlara neden olan genlerden bazıları ve ürünleri şunlardır,

Gen Ürün

• XPA Hasarı tanıma enzimi

• XPB Helikaz

• XPC DNA ya bağlanan proteinler

• XPD Helikaz

• XPF 5’ nukleaz

• XPG 3’ nukleaz

Ataxia telangiectasia (AT) ;

• İyonizan radyasyon (X - ışınları) etisi ile

ortaya çıkan DNA hasarının onarılamaması

• Kas kontrol kaybı,immun sistem bozuklukları,

kansere yatkınlık (lösemi ve lenfoma gibi).

• Moleküler temelinde anormal DNA sentezi

yatar.

Fanconi anemia ;

• UV ve bazı kimyasallar nedeniyle DNA hasarının meydana gelmesi ve eksizyon enzim eksikliği nedeniyle tamir olmaması hastalığın altında yatan nedendir.

• Azalmış kan hücreleri, kalp ve böbrek malformasyonları, deride pigmentleşme, kanser ve kromozom anomalileri klinik bulgularıdır.

MUTASYON

MUTASYON

• Mutasyon; DNA dizilerinde ( “genotipte”),

meydana gelen kalıtsal değişiklerdir.

• Mutasyon; gen ürünü olan protein yapısında değişikliğe yada o proteinin hiç yapılmamasına neden olabilir.

• Mutasyon ; hücre veya organizmada kısmi bozukluklara neden olabilir.

• Mutasyona uğramış organizma yada

hücreye MUTANT denir

görünüş, fizyolojik işlemler veya

davranışlardaki farklılıklar ile

yabani=mutasyona uğramamış

organizmalardan ayırt edilirler

Mutasyonlar

• 1. Spontan (kendiliğinden )

• 2. İndüklenebilir (yapay- yönlendirilmiş)

• DNA replikasyonu sırasında düşük oranlarda

purin veya pirimidin bazlarında meydana

gelen değişiklerden kaynaklanır

• Çoğu DNA tamir mekanizmaları ile kaldırılır.

• Tamir olamayanlar Mutasyonlar olarak ortaya

çıkar.

• Mutasyon DNA tamir mekanizmasındaki

yetmezlik sonucudur.

Spontan mutasyonlar

• Hücre veya organizmanın çevresel koşullardan etkilenmesi sonucu DNA da ortaya çıkan yapısal değişiklerdir

Mutajenler

• Fiziksel (U.V ışınlar, İyonizan ışınlar,

Manyetik alan, Sıcaklık)

• Kimyasal (kanserojen ajanlar

örn; aflotoksin-B1, nitröz asidi,

Alkilleyici ajanlar)

İndüklenebilir mutasyonlar

Mutasyon Tipleri

1- Gen Mutasyonları

2- Kromozom Mutasyonları ( yapı ve sayı

değişimi ) (büyük ölçekli Mutasyonlar)

Mutasyon Tipleri

1. Gen Mutasyonları

• Tek baz değişimleri

** Yanlış eşleşme

** Anlamsız mutasyon

** Sessiz mutasyon

• Kırpılma-yeri mutasyonları

2. Kromozom Yapı-Sayı Değişikliği Mutasyonları

** Nukleotid Katılım veya Çıkarım mutasyonları

** Duplikasyonlar

** Translokasyonlar

Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)

• Bir bazın, bir diğeri yer değiştirmesidir

• Eğer bir purin ( A veya G) veya bir pirimidin (C

veya T) bir diğeri ile yer değiştirirse buna

transisyon adı verilir.

• Eğer bir purin, bir pirimidin ile yer değiştirirse

veya tersi olursa buna transversiyon adı verilir

GAG -------- Glutamik asit

GTG -------- Valin

Örneğin Orak hücre anemisi

17. Nukleotidte A yerine T geldiğinde hemoglobinnin beta

zincirindeki gende GAG ( glutamik asit) ile GTG (valine).

yer değiştirir

Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)

• Bazı nukleotid değişimleri anlamsız

kodon (sonlandırıcı=stop kodonlar)

ortaya çıkmasına neden olur

TAA, TAG, veya TGA

• Bu kodonlar mRNA nın o noktalarda

translasyonu durdurmasına neden olur

ve kısa proteinler (disfonksiyonel

proteinler) oluşur.

Tek-Baz değişimleri ( Nokta Mutasyonları)

• Örn; Kistik fibroziste 1609. Nukleotid te

oluşan baz değişimi

CAG ---------- TAG

Glutamin -------- sonlandırıcı kodon

• oluşan protein 1480 amino asid (a.a)

yerine 493 a.a lik bir proteindir ve

fonksiyonsuzdur.

Sessiz mutasyon

• Bazı a.a ler birden fazla kodona sahiptirler

örn:Serin TCT

TCA

TCC

TCG

• Üçüncü baz değişiminde yine serin a.a. i polipeptitde yer alır.

Kırpılma-yeri mutasyonları

İnsersiyon - Delesyon

Bir genin DNA’ sından ekstra bir baz çiftinin

veya nukleotid dizisinin eklenmesi

İnsersiyon - çikarılması ise Delesyon

adını alır.

Sayı değişikliği birden - binlerce nukleotide

kadar değişir.

• İnsersiyon ve delesyon translasyon sırasında

codon kaymasına ve farklı okumaya neden olan

Çerçeve Kayması na neden olur.

• “Çerçeve kayması” bazen yeni bir

sonlandırıcı (=stop) kodon oluşmasına

neden olarak yeni bir anlamsız mutasyon

oluşur ve fonksiyonel olmayan kısa

proteinler üretilir.

Frajil -X Sendromu

• İnsanda X kromozomunun bir lokusunda

CGG tripleti çok sayılarda tekrarlanır

(CGGCGGCGGCGG,,,,,,,,)

yaklaşık 4000 den fazla

• Bu olay X kromozomunu kırılgan yapar ve

mental gerilik ile seyreden ciddi genetik

hastalık ortaya çıkar.

Kromzom mutasyonları;

translokasyon

• Burkitt lenfoma

Philadelphia kromozomu

Somatik – Germ hücre Mutasyonları

• Somatik mutasyonlar

Somatik hücrelerde (örn;Kemik iliği, karaciğer vs) ortaya çıkan mutasyonlar

* hücre hasarına,

* kanser hücresi oluşumuna,

* hücre ölümüne

neden olabilir

Somatik mutasyonlar oluştuğu hücre ile sınırlıdır ve döle geçiş yapmaz

• Germ hücre mutasyonları

Gametlerde ortaya çıkan mutasyonlardır ve dölden döle geçiş gösterir