Upload
sveta
View
183
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
DNA 的 复 制 DNA replication. 一、 DNA 复制假说. Watson 和 Crick 提出的 DNA 复制方式为半保留复制方式;. 全保留复制:亲代 DNA 分子完整的转移到子代中;. 散布式复制:亲代 DNA 片段分散在子代 DNA 分子中。. Meselson - Stahl 实验. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
DNA 的 复 制
DNA replication
一、 DNA 复制假说
Watson 和 Crick 提出的 DNA 复制方式为半保留复制方式;
全保留复制:亲代 DNA 分子完整的转移到子代中;
散布式复制:亲代 DNA 片段分散在子代 DNA 分子中。
• Meselson - Stahl 实验
1958 年, Meselson 和 Stahl 首先将大肠杆菌在含重同位素 15N 的培养基中培养约十五代,使所有细菌都被 15N 标记。然后移至只含有轻同位素 14N 的培养基中同步培养一代,二代,三代。分别提取DNA ,作 CsCl 密度梯度离心,观察 DN
A 的位置。
15N-DNA 14N-DNA 混合 1 2 3
对 15NDNA 、 14NDNA 杂交分子经加热变性,对于变性前后的 DNA 分别进行CsCl 密度梯度离心。
结果变性前的杂交分子为一条中间密度带,变性后则分为两条区带,即重密度带( 15NDNA )和低密度带( 14NDNA )。
* 1963 年 Cairns 用放射自显影方法阐明了大肠杆菌 DN
A 的复制是半保留复制且 DNA 是环状分子。
* 1957 年 Taylor 用 3H 脱氧胸苷的溶液标记蚕豆,证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。
● DNA 分子是以半保留凡是进行复制,不管是原核还
是真核生物。
二、半保留复制
1 、定义
DNA 在复制时 , 以亲代 DNA 的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代 DNA ,每个子代 DNA 中都含有一股亲代 DNA 链,这种现象称为 DNA 的半保留复制 (semi-cons
ervative replication) 。
• 模板• 原则• 特点
• 亲代的 DNA 双链,每股链都可作为模板• 按碱基配对原则指导新链的合成• 合成的两个子代 DNA 分子碱基顺序与亲
代分子完全一样• 一条链来自于亲代的 DNA 链,另一条链
是新合成的链
规律
亲代 DNA
子代 子代新合成 的链
半保留复制
2 、 DNA 半保留复制的类型
1 ) 线性双链: 双向、多重起始双向
2 ) 环状 DNA : θ 型(双向、单向)、 D 型、滚筒
θ
型双向
滚筒复制
φX174RF 是一个合成单链病毒圆环的模板
D
型复制
3 、参与 DNA 复制的物质
1 ) 底物:四种脱氧核糖核酸 :
即 dATP , dGTP , dCTP , dTTP
2 ) 模板: 亲代 DNA 链作为模板。
3 ) 引物: RNA 作为引物 (primer) ;原核生物 : 通常为 5
0 ~ 100 个核苷酸、真核生物 : 约为 10 个核苷酸; 其顺序与其模板 DNA 的碱基顺序相配对
4 ) DNA 聚合酶( DNA Polymerase ):• 以 dNTP 为前体催化合成 DNA
• 需要模板和引物的存在• 不能起始合成新的 DNA 链• 催化 dNTP 加到生长中的 DNA 链的 3’-OH 末端• 催化 DNA 合成的方向是 5'→3'
A 原核生物聚合酶
• DNA 聚合酶有三种• 具有多种酶活性的多功能酶• 参与 DNA 复制的主要是 polⅢ和 polⅠ。
• Kornberg 酶( 1956 年)• 400 个酶分子 / 每个细胞• 单链多肽( 109kD )• 大小二个片段(枯草杆菌蛋白酶处理)
DNA 聚合酶Ⅰ( DNA PolymeraseⅠ, PolⅠ )
3’ 5’ 5’ 3’3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶外切酶 聚合酶
N C
小片段 大片段( klenow 片段) (常用的工具酶)34kD 76kD
5’ 3’5’ 3’外切酶外切酶
5‘ - 3’ 聚合活性:
♦ 模板;
♦ 3‘ - OH 末端引物;
♦ 方向从 5’ - 3‘ 。
复制方向
DNA 聚合酶Ⅰ的校对功能 (3’-5’ 外切酶活性 )
错配硷基
5´3´
正确
核苷酸
5´3´3´
切除错配核苷酸
5’ - 3‘ 外切酶活性: ♦ 从 5’-P 端依次切除,可连续切除多个核苷酸; ♦ 只切配对的 5’-P 末端核苷酸; ♦ 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸;
♦ 对只有 5’ 末端的切口也有活性。
DNA 聚合酶Ⅰ的5‘ - 3’ 外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译,制造放射性探针。
• MW 为 120KD
• 100 个酶分子 / 每个细胞• 聚合作用 : 只有 DNApolⅠ的 5%
• 3’→5’ 外切酶活性• 无 5'→3' 外切酶活性• 对作用底物的选择性较强• 不是复制的主要聚合酶
DNA 聚合酶Ⅱ( DNA Polymerase Ⅱ , Pol Ⅱ )
• pol Ⅲ由十种共 22 个亚基组成• α亚基具有 5’→3’ 聚合 DNA 的酶活性• ε亚基具有 3’→5’ 外切酶的活性• θ亚基具有促进 ε亚基外切酶的活性
DNA 聚合酶Ⅲ( DNA Polymerase Ⅲ , Pol Ⅲ )
• 在复制叉处为一二聚体• 核心酶( core enzyme ): α 、 ε 、 θ 。 α :聚合作用;
ε : 3’ - 5’ 外切; θ :与亚基结合有关;• γ 、 δ 、 δ’ 、 χ 、 ψ 提高反应速率和持续性;• β :使 DNApol 能结合在 DNA上。 β亚基结合于 DNA 时消耗 ATP ;如同一个夹子,使 DNApolⅢ结合于 DNA 。
• τ :使两个 DNApol 单体形成二聚体,分别在复制叉的两个链上作用。
B 真核生物聚合酶
五种• DNA 聚合酶 α
• DNA 聚合酶 δ 和 PCNA
• DNA 聚合酶 γ
• DNA 聚合酶 β 、 ε 功能:• 参与随从链的合成• 参与前导链的合成• 参与线粒体 DNA 的合成• 参与 DNA 的修复
DNA 聚合酶 α β γ δ ε
蛋白质分子量( KD > 250 36-38 160-300 170 256
细胞定位 核 核 线粒体 核 核 5’ →3’ 聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’ 外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无
真核细胞几种主要 DNA 聚合酶的性质
5) 解链酶( unwinding enzyme/ helicase )
6 ) 引物酶( Primase )
♦ 本质:依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 ( DDRP ) Ecoli : 60kD , DnaG 编码
♦ 引发体 (primosome) :引物酶+引发前体(蛋白
因子 i 、 n 、 n” 、 dnaC 、 n’ 、 dnaB )
5´ 3
3´ 5´primase
DnaC
primosome
Helicase(DnaB)
• 蛋白因子 i 、 n 、 n” 与蛋白 dnaC跟引物预合成有关;
• 蛋白因子 n’ 和蛋白 dnaB 与识别复制起始点有关,并具有 ATPase 活性。
7 )单链结合蛋白
• single strand binding protein, SSB
• 能够与单链 DNA 结合的蛋白质因子• 稳定单链 DNA ,不形成发夹结构• 保护单链 DNA ,不受DNA水解酶作用• 可重复使用,在滞后链上不断摆动,冈崎片段
合成
8 ) 拓扑异构酶 (topoisomerase) : 可使 DNA拓扑异构体互变的酶。
切割 DNA 双链,此时不需 ATP ;尔后由 ATP供能,使 DNA 分子成负超螺旋再连接切口。
不需 ATP ,切割双链 DNA 中的一链,使 DNA松弛后 , 连接切口。
♦ TOPOⅠ:
♦ TOPOⅡ:
TOPO 酶:切割 DNA 链,使其松弛后再连接。
♦ 功能:与 DNA形成共价结合中间体,使 DNA磷酸二酯
键断裂,形成 DNAnick , DNA 的一条链进行解
旋旋转改变 DNA 分子的拓扑结构。
参与复制、转录、重组。
♦ 效应:可使 DNA发生:连环化( catenate )、脱连环化
( decatenate )、打结( knot )、解结( unknot )。
拓扑异构酶Ⅰ:MW= 100kD ,单肽链,含 3 - 4 个 Zn
作用:• 每次改变一个连环数;• 结合 DNA ,使该处溶解;• 形成酶- DNA 复合物;• 切割双链中的一股,使 DNA 中的一股链穿越切割点;• 断裂单链连接
拓扑异构酶Ⅰ作用机理示意图
作用:• 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。
拓扑异构酶Ⅱ:又称旋转酶。
广泛存在于各种生物中。
拓扑异构酶Ⅱ的作用机制
• Ⅰ 型: MW= 95kD ,单体蛋白,不需 ATP ;• Ⅱ型: MW= 150 - 180kD ,均为二聚体,需 ATP
和 Mg2+ 。
真核生物拓扑异构酶:
酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似,但与原核的酶有明显差异。
9 ) 连接酶• DNA 连接酶 (DNA ligase) 可催化两段 DNA 片段之
间磷酸二酯键的形成,而使两段 DNA 连接起来。• 需 3’-OH , 5’-Pi 基• 碱基互补• 只连 Nick ,不连 Gap
• 需要消耗能量
DNA 连接酶的作用
♦ T4Ligase 特性:
• 可连接 DNA 与 DNA ,也可连接 RNA 与 RNA ;• 可连接 DNA 中的单链切口,也可连接粘性末端切口和平砌末端切口;
• T4Ligase 可作为重组工具酶。
4 、半不连续复制( semidiscontinuous replication )
• 半不连续复制: 在 DNA 复制过程中,亲代 DNA 分子中以 3’ 5’
方向的母链作为模板指导新的链以 5’ 3’ 方向连续合成, 另一股以 5’ 3’ 为方向的母链则指导新合成的链以 5’ 3’ 方向合成 1000—2000 个核苷酸长度的许多不连续的片段(岗崎片段),这种复制方式称之为半不连续复制。
♦ 前导链( leading strand ):
DNA 复制时,一股以 3’ 5’ 方向的母链作为模板,指导新合成的链以 5’ 3’ 方向连续合成的链称为前导链。
(复制方向与解链方向一致)
♦ 随从链( lagging strand):
DNA 复制时,一股以 5’ 3’ 方向的母链作为模板,指导新合成的链沿 5’ 3’ 合成, 1000—2000 个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。
(复制方向与解链方向相反 )
♦ 岗崎片段( Okazaki ):
DNA 复制时,一股以 5’ 3’ 方向的母链作为模板,指导新合成的链沿 5’ 3’ 合成 1000—2000 个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。
岗崎片段由 DNA 连接酶连成一条完整的新链。
5、复制的过程
根据反应阶段和所需的不同酶类, DNA 的复制可被分为三个阶段,即复制起始、延伸和终止。
① 复制的起始阶段:包括起始点、复制方向和引发体 的形成 A 起始点( Ori ) DNA 在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具
有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点。
大肠杆菌中的复制起始点是 OriC ,全长 245Bp ,该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。
• 复制起点在复制过程中呈现叉子的形式,被称为复制叉(Replication fork)
• DNA 复制从起点开始进行直到终点为止,每一个这样的 DNA 单位称为复制子或复制单元 (replicon)
• 一个复制子只含有一个复制起点。• 原核生物中只有一个复制起点,一个复制子• 真核生物中可以从许多起始点同时进行,即有多个复
制子
B 复制方向
DNA 复制时,以复制起始点为中心,向两个方向进行复制。但在低等生物中,也可进行单向复制(如滚环复制)。这决定于在起始点形成 1
或 2 个复制叉。
C 引发体的形成
结合 Ori 区,具 ATP 酶活性促进 DnaB形成起始复合物
DNA螺旋酶
运输 DnaB
DNA 引发酶
促进起始复合物形成
a. 大约 20 个左右的 DnaA 蛋白首先与 OriC 中的 4 个 9 碱基重
复区相结合; HU 蛋白参与并促进这一过程;b. 识别并使 3 个 13 碱基串联重复区 DNA形成开环结构;c. SSB 和旋转每(拓扑异构酶)参入;
d. DnaB 蛋白在 DnaC 的帮助下与未解链序列结合。每六个 DnaB 蛋白形成一组并与一条 DNA母链结合,可在不方 向同时起始 DNA 的复制。 e. DnaG (引物酶)参入成引发体; f. 引发体合成先导链的 RNA 引物; g. DNApolmerase 组装和复制叉上二聚体形成; h. 在 RNA 引物 3‘ 端 DNA开始聚合
② 复制的延伸
• 前导链和滞后链由同一 polⅢ二聚体延伸• 滞后链合成与前导链不同步: ♠ 位于滞后链的引发体,在合成引物后, DnaG (引
物酶)可将模板链提起或成环,使 RNA 引物 3’ 端位于DNApolⅢ处
♠ DNApolⅢ在 RNA 引物 3‘ 端延伸 DNA随从链♠ 解链的滞后模板链被 SSB 结合,保持模板为单链状态,并保护其不被核酸酶水解
♠ 随冈崎片段的延伸, SSB 被 priA 除去,此过程需 A
TP 功能
整个复制过程如下:
在复制叉形成复制体( DnaB,β亚基与 DNA 结合,引发体形成, 2×pol Ⅲ复合体形成)
主导链 DNApol Ⅲ核心酶沿模板 3′ - 5′ 方向滑动,新链以 5′ - 3′延伸,滞后链上 β亚基结合于 模板上,引发体
(引发酶)合成引物, DNApol Ⅲ合成冈崎片段。
引物酶及引发体脱落,冈崎片段合成, β -亚基脱下。随从链上冈崎片段合成后, DNApol Ⅲ核心酶脱落。
β - clamp 结合在随从链新位点上
③ 复制的终止
当子链延伸达到 terminus region ( ter ,带有多个 20bp 序列)时, DNA 复制就终止了。 Ter 有点像一个陷井( trap ),使复制叉只能进入,不能出来。 Ter 的功能主要是由 Ter-Tus 复合物( ter u
tilization substance )来完成的。
• EcoliDNA 的复制终止终点
AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT
TTAATCATCCAACATTGATTTCA
复制叉可被 tus蛋白识别,并结合于其上
• 终止的调节:在终止点 Forksmeet 两侧各有几个短序列,如: terE. D. A. terC. B 。当一侧复制叉前进的快,而另一侧前进的慢时,快侧复制酶则会在 ter 位点停止,等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个“ replication for
k trap” 。• 二个复制叉相距约 100kb 时速度放慢,通过 ter 来协调两复制叉到达终点的时间。
6、复制的保真性 长期进化过程中,使生物体 DNA 复制过程形成了一系列保真机制,保证复制准确,遗传稳定。♥ DNApolⅠ和 Ⅲ的 3′ - 5′ 活性 DNApolⅠ有两个结构域:⑴ 大结构域含一个荷正电,直径 2nm 的裂缝,是 DNA 结合部分。 D
NA
一旦结合,裂缝即被关闭,这时, DNA 只能在裂缝中前后滑动。⑵ 小结构域含核苷酸结合部位,两结构域相距 3nm 。⑶ 当新合成的 DNA 中含错配核苷酸对时,双螺旋发生变形,因而不能 在裂缝中向前滑动,只能后移,这时 3′ - 5′ 外切酶激活,切除错 配核苷酸。⑷ 错配核苷酸切除后,聚合反应继续进行。
♥ RNA 引物起始复制,引物最终除去, 减少错配。
开始合成错配率高,短核苷酸序列中的 错配不易校正。♥ 修复系统有多种机制和酶。
7 、复制的调控
① 原核生物的调控--以噬菌体 λ为例。
OL OR cⅡ
N R c Ⅰ PR Cro O P Q
ori
阻遏蛋白引发蛋白
起始复制
② 真核生物的调控
调控发生在 3 个水平:
♥ 细胞生活周期水平调控:也称限制点调控,即决定细胞停留在 G1期还是进入 S期。致癌剂、促细胞分裂剂等都可诱发细胞由 G1期进入 S期;
♥ 染色体水平调控:决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S期起始复制;
♥ 复制子水平调控:决定复制的起始与否。
Cdc6 蛋白( cdc: cell divisio
n cyclegenes) 是一个十分不稳定的短命蛋白,但在 G1 期不断合成。 Cdc6 与 ORC 的结合,形成起始复合物,复制起始。 Cdc6 在 G1 期保护着 Dnas
e 敏感位点,使其不敏感。细胞进入 S 期, Cdc6 合成降低,Cdc6 合成的减少使 Mcm 脱落,DNA 复制。 G2 期 ORC 仍然结合于 ori ,但由于无 Cdc6 和Mcm ,复制不能起始。在这一时期,细胞周期控制着 Cdc6
的合成,而 Cdc6 又控制着复制。