6.3.2016

1

Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler-3

DNA izolasyonu ve analizi

• DNA ile yapılacak çalışmalarda moleküler biyoloji tekniklerinin uygulanabilmesi için öncelikle yüksek molekül ağırlıklı DNA molekülünün saf bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir.

• DNA izolasyonu yöntemlerinin belirlenmesinde;

kromozom DNA’ sı ve kromozom dışı DNA’ lar (plazmid ve organel DNA’ ları)

olmak üzere iki temel grup temel alınmaktadır. Kromozom ve plazmid DNA’ larının saflaştırma sırasında birbirinden ayrılmasında DNA’ ların moleküler yapısı oldukça önemlidir.

Bu amaçla birçok yöntem geliştirilmiş ancak hepsinde temel prensip aynıdır. DNA izolasyon yöntemlerinde dört temel aşama bulunmaktadır:

a) Hücrelerin ve membrana bağlı yapıların parçalanarak DNA’ nın açığa çıkarılması

b) DNA’yı hidrolize eden enzimlerin inaktive edilmesi

c) Proteinlerin DNA’dan ayrılması ve denatürasyonu

d) DNA nın solventlerle ekstraksiyonu ve çöktürme ile konsantre edilmesi

• Nükleik asitlerin polarlıkları oldukça yüksektir. Bu yüzden polar solventlerde çözünebilirler, apolar solventlerde ise çökmektedirler.

• Prokaryorlarda, DNA çift zincirli, halkasal yapıdadır ve sitoplazmada bulunmaktadır.

• Eukaryotlarda, DNA çekirdekte, mitokondride ve kloroplastlarda bulunmaktadır.

Çekirdek DNA’sı çift zincirli ve lineer; mitokondri DNA’ sı ise, prokaryotlardaki gibi, çift zincirli ve halkasal. Prokaryot DNA’ larına proteinler bağlı değildir, fakat, eukaryotların çekirdek DNA’sına histon proteinleri bağlıdır.

• DNA ve RNA’ nın N- glikozidik purinve pirimidin bağları düşük asidik ve bazik ortamlara dayanıklıdır.

• Bununla beraber, RNA’nın fosfodiester bağları, 37 oC’ de 0.3 M KOH’ de parçalanarak 2’ ve 3’ fosforibonükleotitleri oluştururlar.

• DNA’ nın primer yapısı bu koşullarda stabildir. Seyreltik asitlerde (0.1N TCA, HCl veya HClO4) nükleik asitler çökmektedirler.

6.3.2016

2

• Hücrenin parçalanması, DNA ve RNA izolasyonundaki ilk ve izole edilen DNA ve RNA’ nın verim ve kalitesini etkileyen en kritik aşamalardan biridir.

• Hücre parçalanması hızlı ve etkili olmalıdır.

• Parçalama sonunda bağ dokusu ve kemik gibi katı dokular dışındaki dokularda gözle görülen partiküllerin bulunmaması gerekmektedir.

• Hücre ve doku parçalanmasında en uygun metodun seçilmesi kalite ve verimin arttırılması bakımından oldukça önemlidir. Kullanılan organizmanın türüne göre parçalama metodu seçilmektedir.

Teknik Materyal tipi

Nazik

Ozmotik şok Eritrositler

Enzim uygulaması Bakteriler, mayalar

Deterjan uygulaması Doku kültürü hücreleri

El homojenizatörü (veya havan) Karaciğer vb. yumuşak dokular

Doğrama (kesme, parçalama) Kas vb. dokular

Orta şiddette

Bıçaklı homojenizatör Hayvansal ve bitkisel dokular

Kum, alümina vb ile ezme Bitkisel dokular bakteriler

Sert

Fransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakteriler

Ultrasonikasyon Hücre süspansiyonları

Bilyeli mil Hücre süspansiyonları

Manton Gaulin homojenizatörü Hücre süspansiyonları

Tablo 1. Çeşitli hücre ve dokulara uygulanabilecek bazı parçalama teknikleri

• İzolasyonda hem eukaryotik hem de prokaryotik hücrelerden ayrılması gereken moleküller proteinler ve RNA’dır.

Proteinler organik çözücüler ve deterjanlarla denatüre edilmekte; RNA ise RNaz ile parçalanmaktadır. DNaz aktivitesini inhibe etmek için EDTA kullanılır.EDTA Mg++

iyonlarıyla şelat oluşturarak ortamdan uzaklaştırır.

Proteinleri denatürasyonu , SDS (sodyum dodesil sülfat), proteinazK, fenol ve organik çözücüler kullanılarak sağlanır.

o SDS güçlü bir deterjandır ve proteinleri DNA’ dan ayırıp denatüre etmektedir.

o Proteinaz K, SDS ile aktif olan ve proteinleri 65 oC’ de parçalayan bir enzimdir.

• Fenol ve kloroform nükleik asitleri proteinlerden ayırmak amacıyla kullanılmaktadır.

• Kloroform, izoamil alkolle (izoamil alkol köpük önleyici olarak kullanılır)birlikte kullanılmaktadır.

• Tris buffer, ortamın pH’ sını yükseltmektedir. DNaz’ ın inaktivasyonunusağlamak için pH 8 ve üzerinde çalışılmalıdır. Bunlar ayrıca, ortamdan lipid ve polisakkaritlerinde uzaklaştırılmasını sağlarlar.

• İzopropanol DNA’ çöktürülmesinde kullanılır.

• Ayrıca sodyum ve amonyum tuzları da DNA’ nın çöktürülmesine yardımcı olmaktadır. DNA’ nın son olarak çöktürülüp saflaştırılması ise etanol veya diyaliz ile yapılmaktadır. Etanol düşük bç’ne sahip DNA’ larda kullanılır. Diyaliz ise >200 bç olan DNA’larda uygulanmaktadır.

• İzolasyon aşamalarından sonra da farklı kaynaklı ya da farklı özellikteki DNA moleküllerinin ayrılması (fraksiyonlandırılması) gerekmektedir.

• Genomik DNA’ yı hücre lizatından ayırmada olduğu gibi, tek ve çift zincirli DNA moleküllerini ve plazmid DNA’ sı ile genomik DNA’ yı birbirinden ayırmada da, kromatografiktekniklerden yararlanılabilir.

• Bununla beraber, jel elektroforezi yöntemi daha yüksek ayırma gücü nedeniyle nükleik asitleri ayırmada en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntemle molekül ağırlığı 103-108 Da arasında olan DNA moleküllerini ayırmak mümkündür.

Bakterilerden Kromozomal DNA izolasyonu

Bakteri genomundaki DNA genellikle yüksek organizasyonlu canlılardaki kromozom tanımına analog olarak kullanılır. Bu adlandırma bakteri genom DNA’ sını bazı bakterilerde bulunan plazmid DNA’ sından ayırt etmektedir.

Organizma : E.coli veya B.subtilus

Gerekli Malzemeler:

Luria Bertani (LB) besiyeri, pH 7.3

Tripton %1

Yeast ekstrakt % 0.5

NaCl % 1

Tris-EDTA tamponu (TE), pH 8.0

Tris HCl pH 8.0 10 mM

EDTA pH 8.0 1mM

6.3.2016

3

SDS % 10

Lizozim

Proteinaz K 20 mg/ml

NaCl 5M

CTAB (setil trimetil amonyum bromür) / NaCl

CTAB % 10

NaCl 0.7 M

Kloroform / izoamil alkol 24:1 (v:v)

Fenol

Fenol/kloroform/izoamil alkol 25:24:1 (v:v:v)

İzopropanol

Etanol %70

Yöntem

1) 5 ml LB besiyerine tek koloniden ekim yapılır. 150 dev/dak hızda, 37 oC’ de bir gece boyunca çoğaltılır.

2) Bir gecelik 5 ml bakteri kültürünün 1.5 ml’ si mikrosentrifüjde (10000 dev/dak hızda 5 dak) çöktürür.

3) Üst sıvı uzaklaştırıldıktan sonra çökelti 567 l TE tamponu içerisinde mikropipet yardımıyla çözündürülür.

4) Çözelti içerisine 30 l SDS ve 3 l proteinaz K çözeltileri eklenerek karıştırılır ve 37oC de 1 saat bekletilir. Bu aşamada hücreler lizis olur ve tüp içindeki sıvı saydamlaşır.

5) 100 l 5 M NaCl eklenerek karıştırılır. Daha sonra 80 l CTAB/NaCl çözeltisi eklenir ve karıştırılıp 65 o C’ de 10 dak tutulur.

6) Üzerine eşit hacimde kloroform/izoamil alkol eklenir ve karıştırılır. 10000 dev/dak hızda 5 da sentrifüjlenir.

7) Üst faz temiz bir mikrosentrifüj tüpüne alınır ve eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol karışımından eklenerek karıştırılır. 10000 dev/dak hızda 5 dak sentrifüjlenir.

8) Üst faz dikkatli biçimde temiz bir mikrosentrifüj tüpüne alınır ve 0.6 hacim izopropanol eklenir. DNA çökünceye kadar karıştırılır. Bu aşamada tüp altüst edilerek yavaş şekilde karıştırılırken DNA’ nın iplikçikler şeklinde çökeldiği gözle görülebilir.

9) DNA, 15000 dev/dak hızda 10 dak sentrifüjlenerek çöktürülür.

10) Çökelti üzerine 50 l % 70 etanol eklenerek DNA yıkanır ve tüp hemen ters çevrilerek alkol uzaklaştırılır.

11) Tüp ağzı açık durumda oda sıcaklığında 10-15 dak veya 60 oC’ de birkaç dak bekletilerek alkol tamamen uçurulur.

12) Çökelti üzerine 50-100 l TE eklenir ve tüpe parmakla yavaşça vurularak DNA çözündürülür.

• İzole edilen DNA 4 oC’ de uzun süre saklanabilir.

Bitkilerden kromozom DNA’ sı izolasyonu

Materyal: taze yaprak dokusu

Gerekli malzeme

2-ME/CTAB ekstraksiyon tamponu pH 8.0

CTAB %2

Tris-HCl pH 8.0 10 mM

EDTA pH 8 20 mM

NaCl 1.4 M

2- Merkaptoetanol (2-ME) %2

CTAB/NaCl çözeltisi

Kloroform:izoamil alkol 24:1

CTAB çöktürme tamponu pH 8.0

CTAB %1

Tris-HCl pH 8.0 50 mM

EDTA pH 8 10 mM

Yüksek tuz içerikli TE tamponu

Tris HCl pH 8 10mM

EDTA pH 8 0.1 mM

NaCl 1M

Etanol %80

İzopropanol

TE tamponu pH 8

6.3.2016

4

Yöntem1) Materyalin miktarına göre uygun hacimdeki 2-ME/CTAB ekstraksiyon

tamponu ile CTAB/NaCl çözeltisi su banyosunda 65 oC’ ye kadar ısıtılır.

2) Daha önceden –20 oC’ de soğutulmuş doku parçalayıcı alette toz haline getirilen doku tüp veya beher içerisine alınarak tekrar –20 oC’ de dondurulur.

3) Kullanılan materyale uygun miktarda ısıtılmış 2-ME/CTAB ekstraksiyon tamponu eklenir ve aralıklı olarak karıştırılarak 65oC’ de 20 dak tutulur.

4) Eşit hacimde kloroform/izoamil alkol (24:1) eklenir ve karıştırılır. 10.000 dev/dak hızda 4oC’ de 5 dak sentrifüjlenir.

5)Üst faza 1/10 hacimde 65oC’ de ısıtılmış CTAB/NaCl çözeltisi eklenir ve altüst edilerek karıştırılır.

6)4. aşama tekrarlanır.

7) Üst faza eşit hacimde CTAB çöktürme tamponu eklenir ve altüst edilerek karıştırılır. Eğer çökelti görünür ise 8. aşamaya geçilir, henüz gözlenmiyorsa 65 oC’ de 30 dak beklenir.

8) 2700 dev/dak hızda, 5 dak 4 oC’ de sentrifüjleme yapılır.

9) Üst sıvı uzaklaştırılır ve çökelti yüksek tuz içerikli TE tamponunda (0.5/1 ml/g başlangıç materyali) çözündürülür.

10) DNA’ nın çökmesi için 0.6 hacim izopropanol eklenerek karıştırılır ve 10.000 dev/dak hızda, 15 dak 4 oC’ de sentrifüjlenir.

11) Çökelti %80 etanol ile yıkanır ve TE içerisinde çözündürülür (0.5/1 ml/g başlangıç materyali) ve 4 oC’ de saklanır.

Plazmit DNA sı izolasyonu

• Plazmitlerin rekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında vektör olarak geniş çapta kullanılmaları plazmit izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Çeşitli izolasyon yöntemleri arasında basit ve verimi en yüksek olan yöntemlerden biri aşağıda verilmiştir.

Materyal: E. Coli içinden bulunan herhangi bir plazmit

Gerekli malzemeler:

• Lizis tamponu, PH 8.0

Glukoz 50 Mm

Tris HCl 25 mm

EDTA 10 mm

• Alkali SDS çözeltisi

NaOH 0.2 N

SDS %1

5 M potasyum asetat

Etanol

TE tamponu, PH 8.0

RNaz A 20 mg/ml

• Fenol:kloroform:izoamil alkol 25:24:1

• 0.2 M potasyum asetat

• Yöntem:

• 1) E. Coli taşıdığı plazmitte bulunan antibiyotiğe direnç geninin çeşidine göre, o antibiyotiği yaklaşık 50 ug/ml olarak içeren 5 ml LB besiyerinde, 150 dev/dak hızda 37 C de 1 gece boyunca üretilir.

2) Bir gecelik kültürdeki hücreler 7000 rpm’de 10 dak santrifüjlenerek

toplanır ve 100 ul lizis tamponunda süspansiyon haline getirilir.

3) 5 dak oda sıcaklığında bekletildikten sonra 200 ul alkali SDS çözeltisinden eklenir ve yeniden 5 dak oda sıcaklığında tutularak hücrelerin parçalanması ve genomik DNA’nın denatürasyonu sağlanır.

4) Parçalanmış hüücrelerden oluşan lizat üzerine 4 C’de soğutulmuş 150 ul 5M potasyum asetat eklenerek 5 dak buz içerisinde beklenir

5) 13000 rpm’de yapılan santrifüjleme sonucu üst sıvıda kalan plazmid fraksiyonuna 1 ml etanol eklenir.

6) 13000 rpm’de 20 dak oda sıcaklığında santrifüjlenerek plazmid DNA’sı çöktürülür.

7) Çökelti 50 ul TE tamponunda çözündürülür ve 4 ul RNaz A eklenerek 37 C’de 1 saat bekletilir.

6.3.2016

5

8) Toplam hacim TE ile 400 ul’ye tamamlanıp eşit hacimde fenol kloroform/izoamilalkol eklenerek alt üst edilerek karıştırıldıktan sonra 5 dak oda sıcaklığında 13000 rpm’de santrifüjlenir.

9) Üst faz temiz bir tüpe alınarak 1 ml 0.2 M potasyum asetat eklenir ve -20 C’de 1 saat bekletilir.

10) 20000 rpm2de 20 dak santrifüjlenir (4 C’de) ve 50 ul TE tamponunda çözündürülür.

PlazmitlerHücre içinde kromozomal DNA’dan ayrı olan halkasal yapıdaki

DNA’lardır.

Bakterilerde doğal olarak bulunur. Ökaryotlarda ise nadiren bulunur (S. Cerevisiae).

Plazmitler bakterilerin üremesi için gerekli olan genleri taşımazlar; buna karşılık bakteriye uygun olmayan ortam koşullarında yaşayabilme, çeşitli toksik maddeler üretme ve metabolizeedebilme, antibiyotiklere dirençlilik ve antibiyotik sentezini gerçekleştirebilme, patojen özellik kazandırma gibi nitelikleri sağlayan genleri içerirler.

26

• Plazmitler konak kromozomundan bağımsız replikasyon yaparlar.

• Kendi replikasyonları için gerekli genlerin dışında konaklarına bazı özellikler kazandıran çeşitli genleri de taşırlar (genellikle antibiyotik ve çeşitli metallere direnç genleri)

• plazmitlerin çoğu doğal vektörlerdir (türler arasında Yatay gen transferi sağlar).

• Küçük genleri klonlamakta kullanılır (1-20 kb)

Plazmitlerin klonlama vektörü olarak kullanılmalarının nedenleri:

1) Küçük olmaları DNA’nın izolasyonunu ve manipülasyonunu kolaylaştırır.

2) Bağımsız replikasyon orijinlerinin olması

3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede birkaç kopya halinde bulunabilirler.

4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir işaretlerinin bulunması, plazmit içeren klonların saptanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır

28

Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram düzeyindeki miktarlarının belirlenmesi, moleküler biyoloji alanında çalışan araştırıcılar için temel noktalardan biridir.

Genellikle izole edilen DNA’ların miktar tayininde absorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler kullanılır.

Nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde veya özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA parçalarının saptanmasında elektroforetik yöntemler kullanılmaktadır.

DNA’nın analizi 1. Spektral yöntemlerNükleotitler 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon

gösterirler

Bu nedenle 260 nm’de ölçülen absorbans değerleri (A260) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin ug düzeyinde miktarlarının belirlenmesinde kullanılır.

Çift zincirli DNA molekülleri için 1 optik yoğunluk 50 ug/ml ye karşılık gelmektedir. Buna göre çift zincirli DNA için miktar belirlenmesinde şu formül kullanılır:

DNA (ug/ml) = A260 x sulandırma oranı x 50

6.3.2016

6

• 260 ile 280 nm dalga boylarında okunan değerler arasındaki oran nükleik asitlerin saflığı hakkında bilgi vermektedir.

• Proteinler 280 nm’de absorbsiyon özelliği gösterirler. Bu nedenle 280 nm de ölçülen değerdeki artış A260/A280 oranında düşmeye neden olur.

• Saflaştırılmış DNA’da A260/A280 oranı yaklaşık 1.75-1.80 in üzerinde olmalıdır.

• 325 nm de ölçülen değer DNA çözeltisinde partikül bulunduğunu veya ölçümde kullanılan kuvetin kirli olduğunu; 230 nm’deki değer ise nükleik asit çözeltisi içinde peptitlerin veya fenolün bulunduğunu gösterir.

• Ölçümlerde UV geçirgen kuvartz küvetler kullanılmalı. Cam veya plastik küvetler kullanılmaz

• DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı;

molekülün büyüklüğüne,

yapısına,

jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna

ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

• Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde molekülleri birbirinden ayırmak için kullanılır.

• Destekleyici madde poliakrilamid veya agaroz olabilir

Elektroforetik yöntemler• Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentlerinin (5-

500 baz çifti) ayırımında kullanılır.

• Bu jellerin ayırım gücü çok yüksek olduğundan boyutları birbirine yakın DNA fragmentlerinin analizleri için daha uygundur.

• Poliakrilamid jelleri hazırlamak zor ve uzun süre alır.

• Uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması gerektiğinde agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Agaroz jel elektroforezi

• DNA’nın analizinde tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit yöntemlerden bir agaroz jel elektroforezidir.

• Yöntemin avantajı basit ve hızlı olması, ayrıca DNA fragmentlerinin birbirinden ayrılmasını sağlamasıdır.

• UV ışık altında floresan etki gösteren etidium bromür boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda (1-10 ng) DNA fragmentinin yerini belirlemek mümkündür

35

• Agaroz kırmızı bir alg türü olan agar agar dan elde edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur.

• Agaroz konsantrasyonu % 0.5-1.5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir.

• Küçük DNA fragmentleri için yüksek , büyük DNA fragmentleri için düşük agaroz kons. kullanılarak DNA’nın jelde uygun şekilde yürümesi sağlanabilir.

36

6.3.2016

7

• DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm de ışığı absorblaması sonucu florosan etki göstermesi ile olur. Bu etki DNA konsantrasyonuna bağlı olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.

Agaroz jel elektroforezinin yapılışı• Agaroz

• Tris-asetat (TAE) tamponu ph 8.0 (50x/l)

242 g trisma base

57.1 ml glasiyel asetik asit

100 ml 0.5 M EDTA (PH 8.0)

Tris-borat (TBE) tamponu, PH 8.0 (5x/l)

54 g trizma base

27.5 g borik asit

20 ml 0.5 M EDTA (PH 8.0)

Yükleme tamponu : bromofenol blue, BB

4 M üre

0.025 M EDTA

%60 sakkaroz

% 0.025 bromofenol blue

% ksilen

• TE tamponu, PH 8.0

10 MM tris-HCl

1 mm EDTA, PH 8.0

Etidium bromür (10 mg/ml)

Etidium bromür karanlıkta ve buzdolabında saklanmalıdır

Agaroz jelin hazırlanışı1) Kullanılacak jelin büyüklüğüne göre tartılan agaroz TBE veya

TAE tampon içerisinde kaynatma yolu ile (mikrodalga veya ateş üzerinde) çözündürülür

2) Elle tutulabilecek sıcaklığa (50-55 C) düştüğünde 0.5 ug/ml etidium bromür ilave edilir

3) Kenarları kapatılmış cam veya özel yüzeyler üzerine, sızıntı olmamasına dikkat edilerek dökülür.

4) Cepleri oluşturacak tarak yerleştirilerek donması beklenir.

5) Tarak dikkatlice uzaklaştırılarak jel elektroforez tankına yerleştirilir.

6) Jeldeki cebin büyüklüğüne göre izole edilen DNA solüsyonundan alınarak BB eklenir (genellikle 1/6 hacimde).

İlk cebe daima büyüklüğü bilinen standart (marker) yüklenir.

7) Tüm sıvı pipet yardımıyla jele yüklenir. Jelin üzerine tampon çözeltisi eklenir. Tampon jeli kaplamlalıdır

6.3.2016

8

8) 50 V civarında akım geçirilir. Akım miktarı fragmentlerin boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir.

• nükleik asitler jel boyunca hareket ederler.

• Nükleik asitler negatif yüklü olduğu için katottan anota doğru hareket eder.

• Küçük moleküller büyük moleküllerden daha hızlı hareket ederler.

• Böylece agaroz jel elektroforezinde DNA fragmentleri boyutlarına göre ayrılırlar.

• 9) Sürenin sonunda jel UV (300 nm) ışık altında standartlarla karşılaştırılarak fragmentlerin boyutları belirlenir.

• Floresan etki DNA konsantrasyonuna bağlı olarak kuvvetli veya zayıf olabilir.

Etidium bromür mutajendir. Çalışırken mutlaka eldivenle çalışılmalı.

Çalışılan bölge sadece bu analiz için ayrılmalı. Analiz sonrası Etbr’ün

inaktivasyonu yapılmalı (Na hipoklorit ile)

DNA’nın enzimatik kesimi

• DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon endonükleazları yardımıyla yapılır.

Restriksiyon enzimleri

• Prokaryotik hücreler DNA’yı kimyasal olarak değiştirebilen bir veya daha fazla enzim içerirler.

• Bu enzimlerin önemli bir sınıfı kısaca restriksiyon enzimleri olarak bilinen restriksiyon endonükleazlardır.

• Bu sistemler prokaryotlar arasında geniş yayılımlar göstermesine karşın ökaryotlarda çok nadir olarak bulunurlar.

• Restriksiyon enzimleri (RE) özel DNA dizilerini tanıyarak DNA’yı keserler.

46

• RE hücre içine yabancı bir DNA girişine karşı bir savunma mekanizması (virüslere karşı) oluştururlar

• Hücrede önemli rol oynamalarının yanında restriksiyon enzimleri in vitro DNA çalışmaları için de zorunludur.

• Bunların keşfi genetik mühendisliği alanının doğuşuna imkan vermiştir.

• 1970’lerde DNA klonlamasının gerçekleşmesi RE’inin bulunuşu

ile olmuştur.

47

• Hücre içine yabancı DNA girişine karşı savunma mekanizması iki bileşenden oluşur:

1 Restriksiyon endonükleazlar: Kısa ve simetik bir DNA sekansını tanırlar ve sekansın içinden herbir ipliği spesifik bir noktadan keserler.Dolayısıyla DNA kısa fragmentlere parçalanır.

2) Modifikasyon: Hücresel DNA’da aynı tanıma sekansları içindeki bir C veya A bazına metil grubu ilave eden metilazdır.

Bu modifikasyon konak hücre DNA’sının dirençli olmasını sağlayarak endonükleazlarlaparçalanmasını önlerler.

48

6.3.2016

9

3 tip RE vardır : Tip l, Tip ll, Tip lll

• Tip I ve Tip lll RE hem restriksiyon hem de metilasyon aktivitesine sahiptirler. Her ikisi de DNA’yı tanıma bölgelerinin dışında bir yerden keserler.

• ATP enerjisine ihtiyaçları vardır (tanıma bölgesinden kesim bölgesine hareket etmek için).

• Tip l ve tip lll klonlamada kullanılmaz

Tip II RE sadece restriksiyon (kesme) aktivitesine sahiptirler. Modifikasyon başka bir enzim tarafından gerçekleştirilir

• DNA’yı tanıma bölgesinden keserler. Bunun için ATP enerjisine ihtiyaçları yoktur.

• Mg+2 iyonlarına ihtiyaç duyarlar

49

• Moleküler biyolojide Tip II RE bu enzimler kullanılır. Tam hedef nükleotitten kesim yaptıkları için klonlama ve moleküler biyoloji araştırmaları için önemlidir.

50

Tip II RE

• Mg+2 iyonları varlığında çift iplikli DNA üzerindeki palindromik dizileri tanıyan ve bu diziler içindeki özel bir bölgeden kesen homodimerikenzimlerdir.

• Tanıma bölgeleri palindromiktir ve 4-8 nükleotit uzunluktadır

Palindromik: Eğer zincirlerden biri soldan biri sağdan okunursa aynı diziye sahiptir ( veya ikisi de 5’-3’ veya 3’-5’ yönünde okunursa aynıdır)

Homodimerik: Birbirine benzer iki polipeptit alt ünitesinden oluşmuşlardır.

51

RE kesim sonucunda DNA’da oluşturdukları uçların motiflerine göre iki alt gruba ayrılırlar

• Yapışkan uç oluşturacak şekilde kesim yapanlar: Kesim yapılan bölgelerde tek iplikli çıkıntılı yapı oluşmaktadır. Bunlara yapışkan uçlar denir. Çünkü, bunlar tek iplikli kuyruklarının baz eşleşmesi ile aynı çıkıntı uca sahip herhangi bir uca bağlanabilir.

Daha sonra bu eşleşen zincirler ligasyonla birbirlerine bağlanabilir.

Bu nedenle klonlama çalışmalarında bu enzimler kullanılmaktadır.

52

Küt uçlu kesim yapanlar: İki zinciri de aynı noktadan kesenler. Bunların ligasyon etkinlikleri düşüktür.

• Klonlamada tercih edilmezler

53

• Kesim sonunda her zaman 5’ uçları fosfat gruplarını korur.

54

6.3.2016

10

• 6 bp’lik tanıma sekansı rastgele DNA dizisinde ortalama her 4096 (46) bp’de bir oluşacaktır. Bu nedenle büyük bir DNA molekülü bu tip bir enzimle ortalama 4 kb’lık spesifik fragmentlere kesilebilir.

• Günümüzde 600’den özel dizi tanıyan, yaklaşık 6000 RE bilinmektedir.

• Genetik mühendisliği bakımından büyük öneme sahip olduklarından yeni enzimler de araştırılmaktadır.

• Ticari olarak yaygın bir şekilde bulunmaktadırlar.

55

Bazı RE ve tanıma dizileri

• HindIII ilk bulunan RE (1970)

56

RE’lerinin isimlendirilmesi

Kısaltma Anlam Açıklama

E Escherichia cins

co coli tür

R RY13 suş

I İlk tespit edilmişO bakteride

tespit edilme sırası

•Pek çok RE farklı noktalardan kesim yaptığından ticari olarak karışıklığı önlemek için

enzimlerin isimlendirilmesi yapılmıştır.

İlk harf Bakteri cinsinin baş harfi

2. ve 3. harfler Türün adı

4. harf suşun adı:

5. rakam enzimin izole ediliş (bulunuş)sırası

57

Restriksiyon -modifikasyon sistemi

• Modifikasyon genleri, DNA üzerinde restriksiyon genleri ile yakın bölgede bulunmaktadır. Bu nedenle bunlara restriksiyon modifikasyon genleri (R/M) denilmektedir.

• RE tanıdığı nükleotit dizilimlerini tanıyan metilaz enzimleri de vardır.

• Metilazlar ortak tanıma dizilimlerini bir veya birkaç noktada metilasyona uğratmaktadır (A veya C’e metil grubu eklerler).

• Bu durumda, DNA metile olarak, metilaz enzimi için substrat olmaktan çıkar ve korunmuş olur.

58