생명과학 /바이오 융합 연계전공20050831 한다혜

Abstract

Method & Theory• Central dogma ,DNA 구조 , PCR, hybridization

Data & discussion

Result

Reference

실험 목적High-througtout 방법인 DNA chip 을 이용하여 조건에 따라 달리 발현되는 세포 내 유전자상의 DNA조각들을 일정한 간격으로 붙이고 형광물질로 표지 한 유전자 cDNA (RNA) or DNA 의 hybridization을 통해 발현 양상을 정량적으로 분석

DNA Chip 제작 DNA 추출

Primer 설계• 좋은 primer 의 조건

PCR

Electrophoresis• Purification • Elution

chip 제작

Sample 제작 RNA 추출• Purification

Reverse transcription Amino Allyl Labeling• Cy3/ Cy5

DNA 추출과 primer 제작 • 병원성 유전자- S. typ, S. flex, E. coli, V. vul, V.cho, V. par

• Primer 설계

- 좋은 primer 의 조건a.앞 / 뒤 primer 의 Tm 값 비슷하게b.GC 의 함유량은 40~60%c.Self complimentary, hetero dimer 생성 방지

1 FlgE ATG GAT TTG CGC ATT AGC GG 56.5 CAG TGA CAT TCG AGG TCT GC 55.7 250

2 VenB ATG CCA TCG CGG ATT TTA CT 54.9 CCA TTT TTC CAC CAA CAC CA 53.7 251

3 FliP ACT TCT GAC CAC GTT TTG GC 55.9 AGT AGT CTT CAC TGC CGT CA 55.5 236

4 Wzb TGA GCG TGT GCT ACA AAA A 52.5 GTT AGT GCT TCC ATA TGG C 50.8 228

5 hemolysin CAG TCA ATA TAG TGT GCG CG 53.7 GCA CTG TGG TCA AAG GTT TT 53.9 246

6 RtxA GTA AAA TCA GAG CGA GAG CC 53.3 CTG ATG CTC AAC GGC AAT AT 53.1 249

7 VvhA CAA AGT AGG CGC GGA AGT GA 57.7 CAA ATA CCC AAC CAC TGC CC 56.5 245

8 VvhB TGC TGT TTG TTT GCG GCG AA 58.8 GCG TCG TCA CCA GCA ATT TG 57.4 248

9 VvhD TGA ACG CGG CGT GCT TAA TG 58.9 GCG GCG ATC AAC ACC AAA GT 58.7 244

10 VvhE-1 GTC GAT GCC CAT TTC TTT GC 54.9 GTC GGT CAA TCC GTG TGA AA 55.3 250

11 VvhE-2 GAT TCA ACT GCC GAA TGG CA 56.1 GAG CGC TTT AGC ATT GGC AT 56.4 241

1. Denaturation2. Annealing –Taq Polymerase

3. Elongation

• V. vnl 의 RNA 추출 - RNA 다룰 때 유의사항

• Reverse transcription

• Amino Allyl Labeling- DNA : Cy3( 녹색 ), RNA : Cy5( 붉은색 )

• Multiplex-PCR

발현 양상- Positive control 과 비교- 2nd line 에서 RNA 발현

Trouble shooting- Edge drying- Comet- High background

- DNA hybridization 을 통해 어떤 균이 실제로 있는지 알 수 있고 RNA (cDNA) hybridization 을 통해 어떤 gene 이 turn on 되었는지도 알 수 있다 .

Spot 의 밝기를 정량적으로 분석한다면

발현의 정도 역시 정량적으로 분석가능하나 이번 실험에서는 다른 spot들과의 비교를 통해 발현의 정도를 알아보았다 .

• Molecular Biology of The Gene, Watson 외 5 명 , 4tyh, Benjamin cummings, pp97~111

• The cell, Geoffery M.Cooper 외 1 명 , 3rd, ASM press, p4, 8 pp29~31, 95~96, 115~116

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• Molecular cloning mannual –DNA Microarray, David Bowtell and Josep sanbrock

• Baldi, P. and Hatfield G. W. DNA microarray and Gene Expression, Cambridge University Express, 2002