Gene expression Gene expression microarraymicroarray

Halaška,M., Chod,J., Halaška,M., Chod,J., Strnad,P., Kolařík,D., Strnad,P., Kolařík,D.,

Hrouda,M. Hrouda,M. Gynekologicko-porodnická klinika FN Motol a 2. LF Gynekologicko-porodnická klinika FN Motol a 2. LF

UKUK

Gynekologicko-porodnická klinika FN Bulovka a 1. Gynekologicko-porodnická klinika FN Bulovka a 1. LF UKLF UK

ÚvodÚvod

známa sekvence lidského genomu: 30 000-40 000 známa sekvence lidského genomu: 30 000-40 000 genůgenů

metodika analýzy microarray vyvinuta na Stanfordumetodika analýzy microarray vyvinuta na Stanfordu

(Schena,M., Science, 270, 1995)(Schena,M., Science, 270, 1995) na 65 vzorcích testováno 8102 genůna 65 vzorcích testováno 8102 genů

(Perou CM, Nature, 2000)(Perou CM, Nature, 2000) clinical implications clinical implications

(Sorlie, T, 2001)(Sorlie, T, 2001)

RozděleníRozdělení

podle typu sondypodle typu sondy cDNAcDNA

k analýze genomu (sekvenční analýza, variabilita genu)k analýze genomu (sekvenční analýza, variabilita genu) k analýze genové exprese (RNA)k analýze genové exprese (RNA)

proteinovéproteinové tkáňové (TMAs)tkáňové (TMAs)

podle přípravypodle přípravy oligonukleotidy (20-100 bp)oligonukleotidy (20-100 bp) pomocí fotolithografiepomocí fotolithografie cDNA (300-4000 bp)cDNA (300-4000 bp) předem připravené na čipu předem připravené na čipu

PCRPCR

DENATURACE

dvouřetězcová DNA

jednořetězcová DNA

RENATURACE

HybridizaceHybridizace

HybridizaceHybridizace

spojení 2 jednořetězcových molekul (DNA nebo RNA) různého původu

DENATURACERENATURACE

HybridizaceHybridizace

DENATURACERENATURACE

PostupPostup

izolace mRNA z tkáněizolace mRNA z tkáně reverzní transkripcí do DNA - následně namnoženíreverzní transkripcí do DNA - následně namnožení označení červenou flurescencíoznačení červenou flurescencí smíchání se zelenými referenčními genysmíchání se zelenými referenčními geny scanování a vyhodnocení převahyscanování a vyhodnocení převahy

sklo se spec. upraveným povrchem nebo nylonová membránananesení: ink jet technology

photolitography

SONDA

cDNA

jedno políčko mikročipu = hybridizační jednotka

DNARNAmRNAcDNAcRNA

NK označená fluorescenční barvou

Laserové světlo

DETEKTOR

DETEKTORMěření intenzityfluorescence = odpovídámnožství RNA ve vzorku

Microarrays po hybridizaci - počítačové zobrazení

Affymetrix - genové čipy cDNA microarray

HodnoceníHodnocení

kontrolované (supervised)kontrolované (supervised) nejdříve stanovení genové expresenejdříve stanovení genové exprese vytvoření skupin podle podobnosti vytvoření skupin podle podobnosti

exprese exprese vytvoření dendrogramu vytvoření dendrogramu poté hledání klinického významu skupinpoté hledání klinického významu skupin

nekontrolované (unsupervised)nekontrolované (unsupervised) nejčastěji hierarchial clusteringnejčastěji hierarchial clustering rozdělení vzorků do skupin podle vlastnostírozdělení vzorků do skupin podle vlastností stanovení expresestanovení exprese hledání genů, které jsou odlišné hledání genů, které jsou odlišné

v jednotlivých skupináchv jednotlivých skupinách

Analýza velkého počtu genů

30 000

vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese)

(70)

Extrémní finanční nároky1 čip - 1000 USDdesítky vzorků

Analýza velkého počtu genů

30 000

vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese)

(70)

Extrémní finanční nároky1 čip - 1000 USDdesítky vzorků

Levnější metody

kvantitativní RT-PCRminiarrays - čip s omezeným počtem sond

Analýza velkého počtu genů

30 000

vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese)

(70)

Extrémní finanční nároky1 čip - 1000 USDdesítky vzorků

Levnější metody

kvantitativní RT-PCRminiarrays - čip s omezeným počtem sond

Budoucnost: kombinace výsledků do jednoho superčipu - staging, grading, prognóza, rezistence...

Perou,CM., Nature, 2000 Perou,CM., Nature, 2000

soubor 65 vzorků. 8102 genů, z toho 36 duktálních IBC, 2 soubor 65 vzorků. 8102 genů, z toho 36 duktálních IBC, 2 lobulárních IBC, 1 DCIS, 1 fibroadenom, 3 normální vzorkylobulárních IBC, 1 DCIS, 1 fibroadenom, 3 normální vzorky

u 20 pacientů byla podána chemoterapie, 2 nádory porovnány s u 20 pacientů byla podána chemoterapie, 2 nádory porovnány s SLN SLN

referenční cDNA z 11 linií, provedeno hierarchial clusteringreferenční cDNA z 11 linií, provedeno hierarchial clustering vytipováno 1753 genů, alespoň 4x variabilnější než medián vytipováno 1753 genů, alespoň 4x variabilnější než medián

ostatníchostatních nalezena výrazná heterogenita mezi nádory nalezena výrazná heterogenita mezi nádory sety genů byly navzájem nezávislésety genů byly navzájem nezávislé 15 z 20 vzorků před a po chemoterapii byly velmi podobné 15 z 20 vzorků před a po chemoterapii byly velmi podobné

(clustred together), stejně jako 2 vzorky metastáz(clustred together), stejně jako 2 vzorky metastáz byla určena skupina genů – intrinsic gene set – která představovala byla určena skupina genů – intrinsic gene set – která představovala

skupinu výrazně proměnlivých genů mezi jednotlivými nádoryskupinu výrazně proměnlivých genů mezi jednotlivými nádory vyselektováno 496 genů, pomocí kterých rozdělení na 4 skupiny vyselektováno 496 genů, pomocí kterých rozdělení na 4 skupiny

podle fenotypu: basal-like, luminal-like, ERBB2, normálnípodle fenotypu: basal-like, luminal-like, ERBB2, normální

Sorlie,T., PNAS, 2001 Sorlie,T., PNAS, 2001

soubor 78 vzorků, 51 vzorků bylo od pacientů po soubor 78 vzorků, 51 vzorků bylo od pacientů po chemoterapii – doxorubicin, následován tamoxifenem, u 2 chemoterapii – doxorubicin, následován tamoxifenem, u 2 tumorů testovány rovněž metastázy z lymfatických uzlintumorů testovány rovněž metastázy z lymfatických uzlin

427 intrinsic genů na základě předchozí práce 427 intrinsic genů na základě předchozí práce byly nalezeno 6 typů genetických profilů: byly nalezeno 6 typů genetických profilů:

gene exp. name ER prognoza BRCA p53 (%)

luminal like A ++ dobrá BRCA 2 13

luminal like B +     40

luminal like C +     80

basal like - špatná BRCA 1 82

ERBB2+ - špatná   71

normální       33

B asa l E rb B + N orm a l L u m in a l C L u m in a l B L u m in a l A

Sorlie,T., PNAS, 2001Sorlie,T., PNAS, 2001 (cont.)(cont.)

hodnocení p53hodnocení p53:: exprese p53 je nezávislá na ERBB2exprese p53 je nezávislá na ERBB2

vytipováno 158 genů v souvislosti s p53vytipováno 158 genů v souvislosti s p53 sledována survival analysis, vyselektováno 264 survival genůsledována survival analysis, vyselektováno 264 survival genů::

71 z 78 nádorů se z hlediska přežití 71 z 78 nádorů se z hlediska přežití rozdělilo na rozdělilo na stejné skupiny jako podle stejné skupiny jako podle charakteristik (viz výše)charakteristik (viz výše)

zdá se, že skupina luminal like B nebude profitovat z adjuvantní zdá se, že skupina luminal like B nebude profitovat z adjuvantní antihormonální léčby (charakteristiky jsou podobné basal like, antihormonální léčby (charakteristiky jsou podobné basal like, ERBB2)ERBB2)

van´t Veer, PNAS, 2003van´t Veer, PNAS, 2003

117 tumorů (z toho 20 familiárních tu) u mladých žen117 tumorů (z toho 20 familiárních tu) u mladých žen rozlišeno luminal like A, luminal like B, basal like, ERBB2rozlišeno luminal like A, luminal like B, basal like, ERBB2 Kaplan-Meier analysisKaplan-Meier analysis rozdíly mezi luminal A a B nebyly tak zřetelnérozdíly mezi luminal A a B nebyly tak zřetelné 18 BRCA 1 a 2 BRCA 218 BRCA 1 a 2 BRCA 2 BRCA 1 nalezeno výhradně v souvislosti s basal like (zároveň BRCA 1 nalezeno výhradně v souvislosti s basal like (zároveň

vysoká exprese p53, ER negativní, ERBB2 negativní)vysoká exprese p53, ER negativní, ERBB2 negativní)

You,F., San Antonio, 2004, 1022: pomocí gene expression na 21 You,F., San Antonio, 2004, 1022: pomocí gene expression na 21 vzorcích byla stanovena skupina genů, které by mohly vzorcích byla stanovena skupina genů, které by mohly předvídat odpověď na Herceptine/Vinorelbine chemoterapii u předvídat odpověď na Herceptine/Vinorelbine chemoterapii u HER 2 3+ early breast cancerHER 2 3+ early breast cancer

Liu,MC., San Antonio, 2004, 1030: gene expression u linie MDA MB Liu,MC., San Antonio, 2004, 1030: gene expression u linie MDA MB 231 sériově po aplikaci docetaxelu 0-14 dní, identifikován set 122 231 sériově po aplikaci docetaxelu 0-14 dní, identifikován set 122 genů, který s přesností 89 % diskriminoval mezi respondenty a genů, který s přesností 89 % diskriminoval mezi respondenty a nonrespondentynonrespondenty

Rouzier,R., San Antonio, 2004, 201: FNA u 83 pacientů před Rouzier,R., San Antonio, 2004, 201: FNA u 83 pacientů před neoadjuvantní chemoterapií, použití intrinsic gene set podle Perou, neoadjuvantní chemoterapií, použití intrinsic gene set podle Perou, chemoterapie: paclitaxel, 5-FU, doxorubicin, cyklofosfamid, basal-chemoterapie: paclitaxel, 5-FU, doxorubicin, cyklofosfamid, basal-like nejlépe zareagovaly na chemoterapii (cPR), luminal-like like nejlépe zareagovaly na chemoterapii (cPR), luminal-like nejméněnejméně

Miller,WR., San Antonio, 2004, 1020: u 69 pacientů provedeny 3 Miller,WR., San Antonio, 2004, 1020: u 69 pacientů provedeny 3 biopsie během neoadjuvantního podávání letrozolu, vytipování biopsie během neoadjuvantního podávání letrozolu, vytipování genů a sledování jejich exprese, které souvisí se vznikem genů a sledování jejich exprese, které souvisí se vznikem rezistence na terapiirezistence na terapii

geny: trefoil, LIV-1, PgR, cyclin B2, BRCA 1 a dalšígeny: trefoil, LIV-1, PgR, cyclin B2, BRCA 1 a další Harris,C., San Antonio, 2004, 3007: vytipování 16 genů, které Harris,C., San Antonio, 2004, 3007: vytipování 16 genů, které

s přesností 89 % mohou předpovídat riziko rekurence nádorus přesností 89 % mohou předpovídat riziko rekurence nádoruSa

n Ant

onio

200

4: 8

7

San

Anton

io 2

004:

87

prez

enta

cí

prez

enta

cí

VyužitíVyužití

staging, grading, vyhledávání podskupinstaging, grading, vyhledávání podskupin therapy tailoring (individualizace léčby)therapy tailoring (individualizace léčby) indikace adjuvantní/neoadjuvantní terapieindikace adjuvantní/neoadjuvantní terapie pochopení metastazovánípochopení metastazování

genový profil metastáz je velmi podobný primárnímu genový profil metastáz je velmi podobný primárnímu nádoru (neplatí teorie o selekci)nádoru (neplatí teorie o selekci)

vytipování genů s významným efektem - cíl terapievytipování genů s významným efektem - cíl terapie

Projekt ChemoProjekt Chemosensesense

grant EU: grant EU: Use of in-vitro chemosensitivity testing and gene Use of in-vitro chemosensitivity testing and gene expression profiling to optimize neo-adjuvant breast expression profiling to optimize neo-adjuvant breast cancer treatment (Univ. Prof. Dr. Ch. Singer)cancer treatment (Univ. Prof. Dr. Ch. Singer)

ccílemílem:: vvyhodnotit možnosti in-vitro testování chemosenzitivity yhodnotit možnosti in-vitro testování chemosenzitivity

pomocí ATP-TCA u pacientek podstupující pomocí ATP-TCA u pacientek podstupující neoadjuvantní chemoterapii Epirubicin, Docetaxelneoadjuvantní chemoterapii Epirubicin, Docetaxel

nalezení typické genové exprese, která by předvídala nalezení typické genové exprese, která by předvídala senzitivitu k této chemoterapiisenzitivitu k této chemoterapii

rozšíření testování na další zhoubné nádory (ca ovaria).rozšíření testování na další zhoubné nádory (ca ovaria).