1 Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Κεφάλαιο 10 DNA: Το γενετικό υλικό

Η διπλή έλικα του DNA. Αριστερά, κάτοψη. Δεξιά, πλάγια όψη.

Στόχοι του μαθήματος:

• Περιγραφή των ιστορικών γεγονότων σχετικά με την ανακάλυψη της δομής και του ρόλου του DNA

• Περιγραφή των δεδομένων που επιβεβαιώνουν ότι το DNA είναι το γενετικό υλικό

• Περιγραφή της δομής του DNA • Διαμόρφωση και πακετάρισμα του DNA

Εισαγωγή

• Οι γενετικές μας πληροφορίες είναι κωδικοποιημένες στο DNA που κληρονομούμε από τους γονείς μας.

• Τα νουκλεϊκά οξέα είναι μοναδικά για την ικανότητά τους να αντιγράφονται.

• Η ομοιότητα των απογόνων με τους γονείς εξαρτάται από την ακριβή αντιγραφή του DNA και τη μεταβίβασή του από τη μια γενιά στην άλλη.

• Όταν η ομάδα του T.H. Morgan έδειξε ότι οι μονάδες κληρονομικότητας βρίσκονται στα χρωμοσώματα ,τα δυο συστατικά τους, DNA και πρωτεΐνες ήταν τα υποψήφια μόρια του γενετικού υλικού.

• Μέχρι τη δεκαετία του ‘40, οι πρωτεΐνες λόγω της μεγάλης ετερογένειας δομής και λειτουργίας φαίνονταν να κερδίζουν την προτίμηση των επιστημόνων σαν γενετικό υλικό.

• Όμως, Πειράματα με μικροοργανισμούς, όπως βακτήρια και ιοί, έλεγαν μια διαφορετική ιστορία…

Το γενετικό υλικό των κυττάρων βρίσκεται στα γονίδια που είναι οργανωμένα σε χρωμοσώματα του

πυρήνα

Γενετικό υλικό

Χρονοδιάγραμμα ανακάλυψης του γενετικού υλικού

1885 to 1901 Albrecht Kossel. Isolation and description of nucleobases

Χρωμοσώματα

Chromosomes were first observed in plant cells by Swiss botanist Karl Wilhelm von Nαgeli in 1842, and independently in Ascaris worms by Belgian scientist Edouard Van Beneden (1846-1910). The use of basophilic aniline dyes was a fundamentally new technique for effectively staining the chromatin material in the nucleus. Their behavior in animal (salamander) cells was later described in detail by German anatomist Walther Flemming, the discoverer of mitosis, in 1882. The name was invented later by another German anatomist, Heinrich von Waldeyer

Τα Χρωμοσώματα είναι φορείς του γενετικού υλικού

Walter Sutton (left) and Theodor Boveri (right) independently developed the chromosome theory of inheritance in 1902

the theory was hotly contested by some famous geneticists: William Bateson, Wilhelm Johannsen, Richard Goldschmidt and T.H. Morgan, all of a rather dogmatic turn of mind. Eventually, complete proof came from chromosome maps in Morgan's own lab.

Ποια είναι η σύστασή τους?

Τα μόρια της ζωής

• ΑΠΛΑ ΜΟΡΙΑ ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑ

• Αμινοξέα Πρωτεΐνες • Σάκχαρα Υδατάνθρακες • Λιπαρά οξέα Λίπη • Νουκλεοτίδια Νουκλεϊκά οξέα

Χημική σύσταση χρωμοσωμάτων

Πρωτεΐνες Νουκλεϊκά οξέα

Ποια μόρια μεταφέρουν την κληρονομήσιμη πληροφορία;

Οι ιδιότητες του μορίου της κληρονομικότητας • Αντιγραφή – περνά την πληροφορία στους απογόνους

• Ποικιλία μορφών – Υπάρχει σε τεράστιο αριθμό διαφόρων μορφών ώστε να ελέγχει πολλά γνωρίσματα

• Μετάλλαξη – αλλάζει δίνοντας δυνατότητα να δημιουργηθούν νέοι χαρακτήρες

– 1928 Griffith – 1944 Avery, McCarty, & MacLeod – 1952 Hersey and Chase

11

Κύρια δεδομένα που αποδεικνύουν το DNA σαν γενετικό υλικό

12

Ο Griffith εργαζόταν με τον πνευμονόκοκκο

Streptococcus pneumoniae

13

Το πείραμα μεταμόρφωσης του Griffith

15

Το πείραμα μεταμόρφωσης των Avery, MacLeod, McCarty

? ηταν καθαρό το παρασκεύασμα;

Πείραμα Hersey και Chase

DNA

Viral

Protein capsid

Πείραμα Hersey και Chase

Πείραμα Hersey και Chase

Άλλες ενδείξεις:

• The fact that cells double the amount of DNA in a cell prior to mitosis and then distribute the DNA equally to each daughter cell provided some circumstantial evidence that DNA was the genetic material in eukaryotes.

• Similar circumstantial evidence came from the observation that diploid sets of chromosomes have twice as much DNA as the haploid sets in gametes of the same organism.

Πείραμα Gierer και Schramm

Απομονωμένο RNA του ιού TMV προκαλεί τα συμπτώματα της ίωσης

το RNA είναι το γενετικό υλικό του ιού της μωσαϊκής του καπνού (ΤΜV)

το RNA είναι το γενετικό υλικό του ιού της μωσαϊκής του καπνού (ΤΜV)

Πείραμα Fraenkel-Conrat και Singer

Ιδιότητες DNA

Το DNA ως ο φορέας των κληρονομικών χαρακτηριστικών έχει τις πιο κάτω ιδιότητες:

• Είναι ικανό να αποθηκεύει κωδικοποιημένα μηνύματα στο μόριό του, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο του μεταβολισμού και της ανάπτυξης του κάθε οργανισμού.

• Μπορεί να αντιγράφεται κατά την κυτταρική διαίρεση, με αποτέλεσμα όλα τα κωδικοποιημένα μηνύματα να μεταφέρονται από την πατρική στη θυγατρική γενιά.

• Είναι σταθερό και έτσι μεταφέρονται όλα τα κωδικοποιημένα μηνύματα σε πολλές διαδοχικές γενιές.

• Μπορεί να υποστεί μεταλλάξεις (αλλαγές), με δυνατότητα να δημιουργηθούν νέοι χαρακτήρες που επιτρέπουν στους οργανισμούς να προσαρμόζονται καλύτερα στις μεταβαλλόμενες συνθήκες του περιβάλλοντος.

Δομή DNA

– 1869 Friedrich Miescher – 1947 Chargaff – 1954 Wilkins, Franklin, Watson, & Crick

Δομή DNA

– 1869, Friedrich Miescher – 1901, Albrecht Kossel – 1938, Phoebus Aaron Theodor Levene

– http://www.americanscientist.org/issues/feat

ure/the-first-discovery-of-dna/1

H Πυρηνίνη του FRIEDRICH MIESCHER

ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ C H O N P

Αδενίνη Θυμίνη Γουανίνη Κυτοσίνη Ουρακίλη

Αζωτούχες βάσεις , Albrecht Kossel, 1901

Οι δομές των αζωτούχων βάσεων στο DNA και στο RNA. Οι χαρακτηριστικές πρόδρομες ενώσεις είναι η πουρίνη (επάνω αριστερά) και η πυριμιδίνη (κάτω αριστερά). Επισημαίνονται οι διαφορές μεταξύ των βάσεων.

Αζωτούχες βάσεις στο DNA και στο RNA

Σάκχαρα (1909-1929) και Τετρανουκλεοτίδια (1938), Phoebus Aaron Theodor Levene

Οι δομές της δεοξυριβόζης και της ριβόζης, των σακχάρων πεντόζης του DNA και του RNA αντίστοιχα ανακαλύφθηκαν από τον Levene. Επισημαίνεται η διαφορά μεταξύ των δύο σακχάρων στο 2΄ άνθρακα.

Δεοξυριβόζη και ριβόζη

1909 1929

Νουκλεοτίδια-Ονοματολογία

ΒΑΣΕΙΣ ΣΑΚΧΑΡΑ ΦΩΣΦΟΡΟΣ

Ονοματολογία

Tetranucleotide

1940

Χημική δομή του DNA και του RNA

Δομή DNA : Erwin Chargaff • By 1947, Erwin Chargaff had developed a series of rules based on a

survey of DNA composition in organisms. – He already knew that DNA was a polymer of nucleotides consisting

of a nitrogenous base, deoxyribose, and a phosphate group. – The bases could be adenine (A), thymine (T), guanine (G), or cytosine

(C). • Chargaff noted that the DNA composition varies from species to

species. • In any one species, the four bases are found in characteristic, but

not necessarily equal, ratios. • He also found a peculiar regularity in the ratios of nucleotide bases

which are known as Chargaff’s rules. • The number of adenines was approximately equal to the number

of thymines (%T = %A). • The number of guanines was approximately equal to the number

of cytosines (%G = %C). – Human DNA is 30.9% adenine, 29.4% thymine, 19.9% guanine and

19.8% cytosine.

37

Τι σημαίνει ότι A=T και G=C?

Οι αναλογίες του Chargaff

Δομή DNA

• By the beginnings of the 1950’s, the race was on to move from the structure of a single DNA strand to the three-dimensional structure of DNA. – Among the scientists working on the problem

were the Nobel winning Chemist Linus Pauling, in California, and Maurice Wilkins and Rosalind Franklin, in London.

Δομή DNA: Τι ήταν γνωστό?

–The phosphate group of one nucleotide is attached to the sugar of the next nucleotide in line.

–The result is a “backbone” of alternating phosphates and sugars, from which the bases project.

Πρωτεΐνες: Α-έλικα

The model of Linus Pauling

42

Maurice Wilkins and Rosalind Franklin

Maurice Wilkins and Rosalind Franklin

•Maurice Wilkins and Rosalind Franklin used X-ray crystallography to study the structure of DNA.

–In this technique, X-rays are diffracted as they passed through aligned fibers of purified DNA. –The diffraction pattern can be used to deduce the three-dimensional shape of molecules.

•James Watson learned from their research that DNA was helical in shape and he deduced the width of the helix and the spacing of bases based on their research.

James Watson and Francis Crick

• Watson and his colleague Francis Crick began to work on a model of DNA with two strands, the double helix.

• Using molecular models made of wire, they first tried to place the sugar-phosphate chains on the inside.

• However, this did not fit the X-ray measurements and other information on the chemistry of DNA.

James Watson and Francis Crick

• The key breakthrough came when Watson put the sugar-phosphate chain on the outside and the nitrogen bases on the inside of the double helix.

• The sugar-phosphate chains of each strand are like the side ropes of a rope ladder.

• Pairs of nitrogen bases, one from each strand, form rungs.

• The ladder forms a twist every ten bases.

The Breakthrough into DNA Structure

Η ανακάλυψη της διπλής έλικας

Watson and Crick •The nitrogenous bases are paired in specific combinations: adenine with thymine and guanine with cytosine. (This is supported by Chargaff’s rule) •Pairing like nucleotides did not fit the uniform diameter indicated by the X-ray data.

–A purine-purine pair would be too wide and a – pyrimidine-pyrimidine pairing would be too short. –Only a pyrimidine-purine pairing would produce the 2-nm diameter indicated by the X-ray data.

Πως ζευγαρώνουν οι αζωτούχες βάσεις

In addition, Watson and Crick determined that chemical side groups off the nitrogen bases would form hydrogen bonds, connecting the two strands.

Based on details of their structure, adenine would form two hydrogen bonds only with thymine and guanine would form three hydrogen bonds only with cytosine.

This finding explained Chargaff’s rules.

Watson and Crick

• The base-pairing rules dictate the combinations of nitrogenous bases that form the “rungs” of DNA.

• However, this does not restrict the sequence of nucleotides along each DNA strand.

• The linear sequence of the four bases can be varied in countless ways.

• Each gene has a unique order of nitrogen bases.

Δομική ποικιλομορφία

• Ποικιλία μορφών: Υπάρχουν 4 είδη νουκλεοτιδίων σε μια απλή αλυσίδα DNA. Μπορεί να είναι σε οποιαδήποτε διάταξη και μήκος. Για παράδειγμα, ένα γονίδιο 500 βάσεων μπορεί να πάρει 4500 διαφορετικές διαμορφώσεις

Watson and Crick

• In April 1953, Watson and Crick published a succinct, one-page paper in Nature reporting their double helix model of DNA which shook the scientific world.

• They were awarded a Nobel Prize in 1962. James Watson is still alive today. Francis Crick died in 2004. There discovery has had a tremendous impact in the biological field as it relates to genetics and evolution.

Nature paper

Μοντέλο διπλής έλικας

Salvador Dalí Butterfly Landscape (The Great Masturbator in a Surrealist Landscape with DNA) 1957–58

Salvador Dali Galacidalacidesoxyribonucleicacid. Also known as: Homage to Crick and Watson (Discoverers of DNA)

Susan Rankaitis. “TGCA,” combined media monoprint, 1996, Robert Mann Gallery, New York

Tom Otterness DNA chain, 1986

Χωροπληρωτικό μοντέλο διαφορετικών τύπων DNA

Δομή RNA

• DNA RNA • Σάκχαρο: δεσοξυ-ριβόζη ριβόζη • Διπλή αλυσίδα Μονή αλυσίδα • A, T, C, G A, U, C, G

Δομή RNA

Δομή RNA

Τα είδη μορίων RNA στο κύτταρο

Είδος RNA Λειτουργία mRNA κωδικοποιεί πρωτεΐνες rRNA είναι συστατικό του ριβοσωματίου και συμμετέχει στη

σύνθεση των πρωτεϊνών tRNA χρησιμοποιείται στην πρωτεϊνοσύνθεση ως μόριο

προσαρμογής μεταξύ του mRNA και των αμινοξέων Μικρά RNA χρησιμοποιούνται στη συρραφή του προ-mRNA, στη

μεταφορά των πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο και σε άλλες διεργασίες του κυττάρου

Οργάνωση του DNA σε χρωμοσώματα

DNA

1 m = 103 mm = 106 μm = 109 nm = 10 x109 Angstrom

10 b 3,4 nm 10 x 103 b 3,4 μm 10 x 106 b 3,4 mm 10 x 109 b 3,4 m

1 Mb = 103 Kb = 106 bp 1Mb = 0,34 mm

Μετατροπές μονάδων

DNA: Μονόκλωνο Δίκλωνο Γραμμικό Κυκλικό

Χρωμοσώματα προκαρυωτικών οργανισμών

79

Ηλεκτρονιομικρογραφία του βακτηριοφάγου ΦΧ174.

Χρωμόσωμο 5.386 νουκλεοτίδια Αναλογία βάσεων 25Α:33Τ:24G:18C

80

Η δομή του χρωμοσώματος του φάγου λ ποικίλλει στα στάδια της λυτικής μόλυνσης της E. coli. Τμήματα του χρωμοσώματος του φάγου λ, που δείχνουν τη νουκλεοτιδική αλληλουχία των δύο μονόκλωνων, συμπληρωματικών («κολλωδών») άκρων. Μετά τη μόλυνση ενός βακτηρίου E. coli, το χρωμόσωμα του φάγου λ γίνεται κυκλικό με ζευγάρωμα των συμπληρωματικών άκρων του, ενώ η κυκλοποίηση ολοκληρώνεται από την DNA λιγάση.

Η δομή του χρωμοσώματος του φάγου λ

81

Χρωμόσωμα που απελευθερώθηκε από ένα κύτταρο Ε. coli το οποίο έχει υποστεί λύση.

Μήκος κυττάρου 1 μm Χρωμόσωμο 4,6 Μb (4,6 x 106 b) Μήκος 1.100 μm

82

(α) Γραμμικό DNA με 20 ελικοειδείς στροφές (208 ζεύγη βάσεων). (β) Χαλαρό κυκλικό DNA το οποίο προκύπτει από τη σύνδεση των δύο άκρων του γραμμικού μορίου που απεικονίζεται στο (α). (γ) Το γραμμικό μόριο DNA από το (α) ξετυλιγμένο κατά δύο ελικοειδείς στροφές από το ένα άκρο του. (δ) Ένα πιθανό κυκλικό μόριο DNA το οποίο παράγεται με σύνδεση των δύο άκρων του γραμμικού μορίου από το (γ). Το κυκλικό μόριο έχει 18 ελικοειδείς στροφές και μια βραχεία ξετυλιγμένη περιοχή. (ε) Η πιο ευνοούμενη ενεργειακά μορφή του (δ), ένα υπερελικωμένο DNA με 20 ελικοειδείς και 2 υπερελικοειδείς στροφές.

Απεικόνιση της υπερελίκωσης του DNA.

83

Ηλεκτρονιομικρογραφία ενός κυκλικού μορίου DNA, όπου φαίνεται η χαλαρή και η υπερελικωμένη κατάσταση.

α) β)

(α) Χαλαρό (μη υπερελικωμένο) DNA. (β) Υπερελικωμένο DNA. Τα δύο μόρια απεικονίζονται στην ίδια μεγέθυνση.

84

Μοντέλο της δομής ενός βακτηριακού χρωμοσώματος.

85

Τιμή C

86

Δομή ευκαρυωτικού χρωμοσώμου

ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ

Δομή ευκαρυωτικού χρωμοσώμου

ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ DNA και πρωτεΐνες

Μορφές χρωματίνης

Ευχρωματίνη •Χαλαρή μορφή συμπύκνωσης •Μεταγραφικά ενεργή Ετεροχρωματίνη •Σταθερή συμπύκνωση •Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες •Μεταγραφικά ανενεργή •Διακρίνεται σε ιδιοστατική (ίδια θέση στα ομόλογα) και δυνητική (ποικιλία θέσεων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, στάδια ανάπτυξης κλπ)

Αριθμός χρωμοσωμάτων

91

Ηλεκτρονιομικρογραφία ξετυλιγμένης χρωματίνης, όπου φαίνονται τα νουκλεοσώματα που μοιάζουν με «χάντρες κομπολογιού».

Ευκαρυωτικοί οργανισμοί: νουκλεοσώματα

Νουκλοεσωμάτιο

Ιστόνες

Ο κώδικας των ιστονών

97

(α) Ο πυρήνας ιστονών του νουκλεοσώματος. (β) Διάγραμμα νουκλεοσωμάτων με μορφή «χάντρες κομπολογιού» στη χρωματίνη. Οι διαστάσεις ενός νουκλεοσώματος είναι 11 nm × 5,7 nm. (γ) Συμπύκνωση της χρωματίνης εξαιτίας της πρόσδεσης της Η1.

Βασική δομή ευκαρυωτικού χρωμοσώματος

99

(α) Ηλεκτρονιομικρογραφία του ινιδίου. (β) Σωληνοειδές μοντέλο για τον τρόπο οργάνωσης των νουκλεοσωμάτων στα ινίδια χρωματίνης των 30 nm. Η ιστόνη Η1 δεν απεικονίζεται.

α)

β)

To ινίδιο χρωματίνης των 30 nm.

iGenetics 100

Το χρωμόσωμα διατηρεί το γενικό του σχήμα μέσω ενός μη ιστονικού ικριώματος από το οποίο προεκβάλλουν βρόχοι DNA.

Ηλεκτρονιομικρογραφία ενός μεταφασικού χρωμοσώματος από το οποίο αφαιρέθηκαν οι ιστόνες.

101

(α) Βρόχοι ινιδίων των 30 nm προσδεδεμένοι μέσω περιοχών σχετιζόμενων με το ικρίωμα σε μη ιστόνες του χρωμοσωμικού ικριώματος. (β) Σχηματική απεικόνιση τμήματος ενός μεταφασικού χρωμοσώματος, όπου φαίνεται η περιέλιξη των περιοχών βρόχων.

Περιοχές βρόχων σε μεταφασικά χρωμοσώματα.

Συμπύκνωση…..

….Συμπύκνωση.

10.000 φορές πιο κοντό 400 φορές πιο παχύ από το γυμνό DNA

DNA

Χρωμόσωμο

Δομή χρωμοσωμάτων -Ανακεφαλαίωση

Κεντρομερές

107

Το R συμβολίζει μια πουρίνη. Τα ζεύγη βάσεων που υποδεικνύονται με κεφαλαία γράμματα συναντώνται σχεδόν σε όλα τα κεντρομερή (σε 15 ή 16 από τα 16) του ζυμομύκητα και θεωρούνται πολύ συντηρημένα. Τα ζεύγη βάσεων που εντοπίζονται σε 10 ως 13 από τα 16 κεντρομερή είναι συντηρημένα και υποδεικνύονται με πεζά γράμματα. Οι μη συντηρημένες θέσεις συμβολίζονται με παύλες.

Πρότυπη αλληλουχία για τα κεντρομερή της ζύμης Saccharomyces cerevisae.

108

Φαίνεται η σχέση μεταξύ των μικροσωληνίσκων της ατράκτου και των στοιχείων αλληλουχίας DNA του κεντρομερούς.

Υποθετικό μοντέλο του κινητοχώρου στο ζυμομύκητα

109

Τελομερή

(α) Απλές τελομερικές αλληλουχίες στα άκρα των χρωμοσωμάτων του πρωτοζώου Tetrahymena. (β) Μοντέλο της δομής του τελομερούς σύμφωνα με το οποίο το τελομερικό DNA αναδιπλώνεται και σχηματίζει ένα βρόχο t. Το μονόκλωνο άκρο διεισδύει στη δίκλωνη τελομερική αλληλουχία και δημιουργεί ένα βρόχο εκτόπισης ή βρόχο D.

DNA ενός αντιγράφου

Τα περισσότερα γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες

Επαναλαμβανόμενο DNA

Μεταθετά στοιχεία rRNA tRNA Κεντρομερή τελομερή

Μεταθετά στοιχεία

Περίπου 45% του ανθρώπινου γονιδιώματος αποτελείται από μεταθετά στοιχεία

Active transposable elements in the human genome.

Muotri A R et al. Hum. Mol. Genet. 2007;16:R159-R167

© The Author 2007. Published by Oxford University Press. All rights reserved. For Permissions, please email: journals.permissions@oxfordjournals.org

Χρωμοσωμικές περιοχές της E. coli, του ζυμομύκητα, της φρουτόμυγας και του ανθρώπου, από τη σύγκριση των οποίων φαίνεται η διακύμανση της γονιδιακής πυκνότητας στα διάφορα γονιδιώματα.