DNA y RNA Polimerasas

Temario

DNA polimerasas• Generalidades• Procariota (I, II, III)• Eucariota ( , , , )a b g e

RNA polimerasas• Generalidades• Procariota • Eucariota (I, II, III)

DNA Polimerasas-Generalidades

Momento: Replicación

DNA polimerasas

• Catalizan la reacción química de la síntesis del DNA, creación de enlaces fosfodiéster entre los desoxirribonucleótidos en una cadena de DNA.

DNA Polimerasas-Generalidades

Mecanismo de Reacción

• Grupo hidroxilo extremo terminal 3' al final de una cadena de DNA realiza un ataque nucleofílico sobre el fosfato α de un dNTP*.

• Dirección 5'3' exclusivamente**.*El dNTP ha sido posicionado previamente para la incorporación al cebador

mediante enlaces de hidrógeno con el nucleótido apropiado en la cadena molde.** La dirección es exclusivamente 5‘3‘en la actividad de polimerasa, sin embargo existen polimeras como la pol I con actividad exonucleasa en sentido opuesto.

Poli(nucleótido)n-3'-OH + dNTP --> Poli(nucleótido)n+1-3'-OH +PP

DNA Polimerasas-Generalidades

• Reacción fácilmente reversible.

Grupo hidroxilo es un nucleófilo débil y el pirofosfato un buen grupo de saliente…..

• Se gastan dos fosfatos por cada nucleótido incorporado.

La reacción se desplaza hacia los productos por la

acción del pirofosfato sobre otro producto de

reacción (PPi + H2O2Pi)….

Poli(nucleótido)n-3'-OH + dNTP --> Poli(nucleótido)n+1-3'-OH +PP

DNA Polimerasas-Generalidades

DNA polimerasa I

• Presente en bacterias.

• Actividad exonucleasa dirección 3' 5'

• Permite la traslación de mella.

DNA Polimerasas-Generalidades

Traslación de mella: La eliminación de ribonucleótidos del extremo 5' del RNA cebador, acoplada con la extensión simultánea del extremo 3' del fragmento de Okazaki, mediante la incorporación de desoxirribunocleótidos.

La polimerasa replicativa es dimérica, y sus acciones están coordinadas con los moldes de la cadena líder y la retardada.

DNA Polimerasa en Procariotas- DNA Polimerasa I

Requiere de un DNA molde y un cebador (DNA o RNA).

Una sóla cadena polipeptídica. La enzima posee tres lugares

activos: a) 3' exonucleasab) 5' exonucleasac) Polimerasa Es posible eliminar desoxi o

ribonucleótidos. Puede eliminar nucleótidos

dañados y reponerlos inmediatamente.

3' exonucleasa

• Correción de pruebas

• Eliminación de nucleótidos con apareamiento incorrecto.

5' exonucleasa

• Corta RNA en cadena retardada.

• Elimina ribonucleótidos y sustituye por desoxiribonucleótidos.

DNA Polimerasa en Procariotas- DNA Polimerasa I

Estructura

103 Kdalton

Fragmento N terminal pequeño (dominio 5' exonucleasa)

Fragmento C teminal grande (dominio 3' exonucleasa y polimerasa bien separados) a.k.a Fragmento de Klenow

Hendidura grande para el DNA, parecido a una mano con palma, pulgar y dedos.

DNA Polimerasa en Procariotas- DNA Polimerasa II y III

II

Incorporación de nucleótidos durante la replicación.

Función como reparadora de DNA

Elevada Vmax

Gen polB

III

Esencial en replicación

polC gen para subunidad catalítica

DNA Polimerasa en Procariotas- DNA Polimerasa I, II y III

Estructuras y Mecanismos de las Polimerasas

El lugar activo de la polimerasa se encuentra en el dominio de la palma y el de la 3' exonucleasa en la base de la palma.

Dos iones de magnesio unidos a nucleótidos fosfato y residuos aspartato son esenciales para la catálisis.

Holoenzima de la Polimerasa III

•G

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Cargador de Pinza

Complejo : , g d d', , c , (g dos o tres subinidades)

Se une a lleva a cabo la apertura del anillo.

Requiere ATP para cambio conformacional, mas no se hidroliza hasta que cierra el anillo.

Holoenzima Polimerasa III

DNA Polimerasa en Eucariotas Cinco DNA polimerasas distintas: , , , a b g d e

RNA Polimerasas-Generalidades

Momento: Transcripción

• Síntesis de RNA utilizando un proceso de copiado a de una cadena molde de DNA

n(ATP+CTP+GTP+UTP)(AMP-CMP-GMP-UMP)n +nPPi

RNA Polimerasa

Procariota

Una sola sintetiza las tres clases de RNA

Eucariota

I : rRNA

II: mRNA

III: rRNA y especie 5s del rRNA

• La actividad de la RNA polimerasa es lenta pero se produce en muchos sitios simultáneos.

• Rara vez o nunca se disocia del molde hasta que llega la señal específica.

• Es menos exacta que DNA polimerasa.• En E. coli la actividad exonucleasa se da por las proteínas

GreA y GreB

Estructura de RNA Polimerasa Procariota

Estructura de RNA Polimerasa Eucariota RNA polimerasas diferentes. RNA polimerasa nuclear tiene hasta doce

subunidades. Requieren factores de transcripción.

Estructura de RNA Polimerasa Eucariota

RNA pol I

• Pre-rRNA • 13

subunidades• 600 Kdalton

RNA pol II

• Genes estructurales y RNA nucleares pequeños

• 12 subunidades

• Al menos cinco factores de transcripción

RNA pol III

• 700 Kdalton• 14

subunidades• Genes

pequeños que no se traducen a proteinas. tRNA y rRNA 5S

• Regulado por secciones dentro de la cadena.

• Al menos 5 factores de transcripción

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