DNA-RNAHazırlayan:

Fatimah AZZAHRAGıda Mühendisliğinde Moleküler Uygulamalar

KAPSAMI

• Nükleik Asitlerin Yapısı– Deoksiribonükleik Asit (DNA)– Pürin ve Pirimidin Bazları– DNA’nın Biyosentezi– DNA’nın Kromozomları Oluşturması– Denatürasyon ve Renatürasyon– DNA’nın Yapısal Formları– DNA’nın İzolasyon Teknikleri– Viral Nükleik Asitler– Transdüksiyon

• Ribonükleik Asitler (RNA)– Başlıca RNA Türleri

• DNA’nın Temel Fonksiyonları– DNA Replikasyonu (eşlenme,

duplikasyon)– Transkripsyon ve Translasyon– Reverz Transkripsyon

• DNA Rekombinasyonları– DNA Rekombinasyonunda Görev

Alan Enzimler– Rekombinasyonda Kullanılan

Vektörler– Gen Klonlaması

2Uludağ Üniversitesi

Uludağ Üniversitesi 3

Deoksiribonükleik Asit (DNA)• Hücrenin genomu (kromozomu, nükleik asit, ve histon) pozitif yüklü küçük

bir proteinin oluşturduğu bir yapı olarak bilinmektedir.

• Genetik bilgiyi taşıyan hücre nükleusundan izole edilmiş, her hücrede bulunan genler ve kalıtsal faktörlerle ilgili protein sentezinin anahtar maddeleri, nükleik asitler olarak isimlendirilmiş.

• Frederick Miescher (1869) tarafından bulunmuş ve James Watson & Francis Crick (1953) DNA modeline tespit etmiştir.

• DNA, bir eksen ve birbiri etrafına sarılarak çift sarmal (double helix) meydana getiren, iki DNA sırasından oluşan büyük bir moleküldür.

• DNA’yı oluşturan çift sarmalın her sırası ‘nükleotid’ birimlerinin peş peşe dizilmesi ile polinükleotid olarak oluşmaktadır.

Uludağ Üniversitesi 4

Nükleik Asitler

• Proteinlerde polipeptid zincirleri gibi nükleik asitler de nükleotidlerden kurulur. Nitrojenli baz-deoksiriboz-fosfat sırasına göre birbirine bağlanır ve nükleotid olarak ifade edilir.

1. Azot ihtiva eden kapalı halka yapısında pürin (iki halkalı) veya pirimidin (tek halkalı) bazları

2. Deoksiriboz, 5 karbonlu pentoz şekeri (2-deoksi-D-riboz), 2’pozisyonundaki bir atom oksijeni fazla olan formuna ise riboz adlandirilmaktadır.

3. Fosfat molekülü (fosforik asit, H3PO4)

Uludağ Üniversitesi 5

• Nükleik asitler şekerin çeşidine göre iki tiptir:

– RNA (Ribonükleik Asit)

– DNA (Deoksiribonükleik Asit)

• DNA replikasyon ile doğrudan kendini oluşturabilir.

• DNA doğrudan RNA da sentezleyebilir ve, RNA üzerinden de protein sentezlenebilir.

• Nükleik Asit yapısı:

Uludağ Üniversitesi6

DNA çift ipliksi molekül halindedir RNA tek iplikcik halindedir

Çift sarmal yapı Deoksiriboz yerine riboz içerir

Tamamlayıcı baz çiftiHidrojen bağı

Timin yerine Urasil içerir

Pürin ve Pirimidin Bazları (1)• Pürin bazları Adenin (A) ve Guanin (G) dokuz atomdan oluşan iki

adet karbon-azot halkası teşkil ederken, Pirimidin bazları Timin (T) ve Sitozin (C) altı atomdan oluşan bir adet karbon-azot halkasından ibarettir.

Uludağ Üniversitesi 7

Pürin ve Pirimidin Bazları (2)• RNA’nın yapısında ise Pirimidin bazlarından

Timin yerine Urasil (U) yer almaktadır.

• DNA’yı oluşturan iki ipliğin arası sabit olup H bağları ile bağlanmıştır. Sabit olan bu aralığa girecek baz çiftlerinin de pürin-pirimidin şeklinde olması gerekir.

• DNA’nın çift sarmalını oluşturan nükleotidler arası bağlantı karşılıklı olarak

– Guanin-Sitozin

– Adenin-Timin

• Bu dört temel bazın (A, T, G, C) yan yana ve karşılıklı dizilişi ile oluşan DNA iplikçiklerin hücreler genetik bilgileri taşırlar ve bu diziliş sırası ile yakından ilişkilerdir.

Uludağ Üniversitesi 8

DNA ve RNA mevcut ana bazlarDNA RNA

Adenin (A) Adenin (A)

Sitozin (C) Sitozin (C)

Guanin (G) Guanin (G)

Timin (T) Urasil (U)

Uludağ Üniversitesi 9

Pürin ve Pirimidin Bazları (3)• Adenin timin ile 2 hidrojen bağı (A=T) ve guanin de sitozin ‘le 3 hidrojen

bağı (G≡C) ile bağlanarak DNA’nın iç kısmında yer alırlarken şeker-fosfat omurgası da dış tarafta bulunur. Karşılıklı birleşmiş olan nükleotidler baz çiftlerini meydana getirirler ve böylece DNA çift iplikçikli bir yapı karakteri gösterir.

Uludağ Üniversitesi 10

Pürin ve Pirimidin Bazları (4)• DNA’nın çift sarmalını oluşturan her bir zincirde peş peşe dizilen

nükleotidler (monomerler), birbirlerine 1. nükleotidin 3. karbonundaki OH grubu ile 2. nükleotidin 5. karbonundaki fosfat grubu arasında fosfodieser bağları (O-P-O) ile birleşerek polinükleotid zincirlerini (polimer) meydana getirmektedir.

• Bu şekilde tekrarlanan şeker-fosfat birimleri oluşur.

• DNA’yı oluşturan polinükleotid iplikçiklerinde bulunan 4 bazın (A, C, G, T) diziliş düzeni genetik şifreyi (genetik kodlama) meydana getirir.

Uludağ Üniversitesi 11

DNA’nın Biyosentezi• DNA çoğalmasının biyokimyasal yönünün açıklaması, DNA

Polimeraz ve DNA Ligaz adı verilen iki enzim yardımı ile in vitro DNA sentezini gerçeklestirir.

• DNA’yı oluşturan polinükleotid iplikçilerinin sentezlenmesi, hücre içinde bir nükleotid kaynağına ihtiyaç gösterir.

• Bazı bakteriler bu nikleotidleri bulundukları ortamdan hazır olarak alırlar. Bazıları ise, glukoz, amonyum sülfat, ve mineral gibi basitlerden nükleotidleri sentezlerler. Basit besinlerin nükleotidlere dönüşmesi, bir takım hücre mekanizmaları ve ATP şeklinde enerjiyi gerektiren reaksiyonlar sonucu oluşur.

Uludağ Üniversitesi 12

DNA’nın Kromozomları Oluşturması (1)• Genel olarak prokaryotik hücrelerin tek ve halkasal, ökaryotların ise 2-50

arasında iki ucu açık lineer kromozoma sahib olur.

• Her kromozom bir DNA molekülünden oluşmaktadır. Hücre bölüneceği zaman kromozomu oluşturan DNA replike olur, diğer bir ifade ile iki DNA moleküllü bir kromozomu (sister kromatid) oluşur.

• Kromatin adını hücre çekirdeğinde bulunan genetik madde veya kromozomların kimyasal analizi yapıldığında, başta DNA ve protein olmak üzere az miktarda da RNA (özellikle transkripsyon aşamasında henüz DNA’dan ayrılmamış mRNA) moleküllerinden oluşturduğu görulmuştur.

Uludağ Üniversitesi 13

DNA’nın Kromozomları Oluşturması (2)• Kromatinin yapısına giren proteinler iki gruba ayrılır :

1. Histon tipi küçük ve bazik karakterde proteinler

2. Histon olmayan kromozomal asidik proteinler (bunların bir kısmı kromozomun yapısında sürekli, bir kısmı da replikasyon/transkripsyon aşamalarında olduğu gibi geçici olarak yer alır)

• Histon tipi proteinler (H1, H2A, H2B, H3, H4, ve H5) molekülü ile iyonik bağlantı kurarak nükleozom oluşumlarını meydana getirirler.

Uludağ Üniversitesi 14

DNA’nın Kromozomları Oluşturması (3)• Nükleozomları birbirine bağlayan ve linkler olarak ifade edilen ara

bağlantılar ise 20-60 nükleotid oluşur.

• DNA pH 7.0 ve oda sıcaklığında oldukça vizkoz bir yapı gösterir. pH değişimine ve sıcaklığın 800C’nın üstündeki sıcaklıklara yükselmesi oranında çözünürlüğü artar.

• Bir hücre yer alan kromozomların toplamına genom adı verilir.

Uludağ Üniversitesi 15

NükleotidlerDNA,

DNA+ProteinNükleozomlar Kromatin Kromozom Genom

Denatürasyon ve Renatürasyon (1)• İki ucu açık çift sarmallı DNA 1000C’ye kadar ısıtıldığında, sarmalı

oluşturan iki iplikçik arasındaki hidrojen bağları çözülüp iki iplikçikler birbirinden ayrıldığı zaman denatürasyon adı verilir.

Uludağ Üniversitesi 16

Denatürasyon ve Renatürasyon (2)

• Bir DNA molekülünü oluşturan iki ipliğin birbirinden ayrılmasını sağlayan sıcaklığın derecesi molekülünü oluşturan baz birleşenlerine bağlıdır.

• Guanin ile sitozin arasında 3 hidrojen bağı olduğundan, 2 hidrojen bağına sahip adenin-timin çiftine göre daha geç ayrılmaktadır.

• Denatüre edilebilmeleri için halkasal kromozomun en az bir noktasından kesilmesi gerekir.

• Kromozomların replikasyonu ise hücre içi Dnaz enzimi ile bir fosfodiester bağı koparıldıktan sonra gerçekleşir.

• Isıtma yöntemi ile ayrılan iplikçiklerin süspansiyonu yavaş yavaş soğutulursa, karşılıklı hidrojen bağları tekrar kurulur ve iplikçikler tekrar eşleşerek çift sarmalı yeniden oluşturduğu zaman ise renatürasyondenilir.

Uludağ Üniversitesi 17

DNA’nın Yapısal Formları

• DNA molekülleri başlıca 3 konumda bulunmaktadır:

1. Lineer (uzunlamasına) dubleks DNA formu: Ökaryotik hücre kromozomlarında, bazı fajlarda ve virüslerde genetik materyali oluşturan sarmal DNA’nın iki ucu açık, lineer bir formda bulunur.

2. Sirküler dubleks DNA formu : bakteriler, bazı fajlar, virüsler, ökaryotik mitokondri, kloroplast ve plazmid DNA’ları çift iplikçikli sarmal sirküler bir yapı gösterirler.

3. Süper sarmal (süper heliks) DNA formu : plazmid ve virüslerde daha fazla rastlanılan bu yapı, dübleks sarmal DNA’nın serbest ortamda kendi ekseni etrafında 3600C ve bir kaç kere dönmesinden kaynaklanmaktadır.

Uludağ Üniversitesi 18

DNA’nın İzolasyon Teknikleri (1)

Pürifikasyon

• DNA’nın eksrakt edilmesi ve saflaştırılması

• DNA’nın hücrede bulunan her türlü yapısal moleküllerden uzaklaştırılması gerekir

• Bakteri hücrelerinin peptidoglikan yapıları lizozim enzimi ile lize edilir

• Aynı zamanda lipid ve karbohidratları uzaklaştırır

• DNA molekülleri agaroz jel ortamında ethidyum bromür yardımyla görüntülenir

Spektrofotometri

• Solüsyon içerisindeki DNA miktarı 260-280 nm dalga boyundaki UV ışınları kullanılarak belirlenir

• Elektroforez yardımıyla görüntülenir

Sedimentasyon

• Molekül ağırlıkları farklı DNA’lar devirli santrifüj yardımı ile birbirinden ayrılabilmektedir

• CsCl2 (Thiophosgene) ilave edilen DNA süspansiyonu santrifüj esnasında yoğunluğa bağlı olarak çesitli bantlara ayrılır

• Ethidyum bromid ilave ederek yoğunlukları farklı DNA bantları görüntülenir

Uludağ Üniversitesi 19

DNA’nın İzolasyon Teknikleri (2)

Pürifikasyon Spektrofotometri Sedimentasyon

Uludağ Üniversitesi 20

Viral Nükleik Asitler (1)

• Virüsler konak hücre içerisinde olmadıklarında, nükleik asit ve proteinlerden oluşan cansız makromoleküller olarak tanımlanır.

• Daha çok sahip oldukları nükleik asit çeşidine, oluşturdukları hastalıklara veya yapısal formlarına göre isimlendirilmektedir.

• Virüslerde genellikle tek bir nükleik asit möleküllü bulunmaktadır.

• Viral nükleik asit ya DNA, ya da RNA olup tek ya da çift iplikçiklidir.

• Kapsidler, heliks, ikosahidral veya kompleks şekilli olabilirler.

• Bazı virüslerde kapsidin etrafında olumsuz çevre şartlarına karşı direnci sağlayan bir zarf yapısı mevcuttur.

Uludağ Üniversitesi 21

Viral Nükleik Asitler (2)

Uludağ Üniversitesi 22

• Virüsler hayvan hücrelerine ya reseptör proteinlerine bağlandıktan sonra vezikül halinde endositoz olarak hücrenin içerisine girer, füzyon ile sadece kalıtsal materyali bir kanala aktarır.

• Virüsler enfekte ettikleri hücrenin enzim, ribozom, ve tRNA gibi faktörlerini kullanarak kendi proteinlerini sentezlerler.

Viral Nükleik Asitler (3)

Uludağ Üniversitesi 23

Transdüksiyon• Transdüksiyon, fajlar aracılığı ile bir bakterinden diğerine bakteriyal genin

taşınması olayıdır.

• Herhangi bir geninde mutasyon olan bakteriye fajlar tarafından sağlam gen aktarılması ile transdüksiyon izlenebilir.

• Transdüksiyon ile bir bakteri katılır hücresine gelen yeni DNA molekülü için iki seçenek vardır:

– Bakteri genomuna katılır ve beraberinde getirdiği bakteri genimi alıcı bakterinin genomuna yerleştirir.

– Sitoplazma serbest plazmid şeklinde kalır.

Uludağ Üniversitesi 24

Ribonükleik Asitler

• Ribonükleik asit veya RNA bir nükleik asittir, nükleotitlerden oluşan bir polimerdir.

• RNA yapısında DNA’da olduğu gibi 3 temel yapı bulunmaktadır:

1. Pürin ve Pirimidin bazları (Urasil, Adenin, Sitozin, Guanin)

2. Pentoz şekeri (riboz)

3. Fosfat moleküllü (fosforik asit)

• RNA pek çok önemli biyolojik rol oynar, bunların arasında DNA'da taşınan genetik bilginin proteine çevirisi (translasyon) ile ilişkili çeşitli süreçlerde de yer alır.

Uludağ Üniversitesi 25

Başlıca RNA Türleri (1)

• Bakterilerde RNA, molekül ağırlıklarına ve fonksiyonlarına göre genel olarak ayrı grupta incelenir:

1. Mesenger RNA (mRNA)

2. Transfer RNA (tRNA)

3. Ribozomal RNA (rRNA)

4. Pirimer RNA (pRNA)

• İnsan embiryo hücrelerindeki toplam RNA’ların %80’i rRNA, %15’tRNA, ve çok az bir bölümü ise mRNA’dan oluşmaktadır.

Uludağ Üniversitesi 26

Mesenger RNA (mRNA)• DNA iplikçiklerin birinden mevcut genetik bilginin RNA Polimeraz enziminin

yardımı ile mRNA’ya aktarılması (transkripsiyon) şeklinde gerçekleşir.

• Yeni oluşan mRNA, kendisine kalıplık yapan DNA iplikçiğine antiparalel bir durum gösterir.

• Herhangi bir anda farklı hücrelerin yapı ve fonksiyonlarına bağlı olarak içerdikleri mRNA’nın türü ve miktarı farklıdır.

• mRNA, A, U, C, ve G bazlarından ibaret tek iplikçik, düz ve iki ucu açık bir moleküldür.

• mRNA’da peş peşe gelen her üç baz bir kodon teşkil etmekte ve her bir kodon bir amino asit sentezinde gerekli şifresi olüşmaktadır.

• mRNA’nın 5’-ucunda protein sentezini (translasyon) başlatıcı AUG (metionin) kodonu bulunur.

Uludağ Üniversitesi 27

Mesenger RNA (mRNA)

Uludağ Üniversitesi 28

Transfer RNA (tRNA)

• DNA’dan doğrudan doğruya sentezlenen taşıyıcı RNA veya transfer RNA (tRNA) çeviri işleminde görev alır.

• mRNA gibi tek iplikçikli olmasına karşın bazı bölgelerinde zayıf bağlarla baz çiftleri oluşturur.

• tRNA, ribozom üzerindeki mRNA‘dan aldığı şifre doğrultusunda proteinlerin amino asit dizilişini sağlamakta görevli küçük bir moleküldür.

• Hücrede sentezlenen ve enzimler tarafından aktive edilen amino asit molekülleri, kendileri için özgül olan tRNA moleküllerince aranıp bulunur ve tRNA möleküllerin serbest ucu özgül amino asitlerle birleşir.

• Amino asitler amino açil santetaz enzimi ile aktivite olduktan sonra amino açil-tRNA ligaz enzim ile tRNA’nın 3’-OH ucuna bağlanırlar.

Uludağ Üniversitesi 29

Ribozom ve Ribozomal RNA (rRNA)• Ribozomlar, amino asitlerin birbiriyle birleşerek protein oluşumunda rol

oynamayan önemli moleküllerdir.

• Ribozomlar sitoplazmada serbest veya endoplazmik retikulum yüzeyine bağlı halde bulunurlar.

• Bir ribozomun yapısında yaklaşık olarak %55 RNA (ribozomal RNA) ve %40 protein bulunur.

• Çekirdekli hücrelerde ribozom sentezi, çekirdek içerisindeki çekirdekçikte yapılır.

Uludağ Üniversitesi 30

Uludağ Üniversitesi 31

Ribozomal RNA (rRNA)• Ribozomal RNA prensip olarak bir protein sentezinin başlangiç

noktasından bitiş noktasına kadar bütün işlemlerde görev alır.

• rRNA toplam hücresel RNA’nın yaklaşık %80’inini oluşturur.

• rRNA’ların bir kısmı ribozi adı verilen enzimin de yapısına girmektedir. Buenzim sentezlenen amino asitler arasında peptid bağının oluşumunu veökaryotik hücrelerde öncül mRNA’lardaki intronların uzaklaştırılmasındagörev alır.

Uludağ Üniversitesi 32

Pirimer RNA (pRNA)

Uludağ Üniversitesi 33

• DNA’nın replikasyonu sırasında ana iplikçiğin 3’← 5’ yönünde olanına yeni iplikçik sentezlenirken sentez yönü tersine 3’→5’ olacağından, DNA Polimeraz enzimi ters olan bu sentezi kesintili olarak sürdürür.

• Önce, primaz enzimi tarafından yaklaşık 10 kadar nüklotidden oluşan pirimer RNA’lar sentezlenir. Bu fragmentlerin devamı ise Polimeraz III enzimi yardımıyla tamamlanır.

• Oluşan bu fragmentlerin araları Polimeraz ile doldurulduktan sonra DNA ligaz ile de birleştirilir. pRNA’ların görevi bittikten sonra çıkarılır.

Başlıca RNA Türleri (2)

Uludağ Üniversitesi 34

RNA Çeşidi Molekülün Nüklelotid

SayısıFonksiyonu

mRNA 500-3000 Aminoasitlerin dizisini belirler.

rRNA 100-3000Bağlantı kurduğu proteinler ile ribozomun yapısını oluşturur. Ayrıca, protein sentezinde görev alır.

tRNA 75-85mRNA’daki kodon şifresine, uygun antikodon şifresi ilebağlanırken beraberindeki özel amino asidi ribozoma taşır.

pRNA 8-15 DNA replikasyonunda öncüllük yapar.

DNA’nın Temel Fonksiyonları

DNA’nın 3 temel fonksiyonu bulunmaktadır:1. DNA replikasyonu

2. Transkripsiyon ve translasyon

3. Reverz transkripsiyon

Uludağ Üniversitesi 35

DNA Replikasyonu (eşlenme, duplikasyon)

• Replikasyon başlangıç (orijin) noktasında DNA sarmalı açılır.

• Nükleotid monomerler birer birer sentezlenmekte olan iplikçiğe DNA Polimeraz adı verilen bir enzim yardımı ile ilave edilir.

• Sentezlenen yeni iplikçikteki baz dizisi, ana iplikçiğe antiparalel olarak yerleşir.

• Sentezlenen yeni iplikçik eski iplikçiğe hidrojen bağları ile bağlanır.

Uludağ Üniversitesi 36

DNA Replikasyonu (eşlenme, duplikasyon)

• Semikonservatif replikasyon tarzı denilirse, DNA bir ‘’Y’’ harfı şeklinde bir uçtan açılım gösterir. Bu açılma, DNA primaz, helikaz, topoizomeraz enzimleri, DNA bağlayıcı proteinler ve ATP enerjisi yardımı ile gerçekleşir.

• Açılma noktasında iplikçiklerden birinin yönü 5’→3’, diğerinin yönü ise, antiparalel olması nedeniyle ters yani 3’←5’ yönündedir. Bu bölgedeki süper sarmalın açılması topizomeraz enzimi yardımı ile gerçekleşir.

Uludağ Üniversitesi 37DNA sarmalının çatal şeklinde açılması ve repliikasyonda görev alan bir seri enzimler yardımıyla 3’←5 ’ aşamaları (Watson et el., 2004)

Transkripsiyon ve Translasyon (1)

• DNA’da saklanan genetik bilgilerin bir RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA) şeklinde kopyalanması veya yazılması olayına transkripsiyon adı verilir.

• Transkripsiyonla RNA’ya kopyalanan genetik bilginin bir protein veya polipeptit zinciri haline dönüştürülmesidir. Protein oluşturan amino asitlerin mRNA şifresine uygun olarak sentezine ise translasyon adı verilmektedir.

• Ökaryotik bir hücrede DNA replikasyonu ve transkripsiyon nükleusda, translasyon ise genelde sitoplazmada gerçekleşir.

Uludağ Üniversitesi 38

Transkripsiyon ve Translasyon (2)

• DNA’dan RNA sentezi genel olarak:1. RNA olimeraz, DNA’nın 20-200 baz uzunluğunda spesifik bir bölgesine

(promotor-operatör bölgesi) bağlanır.

2. RNA polimerazın DNA’ya bağlanmasından sonra promotor bölgesininaktivasyonu ile DNA’da açılma meydana gelir ve açılma noktasına açık promotor kompleksi adı verilir. Bu arada gerekli enerji ATP veya GTP’den sağlanır.

3. Açık promotor kompleksinden itibaren RNA sentez başlar.

4. Daha sonra RNA polimeraz DNA boyunca hareket ederek nükleotidler dizisini oluşturarak RNA’yı tamamlar.

5. RNA sentezi, terminator bölgesinde rho adı verilen bir proteinin sinyal vermesi ile sonlanır.

Uludağ Üniversitesi 39

Transkripsiyon ve Translasyon (2)

Uludağ Üniversitesi 40

Reverz Transkripsiyon

• Transkripson olayında, RNA polimeraz, DNA iplikçiklerinden birini kalıp olarak kullanıp, bundaki genetik bilgiyi olduğu gibi mRNA’ya aktarır (DNA→mRNA).

• Reverz transkripsiyonda ise, kalıtım maddesi olarak RNA’yı ihtiva eden virüsler RNA’yı kalıp olarak kullanırlar.

• Kanser ve AIDS virüsler gibi içinde bulunduğu kalıtım maddesi RNA’dır.

• Virüsler konak hücreye girdikten sonra içerdikleri reverz transkriptaz yardımı ile antiparalel DNA’yı (komplementer DNA, cDNA) sentezleyip RNA-DNA hibrid oluşur. Oluşan bu cDNA bir kalıp olarak görev alır ve DNA Polimeraz yardımı ile ikinci iplikçiğni sentezler.

Uludağ Üniversitesi 41

DNA Rekombinasyonları

• Belli bir gen parçasının diğer bir DNA molekülüne integre olması ile oluşan fenomene rekombinasyon ve bu özelliği taşıyan DNA’ya rekombinant adı verilir.

• Rekombinasyon ayrıca, karşılıklı gelen DNA iplikçikleri arasında oluşan kopmalar ve yeniden çapraz birleşmeler (cross over) ile meydana gelmektedir.

• Rekombinant DNA teknolojisi, genetik materyallerde kesmeler, koparmalar, birleştirmeler, tamirat, transfer gibi birçok işlemleri içine almaktadır.

• Rekombinasyon doğal olarak (kromozom-kromozom, bakteri-bakteri, bakteri-faj, bakteri-plazmid, faj-faj, plazmid-plazmid, virüs-virüs) meydana geldiği gibi, cansız ortamda (in vitro) suni olarak oluşturulabilir.

Uludağ Üniversitesi 42

Uludağ Üniversitesi 43

DNA Rekombinasyonunda Görev Alan Enzimler

ENZİM ADI GÖREVİ

DNA PolimerazDNA’nın sentezinde, substrat (ana DNA molekül) ve komplementer (uyumlu) pirimer ve nükleotidlerin bulunmasıyla gerçekleşir.

DNA LigazlarÇift iplikçikli DNA’nın ayrılmış olan tek iplikçiğini veya farklı iki DNA molekülünün 3’-OH ve 5’-P uçları arasında fosfodiester bağı kurarak bağlanmalarını sağlar.

Restriksyon Endonükleazlar

Prokaryotlarda bulunan bu enzimler moleküler klonlamanın gelişiminde temel oluşturulmuşlardır.

EkzonükleazLineer DNA molekülünün uç kısımlarındaki baz sıralarını 5’→3’ yoksa 3’←5’ yönünde koparan bir enzimdir.

EndonükleazDNA molekülünün içindeki nükleotidler arası fosfodiesterbağlarını koparan bir enzimdir.

PrimazDNA replikasyonu sırasında DNA’nın ilgili bölümüne uygun olarak 10-12 nükleotidlik RNA pirimerlerinin sentezini katalize eden enzimler.

TopoizomerazSüper helix yapıdaki DNA’nın üzerinde kesim yaparak çözülmeyi sağlayan bir enzimdir. Uludağ Üniversitesi 44

Rekombinasyonda Kullanılan Vektörler

Rekombinasyonda Kullanılan Vektörler

Protein Ekspresyon Vektörleri

Fajlar

Plazmidler

Uludağ Üniversitesi 45

Plazmidler

• Çoğu bakterilerde ve bazı maya, mantar, ve bitkilerine özgü kromozomlarından ayrı olarak bulunan bir başka kalıtsal yapıya plazmid adı verilmektedir.

• Plazmidler temelde hücre kromozomlarından ayrılarak oluşan sirküler kalıtsal yapılardır.

• Hücre bölüneceği zaman genomik DNA gibi plazmidler replike olur.

• Plazmidler sitoplazmada serbest değil de kromozomlar üzerinde yer alırsa bunlara episom adı verilir.

• Plazmidler çoğu E.coli bakterisinden izole edilip tanımlanmıştır.

• Plazmidler klonlama, replikasyon orijini ve antibiyotik üreten, antibiyotiklere direnci sağlayan, bitkilerde tümör oluşturabilen, şeker fermentasyonu yapabilen veya ağır metallere direnci sağlayabileb gen bölgelerine sahiptirler.

• Plazmidler, kullanım amaçlara göre, klonlama verktörü plazmidler (ör. Pbr322 ve pUC19) ve protein ekspresyon vektörü plazmidler (ör. pET-15b ve pGEX)

Uludağ Üniversitesi 46

Fajlar

• Klonlama en yaygın kullanılan faj M13 vektörüdür M13 fajı tek iplikli bi DNA’dan oluşmaktadır.

• Tek iplikli M13 faj DNA’sı E. Coli hücresine girdikten sonra replike olur ve çift iplikli DNA’ya dönüşmüş olur.

• Çift iplikli DNA konumuna geçen M13’e yabancı DNA konaklanır ve konak hücreye transfer edilir.

• Konak hücre içerisindeki fajlar tek iplikli DNA’ya sahip olarak çoğalmaya başlar ve hücre dışına salınırlar.

• Konak hücrenin kültür ortamında tek iplikli rekombinant DNA’lar olarak izole edilir.

Uludağ Üniversitesi 47

Protein Ekspresyon Vektörleri

• Klonlanan yabancı genden protein sentezlemek için klonlama vektöründe bulunması gereken özellikler bakterilerde; RNA polimerazın bağlanacağı promotor, transkripsyon terminatörğ ve ribozom bağlanma bölgesi, ökaryotlarda ise; poli A ilavesi, transkripsiyon faktörü, enhancer gen bölgesi şeklinde özetlenebilir.

• Pritein ekspresiyonunda T7 promotor bölgesine sahip pGEX ve pET plazmid serileri yaygın olarak kullanılmaktadır.

Uludağ Üniversitesi 48

Gen Klonlaması

• Gen klonlaması, bir ürün veya proteinin sentezini kodlayan genin (hedef DNA) ait olduğu hücre (prokaryotik veya ökaryotik) genomundan veya kromozomundan özel yöntemlerle (genellikle restriksiyon endonükleaz enzimleri ile) kesilerek çıkarılması, bunun bir taşıyıcı vektör DNA’sı (plazmid, bakteriyofaj, vb.) ile birleştirilerek alıcı hücreye (prokaryotik veya ökaryotik) transfer edilmesi ve bu alıcı hücrede gen ekspresonunun (sentez) sağlanmaktadır.

Uludağ Üniversitesi 49

• Gen klonlamasında önemliolan aşamalar kısaca şöyledir(genel prensipler). 1. Gen taşıyan DNA'nın (veya

RNA) saf olarak eldeedilmesi,

2. Genin yerinin belirlenmesi, 3. Genin çıkarılması, 4. Taşıyıcı (vektör) DNA'nın

elde edilmesi, 5. Gen DNA'sının vektör

DNA'sı ile birleştirilmesi, 6. Oluşan rekombinant vektör

DNA'nın alıcı hücreyeaktarılması,

7. Seleksiyon, 8. Gen ürününün kontrol

edilmesi.

Uludağ Üniversitesi 50

GDO

Referanslar

• Dilsiz, Nihat. 2009. Moleküler Biyoloji. Şanlıurfa: Palme Yayıncılık. • Turner, P.C, ve ark. 2004. Moleküler Biyoloji. Cev: Muhsin Konuk.

Ankara: Nobel Yayıncılık. • Aran, Necla. 2010. Gıda Biyoteknolojisi. Ankara: Nobel Yayıncılık. • National Institutes of Health. 2014. Genetics Home Reference. U.S.

National Library of Medicine. http://ghr.nlm.nih.gov/• Schleif, Robert. 1993. Genetics and Molecular Biology 2nd Edition.

The Johns Hopkins University Press Baltimore and London. • Hartl, Daniel L. ve Elizabeth W. Jones. 1998. Genetics: Principles

and Analysis Fourth Edition. Jones and Barlett Publıshers, Massachusetts.

• http://ebadersleri.com/dnanin-replikasyonu-kendini-eslemesi/• http://www.mikrobiyoloji.org/TR/Genel/BelgeGoster.aspx?F6E10F8

892433CFFAAF6AA849816B2EF79299488453EF356

Uludağ Üniversitesi 51

zahra_purple@yahoo.com