do an Lam + Quyen 09sh (cũ)

SINH VIÊN THỰC HiỆNLỚPGIÁO VIÊN HƯỚNG DẪNĐỀ TÀI

CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA

HPLC-FPLCHPLC-FPLC

MÃ SỐ SINH VIÊN

Mở đầu

Từ khi được nhà thực vật học người Nga Mikhail Semyonovich Tsvet phát minh ra đến nay, kĩ thuật sắc kí đã phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau

1872–1919

Mở đầu

Mở đầu

High-performance liquid chromatography-HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) xuất hiện từ những năm 1960 như là nhánh của sắc ký lỏng thực hiện trên cột,trong đó công nghệ chế tạo cột và các bộ phận của thiết bị đã được cải tiến

Mở đầu

So với sắc ký lỏng cột áp suất thấp truyền thống, HPLC có những ưu điểm vượt trội hơn như:

Tốc độ nhanh

Độ phân giải được cải thiện tốt hơn

Độ nhạy tốt hơn

Khả năng tái sử dụng cột

Lý tưởng cho những ion hoặc phân tử lớn

Thu hồi mẫu dễ

Các ứng dụng của HPLC trong thời kỳ đầu gồm có phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong rau quả, các acid hữu cơ, lipid, acid

amin, chất độc và vitamin. Ngày nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao tiếp tục được ứng dụng

để phân tích nhiều loại vật liệu sinh học khác.Trong đó có kỹ thuật phân tích protein FPLC (Fast protein liquid chromatography)

Mở đầu

Việc nghiên cứu cấu tạo, nguyên lý hoạt động của HPLC-FPLC nhằm ứng dụng trong phân tích sinh học rất cần thiết cho hoạt động nghiên cứu về sau của sinh viên

CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA

HPLC-FPLCHPLC-FPLC

đó chính là lý do em chọn đề tài…

Sắc ký là khái niệm chung áp dụng cho nhiều kỹ thuật tách đa dạng dựa vào sự phân đoạn hoặc phân bố của mẫu (chất tan) giữa pha di chuyển (pha động) và pha cố định (pha tĩnh)TỔNG QUAN

1.1 Phương pháp sắc kýChương I

Chương I

1.1.1 Sắc ký là gì?

Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này


Kết quả là các thành phần có trong mẫu sẽ được tách ra thành từng dãi trong pha động


Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự phân bố trong hai pha như khả năng hòa tan các thành phần trong 2 pha,khả năng hấp phụ, trao đổi ion, kích thước các phân tử… nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký

Có nhiều tiêu chí để phân loại các phương pháp sắc ký, trong đó tiêu chí được sử dụng nhiều nhất là phân loại theo hệ pha, tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì

Sắc ký

giấy

Sắc ký

giấy


1.1.2 Phân loại sắc ký

Phương pháp sắc ký

Sắc ký lỏng

HPLCHPLCSK khí-rắnSK khí-rắn SK khí-lỏngSK khí-lỏngSắc ký

phân bố

lỏng-lỏng

Sắc ký

phân bố

lỏng-lỏng

Sắc ký

rắn-lỏng

Sắc ký

rắn-lỏng

Sắc ký khí

SK phẳngSK phẳngSắc ký

điện di

mao quản

Sắc ký

điện di

mao quản

Sắc ký

điện di

lớp mỏng

Sắc ký

điện di

lớp mỏng

1.1.3 Phân loại sắc ký

1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký, chất phân tích có thể là các ion, phân tử trung hoà hay các chất phân cực; đối tượng tác động của nó cũng có thể là ion, phân tử trung hoà hay chất phân cực. Từ đó chúng tương tác với nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành 4 loại

Lực liên kết ion

Lực phân cực

Lực Van der Waals

Lực tương tác kỵ nước

1.2 Sắc ký lỏng trên cột

1.2 Sắc ký lỏng trên cột

Cấu tạo hệ thống HPLC:

Bình chứa pha động.

Bộ phận khử khí (degasse)

Bơm cao áp

Bộ phận nạp mẫu

Cột sắc ký (pha tĩnh)

Đầu dò ( detector)

Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống

In dữ liệu

• Thông thường máy HPLC có 4 bình chứa pha động. Mục đích: Tạo nồng độ pha động theo gradient để thực hiện rửa giải trong quá trình sắc ký.

• Không sử dụng hết 4 bình khi dùng máy.

Bình chứa pha động

Vai trò: loại trừ các bọt nhỏ có trong dòng pha động.

Các hiện tượng khi không khử sạch bọt khí :

+ Tỷ lệ pha động cuả các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho pic không chính xác.

+ Nếu lượng bọt khí quá lớn, bơm sẽ không bơm được pha động, máy ngừng làm việc.

Bộ phận khử khí

Bơm cao áp

Mục đích: vận chuyển pha động qua hệ thống sắc ký.

Đặc điểm: Lưu lượng dòng chảy trong bơm thường là 1ml/phút Được kiểm soát đảm bảo tính đúng và chính xác Hai loại bơm thường được sử dụng vận hành ở chế độ: áp suất không đổi hoặc thể tích không đổi.

Cấu tạo: Bơm áp suất không đổi có thiết kế dạng pittong hoặc dạng bơm tiêm.Dạng pittong tạo dòng chảy có xung động, vì vậy phải có bộ

phận khử xung cơ học hoặc điện tử để loại trừ dao động của áp suất. Bộ phận khử xung cơ học gồm 1 bộ phận có thể thay đổi thể tích tương ứng sự thay đổi áp suất ( ví dụ như kim loại dễ biến dạng, ống chứa đầy chất lỏng dễ nén…)

Dạng tiêm trục vít tạo ra dòng chảy không có xung nhưng thể tích bơm hạn chế.

Bộ phận nạp mẫu

Vai trò: Đưa mẫu vào dòng pha động để nạp vào cột sắc ký. Ngày nay, hầu như tất cả hệ thống HPLC đều sử dụng van nạp mẫu. Bơm tiêm sẽ đưa mẫu đến van nạp mẫu để nạp mẫu vào cột

Cấu tạo của van nạp mẫu

• Van nạp mẫu là van 6 cổng, trong đó có 1 cổng để nạp mẫu vào vòng nạp mẫu.

• Vòng nạp mẫu(sample loops) có thể tích cố định ở áp suất thường. Thể tích vòng nạp thường dùng là 10-100 microlit

• Van có thể điều chỉnh để xoay theo các vị trí LOAD và INJECT

Nguyên tắc hoạt động của van nạp mẫu:

Khi van nạp ở vị trí LOAD: mẫu được nạp qua bơm tiêm vào vòng ngoài, lúc đó pha động chảy trực tiếp vào cột sắc ký.Khi van nạp xoay đến vị trí INJECT: vòng chứa mẫu trở thành 1 bộ phận trong dòng chảy của pha động và mẫu sẽ theo pha động vào cột.

Cột sắc ký

Vai trò: Là công cụ chính để tách riêng các cấu tử có trong mẫu.

Cấu tạo: Gồm 2 phần chính: +Phần cứng +Vật liệu nhồi cột

Cột phân tích:

Kích thước cột thường dùng có đường kính trong 4, 5, 6 mm; chiều dài cột là 10, 15, 25cm.

Cột được nhồi bằng các hạt 3, 5, 10 mm, vận hành ở điều kiện lưu lượng 1-2ml/phút.

Cột sắc ký

Phần cứngDạng ống bằng thép không rỉ, thủy tinh silica nung chảy, titan, nhựa PEEK (polyether ether ketone); có 1 đầu nối với bộ nạp mẫu, 1 đầu nối với detector của hệ thống.

Cột precolumn: Là các cột phụ kiện đặt trước cột phân tích HPLC. 2 loại cột phổ biến nhất là cột precolumn bão hòa và cột bảo vệ:• Cột precolumn bão hòa: chứa những hạt silica trầncos kích

thước lớn. Cột được đặt giữa bơm và bộ nạp mẫu để bão hòa pha động với silica, nó giúp làm chậm quá trình hòa tan các vật liệu nhồi trên nền silica trong quá trình sử dụng pha động chứa nước.

• Cột bảo vệ: Được phủ bên trong bằng lớp mỏng pha liên kết hoặc vật liệu nhồi vi hạt giống cột phân tích. Cột được đặt giữa bộ nạp mẫu và cột phân tích để bảo vệ cột phân tích khỏi bị nhiễm bẩn bởi những thành phần có tính hấp thụ mạnh. Cột bảo vệ cần được nhồi lại hoặc thay thế khi năng lực liên kết bị giảm đáng kể và tạp chất bắt đầu xâm nhập vào cột phân tích.

Vật liệu nhồi cột HPLC

Các yêu cầu chung của vật liệu nhồi cột

+ Vật liệu nhồi cột có chức năng chính là làm chất mang của hệ thống sắc ký.

Trong sắc ký lỏng-lỏng cổ điển, vật liệu nhồi chỉ có chức năng làm chất mang cho pha tĩnh. Trong sắc ký loại trừ kích thước, sự tương tác giữa chất tan và vật liệu nhồi cột là không cần thiết ( do quá trình tách chỉ dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử). Trong sắc ký hấp thụ ( sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực) vật liệu nhồi thực hiện đồng thời cả chức năng là chất mang và chức năng của pha tĩnh. Do đó, có thể thấy, vật liệu nhồi có thể có liên quan đến quá trình tách thật sự hoặc không.

+ Vật liệu nhồi phải là sẵn có với kích thước hạt chính xác, đồng đều, ít thay đổi.

+ Độ bền cơ học đủ lớn để chống lại áp suất tạo ra trong quá trình nhồi cột và sử dụng.

+ Độ bền hóa học cao, tránh bị ăn mòn nhanh chóng.

Vật liệu nhồiChất nhồi cột dựa trên nền silica 1. Silica rỗng: +Đáp ứng khá tốt các yêu cầu của vật liệu nhồi cột. Các hạt silica có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau tùy mục đích sử dụng cột sắc ký mà ta chọn loại hạt cho thích hợp.

+Các hạt silica hạt chứa nhiều lỗ nhỏ, có thành phần chủ yếu là SiO2 với mỗi nguyên tử nằm ở tâm tứ diện đều. Tại bề mặt hạt, một hóa trị còn lại thường được nhóm OH chiếm, và gọi đó là silanol, có tác dụng biến tính bề mặt của hạt silica do tính chất hoạt động của nó.

2. Pha liên kết: được tạo ra nhờ liên kết đồng hóa trị của nhóm hydrocacbon vào bề mặt silica qua các nhóm silanol tại bề mặtNhược điểm chính của chất nhồi trên nền silica : bộ khung silica hòa tan dần trong dung dịch có nước khi pH>8. Một số vật liệu được sử dung thay thế: alumina, zirconia, titania, cacbon graphit rỗng, hydroxyapatite.3. Vật liệu nhồi có màng mỏng: Tạo bằng cách phủ lớp mỏng lên bề mặt của vi hạt trơ, thường không rỗng. Vật liệu làm lõi có thể có bản chất như hạt silica hoặc polymer, latex. Các nhóm chức như các vị trí trao đổi ion chỉ có ở bề mặt, lõi chỉ đảm nhận làm tăng độ bền cơ học. Nhược điểm chính: lớp phủ bề mặt làm mất đi số lượng tâm tương tác làm hiệu quả liên kết giảm.

Chất nhồi cột polymer: - Bền

- Có thể thay đổi các đặc tính tương tác qua biến đổi hóa học trực tiếp.

Có 2 dạng vật liệu polymer:1. Vi lỗ: các hạt tồn tại ở dạng gel, mỗi loại hạt có 1 độ xốp nhất định, chúng có thể trương nở hoặc co lại khi có sự thay đổi pha động, tuy nhiên có thể gây vỡ hạt, truyền khối kém, trở lực dòng chảy lớn…

2. Lỗ lớn: Có nhiều liên kết ngang(>50%), gồm 1 mạng các hạt gel tiểu cầu liên kết nhau tạo thành 1 hạt lớn. Thường được dùng trong HPLC hơn dạng vi lỗ.

Detector

Vai trò: Nhận biết sự thay đổi nồng độ trong dung dịch ra khỏi cột và biểu hiện ở dạng tín hiệu điện.

Lựa chọn detector dựa vào: bản chất, nồng độ chất tan, độ nhạy, phạm vi tuyến tính của detector, tính tương thích với dung môi và chế độ chạy của pha động ( đẳng dòng hay theo gradient) sử dụng, và cả tính kinh tế, chi phí vận hành…

Các loại detector được sử dụng rộng rãi nhất : detector quang phổ khả kiến-tử ngoại,phổ huỳnh quang đo chỉ số khúc xạ phân tích điện hóa

Detector đo dộ hấp thụ UV-VIS

Sử dụng khi hợp chất có chứa nhóm mang màu: chất không no như ketone, hợp chất có nối đôi liên hợp, vòng thơm, một số ion vô cơ và các phức chất khác.

Độ lớn của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích theo định luật Beer:

A= e x d x C

Detector UV-VIS có 3 kiểu thiết bị khác nhau:

+ Bước sóng đo cố định

+ Bước sóng đo thay đổi được

+ Sử dụng mảng diode

Detector có bước sóng đo cố định:• Là kiểu thiết kế đơn giản nhất, vận hành ở bước sóng cố định.• Sử dụng 1 kính lọc để tách vạch bức xạ đơn từ nguồn bức xạ (như đèn thủy ngân…)• Dễ vận hành, không đắt tiền• Khả năng ứng dụng bị hạn chế.

Detector có bước sóng thay đổi được:• Được sử dụng phổ biến nhất• Đơn giản, vận hành ở các bước sóng có thể điều chỉnh được.• Nguồn bức xạ là đèn tungsten hoặc deuterium, việc lựa chọn bức xạ được thực hiên nhờ máy đơn sắc.

Detector sử dụng màng diode:• Là phương pháp hiện đại, đem lại nhiều thông tin hơn về thành phần mẫu.• Cho phép nhận biết các hợp chất có trong 1 hỗn hợp và có thể dùng để đánh giá độ tinh khiết.• Chi phí lớn.• Ở thiết bị này, toàn bộ ánh sáng từ đèn deuterium được trải thành 1 phổ trên một mảng các photodiode gắn trên 1 con chip silic. Thiết bị đo đồng thời độ hấp thụ tại tất cả các bước sóng và máy tính xử lý số liệu.

Detetor huỳnh quang: Sử dụng cho các hợp chất hữu cơ có khả năng trả lại 1 phần bức xạ UV-VIS tại 1 bước sóng dài hơn: hiện tượng phát huỳnh quang, ví dụ như: vitamin trong thực phẩm, thuốc; các hydrocacbon thơm trong nước thải… Đối với những hợp chất có khả năng phát huỳnh quang thì việc đo dễ dàng. Đối với các hợp chất không có khả năng phát huỳnh quang thì ta phải biến đổi hợp chất ban đầu thành các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang. Đây là phương pháp có tính chọn lọc và độ nhạy rất cao, là detector lý tưởng để phân tích lượng vết. Có giới hạn nhận biết đối với cùng 1 hợp chất nhỏ hơn 100-1000 lần so với phổ hấp thụ, dễ bị nhiễu nền do bức xạ bên ngoài.

Detector đo chỉ số khúc xạ: Sử dụng cho hầu hết các chất phân tích hòa tan trong dung môi và không chứa tâm hấp thụ UV-VIS như cacbohydrate, lipid… Ít nhạy hơn so với các detector khác do dung môi pha động chiếm thể tích lớn, cần phải có một nồng độ chất phân tích lớn để làm thay đổi chỉ số khúc xạ. Không thể dùng cho rửa giải gradient.

Detector điện hóa: Sử dụng chủ yếu để nhận biết các ion vô cơ, các acid hữu cơ khi ra khỏi cột trao đổi ion yếu; phân tích các catechoamine, các hợp chất phenol, cacbohydrate(detector ampe kế xung điện), định lượng ancol gây mùi, nhất là terpenol… Nguyên lý: dựa vào quá trình oxi hóa khử điện hóa của các chất phân tích làm thay đổi độ dẫn điện của pha động ra khỏi cột. Có độ chọn lọc rất cao, rất nhạy, thường gấp 10^14 lần so với phương pháp phân tích UV thông thường.

Các detector HPLC khác:

a. Detector tán xạ ánh sáng

b. Detector phóng xạ

c. Detector nitơ phát quang hóa

Hệ thống ghi, xử lý số liệuVai trò: hiển thị kết quả và định lượng các peak trong sắc ký đồ Máy phân tích điện tử xác định thời gian lưu, diện tích, chiều rộng của các peak bằng cách theo dõi tín hiệu detector nhận biết những điểm khởi đầu, kết thúc, cực đại của mỗi peak.Ở cuối mỗi lần chạy, một bản báo cáo được in ra nhờ máy in trong đó liệt kê đầy đủ những dữ liệu cần thiết. nếu hệ thống được chuẩn hóa( bằng chất ngoại hoặc nội chuẩn) thì nồng độ chất phân tích được xác định. Thiết bị phân tích có thể đứng riêng hoặc kết nối với máy vi tính. Hệ thống này có thể liên kết với hệ thống quản trị thông tin của phòng thí nghiệm để tạo thuận tiện cho việc thu thập, phân tích, lưu trữ dữ liệu. Mặc dù máy phân tích có thể làm đơn giản đáng kể việc xử lý số liệu nhưng điều quan trọng là người phân tích phải hiểu rõ về năng lực, hạn chế của thiết bị và đưa ra đánh giá.

Các chế độ tách trong HPLCCác chế độ tách trong HPLC

Lê Hữu LâmLê Hữu LâmDương Thị QuyênDương Thị Quyên

Sinh viên thực hiệnSinh viên thực hiện

Giáo viên hướng dẫnGiáo viên hướng dẫn

Nguyễn Thị Minh XuânNguyễn Thị Minh Xuân

Các chế độ tách trong HPLC

•Sắc ký pha chuẩn (NP-HPLC)

•Sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

•Sắc ký trao đổi ion (IC)

•Sắc ký loại trừ kích thước

•Sắc ký ái lực


Pha chuẩn (NP-HPLC)

Pha độngPha động

MẫuMẫu

CaCO3CaCO3

Các vạch sắc tố được phân táchCác vạch sắc tố được phân tách

Đặc điểm: Chất lỏng của pha động không phân cực, chất lỏng của

pha tĩnh phân cực mạnh.



Cấu tạo: • Pha tĩnh: là chất hấp thụ phân cực như hạt silica trần hoặc hạt silica có gắn các pha liên kết.

• Pha động: thường là các dung môi không phân cực (như hexane ),trong đó có bổ sung tác nhân phân cực hơn (như methylene choloride) để kiểm soát lực dung môi và độ chọn lọc.

SiSi

rất yếuSiOH

mạnh

Yếu

OH

OH



Nguyên tắc tách :



Các dung môi pha động sử dụng:

Dung môi chủ yếu ( không phân cực):•Hydrocarbons (Pentane, Hexane, Heptane, Octane)•Aromatic Hydrocarbons (Benzene, Toluene, Xylene)•Methylene chloride•Chloroform•Carbon tetrachlorideDung môi phụ(phân cực hoặc hơi phân cực) Methyl-t-butyl ether (MTBE), Diethyl ether, Tetrahydrofuran (THF),Dioxane, Pyridine, Ethyl acetate, Acetonitrile, Acetone, 2-propaol,ethanol, methanol

-Dung môi chủ yếu được sử dụng chính để làm pha động-Dung môi phụ được sử dụng để thêm vào dung môi chính với

tỉ lệ nhất định nhằm thay đổi thời gian lưu.

Ứng dụng: Tách các hợp chất tan tốt trong dung môi hữu cơ

Ví dụ: vitamin tan trong chất béo; phosphorlipid; các hợp chất, đồng phân, các carbohydrate tan tốt trong nước…cũng có thể được rửa giải bằng sắc ký pha chuẩn.



Đặc điểm: Pha tĩnh là không phân cực, pha động là phân cực.

Cấu tạo: Pha tĩnh: phổ biến nhất là các pha liên kết được chuẩn bị bằng các phản ứng trên bề mặt các hạt silica: nhóm silanol liên kết với các gốc hydrocabon (nhờ phản ứng với các chlorosilane)Dựa vào nhóm R3 người ta phân ra các loại cột:•Cột C18 (ODS) : Octadecylsilane [-(CH2)17CH3] là một trong những vật liệu nhồi cột pha đảo phổ biến nhất.•Cột C8 (octyl) •Cột C4 (butyl)•Cột Phenyl


Pha đảo (RP-HPLC):

Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của cột:

•Kiểu nhóm hữu cơ được liên kết với nhóm silica•Chiều dài mạch của chất hữu cơ•Lượng chất hữu cơ có trên một đơn vị thể tích chất nhồi•Kích thước và hình dạng của các hạt mang pha tĩnh•Diện tích bề mặt và độ rỗng của cấu trúc•Địa hình bề mặt pha liên kết•Nồng độ silanol tự do



Cấu tạo:

Pha động: thường là nước hòa trộn với methanol, acetonitril hoặc tetrahydrofuran. Các chất tan được giữ lại do tương tác kỵ nước với pha tĩnh và được rửa giải dần theo thứ tự tăng dần của độ kỵ nước

Các chất phụ gia khác cũng được thêm vào pha động để làm vô hoạt các nhóm silanol dư.

Dung dịch đệm được thêm vào nhằm làm giảm hoặc ức chế, kiểm soát các quá trình ion hóa các thành phần có trong mẫu.



Cấu tạo:

OH

C18

OH

Các loại dung môi sử dụng trong pha đảo:Methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) hay THF là các dung môi thường sử dụng nhất cho sắc ký pha đảo.

Nguyên tắc tách :



Ứng dụng: • sử dụng nhiều nhất trong phân tích protein thực vật.•Cả vitamin tan trong nước hoặc chất •Ngoài ra còn dùng để phân tách các thành phần của nước giải khát ( như caffein, aspartame..); các thành phần phẩm màu, các sắc tố (chlorophil, carotenoid…); các hợp chất phenol có mùi…

Phân tích vitamin B1 máu bằng HPLC pha đảo.

Nguyên tắc: Trong đó: pha tĩnh chứa các nhóm chức mang điên tích dương hoặc âm; pha động chứa mẫu có bản chất mang điện trái dấu với điện tích của pha tĩnh.

HPLC trao đổi ion


Gồm 2 loại sắc ký : trao đổi ion dương và trao đổi ion âm

Cụ thể, nếu pha tĩnh mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), , thì pha động sẽ là những phân tử mang điện tích dương và tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương. Ngược lại, nếu pha tĩnh mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với pha động mang điện tích âm.



Cấu tạo:Pha tĩnh: tùy vào từng loại cột cho từng mục đích sử dụng khác nhau mà ta có các loại cột sau:

•Cột trao đổi cation: cột trao đổi cation mạnh: SCX :chứa nhóm –SO3- ( sufopropyl) ví dụ sodium sunfate.•Cột trao đổi cation yếu: WCX :–COO-( carboxyl), ví dụ như carboxylmethyl-cellulose CMC.•Cột trao đổi anion: •Cột trao đổi anion mạnh: SAX: R4N+ (amine) •Cột trao đổi anion yếu: WAX : hợp chất DEAE-diethyl aminoethyl.



Pha động: Pha động sử dụng trong HPLC thường là dung dịch đệm có chứa nước. Tăng lực ion của pha động làm giảm thời gian lưu của chất tan. Sự thay đổi pH của pha động cũng làm ảnh hưởng đến pha tĩnh và cả mẫu. Chế độ rửa giải thường sử dụng là đẳng dòng pha động , gradient nồng độ, gradient pH.



Ứng dụng: HPLC trao đổi ion có nhiều ứng dụng, từ việc nhận biết các ion vô cơ đơn giản đến việc phân tích các hợp chất carbohydrate và acide amine hoặc tinh sạch các protein. Ứng dụng lớn nhất của HPLC trao đổi ion là tinh sạch các protein và phân tích các thành phần carbohydrate có trong các mẫu thực phẩm, mẫu sinh học





Nguyên lý: Các chất trong mẫu được tách nhờ sự sai khác nhau về kích thước, quá trình không có sự tương tác về mặt hóa học giữa pha động và pha tĩnh. Trong đó, pha tĩnh là các vật liệu có một độ xốp nhất định, chất tan có kích thước lớn không lọt qua được các lỗ trong sẽ di chuyển ở bên ngoài các khoảng trống các hạt của pha tĩnh và đc rửa giải ra khỏi cột đầu tiên. Các chất tan có kích thước nhỏ hơn sẽ lần lượt ra khỏi cột.

HPLC loại trừ kích thước




Cấu tạo: -Pha tĩnh: vật liệu nhồi cột được chọn sao cho kích thước lỗ của cấu trúc phù hợp với phạm vi khối lượng phân tử chất rửa giải. -Pha động: chọn theo độ tan của mẫu, tính tương thích với cột, tính tương tác giữa chất tan và pha chuẩn. Dung dịch đệm bổ sung vào pha động ( dùng cho các polymer sinh học như protein, axit nucleic) giữ hoạt tính sinh học và ngăn ngừa các tương tác hấp phụ



Ứng dụng•Cột sắc ký loại trừ kích thước sử dụng polymer ưa nước được dùng để xác định nhanh khối lượng phân tử trung bình của poly saccarit như amylose, amylopeptin, các dẫn xuất xenlulose tan trong nước.•Trong công nghiệp HPLC được sử dụng để đánh giá giống đậu nành nhờ vào hàm lượng protein•Gần đây phương pháp sắc ký này đã được áp dụng để xác định polymer triacylglycerol trong dầu



Xây dựng quy trình táchXây dựng quy trình tách

Xây dựng quy trình táchXây dựng quy trình tách

TỔNG KẾTTỔNG KẾT


Một hệ thống HPLC cơ bản gồm có

•Bơm đẩy pha động đi qua hệ thống.

•Bộ nạp mẫu cho phép mẫu được đưa vào pha động để dẫn vào cột.

•Cột HPLC, nối giữa bộ nạp mẫu và detector, gồm có phần cứng bằng thép không rỉ được làm đầy bằng chất nhồi cột.

•Detector dùng trong HPLC gồm có hấp thụ UV-VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, điện hóa và một số dạng khác

•Hệ thống ghi/ xử lý số liệu có chức năng ghi lại kết quả cơ bản của quá trình sắc ký


Vật liệu nhồi cột:

•Polymer (vi lỗ hoặc lỗ to)

•Nền silica (silica rỗng,có pha liên kết, phủ thành trong cột)Sự thành công của silica có pha liên kết đã mở rộng ứng dụng chế độ tách pha chuẩn và pha đảo của HPLC

Quá trình tách:

Theo nguyên lý trao đổi ion, loại trừ kích thước và sắc ký ái lực


Ứng dụng

•Phân tích các phân tử nhỏ và ion như đường, vitamin và axit amin

•Tách và tinh sạch các đại phân tử như protein, axit nucleic và polysacarit

MỘT SỐ HÌNH ẢNH HPLC TRƯỜNGMỘT SỐ HÌNH ẢNH HPLC TRƯỜNG



Documents

do an Lam + Quyen 09sh (cũ)