CIIDIR- IPN UNIDAD DURANGO

Proyecto

Medición del metabolito de salicilato, ácido 2,3- dihidroxibenzoico (2,3-DHBA), como índice

indirecto de la modulación del estrés oxidativo en plasma humano

Dr. en C. Ismael Lares Asef Responsable del proyecto

Doctorante : Blanca Patricia Lazalde Ramos

Investigador asociado

Durango, Dgo. Enero de 2008

RESUMEN El estrés oxidativo (EOx), está involucrado en la patogenia de varias enfermedades crónico-degenerativas e inflamatorias. La cuantificación en plasma, de un metabolito de la aspirina, ácido 2,3- dihidroxibenzoico (2,3-DHBA), se puede interpretar como un índice indirecto de la modulación del estrés oxidativo.En el presente trabajo se estandarizó, modificó, y revalidó el método cromatográfico descrito previamente por Grootveld y Halliwell en 1986, para cuantificación en plasma de los metabolitos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA,). Se determinó de manera preliminar, in vivo, la concentración del metabolito en tres pacientes que cursan con DM2 y se comparó con los resultados de dos individuos aparentemente sanos (grupo control). Se realizó historia clínica que comprendía parámetros tanto clínicos como bioquímicos, en cinco individuos de sexo femenino. El índice de masa corporal (IMC) de los individuos control se encontró dentro del rango normal (22.09 kg/m2), sin embargo dos pacientes con DM2 presentaron sobrepeso y obesidad mórbida, observándose un IMC de 29.37±10.16 kg/m2 en promedio. Dos pacientes con DM2 recibían tratamiento farmacológico para controlar glucemia, presión arterial y dislipidemia. Solamente un individuo del grupo control y la paciente DM2 que no recibía tratamiento manifestaron el uso de antioxidantes por vía oral. Las pacientes con DM2 presentaron presión sistólica (PAS), diastólica (PAD) y media (PAM) mayores que los individuos control, por arriba de lo normal, con diferencia estadística en PAM, contra el control (p < 0.05). Los parámetros bioquímicos que mostraron diferencia significativa, con incremento notable, fueron glucosa sanguínea (64.3%), glicohemoglobina (31.8%), urea (110.7%) y VLDL (195.5 %). Los valores de triglicéridos se encontraron fuera del rango normal tanto en el grupo control como en el de pacientes con DM2 aunque con gran variación individual. No mostraron diferencia estadísticamente significativa los niveles de creatinina, triglicéridos, colesterol total y colesterol LDL. El colesterol-HDL disminuyó a niveles por debajo de lo normal. La concentración del 2,3-DHBA mostró incremento en su producción en pacientes con DM2 en un 25.4% en comparación con el grupo control.

1

INTRODUCCIÓN

Se ha denominado estado de estrés oxidativo (EOx) al desequilibrio bioquímico producido por diversas patologías, el cual es propiciado por la producción excesiva de especies reactivas que provocan daño oxidativo a las biomoléculas y que no puede ser contrarrestado por los sistemas antioxidantes. El EOx se ha relacionado con más de 100 padecimientos, ya que las especies reactivas y los radicales libres (RL) entre los cuales se encuentra el radical hidroxilo (OH•), favorecen la presencia o las complicaciones de enfermedades tales como ateroesclerosis, diabetes mellitus, procesos inflamatorios, enfermedad de Alzheimer y diversos tipos de cáncer, entre otras (Harman, 1992; Halliwell, et al., 1992; Forsberg, et al., 2001; Beristain-Pérez, et al., 2006). Una gran variedad de marcadores biológicos se han propuesto para evaluar el EOx, cuyos indicadores han sido desarrollados para determinar el daño mediado por RL o la generación de RL in vivo, dentro de los cuales se incluyen las mediciones de lípidos, proteínas y ADN oxidados (Meagher y FitzGerald, 2000; Mayne, 2003). Entre los marcadores mas comúnmente utilizados están los de lipoperoxidación cuya medición determina principalmente al malondialdehido (MDA) que reacciona con ácido tiobarbitúrico (TBA); y la actividad de las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutatión peroxidasa, entre otras (sistema endógeno antioxidante). Pocos trabajos determinan directamente las especies reactivas de oxígeno, especialmente el OH•, debido a su corta vida media (Referencia). Sin embargo, mientras que los sistemas de defensa antioxidante pueden estar elevados o disminuidos en presencia de EOx, la determinación directa de los radicales libres nos indica el grado de nivel oxidativo del organismo. La determinación del OH• se realiza por la generación de derivados estables que puedan ser evaluados de forma práctica. Una forma es medir un metabolito del salicilato (Grootveld y Halliwell, 1986), ya que a través de un proceso de hidroxilación conduce a la producción de los metabolitos ácido 2,3-dihidroxibenzoico (2,3-DHBA) por atrapamiento de radicales hidroxilo y ácido 2,5-dihidroxibenzoico (2,5-DHBA) por hidroxilación vía proceso enzimático del citocromo P450 a través de las isoenzimas 2E1 y 3A4 (Dupont, et al., 1999). Por lo anterior la hidroxilación de salicilato, una alternativa planteada por Grootveld y Halliwell en 1986, es una de las más recomendadas debido a su precisión al medirse por cromatografía líquida de alta resolución (Halliwell y Kaur, 1997; Tsai, et al., 1999). Después de la administración oral de ácido acetilsalicílico, este es hidroxilado por los radicales OH• que se encuentran en los tejidos del organismo, generándose el derivado 2,3-DHBA, el cual es estable en sangre, y puede ser detectado y cuantificado en plasma (Floyd, et al., 1986; Halliwell, et al., 1991; Thome, et al., 1997). Existe evidencia de la producción de estrés oxidativo en diabetes mellitus; que resulta del incremento de producción de radicales libres de oxígeno (RLO) que juegan un papel importante en la patogénesis de las complicaciones tardías de la diabetes (Brownlee, 2001; West, 2000; Porte, 2001). La hiperglicemia activa presenta cuatro vías bioquímicas bien caracterizadas (Referencias) que juegan un papel significativo en el desarrollo de las complicaciones de la DM (productos finales de la glicosilación avanzada, activación de la proteína cinasa C, vía de la

1

hexosamida y vía del poliol). La activación de estas vías están relacionadas con la hiperglicemia mediante el aumento de la producción de RLO y consecuentemente el incremento del estrés oxidativo (Nishikawa, et al., 2000; Rosen, et al., 2001; Vincent, et al., 2004). Por tal motivo, es de suma importancia contar con un método analítico validado para la determinación y cuantificación de este metabolito, para ser aplicado en pacientes con diabetes mellitus, y evaluar la relación entre la gravedad de la enfermedad con el EOx y la producción del 2,3-DHBA. ANTECEDENTES

Estrés oxidativo y radicales libres.

El EOx se define como una alteración del equilibrio entre las especies prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras. Puede originarse por un exceso de moléculas prooxidantes, una deficiencia de sistemas antioxidantes endógenos, o por ambos factores a la vez (Sies, 1986; Maritim, et al., 2003). Un RL es aquella especie química (átomos, iones o moléculas), que contiene uno o más electrones desapareados en el último orbital electrónico, por lo que son capaces de extraer electrones de las moléculas vecinas para completar su orbital, convirtiéndose en componentes altamente reactivos y oxidantes (Simic y Taylor, 1988). Las principales substancias oxidantes en los sistemas biológicos son los RL que se generan de diversas formas en la naturaleza. Algunos son compuestos oxigenados y se denominan especies reactivas de oxígeno (ROS) las cuales tienen un papel esencial en procesos biológicos. También existen RL nitrogenados o especies reactivas de nitrógeno (RNS) cuya importancia se ha descrito en los últimos tiempos (Maritim, et al., 2003). En la tabla 1 se enlistan los RL más importantes. Los RL pueden ser de origen endógeno o exógeno (Tabla 2). Los de origen endógeno surgen como “accidentes químicos”, es decir, como reacciones secundarias no deseadas entre las biomoléculas, mientras que otros se generan in vivo con un fin determinado, como en el caso de los fagocitos activados, que producen peróxido de hidrogeno (H2O2) y el radical O2

-● (Freeman y Crapo, 1982; Frei, 1994).

2

Tabla 1. Generación de especies reactivas oxidantes.

Especie reactiva

Origen Referencia

OH•

Hidroxilo El radical hidroxilo es la especie química más reactiva que se conoce. Se genera a través de la lisis del agua o del peróxido de hidrógeno, por acción de las radiaciones ionizantes, al reducir H2O2 por iones de metales de transición y también a partir de H2O2 y del radical superóxido, por la reacción de Haber-Weiss.

Haber y Weiss, 1934; Sawyer, 1988; Cheeseman y Slater, 1993; Frei, 1994; Breen y Murphy, 1995.

O2•-

Anión Superóxido

El radical superóxido es el resultado de la reacción de oxígeno con las proteínas que contienen hierro y azufre y también con la ubiquinona parcialmente reducida y el citocromo b del complejo III. Otra fuente importante son los fagocitos activados que lo producen en gran cantidad como mecanismo protector frente a organismos extraños

Fridovich, 1997.

H2O2 Peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno no es un radical libre como tal; es la forma menos reactiva de las ROS. Se origina por: reducción directa de una molécula de oxígeno por dos electrones, dismutación del anión superóxido, como producto de algunas enzimas (glucosa oxidasa, uricasa, entre otros) y por reacciones químicas de autooxidación.

Korycka-Dahi y Ricarson, 1981; Fridovich, 1997; Rojkind, et al., 2002.

NO•

Óxido nítrico

Su formación tiene lugar por una reacción enzimática en que la enzima oxido nítrico sintasa cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina, dando como producto el oxido nítrico en numerosos tipos celulares. El óxido nítrico modula la liberación de anión superóxido y la formación de peroxinitrito en vasos vasculares humanos.

Bush, et al., 1992; , et al., 2002.

NO2•

Dióxido de nitrógeno

El dióxido de nitrógeno es un radical libre contaminante producido primariamente a partir de la oxidación del NO atmosférico. Es un iniciador muy efectivo de la cadena de peroxidación lipídica

Halliwell, 1994; Postlethwait, et al., 1995.

RC•

Radicales de carbono

Los radicales centrados en un átomo de carbono (RC•) surgen del ataque de un radical oxidante sobre una molécula biológica

Frei, 1994.

RS•

Radicales de azufre

Los átomos de azufre también pueden ser el centro de un radical libre (RS•) formado, por ejemplo, a partir de la cisteína. Ésta se autooxida con facilidad dando lugar a la formación de radicales tiilo e hidroxilo

Estrela, et al., 1983; Sparrow y Olszewski, 1993.

3

Tabla 2. Fuentes generadoras de radicales libres

ENDÓGENAS

• Cadena de transporte mitocondrial. Durante el metabolismo

aeróbico normal las mitocondrias consumen oxígeno molecular y lo reducen hasta producir agua, una pequeña fracción de oxígeno se metaboliza vía reducción univalente y los productos intermedios de esta reacción son el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo (Frei., 1994).

• El sistema enzimático citocromo P-450 constituye una defensa primaria contra varios xenobióticos y sustancias endógenas que aumentan la producción de radicales libres (Dolphin, 1988; Foster y Estabrook, 1993).

• Los leucocitos polimorfonucleares poseen en sus membranas la enzima NADPH oxidasa generadora de O2

•- que en presencia de hierro se transforma en el radical OH• (Babior, 1978)

• Sistema hipoxantina/xantina oxidasa, normalmente depura las xantinas generando el radical O2

•- (Waud y Rajagopalan, 1976).

• Reacción de Fenton-Haber-Weiss con complejos de bajo peso molecular de Fe++ como el citrato-Fe++ o la ATPasa-Fe++ genera radicales hidroxilo (Fenton, 1894).

• Los peroxisomas generan H2O2, el cual es depurado por enzimas específicas (catalasas) y transformado en agua (Boveris y Chance, 1973).

• Diversas enzimas también contribuyen a la generación endógena de especies reactivas de oxígeno (Frei, 1994).

EXÓGENAS

• Algunos agentes antineoplásicos (adriamicina, bleomicina,

daunorrubicina) y algunos antibióticos que dependen de grupos quinoides o de unión a metales para su actividad (Doroshow, et al., 1991).

• Radiaciones electromagnéticas (rayos X y γ) o radiaciones de partículas: electrones, protones, neutrones, deuterones y partículas α y β (Bielsky y Gebieki, 1977).

• Factores ambientales como contaminantes aéreos, fotoquímicos, hiperoxia, pesticidas, humo del tabaco, solventes, anestésicos e hidrocarburos aromáticos (Mason, 1982)

4

Estrés oxidativo y enfermedades El estrés oxidativo se ha asociado a una larga lista de enfermedades, síndromes y situaciones clínicas, como son el envejecimiento, la ateroesclerosis, el cáncer, la hipertensión arterial (HTA) y la diabetes mellitus (Flora, 2007). Estrés oxidativo y diabetes mellitus En la diabetes mellitus (DM) existe evidencia de estrés oxidativo resultante del incremento de producción de radicales libres de oxígeno (RLO) los cuales juegan un papel importante en la patogénesis de las complicaciones tardías de la diabetes (West, 2000; Brownlee, 2001; Porte, 2001; Schultz, et al., 2005). En pacientes diabéticos descontrolados, el nivel de superóxido dismutasa (enzima responsable de inactivar el radical superóxido) junto con los niveles de antioxidantes (vitamina E y ácido α-lipoico) se encuentran disminuidos (Uchimura , et al., 1999; Hartnett, et al., 2000). Existen evidencias de que la deficiencia de catalasa en el eritrocito, enzima responsable de la extracción del H2O2, está asociada con el incremento de la frecuencia de la DM (Go´th y Eaton, 2000; Go´th, et al., 2001). Dentro de las fuentes enzimáticas que aumentan la generación de especies reactivas en la diabetes se incluyen el oxido nítrico sintasa (NOS), NAD (P) H oxidasa y la xantina oxidasa (Guzik et al., 2000; Guzik et al., 2002; Aliciguzel et al., 2003). En la cadena respiratoria mitocondrial, el oxígeno molecular es esencial para el metabolismo de la glucosa y otros substratos durante la producción de ATP. Durante la fosforilación oxidativa normal, entre el 0.4 y 4% de todo el oxígeno consumido es convertido en el radical libre superóxido O2

•- (Boveris, 1984; Cadenas y Davies, 2000). Subsecuentemente, el O2

•- puede ser convertido en otros RLO y especies reactivas de nitrógeno (RNS). Este O2

•- se elimina por el mecanismo de defensa antioxidante dentro de la mitocondria (figura 4) convirtiendose rápidamente en H2O2 por la enzima mitocondrial superóxido dismutasa SOD de manganeso (mitocondria) y de cobre (citosol) (Boveris, 1977; Hartnett, et al., 2000; Go´th y Eaton, 2000, Evans, et al., 2002). El H2O2 es entonces detoxificado a H2O y O2 por la glutatión peroxidasa (GSH-peroxidasa) en la mitocondria, o difunde al citosol y es detoxificado por la catalasa en los peroxisomas. De cualquier manera, en presencia de metales de transición reducidos como el cobre (Cu++) ó hierro (Fe++), el H2O2 puede convertirse en el radical hidroxilo OH•, el cual es muy reactivo, a través de la reacción de Fenton.

5

Figura 4. Generación de especies reactivas en la DM2. El oxígeno es convertido a radical superóxido (O2

•-) vía activación enzimática y no enzimática, el cual es dismutado a H2O2 por la enzima SOD. El H2O2 se convierte a H2O y O2 a través de catalasa o GSH-Px, ó a OH• después de la reacción de Fenton.

Estudios in vivo revelan que el estrés oxidativo debido a la hiperglicemia ocurre

antes de que las complicaciones tardías se vuelvan clínicamente evidentes

(Baynes y Torpe, 1996; West, 2000; Rosen, et al., 2001; Ceriello y Motz, 2004).

O2•-

Superóxido Dismutasa

H2O2 Catalasa H2O + O2

OH•

Reacción de Fenton(Cu++, Fe++)

GSH peroxidasa

Eresión de genes sensibletrés

GSSGGSHGSH reductasa

NADPH + H+ NADP+

O 2

Fuentes no enzimáticas Cadena respiratoria mitocondrial Autooxidación de glucosa Formación de productos finales y glicación (AGE) Activación de la ruta de polioles. Fuentes enzimáticas Xantin-oxscigenasa Oxido nítrico sintasa no unido o no acoplado

6

JUSTIFICACIÓN

El EOx está involucrado en la patogénesis de diversas enfermedades degenerativas e inflamatorias, asociándosele a las complicaciones de más de 100 padecimientos, ya que los RL, entre los cuales se encuentra el OH•, favorecen la presencia o las complicaciones de enfermedades tales como: ateroesclerosis, diabetes mellitus, procesos inflamatorios, enfermedad de Alzheimer y diversos tipos de cáncer. En la diabetes mellitus se promueve una autooxidación de azúcares generando ROS, entre ellas el OH•, produciéndose por lo tanto daño celular, especialmente a nivel de proteínas celulares, carbohidratos, lípidos y ADN. Una manera de modular la excesiva producción de OH•, para disminuir a su vez el EOx, es facilitando que dicho RL pueda participar en biotransformación para reducir su concentración sistémica y por lo tanto minimizar el estrés oxidativo, interpretándose este hecho como la modulación negativa del índice de oxidación para beneficio del paciente diabético. La aspirina se biotransforma a salicilato el cual puede atrapar radicales OH• a través de un proceso de oxidación que conduce a la producción del ácido 2,3-DHBA, dando origen a una disminución de OH• y consecuentemente del estrés oxidativo. Por lo anterior es importante contar con un método analítico que nos permita determinar un indicador que al utilizar los OH• reduzca el nivel oxidativo del organismo. Lo establecido permitiría utilizar la medición plasmática del ácido 2,3-DHBA como un índice de la magnitud en la producción de OH• y por lo tanto de EOx en pacientes diabéticos que reciban AAS, identificando en forma temprana el riesgo de daño a la salud. Por lo que en el presente trabajo se planteó la necesidad de estandarizar y re-validar el método analítico para cuantificar el ácido 2,3-DHBA en plasma de pacientes con DM2. Esta particularidad, nos brinda la posibilidad de que al medir dicho metabolito, se pueda valorar la magnitud de producción de radicales OH•, relacionándolo con indicadores bioquímicos que muestran el grado de daño orgánico producido por el aumento de estos radicales en personas que padecen DM2. HIPÓTESIS

La identificación del metabolito hidroxilado 2,3-DHBA, del ácido acetilsalicílico, en plasma humano, es un indicador de modulación del grado de estrés oxidativo en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. OBJETIVOS

General

Cuantificar en plasma humano, por HPLC, los productos de hidroxilación de salicilatos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA, para relacionar preliminarmente su presencia con el grado de estrés oxidativo en pacientes diabéticos tipo 2.

7

Particulares

Determinar la concentración plasmática de la producción in vivo de los ácidos 2,3 y 2,5-dihidroxibenzoico en individuos control y pacientes con diagnóstico de DM2, ambos grupos administrados con AAS. METODOLOGÍA Diseño experimental

Para resolver los objetivos planteados, el diseño experimental se dividió en cuatro etapas. Primera etapa

Estandarización de condiciones cromatográficas para medición de metabolitos

Segunda etapa

Validación del método analítico de acuerdo a los parámetros establecidos por la Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-2004. Tercera etapa

Esta etapa se estableció para captar preliminarmente algunos pacientes diagnosticados con DM2, en los que se aplicaría la metodología para demostrar la producción de 2,3-DHBA in vivo. Se estudiaron cinco individuos, tres pacientes con diagnóstico de DM2 y dos individuos aparentemente sanos (cuadro 4), a los cuales se les realizó una historia clínica, la cual consideró antecedentes clínicos y características generales, así como demográficas y evolutivas de la enfermedad. También se realizó la determinación de parámetros bioquímicos como glucosa sanguínea, hemoglobina glicosilada HbA1c, colesterol total, colesterol-HDL, colesterol-LDL, colesterol-VLDL, triglicéridos, urea y creatinina.

abla 4. Criterios que deberán reunir los individuos a estudiar

Controles Pacientes • Aparentemente sanos. • Diagnóstico de DM2 • Euglucemia. • Hiperglucemia • Con familiares de primera línea sin

DM2. • Control relativo de la DM2 • No descompensados

Además para ambos grupos:

• Pueden ser de ambos sexos • Que acepten participar en el estudio. • Que otorguen su Consentimiento Informado firmado. • Que permitan se les realice una historia clínica • Que permitan que se les tome las muestras sanguíneas

8

necesarias para este estudio • Que acepten ingerir una dosis de AAS para el estudio.

Cuarta etapa

Con la finalidad de comprobar de manera preliminar la presencia de los metabolitos, ácidos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA en plasma in vivo, en esta etapa se administró AAS a los cinco individuos integrados al estudio. La toma de las muestras sanguíneas para la medición de los metabolitos de la aspirina producidos in vivo, ácido 2,3-DHBA y 2,5-DHBA se llevó a cabo después de 3 h de una dosis única de 1 g de aspirina. En el plasma obtenido se cuantificaron dichos metabolitos por HPLC.

Materiales y Métodos

Equipo analítico

Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de la marca Agilent, serie 1100 constituido por un sistema Agilent Chemstation, acoplado a una bomba cuaternaria con cuatro vías, un degasificador, con automuestreador y un horno de columna. El detector utilizado fue electroquímico, modelo 1049A (Hewlett Packard). Se utilizó la columna de fase reversa Waters Spherisob 5 µm ODS2 (25 cm X 4.6 mm).

Métodos

Se procedió a establecer, en el HPLC, las condiciones cromatográficas óptimas encontradas: potencial de oxidación de 0.55 V, velocidad de flujo de 1 mL/min, tiempo de corrida de 10 min, volumen de inyección de 10 µL, y se estabilizó con fase móvil compuesta de acetato/citrato de sodio 30 mM:metanol (93:7) a un pH de 2.5. Las muestras se resuspendieron con 400 µL de fase móvil, se mezclaron durante 30 segundos a máxima velocidad y se depositaron Procedimiento analítico cromatográfico en viales, los cuales contenían un inserto para que la aguja del cromatógrafo alcanzara a succionar la muestra necesaria para el análisis. Los viales fueron depositados en el automuestreador del cromatógrafo y se programó el muestreo. Extracción de los ácidos 2,3-DHBA, 2,5-DHBA y 3,4-DHBA de plasma humano in vitro. El procedimiento de extracción se basó en el método propuesto por Coudray y colaboradores en 1995 Parámetros de validación del método analítico de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-2004 Captación de voluntarios para el estudio. Se reclutaron voluntarios que accedieron a participar en el estudio, a los cuales se les explicó ampliamente en que consistía éste: Los individuos que aceptaron

9

participar firmaron un consentimiento informado y estuvieron de acuerdo en que se les administraría una dosis única de 1 g de AAS, vía oral y a la toma de muestras sanguíneas necesarias para cumplir los objetivos de este proyecto. Indicadores generales Como indicadores generales se midió y registró la siguiente información: nombre, edad, peso, talla, sexo, fecha de nacimiento, lugar de nacimiento, domicilio, escolaridad, antecedentes patológicos, consumo de medicamentos, consumo de antioxidantes, si realizaban algún tipo de ejercicio, presión arterial diastólica y sistólica. Con el peso y la talla de los individuos se determinó el índice de masa corporal (IMC), también conocido como índice de Quételet. Toma de muestra sanguínea. De cada individuo se colectó 10 mL de sangre periférica en ayunas, la cual se depositó en dos tubos, uno con EDTA como anticoagulante, y el otro sin anticoagulante, posteriormente se administró dosis única de 1 g de ácido acetilsalicílico, vía oral. Tres horas después de la ingesta de AAS se colectó una segunda muestra de 5 mL de sangre periférica que fue depositada en un tubo con EDTA como anticoagulante para su procesamiento. En plasma se midieron los metabolitos hidroxilados de la aspirina. El suero se utilizó para la determinación de pruebas bioquímicas. Análisis Estadístico

Un paso más en el análisis de la información experimental fue la determinación de la distribución de probabilidad, para evaluar la igualdad de dos estimaciones de varianza a través de la prueba F de ANOVA. Si las varianzas eran iguales (Ho: σ0 = σ1), se aceptó la hipótesis nula y se procedió a la realización de la prueba de t, si no existía homogeneidad de varianzas (Hi: σ0 ≠ σ1), se acepto la hipótesis alternativa y se procedió a la comparación de medias con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se planteó para cada uno de los parámetros estudiados la hipótesis de igualdad (Ho: µ0 = µ1). La hipótesis se rechazó para aquellos parámetros con valor de p < 0.05 (Dawson y Trapo, 2002). Se utilizó el programa estadístico Statgraphics Plus versión 5.

10

RESULTADOS

Índice de estrés oxidativo basado en la medición del 2,3-DHBA in vivo en

pacientes con DM2

Parámetros clínicos y bioquímicos de pacientes con DM2 e individuos control. Con la finalidad de comprobar la aplicabilidad del método de medición de los metabolitos ácidos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA en plasma in vivo, para evaluar el estrés oxidativo en función del atrapamiento del radical OH•, se estudiaron cinco individuos, tres pacientes con diagnóstico de DM2 y dos individuos con aparente estado de salud (grupo control), a los cuales se les realizó una historia clínica, la que consideró características de la enfermedad, así como la determinación de parámetros bioquímicos. Dentro de las características individuales (ver anexo 2) se consideró la edad, sexo, talla y peso corporal, perímetro de cintura, índice de masa corporal (IMC), tiempo de evolución de la DM2, último grado de estudio, si realizaban ejercicio, padecimientos agregados, presión arterial, tratamiento farmacológico actual e ingesta de antioxidantes. Parte de la información captada se muestra en la tabla 10. Tabla 10. Características demográficas y evolutivas de los individuos estudiados en los dos grupos de estudio. Individuos control Pacientes con DM2 C1 C2 P1 P2 P3 Edad (años) 23 34 38 64 34 Talla (m) 1.65 1.59 1.51 1.78 1.74 Peso (Kg) 60 56 63 64 122 Perímetro de cintura (cm)

72 75 97 90 122

Evolución de la DM2 (años)

_ _ 8 11 7

Escolaridad licenciatura licenciatura licenciatura secundaria licenciatura Ejercicio fisico si si no no no Tipo de ejercicio fisico

karate, aerobics y

pesas

caminata

_ _ _

Patologías agregadas hipertensión arterial

dislipidemia

hipertensión arterial

dislipidemia Presión arterial (mm Hg)

100 / 70 100 / 70 130 / 80 130 / 90 130 / 75

C = control sano; P = paciente con DM2

Los participantes en el estudio fueron de sexo femenino. Las tres con diagnóstico de DM2, se encontraban controladas en su glucemia y se incluyeron 2 en el grupo control. Los individuos que formaron el grupo control mostraron un promedio de edad de 28.5 ± 7.7 años; la edad promedio del grupo de pacientes con diagnóstico de DM2, fue de 45.3 ± 16.2 años.

11

El último grado de escolaridad, en cuatro de los casos fue de licenciatura, y solo en una de las pacientes con DM2 era de secundaria concluída. Todos los individuos estudiados se pesaron y midieron para determinar su índice de masa corporal y así evaluar el grado de riesgo asociado a obesidad. Los dos individuos que conformaron el grupo control se encontraban dentro del rango normal (18 - 25 kg/m2) con un IMC muy parecido de 22.03 y 22.15 kg/m2, en cambio, solamente un individuo de los tres con DM2 se encontraba dentro del rango normal con un IMC de 20.19 kg/m2, y los otros dos se encontraron fuera del rango normal, uno de ellos con sobrepeso, interpretado como obesidad de grado I, con un IMC de 27.63 kg/m2 y el otro individuo con obesidad mórbida, con un IMC de 40.29 kg/m2, lo cual lo clasifica como obesidad de grado IV (figura 12).

0

15

30

45

C1 C2 P1 P2 P3

Control = 22.09 ± 0.08 DM2 = 29.37 ± 10.16

IMC

kg/

m2 0

10

20

30

40

Control DM2

IMC

Kg/

m2

0

15

30

45

C1 C2 P1 P2 P3

Control = 22.09 ± 0.08 DM2 = 29.37 ± 10.16

IMC

kg/

m2 0

10

20

30

40

Control DM2

IMC

Kg/

m2

Figura 12. Índice de masa corporal individual en los dos grupos de estudio (control y con DM2). C = control; P = paciente con DM2. El inserto muestra la gráfica del valor promedio de IMC en ambos grupos ± desviación estándar. La zona sombreada corresponde al rango de valores normales.

En cuanto al esquema terapéutico que recibían las pacientes con DM2, dos de ellas (pacientes 1 y 3) además de ser diabéticas, sufrían de hipertensión arterial y dislipidemia, siendo su esquema farmacológico muy parecido (tabla 11), solo varió en la ingesta, en una de ellas de Aspirina Protec®. La paciente 2 no se encontraba en tratamiento farmacológico hipoglucemiante ya que se mantenía controlada con dieta baja en carbohidratos y grasas y solamente consumía complementos vitaminicos antioxidantes. En cuanto al grupo control, una consumía antioxidantes (ácido fólico).

12

Tabla 11. Tratamiento farmacológico de los pacientes con DM2

Tratamiento farmacológico Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3

• Metformina • Ácido fólico • Metformina • Verapamilo • Complejo B • Verapamilo • Enalapril • Enalapril • Atorvastatina • Atorvastatina

• Aspirina-Protec®

Los individuos que conformaron el grupo control manifestaron que realizaban ejercicio rutinariamente, uno de ellos realizaba caminata durante una hora diaria y el otro individuo manifestó que practicaba karate, aerobics y pesas con una duración de tres horas diarias. Los pacientes que conformaron el grupo con DM2 no manifestaron la práctica de ningún tipo de ejercicio rutinario. Otro de los parámetros estudiados fue la presión sanguínea. El grupo integrado por individuos con DM2 presentó valores más elevados de presión arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) y media (PAM) en comparación con el grupo control en un 12.3, 16.0 y 19.6% respectivamente (figura13). El parámetro de PAM presentó diferencia significativa p < 0.05. El grupo control presentó presiones normales, con un promedio de PAS de 105 ± 7.07 mmHg, 70 mmHg de PAD y 81.60 ± 2.26 mmHg de PAM. Dos de los individuos que conformaron el grupo de DM2 tienen diagnóstico de hipertensión arterial desde hace más de 10 años, y se encuentran bajo tratamiento farmacológico con verapamilo y enalapril. A pesar de los tratamientos, el promedio de PAS fue de 130 mmHg, de 81.67 ± 7.64 mmHg de PAD (la PAD más elevada, de 90 mmHg la presentó la paciente sin diagnóstico de hipertensión), y un promedio de PAM de 97.7 ± 5.12 mmHg.

13

020406080

100120140

Control DM2

PA

S m

mH

g

0

25

50

75

100

Control DM

PA

M m

mH

g0

20

40

60

80

PA

D m

mH

g

C

BA

*

Figura 13. Valores de presión arterial sistólica (pane(panel C) en dos grupos de estudio. Grupo control (n=2resultados se presentan como promedio ± desviación prueba de t.

Los parámetros bioquímicos medidos en sangre glicohemoglobina, urea, creatinina, triglicéridos, ccolesterol-VLDL, colesterol LDL, y así conocer individuos estudiados. Para evaluar el control glicémico en los pacienconcentración de glucosa sérica basal (en ayuno interacción funcional tejidos como el hígado, riñademás de la acción de diversas hormonas, concentración sérica. En la figura 14 se muestranlos niveles de glucosa sanguínea entre ambos mostraron un promedio de 77.5 ± 6.36 mg/dL dedentro del rango normal (≤100 mg/dL), en campresentaron un promedio de 127.33 ± 4.16 mg/dL64% en comparación con el grupo control, enconormal, existiendo una diferencia estadísticamegrupos (p <0.05).

2

Control DM2

l A), diastólica (panel B) y media ) y pacientes con DM2 (n=3). Los

estándar. ∗p<0.05 seguida de una

fueron los niveles de glucosa, olesterol total, colesterol-HDL, la condición fisiológica de los

tes con DM2 se determinó la de 12h), la cual depende de la ón y otros tejidos periféricos, para elevar o reducir la su

las diferencias encontradas en grupos. Los individuos control glucosa sérica, encontrándose

bio, los pacientes con DM2 , mostrando un incremento del ntrándose por arriba del rango nte significativa entre los dos

14

140

120

80

60

40

100

gluc

emia

mg/

dL

20

0

Figura 14. Concentración de glucosa sanguínea en dos grup

tro de los parámetros que se determinó fu

Control

(n=2), pacientes con DM2 (n=3). Los resultados se prdesviación estándar. ∗p < 0.05 seguida de una prueba de t. Oglicohemoglobina (HbA1c) como porcentaje de la hemmétodo de ayuda para el control del paciente diabétiglicohemoglobina son más fidedignos para evaluar el cresponde al tratamiento. La glicohemoglobina esirreversiblemente en los eritrocitos durante sus 120 díasde glicohemoglobina en los glóbulos rojos depende del de glucosa durante un cierto periodo de tiempo y es escélula. Los valores obtenidos de glicohemoglobina A1grupo control fueron de 5.6 y 6.4 %, dando un promencontrándose dentro del rango normal (4.2 a 6.2 %); DM2 presentó un porcentaje de HbA1c de 5.6, 6.4 y 5.80 ± 0.53 %, encontrándose en límites superiores rango del buen control del paciente diabético (5.5 apromedios de los dos grupos, los pacientes con DM2 pdel 30.3 % de glicohemoglobina A1c en comparación cesta diferencia estadísticamente significativa, con un val

*

os de estudio. Grupo control

e la concentración de

DM2

esentan como promedio ±

oglobina total, siendo un co, ya que los niveles de ómo el paciente diabético formada progresiva e de vida. La concentración

promedio de concentración table durante la vida de la c para los individuos del edio de 4.45 ± 0.07 %,

el grupo de pacientes con 5.4% con un promedio de normales, pero dentro del 6.8 %). Al comparar los resentaron un incremento

on el grupo control, siendo or de p<0.05 (figura 15).

15

*6

4

5

HbA

1c

%

3

2

1

0 DM2

Figura 15. Niveles sangíneos de glicohemoglobina A1c en dos grupos de estudio. Grupo control (n=2), pacientes con DM2 (n=3). Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar. ∗p < 0.05 seguida de una prueba de t.

Con respecto a los niveles de urea en sangre (figura 16), parámetro indicativo de la función renal, se hicieron evidentes las diferencias entre los valores encontrados en los individuos control a comparación con los pacientes con DM2. El grupo control presentó una concentración media de 18.7 ± 0.16 mg/dL, en cambio, el grupo con DM2 presentó una concentración media de 38 ± 1.41 mg/dL, por lo tanto los pacientes con DM2 presentaron niveles de urea en sangre 103 % más elevados que el grupo control. A pesar de existir diferencia estadística entre los dos grupos p < 0.05, ambos se encontraron dentro del intervalo normal (10 a 40 mg/dL).

16

Figura 16. Niveles séricos de urea en dos grupos de estudio. Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar, grupo control (n=2), pacientes con DM2 (n=3). ∗p < 0.05 seguida de una prueba de t. Se determinó la concentración de creatinina sérica en los dos grupos de estudio para considerar la existencia de afección renal en los individuos estudiados (figura 17). El grupo control presentó una concentración media de creatinina de 0.8 ± 0.16 mg/dL, siendo mayor en un 23% que la encontrada en el grupo con DM2 (0.65 ± 0.13 mg/dL), encontrándose ambos grupos dentro de los valores normales (0.5 a 1.0 mg/dL), lo cual indica una buena función renal.

*40

2

Ure

a m

g/dL

30

0

10

0

DM2 Control

17

n.s.

1.00

0

0

Cre

atin

ina

mg/

dL

.75

.50

0.25

0.00 DM2 Control

Figura 17. Concentración sérica de creatinina en dos grupos de estudio. Individuos sanos y pacientes con DM2. Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar. n.s. = diferencia no significativa

Se determinó la concentración de triglicéridos en sangre como un reflejo de la ingestión y del metabolismo de grasas (lípidos) y como parte para la evaluación de factores de riesgo coronario. En la figura 18, se muestran las diferencias encontradas entre los valores de triglicéridos de individuos control y pacientes con DM2. Los pacientes con DM2 mostraron niveles de triglicéridos mayores que los del grupo control con un promedio de 263 ± 105 mg/dL; el grupo control presentó un promedio de 234 ± 115 mg/dL, no existiendo diferencias significativas entre ambos grupos (solo 12 %). El rango normal de triglicéridos es de 35 a 165 mg/dL por lo que tanto el grupo control como el de DM2 se encontraron por arriba del rango alto que va de 200 a 499 mg/dL.

18

n.s 400

Trig

licer

idos

mg/

dL

300

200

100

0

Control DM2

Figura 18. Niveles séricos de triglicéridos en dos grupos de estudio. Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar. Control (n = 2), pacientes con DM2 (n = 3). n.s. = diferencia no significativa.

Los lípidos viajan en la sangre asociados a lipoproteínas, por lo que de suma importancia el análisis de éstos para detectar fallas en el metabolismo lipídico particularmente en Dm2, por lo que a los dos grupos de estudio se les realizó las determinaciones de la concentración de colesterol total, lipoproteínas de baja densidad (LDL), Lipoproteínas de alta densidad (HDL) y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Los resultados obtenidos (figura 19) de las concentraciones promedio de colesterol total para el control fue de 136.5 ± 13.4 mg/dL y para el grupo de DM2 de 155.6 ± 13.2 mg/dL, existiendo una diferencia del 14% entre ambos grupos, sin embargo, a pesar de esta diferencia, ambos grupos se encuentran dentro del rango normal (≤ 200 mg/dL). Los valores obtenidos de LDL fueron muy parecidos entre ambos grupos; el grupo control presentó una concentración promedio de 76 ± 1.4 mg/dL y el grupo con DM2 de 78 mg/dL encontrándose, ambos grupos, dentro del nivel óptimo correspondiente a un nivel reducido de riesgo para cardiopatía isquémica (≤ 100 mg/dL). En cuanto a HDL existió una gran diferencia entre los resultados obtenidos entre ambos grupos, ya que el grupo control mostró valores mas elevados en un 42.6% que el grupo con DM2, lo que confirma una reducida protección al disminuir el “colesterol bueno”. El nivel promedio de HDL para el grupo control fue de 43.5 ± 6.3 mg/dL y para el grupo con DM2 fue de 30.5 ± 4.9 mg/dL; los valores normales de HDL en las mujeres van de 45 a 60 mg/dL. La baja concentración de HDL presentada por el grupo con DM2, por debajo de 35 mg/dL, sugiere un aumento del riesgo para

19

enfermedades cardiovasculares como la cardiopatía isquémica e infarto al miocardio Con relación a VLDL el grupo control presentó una concentración media de 22.5 ± 13.4 mg/dL ya que uno de los controles presento una concentración elevada de 32 mg/dL, mientras que el otro control tuvo 13 mg/dL. No obstante la diferencia entre los individuos ambos se encontraban dentro del rango normal (> 40 mg/dL). El grupo DM2 presentó una concentración media de VLDL de 66.5 ± 0.7 mg/dL por arriba de los valores normales, siendo un 195.5% mayor que el grupo control, por lo que la alta concentración de VLDL se asocia a una elevación en la concentración de triglicéridos.

20

A

0

40

80

120

160

Control DM2

Col

este

rol m

g/dL

B

0

20

40

60

Control DM2

HD

L m

g/dL

80

LDL

mg/

dL

60

40

20

0 Control DM2

C

*

D

0

20

40

60

Control DM2

VLD

L m

g/dL

Figura 19. Niveles séricos de colesterol total (panel A), colesterol-LDL (panel B), colesterol-HDL (panel C) y colesterol-VLDL (panel D) en dos grupos de estudio, grupo control (n=2) y grupo de pacientes con DM2 (n=3). Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar. DM2 = diabetes mellitus tipo 2. ∗p < 0.05

21

Cuantificación de metabolitos hidroxilados de AAS in vivo

Después de la administración de 1 g de AAS por vía oral, se muestreó a los pacientes y controles, para cuantificar los ácidos 2,3 y 2,5-DHBA en plasma in vivo, con la finalidad de demostrar que el método analítico es factible para determinar la reducción del índice de estrés oxidativo al propiciarse la producción del àcido 2,3-dihidroxibenzoico al atrapar al radical OH•. Entre mayor sea la concentración del 2,3-DHBA se asocia a que existía un mayor índice de estrés oxidativo. En la figura 20, se muestran las diferencias encontradas en la concentración del ácido 2,3-DHBA en individuos control y pacientes con DM2. En sujetos controlse encontró una concentración media de 66.5 ± 32 nM para el 2,3-DHBA, cuyo valor de desviación estándar se debió a la gran diferencia de concentración presentada por cada uno de los dos individuos que conforman este grupo ya que uno de ellos presentó una concentración de 89.16 nM y el otro de 43.85 nM. Los pacientes que conforman el grupo con DM2 presentaron una concentración media de 83.4 ± 18.24 nM para el 2,3-DHBA, siendo esta concentración más elevada en un 25.3% que la del grupo control por lo cualsugiere un mayor índice de estrés oxidativo en DM2 que en individuos control. La variación individual fue menor que en el grupo control ya que los valores individuales de este grupo fueron 88.6, 63.1 y 98.5

22

nM.A

B

0

25

50

75

100

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,3-

DH

BA

nM

0

25

50

75

100

Control DM2

2,3-

DH

BA

nMA

B

0

25

50

75

100

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,3-

DH

BA

nM

0

25

50

75

100

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,3-

DH

BA

nM

0

25

50

75

100

Control DM2

2,3-

DH

BA

nM

0

25

50

75

100

Control DM2

2,3-

DH

BA

nM

Figura 20. Comparación de la concentración del metabolito de la aspirina ácido 2,3-DHBA en individuos control (n=2) y pacientes con DM2 (n=3). Panel A = Comparación de promedios ± desviación estándar, Panel B = comparación individual

Se determinó tambien la concentración del ácido 2,5-DHBA, el cual se forma al hidroxilarse la molécula de salicilato por las isoenzimas del citocromo P450. En la figura 21, se muestran los valores del ácido 2,5-DHBA en individuos control y pacientes con DM2. El grupo control presento una concentración media de 1118.0 ± 672.4 nM para el metabolito 2,5-DHBA, y el grupo con DM2 de 512.6 ± 205.7 nM, siendo la desviación estándar mucho mas grande para el grupo control dado que los pacientes presentaron concentraciones individuales de 1593.5 y 642.5 nM, habiendo una diferencia entre ellos del 148 %, y el grupo con DM2 presentaron concentraciones individuales de 425, 747.7 y 365.2 nM siendo la diferencias mas grande entre ellos del 104 % Por lo tanto el grupo control presento una

23

concentración mas elevada en un 218% del metabolito 2,5-DHBA a comparación del grupo con DM2, no existiendo diferencia significativa entre los dos grupos.

A

B

0

500

1000

1500

Control DM2

2,5-

DH

BA

nM

0

500

1000

1500

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,5-

DH

BA

nMA

B

0

500

1000

1500

Control DM2

2,5-

DH

BA

nM

0

500

1000

1500

Control DM2

2,5-

DH

BA

nM

0

500

1000

1500

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,5-

DH

BA

nM

0

500

1000

1500

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

2,5-

DH

BA

nM

Figura 21. Comparación de la concentración del metabolito de la aspirina ácidos 2,5-DHBA en individuos control (n=2) y pacientes con DM2 (n=3). Panel A = Comparación de promedio ± desviación estándar, Panel B = comparación individual Se realizó un cociente entre la glucosa y los dos metabolitos hidroxilados del AAS determinados, para conocer la proporción que existía entre ellos. Al hacer la relación de la glucosa con el metabolito 2,3-DHBA y con el 2,5-DHBA en los dos grupos de estudio se observó una tendencia de mayor proporción en el grupo con DM2 en comparación con el grupo control (figura 22). La proporción media presentada por el grupo control fue de 87.23 ± 48.22 para el 2,3-DHBA, esta desviación estándar se debe a que el control 1 presentó una proporción de 87.23 mayor en un 80% que el control 2 con una proporción de 48.22. El grupo con DM2 presentó una proporción media de 108.18 ± 24.07, con una proporción individual

24

de 90.82, 135.66 y 98.05, siendo la máxima diferencia intra-grupal del 49.3%. La diferencia entre ambos grupos para la relación de la glucosa con el metabolito de la aspirina 2,3.DHBA fue del 24%. La proporción media presentada por el grupo control para el 2,5-DHBA fue de 5.63 ± 3.75, mostrando una proporción individual menor en un 178% el control 1 (2.97) en comparación con el control 2 (8.28). El grupo con DM2 presentó una proporción media de 25.30 ± 8.21, con una proporción individual de 18.93, 34.57 y 22.41, siendo la máxima diferencia intra-grupal de 18.3%. La diferencia entre ambos grupos para la relación de la glucosa con el metabolito de la aspirina 2,3.DHBA fue del 349.3%.

0

40

80

120

160

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

40

80

120

160

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

10

20

30

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A

0

10

20

30

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A

A

B

0

40

80

120

160

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

40

80

120

160

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

10

20

30

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A

0

10

20

30

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A0

40

80

120

160

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

40

80

120

160

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

3-D

HB

A

0

10

20

30

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A

0

10

20

30

C 1 C 2 D 1 D 2 D 3

Control DM2

Glu

cosa

/ 2,

5-D

HB

A

A

B

Figura 22 Comparación de la relación de la glucosa con los metabolitos de la aspirina ácidos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA en dos grupos de estudio. Panel A. Se compararon los promedios ± desviación estándar del grupo control (n=2) y el grupo con DM2 (n=3), Panel B comparación individual de cada grupo.

25

VI. DISCUSIÓN

El presente trabajo se realizó con la finalidad de contar con metodología validada para detección de metabolitos farmacológicos que sirvan como un índice para evaluar el grado de estrés oxidativo, generado por el radical OH•, en pacientes con enfermedad crónica metabólica, como es la diabetes mellitus tipo 2. Uno de los objetivos del trabajo fue estandarizar y re-validar las condiciones cromatográficas para la separación de los analitos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA (usando 3,4-DHBA como estándar interno), asegurando la confiabilidad a través de dicha validación de acuerdo a lo establecido por otros autores (Grootvel y Halliwell 1986; Coudray, et al., 1995; Morimoto, et al., 1996) y optimizado por nuestro grupo de trabajo. El potencial de oxidación en el cual se obtuvo señal de los metabolitos analizados (0.55 V), fue menor al descrito por los mismos autores quienes reportaron el uso de la detección electroquímica a un intervalo de (0.6 - 0.68 V). La fase móvil fue muy similar a la descrita por Coudray y colaboradores, difiriendo en la proporción de la mezcla de solventes, ya que ellos emplearon la mezcla acetato/citrato de sodio 30 mM:metanol 85:15 [v/v], mientras que nosotros utilizamos la proporción 93:7 [v/v], a un flujo de 1 mL/min, misma que fue mayor al descrito por dichos investigadores (0.2 mL/min). Por las modificaciones referidas, el tiempo de retención y de corrida para los analitos fue menor al publicado por estos grupos de trabajo, lo cual es correspondiente a las diferencias en la fase móvil y en el flujo empleados. La variación del tiempo de retención en las diferentes corridas cromatográficas fue de ≤ 0.1 minuto. El coeficiente de correlación promedio entre el área bajo el pico y la concentración del analito fue de 0.9924 ± 0.0065 para el 2,3-DHBA y de 0.9966 ± 0.0035 para el 2,5-DHBA, lo que nos indica que más del 99 % del área bajo el pico es explicada por la concentración del analito. Así mismo, los coeficientes de variación intra e inter-análisis de los analitos 2,3-DHBA y 2,5-DHBA fueron menores al 10 %, lo cual se encuentra por debajo del límite de aceptación del 15 % indicado en las normas correspondientes (Guidance for industry: Bioanalytical method validation, 2001; Boulanger, et al., 2003; NOM-177-SSA1-2004), lo que nos confirma que nuestro método es preciso. La exactitud del método se expresó como margen de error porcentual, estableciéndose que el método es exacto, dado que los límites de tolerancia se situaron por debajo del ± 4.3 % y no excedieron los límites de aceptación de ± 15 % (Guidance for industry: Bioanalytical method validation, 2001; Boulanger, et al., 2003). En el mismo sentido, la recuperación fue de 101.83 y 105.41 % para el 2,3-DHBA y entre97.27 a 103.68 % para el 2,5-DHBA, encontrando una variación menor al 7 %. El límite de cuantificación para el 2,5-DHBA fue de 20 nM y para el 2,3-DHBA fue de 40 nM con un coeficiente de variación ≤ 5.57 %, situándole por debajo del límite de aceptación de 20 %. Así mismo el método resulto ser específico, ya que al analizar 6 muestras de plasma de diferentes individuos sanos no se encontró ninguna interferencia

26

cromatográfica en la zona de los tiempos de retención de los analitos estudiados (NOM-177-SSA1-2004). Otro de los objetivos de este trabajo fue demostrar la aplicabilidad del método analítico previamente estandarizado para realizar la medición de los metabolitos hidroxilados del AAS en plasma in vivo, para lo cual se reclutaron tres pacientes con diagnóstico de DM2 los cuales se encontraron bajo control glicemico y dos individuos aparentemente sanos. Dentro de las características individuales que se estudiaron y que se han asociado a un aumento de RL son la edad, el sobrepeso y la hipertensión como lo han reportado diversos autores (Zalba, et al., 2001; Wassmann, et al., 2001; Fenster, et al., 2002; Madamanchi, et al., 2005; Kregel y Zhang, 2006). Los individuos del grupo control fueron de edades menores que el grupo con DM2 y no presentaron sobrepeso ni obesidad (IMC = 22.09 kg/m2), en cambio el grupo con DM2 comprendía pacientes de mayor edad además de que si presentaron obesidad, ya que el promedio de IMC se situó en 29.37 kg/m2, existen evidencias que sugieren un rol directo entre la obesidad con la generación estrés oxidativo y formación de AGE, directamente responsable de la nefropatía diabética (Nangaku, et al., 2005). En cuanto a la presión arterial, el grupo control presentó presión normal como era de esperarse. En contraste dos de los pacientes con DM2 tenían diagnóstico de hipertensión y se encontraban bajo tratamiento farmacológico, a pesar de eso, presentaron niveles elevados de PAS, PAD y PAM en comparación con el control. La presión de los dos pacientes estudiados se clasificó en el rango de normal-alta (prehipertensión), por lo cual este factor pudo contribuir a una mayor concentración del metabolito de la aspirina, ácido 2,3-DHBA, en comparación con el grupo control. Esto concuerda con lo reportado por Beristain-Pérez y colaboradores en el 2006 en el que sugieren que el EOx constituye un factor de riesgo para enfermedades crónico-degenerativas, especialmente para DM e hipertensión arterial. Dentro de tratamiento farmacológico que recibían los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (paciente 1 y 3), se encontraban la metformina, varapamilo, enalapril y atorvastatina, Ceriello y Motz proponen que el tratamiento de riesgo cardiovascular con fármacos tales como los bloqueadores de canales de calcio, inhibidores de la ECA , antagonistas de receptores AT-1 y estatinas son compuestos que muestran actividad antioxidante intracelular (Ceriello y Motz, 2004), por lo cual nosotros esperaríamos observar una disminución de la concentración del 2,3-DHBA en los pacientes que reciben tratamiento con estos compuestos, pero nuestros resultados difieren ya que los pacientes que recibieron tratamiento con este tipo de fármacos presentaron concentraciones mayores de 2,3-DHBA que el paciente diabético que no recibía tratamiento farmacológico. La determinación de glucosa sérica basal en ayuno de 12 h y de glicohemoglobina A1c, son indicadores bioquímicos para conocer el estado glucémico en el que se encontraba el paciente al momento del estudio para evaluar el índice de estrés oxidativo ya que como se había mencionado anteriormente el EOx juega un papel importante en la patogénesis de las

27

complicaciones tardías de la diabetes (Johansen, et al., 2005). El grupo control se encontró dentro de los rangos normales tanto de glucosa serica como de HbA1c como era de esperarse, en contrate los individuos con DM2 presentaron concentraciones elevadas de glucosa sanguínea por arriba del rango normal a pesar de estar recibiendo terapéutica farmacológica hipoglucemiante, en cuanto a la HbA1c se encontró en los limites superiores normales, pero dentro del rango del buen control del paciente diabético, por lo que los niveles elevados de glucosa presentados por los pacientes con DM2 agota los antioxidantes naturales y facilitan la producción de especies reactivas de oxigeno (Penckofer, et al., 2002; Robertson, et al., 2004). Los pacientes con DM2 presentaron niveles más elevados de triglicéridos y colesterol-VLDL con respecto al grupo control encontrándose por arriba de los valores normales, esto concuerda con los resultados publicado por Jian y colaboradores en el 2005 en donde sugieren que el colesterol-VLDL y/o VLDL triglicérido juegan un rol critico en el desarrollo de enfermedades coronarias en los pacientes diabéticos. En cuanto al colesterol total y colesterol-LDL el grupo con DM2 presentó niveles mas elevados que el control pero dentro del rango normal, esto concuerda con lo publicado por varios autores donde evidencian que los niveles séricos de lipoproteínas remanentes, como el colesterol aumentan en pacientes con DM, estos niveles séricos juegan un papel importante en las complicaciones trombogénicas en estos pacientes (Fukushima, et al., 2004; Hidenobu, et al., 2006). Los pacientes con DM2 presentaron niveles de colesterol-HDL mas bajos que el grupo control, esta lipoproteína se encontraron por debajo del rango normal en ambos grupos, esto concuerda con lo reportado por Kontush y Chapman en el 2006 donde ellos expresan que la diabetes mellitus se caracteriza por presentar bajos niveles de colesterol-HDL y elevado riesgo cardiovascular, La diabetes mellitus tipo 2 es la primera causa de insuficiencia renal crónica (Amato-Martínez, et al., 2001; Chang-Hsun, et al., 2006), las lesiones renales se asocian con un aumento del estrés oxidativo y una reducida disponibilidad de oxido nitrico renal (Prabhakar, et al., 2007). Para considerar la existencia de afección renal se cuantificó la concentración de urea y creatinina presentada por los pacientes con diabetes mellitus. Los niveles más elevados de urea los presentó el grupo con DM2 y los de creatinina el grupo control, tanto los valores de urea como de creatinina se encontraron dentro del rango normal, de acuerdo a estos indicadores no hay indicio de afección renal en los pacientes estudiados. Se realizó la cuantificación de los metabolitos hidroxilados de la aspirina in vivo con la finalidad de demostrar que el método analítico era factible para determinar la reducción el índice de estrés oxidativo. El grupo control presentó niveles más bajos del 2,3-DHBA en comparación de los pacientes con DM2 en un 25.3 % como era de esperarse, ya que existen evidencias de una mayor producción de radicales libres en pacientes con DM ya que se promueve una autooxidación de azúcares lo que genera especies reactivas de oxígeno, produciendo por lo tanto daño celular, especialmente a nivel de

28

proteínas celulares, carbohidratos, lípidos y ADN (Rosen, et al., 2001), además el grupo constituido por pacientes con DM2 presentaron mayor edad, obesidad, hipertensión, concentraciones mas elevadas hyperlipidemia que el grupo control, todos estos parámetros asociados a un mayor grado de estrés oxidativo. Nuestros resultados concuerdan con lo reportado por Ghiselli y colaboradores en 1992, donde determinaron la concentración del 2,3-DHBA in vivo después de la administración de 1g de AAS, encontrando valores más elevados en un 23 % del 2,3-DHBA en pacientes con DM2 controlados en comparación con un grupo control. Dajas y colaboradores en el 2004 determinaron la producción de radicales hidroxilo en sangre a través de la determinación de este metabolito in vitro en pacientes con hipertensión arterial, encontrando una mayor concentración de este metabolito en pacientes hipertensos en comparación con los individuos control. En cuanto a la concentración del metabolito 2,5-DHBA el cual se forma por hidroxilación enzimática, el grupo control presentó una mayor concentración de este metabolito en comparación con los pacientes con DM2 no encontrándose diferencia significativa entre ambos grupos, nuestros resultados también concuerdan con los resultados publicados por Ghiselli y colaboradores en 1992, donde ellos también encontraron una mayor concentración el 2,5-DHBA en el grupo control a comparación del grupo con DM2. Nuestros resultados sugieren que el método cromatografico validado nos permitirá medir en vivo el estrés oxidativo a través de la cuantificación de estos metabolitos de manera confiable, y a través de este método valorar el daño oxidativo en las diferentes patologías que se han asociado con la producción de EOx, como es el caso de la diabetes mellitus, y de esta manera detectar de manera temprana el grado de daño orgánico producido por el aumento de los RL y con ello monitorear la evolución de la enfermedad.. IMPACTO: Los resultados del estudio permitiran continuar con ésta línea de investigación en una población mayor para demostrar su utilidad en la práctica clínica como marcador bioquímico de estrés oxidativo.

29

30

BIBLIOGRAFÍA • Aliciguzel Y, Ozen I, Aslan M, Karayalcin U. 2003. Activites of xanthine

oxidoreductase and antioxidant enzymes in different tisúes of diabetic rat. J lab Clin Med; 142(3): 172-1777.

• Amato-Martínez JD, Paniagua-Sierra JR, Álvarez-Aguilar C. 2001. Prevalencia de insuficiencia renal crónica En la población derechohabiente del Instituto Mexicano del Seguro Social. En: García PM, Reyes MH, Viniegra VL. Las múltiples facetas de la investigación en salud. México: IMSS. 153-170.

• Anderson D, Yu T-W, Phillips BJ, Schmezer P. 1994. The effect of various antioxidants and other modifying agents on oxygenradical-generated DNA damage in human lymphocytes in the comet assay. Mutat Res; 307(1):261-271.

• Babior BM. 1978. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes. N Engl J Med; 298(12):659-668.

• Baynes JW, Thorpe SR. 1996. The role of oxidative stress in diabetic complications. Curr Opin Endocrinol 3:277–284.

• Bergman A, Ohman G. 1980. Effect of Detergent on Kinetic Jaffe-Method Assay of Creatinine. Clin Chem. 26(12): 1729-1732.

• Beristain-Pérez AS, Sánchez-Rodríguez MA, Ruiz-Ramos M y Mendoza-Núñez VM. 2006. Estrés oxidativo como factor de riesgo para el desarrollo de diabetes mellitus, osteoartritis o hipertensión arterial en adultos mayores. Bioquímica; 31(1):13-22.

• Bielsky, BH, Gebieki, JM. 1977. Application of radiation chemistry to biology. Free radicals in biology. P. W.A., Academic Press. 3: 1-19.

• Block G, Dietrich M, Norkus EP, Morrow JD, Hudes M, Caan B. 2002. Factors associated with oxidative stress in human populations. Am J Epidemiol; 156:274-285.

• Borel JP, Monboisse JC. 1986. Effect of oxygen free radicals on collagen in inflammation Ann Biol Clin; 44(3):260-265.

• Boulanger B, Chiap P, Dewe W, Crommen J, Hubert P. 2003. An analysis of the SFSTP guide on validation of bioanalytical methods: progress and limitations. J Pharm Biomed Anal; 32: 753-765.

• Boveris A, Chance BC. 1973. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J; 134(3):707-716.

• Boveris A. 1977. Mitochondrial production of superoxide radical and hydrogen peroxide. Adv Exp Med Biol 78:67–82.

• Boveris A. 1984. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. Methods Enzymol 105:429–435.

• Breen AP, Murphy JA. 1995. Reactions of oxyl radicals with DNA. Free Rad. Biol. Med. 18(6):1033-1077.

• Brownlee M. 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414 (6865):813–820.

31

• Bucolo G, David H. 1973. Quantitative Determination of Serum Triglycerides by the Use of Enzymes. Clinical Chemistry. 19: 476-482.

• Bush PA, Ganzález NE, Griscavage JM, Ignerro LJ. 1992. Nitric oxide synthase from cerebellum catalyzes the formation of equimolar quantities of nitric oxide and citrulline from L-arginine. Biochem Biophys Res Comm. 185(3):960-966.

• Cadenas E, Davies KJ. 2000. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med 29:222–230.

• Ceriello A, Motz E. 2004. Is Oxidative Stress the Pathogenic Mechanism Underlying Insulin Resistance, Diabetes, and Cardiovascular Disease? The Common Soil Hypothesis Revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24:816-823.

• Chang-Hsun H, Kung-Hao L, Yi-Jen H, Li-Chin H, Dee P, Ya-Tang L, Shi-Wen K, Monica S, Jui-Lin C, Ellson YC. 2006. Analysis of epistasis for diabetic nephropathy among type 2 diabetic patients. Human Molecular Genetics. 15(18): 2701–2708.

• Cheeseman KH, Slater TF. 1993. An introduction to free radical biochemistry. Br Med Bull; 49(3):481-493.

• Chobanian AV, Bakris GL, Black HR, Cushman WC, Green LA, Izzo JL Jr. 2003. The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure: the JNC 7 report. JAMA. 289:2560-72.

• Coudray C, Talla M, Martin S, Fatome M, Favier A. 1995. High-performance liquid chromatography-electrochemical determination of salicylate hydroxylation products as an in vivo marker of oxidative stress. Analytical Biochemistry. 227(1):101-111.

• Dajas F, Ferrari A, Martínez A, Zeppi M, Ferreira M, Pintos Á. 2004. producción de radicales hidroxilo en sangre en pacientes ancianos hipertensos. Rev Med Uruguay. 20: 12-18.

• Davies KJA. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radicals. General aspects. Journal of Biological Chemistry; 262:9895-9901.

• Dawson B y Trapp RG. 2002. Bioestadística médica. 3ª Edición. México. Ed. Manual Moderno.34-36, 105-116, 151-159, 215-219.

• de Zwart LL, Merman JHN, Commandeur JN, Vermeulen NP. 1999. Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radic Biol Med; 26 (1-2):202-226.

• Dean RT, Gieseg S, Davies MJ. 1993. Reactive species and their accumulation on radical damaged proteins. Trends Biochem Sci. 18:437-441.

• Dolphin D. 1988. The generation of radicals during the normal and abnormal functioning of citochromes P450. Basic Life Sci. 49:491-500.

• Doroshow JH, Akman S, Esworthy S, Chu FF, Burke T. 1991. Doxorubicin resistance conferred by selective enhancement of intracellular glutathione peroxidase or superoxide dismutase content in human MCF-7 breast cancer cells. Free Radic Res Commun. 2:779-781.

32

• Dupont I, Berthou F, Bodenez P, Bardou L, Guirriec NS, Dreano Y and Lucas D. 1999. Involvement of cythochromes P-450 2E1 and 3A4 in the 5-hydroxylation of salycilate in humans. Drug metabolism and Disposition. 27(3): 322-326.

• Estrela JM, Saez GT, Such L, Vina J. 1983. The effect of cysteine and N-acetylcysteine on rat liver glutathione. Biochem. Pharmacol. 32(22):3483-3485.

• European Society of Hypertension-European Society of Cardiology Guidelines Committee. 2003 European Society of Hypertension - European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension. J Hypertens. 21:1011-53.

• European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). 2003. Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic Biol Med. 34:1089-1099.

• Evans Jl, Goldife ID, Maddux BA, Grodsky GM. 2002. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr Rev. 23(5):599-622.

• Fenster CP, Weinsier RL, Darley-Usmar VM, Patel RP. 2002. Obesity, aerobic excercise, and vascular disease: the role of stress. Obesity Reserch. 10 (9): 964-968.

• Fenton HJH. 1894. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron. J Chem Soc Trans. 65:899-910.

• Feria M. 2004. Fármacos analgésicos antitérmicos y antiinflamatorios no esteroideos. Antiartríticos. En: Flórez. Farmacología Humana. 4a Edición. España. Ed. Masson. 385-393.

• Flora SJ. 2007. Role of free radicals and antioxidants in health and disease. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 53(1):1-2.

• Floyd RA, Watson JJ, Wong PK. 1984. Sensitive assay of hydroxyl free radical formation utilizing high pressure liquid chromatography with electrochemical detection of phenol and salicylate hydroxylation products. J Biochem Biophys Methods. 10(3-4):221–235.

• Floyd RA, Henderson R, Watson J, Wong PK. 1986. Use of salicylate with high pressure liquid chromatography and electrochemical detection (LCED) as a sensitive measure of hydroxyl free radicals in adriamycin treated rats. J Free Rad Biol Med. 2(1):13-18.

• Forsberg L, de Faire U, Morgenstern R. 2001. Oxidative stress, human genetic variation, and disease. Arch Biochem Biophys. 389:84-93.

• Fossati P, Príncipe L. 1982. Serium triglycerides determined colorimetrically with an enzyme tha produces hydrogen peroxide. Clin Chem. 28(10): 2077-2080.

• Foster RE, Estabrook RW. 1993. Is oxygen an essential nutrient. Annu Rev Nutr. 13:383-403.

• Fraga CG, Shigenaga MK. 1990. Oxidative damage to DNA during aging: 8-hydroxy-2’deoxyguanosine in rat organ DNA and urine. Proc Natl Acad Sci. 4533-4537.

33

• Freeman BA, Crapo J. 1982. Biology of disease: free radicals and tissue injury. Lab Invest. 47(5):412-426.

• Frei B. 1994. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: mechanisms of action. Am. J. Med. 97(3A): 5S-13S.

• Fridovich I. 1997. Superoxide anion radical (O2•-.), superoxide dismutases, and related matters. J Biol Chem. 72(30):18515- 18517.

• Fukushima H, Sugiyama S, Honda O, Koide S, Nakamura S, Sakamoto T, Yoshimura M, Ogawa H, Fujioka D, Kugiyama K. 2004. Prognostic value of remnant-like lipoprotein particle levels in patients with coronary artery disease and type II diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol. 43:2219–2224.

• Ghiselli A, Laurenti O, DeMattia G, Maiani G, Ferro-Luzzi A. 1992. Salicylate hydroxylation as an early marker of in vivo oxidative stress in diabetic patients. Free Radic Biol Med. 13(6):621-626.

• Go´th L, Eaton JW. 2000. Hereditary catalase deficiencies and increased risk of diabetes. Lancet. 356:1820–1821.

• Go´th L, Lenkey A, Bigler WN. 2001. Blood catalase deficiency and diabetes in Hungary. Diabetes Care. 24:1839–1840.

• Grootveld M, Halliwell B. 1986. Aromatic hydroxylation as a potential measure of hydroxyl-radical formation in vivo. Identification of hydroxylated derivatives of salicylate in human body fluids. Biochem J. 237(2):499-504.

• Grootveld M, Halliwell B. 1988. 2,3-Dihydroxybenzoic acid is a product of human aspirin metabolism. Biochem Pharmacol. 37(2):271-280.

• Grove TH. 1979. Effect of Reagent pH on Determination of High-densityLipoprotein Cholesterol by Precipitationwith Sodium Phosphotungstate-Magnesium. Clin Chem. 25(4): 560-564.

• Guidance for industry: Bioanalytical Method Validation, U.S. 2001. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER).

• Guzik TJ, West NE, Black E, McDonald D, Ratnatunga C, Pillai R, Channon KM. 2000. Vascular superoxide production by NAD(P)H: association with endothelial dysfunction and clinical risk factor. Circ Res. 86(9):85-90.

• Haber F, Weiss J. 1934. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts. J Proc Roy Soc. 147: 332-351.

• Guzik TJ, Mussa S, Gastaldi D, Sadowski J, ratnatunga C, Pillai R, Channon KM. 2002. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105(14):1656-1662.

• Halliwell B, Kaur H, Ingelman-Sundberg M. 1991. Hydroxylation of salicylate as an assay for hydroxyl radicals: a cautionary note. Free Rad Biol Med. 10(6):439-441.

• Halliwell B, Gutteridge JM, Cross CE. 1992. Free radical, antioxidants, and human disease: Where are we now? J Lab Clin Med. 119(6):598-620.

• Halliwell B. 1994. Free radicals, antioxidants and human disease: Curiosity, cause or consequence? Lancet. 344(8924):721-724.

34

• Halliwell B, Kaur H. 1994. Aromatic hydroxylation of phenylalanine as an assay for hydroxyl radicals. Measurement of hydroxyl radical formation from ozone and in blood from premature babies using improved HPLC methodology. Anal Biochem. 220(1):11-15.

• Halliwell, B. 1996. Antioxidants in human health and disease. Annu Rev Nutr. 16:33-50.

• Halliwell B, Kaur H. 1997. Hydroxylation of salicylate and phenylalanine as assays for hydroxyl radicals: a cautionary note visited for the third time. Free Ras Res. 27(3):239-244.

• Harman D. 1992. Free radical theory of aging. Mutat Res. 275(3-6):257-266. • Hartnett ME, Stratton RD, Browne RW, Rosner BA, Lanham RJ, Armstrong

D. 2000. Serum markers for oxidative stress and severity of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 23:234–240.

• Hidenobu Koga, Seigo Sugiyama, Kiyotaka Kugiyama, Hironobu Fukushim1, Keisuke Watanabe, Tomohiro Sakamoto, Michihiro Yoshimura, Hideaki Jinnouchi, and Hisao Ogawa. 2006. Elevated levels of remnant lipoproteins are associated with plasma platelet microparticles in patients with type-2 diabetes mellitus without obstructive coronary artery disease European Heart Journal. 27, 817–823.

• Ingelman-Sundberg M, Kaur H, Terelius Y, Persson JO, Halliwell B. 1991. Hydroxylation of salicylate by microsomal fractions and cytochrome P-450. Lack of production of 2,3-dihydroxybenzoate unless hydroxyl radical formation is permitted. Biochem J. 276 (Pt 3):753-757.

• Jian L, Christopher S, Richard PD, Joan D, Maurizio T, Scott MG. 2005. Joint Distribution of Non-HDL and LDL Cholesterol and Coronary Heart Disease Risk Prediction Among Individuals With and Without Diabetes. Diabetes Care. 28:1916–1921.

• Johansen JS, Harris AK, Rychly DJ, Ergul A. 2005. Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes: Linking basic science to clinical practice. Cardiovascular Diabetology. 4 (5):1-11

• Kaplan A. 1969. The determination of urea, ammonia, and urease. Methods Biochem Anal. 17:311–324.

• Kaur H, Edmonds SE, Blake DR, Halliwell B. 1996. Hydroxyl radical generation by rheumatoid blood and knee joint synovial fluid. Ann Rheum Dis. 55(12):915-920.

• Kontush A, Chapman MJ. 2006. Functionally Defective High-Density Lipoprotein: A New Therapeutic Target at the Crossroads of Dyslipidemia, Inflammation, and Atherosclerosis. Pharmacol Rev. 58:342–374.

• Korycka-Dahi M, Richarson T. 1981. Initiation of oxidative changes in food. Symposium: oxidative changes in milk. J. Dairy Sciences. 63: 1181-1208.

• Kregel KC, Zhang HJ. 2006. An integrate view of oxidative stress in aging: basic mechanisms, functional effects, and phatological consideration. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 292: R18-R36.

• Kristal BS, Chen J, Yu BP. 1994. Sensitivity of mitochondrial transcription to different free radical species. Free Radic Biol Med. 16(3):323-329.

35

• Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. 2005. Oxidatives stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Biol. 25:29-38.

• Maritim AC, Sanders RA, Watkins JB 3rd. 2003. Diabetes, oxidative stress and antioxidants. J Biochem Mol Toxicol. 17(1):24-38.

• Martínez CM, Sánchez MC. 2001. Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante En: Nutrición Clínica: Implicaciones del estrés oxidativo y de los alimentos funcionales. 1ª ed. McGraw-Hill Madrid. 91-111.

• Mason RP. 1982. Free radical intermediates in the metabolism of toxicological significance. Free radicals biology. W. A. Pryor. New York, Academic Press. 262-165.

• Mayne ST. 2003. Antioxidant nutrients and chronic disease: use of biomarkers of exposure and oxidative stress status in epidemiologic research. J Nutr. 133(3):933S-940S.

• McCabe DR, Maher TJ, Acworth IN. 1997. Improved method for the estimation of hydroxyl free radical levels in vivo based on liquid chromatography with electrochemical detection. Chromatogr B Biomed Sci Appl. 691(1):23-32.

• Meagher EA, FitzGerald GA. 2000. Indices of lipid peroxidation in vivo: strengths and limitations. Free Radic Biol Med. 28(12): 1745-1750.

• Meiattini F, Príncipe L, Bardelli F,’ Gianninl G and Tarli P. 1978. The 4-Hydroxybenzoate/4-Aminophenazone Chromogenic System Used in the Enzymic Determination of Serum Cholesterol. Clin Chem. 24(12):2161-2165

• Moore K, Roberts LJ 2nd. 1998. Measurement of lipid peroxidation. Free Radic Res. 28(6):659-671.

• Morimoto T, Globus MY, Busto R, Martinez E, Ginsberg MD. 1996. Simultaneous measurement of salicylate hydroxylation and glutamate release in the penumbral cortex following transient middle cerebral artery occlusion rats. J Cereb Blood Flow Metab. 16(1):92-99

• Mukul D, Kishore B, Naveen PR, Lalit MS. 2005. Oxidative damage of plasma proteins and lipids in epidemic dropsy patients: Alterations in antioxidant status. Biochim Biophys Acta. 1722:209-17.

• Nangaku M, Isaura Y, Usuda N, Inagi R, Shibata T, Sugiyama S, Kurokawa K, de Strihou CY, Miyata T. 2005 In a type 2 diabetic nephropathy rat model, the improvement of obesity by a low calorie diet reduces oxidative/carbonyl stress and prevents diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant. 20: 2661–2669

• Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, Yamagishi S, Matsumura T, Kaneda Y, Yorek MA, Beebe D, Oates PJ, Hammes HP, Giardino I, Brownlee M. 2000. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature. 404:787–790.

• Norma oficial mexicana NOM-177-SSA1-2004 Diario oficial, 11 de Agosto del 2004.

• Okada M, Matsui H, Ito Y, Fujiwara A and Inano K. 1998. Low-density lipoprotein cholesterol can be chemically measured: a new superior method. J Lab Clin Med. 132(3):195-201

36

• Penckofer S, Schwertz D, Florzak K. 2002. Oxidative stress and cardiovascular disease in type 2 diabetes: the role of antioxidants and pro-antioxidants. J cardiovasc Nurs. 16(2): 68-85.

• Podmore ID, Cooper D, Evans MD, Wood M, Lunec J. 2000. Simultaneous measurement of 8-oxo-2'-deoxyguanosine and 8-oxo-2'-deoxyadenosine by HPLC-MS/MS. Biochem Biophys Res Commun. 277(3):764-770.

• Porte Jr D. 2001. Clinical importance of insulin secretion and its interaction with insulin resistance in the treatment of type 2 diabetes mellitus and its complications. Diabetes Metab Res Rev. 17: 181–188.

• Postlethwait EM, Langford SD, Jacobson LM, Bidani A. 1995. NO2 reactive absorption substrates in rat pulmonary surface lining fluids. Free Radic Biol Med. 19(5):553-563.

• Powell SR. 1994. Salicylate trapping of OH• as a tool for studying post-ischemic oxidative injury in the isolated rat heart. Free Radic Res. 21(6):355-370.

• Prabhakar S, Starnes J, Shi S, Lonis B, Tran R. 2007. Diabetic Nephropathy Is Associated with Oxidative Stress and Decreased Renal Nitric Oxide Production. J. Am. Soc. Nephrol. 18:2945-2952

• Reiter RJ. 1995. Oxidative processes and antioxidative defense mechanisms in the aging brain. FASEB J. 9(7):526-533.

• Richter C, Park JW, Ames BN. 1988. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive. Proc Natl Acad Sci USA. 85(17):6465-6467.

• Roberts II LJ y Morrow JD. 2003. Analgésicos-antipiréticos y antiinflamatorios, y fármacos antigotósicos. En: Goodman y Gilman Las bases farmacológicas de la terapéutica. 10ª Edición. Ed. Mc Graw Hill. 707-714.

• Robertson RP, Harmon J, Train POT and poitout V. 2004. β-Cell glucose toxicity, lipotoxicity, and chronic oxidative stress in type 2 diabetes. Diabetes. 53(1): s119-S124.

• Rodríguez PJM, Menéndez LJR, Trujillo LY. 2001. Radicales libres en la biomedicina y estrés oxidativo. Rev Cubana Med Milit. 30(1):36-44.

• Rojkind M, Dominguez-Rosale JA, Nieto N, Greenwel P. 2002. Role of hydrogen peroxide and oxidative stress in healing responses. CMLS Cell Mol Life Sci. 59:1-20.

• Rosen P, Nawroth PP, King G, Moller W, Tritschler HJ, Packer L. 2001. The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: a summary of a Congress Series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association, and the German Diabetes Society. Diabetes Metab Res Rev. 17:189–212

• Sawyer DT. 1988. The redox thermodynamics for dioxygen species (O2, O2•-

, HOO, H2O2 and HOO•-) and monooxygen species (O, O•-, OH, and OH•-) in water and aprotic solvents. Basic Life Sci. 49:11-20.

• Shibutani S, Takeshita M, Grollman AP. 1991. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature. 349(6308): 431-434.

37

• Sies H. 1986. Biochemistry of oxidative stress. Angew Chem Int Ed Engl. 25:1058-1071.

• Simic MG, Taylor KA. 1988. Introduction to peroxidation and antioxidation mechanisms. Basic Life Sci. 49:1-10.

• Sociedad Española de Hipertensión-Liga Española para la Lucha contra la Hipertensión Arterial SEH-LELHA. 2002. Guía sobre el diagnóstico y el tratamiento de la hipertensión arterial en España 2002. Hipertensión. 19 Supl 3:1-74.

• Sparrow CP, Olszewski J. 1993. Cellular oxidation of low density lipoprotein is caused by thiol production in media containing transition metal ions. J Lipid Res. 34(7):2051-2061.

• Stadtman ER. 1992. Protein oxidation and aging. Science. 257(5074):1220-1224.

• Stadtman ER. 2002. Importance of individuality in oxidative stress and aging. Free Radic Biol Med. 33(5):597-604.

• Strolin-Benedetti M, Brogin G, Bani M, Oesch F, Hengstler JG. 1999. Association of cytochrome P450 induction with oxidative stress in vivo as evidenced by 3-hydroxylation of salicylate. Xenobiotica. 29(11):1171-1180.

• Thome J, Zhang J, Davids E, Foley P, Weijers HG, Wiesbeck GA, Boning J, Riederer P, Gerlach M. 1997. Evidence for increased oxidative stress in alcohol-dependent patients provided by quantification of in vivo salicylate hydroxylation products. Alcohol Clin Exp Res. 21(1):82-85.

• Trinder P.1969. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxigen acceptor. Ann Clin Biochem. 6: 24-33

• Trivelli LA, Ranney HM, Lai HT. 1971. Hemoglobin components in patients with diabetes mellitus. New Engl J Med. 284: 353–357

• Tsai TH, Cheng FC, Hung LC, Chen CF. 1999. Measurement of hydroxyl radical in rat blood vessel by microbore liquid chromatography and electrochemical detection: an on-line microdialysis study. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 734(2):277-283.

• Tubaro M, Cavallo G, Pensa V, Chessa MA, Natale E, Ricci R, Milazzotto F, Tubaro E. 1992. Demonstration of the formation of hydroxyl radicals in acute myocardial infarction in man using salicylate as probe. Cardiology. 80(3-4):246-251.

• Uchimura K, Nagasaka A, Hayashi R, Makino M, Nagata M, Kakizawa H, Kobayashi T, Fujiwara K, Kato T, Iwase K, Shinohara R, Kato K, Itoh M. 1999. Changes in superoxide dismutase activities and concentrations and myeloperoxidase activities in leukocytes from patients with diabetes mellitus. J Diabetes Complications. 13:264–270.

• Vincent AM, Russell JW, Low P, Feldman EL. 2004. Oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy. Endocrine Reviews. 25(4): 612-628.

• Wagner W, Khanna P, Frust DE. 2005. Antiinflamatorios no esteroideos, antirreumáticos modificadores de enfermedad, analgésicos no opioides y medicamentos usados para tratamiento de la gota. En: Katzung BG. Farmacología Básica y Clínica. 9ª Edición. México. Ed Manual Moderno. México. 575-602.

38

• Wassmann S, Laufs U, Bäumer AT, Müller K, Ahlbory K, Linz W, Itter G, Rösen R, Böhm M, Nickenig G. 2001. HMG-CoA reductase inhibitors improve endothelial dysfunction in normocholesterolemic hypertension via reduced production of reactive oxygen species. Hypertension. 37: 1450-1457.

• Waud WR, Rajagopalan KV. 1976. The mechanism of conversion of rat liver xanthine deshydrogenase from an NAD+- dependent form (type D) to an O2-dependent form (type O). Arch Biochem Biophys, 172: 365-379.

• West IC. 2000. Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med. 17:171–180.

• WHO. Global Database on Body Muss Index. Copyright 2006 World Health Organization - Last update: 10/10/2007

• Zalba G, San Josè G, Moreno M, Fortuno M, Fortuno A, Beaumont F, Diez J. 2001. Oxidative stress in arterial hypertension: role of NAD(P)H oxidase. Hypertension. 38:1395-1399.

39

ANEXO 1. CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

Doctorado en Ciencias en la Especialidad de Farmacología Médica y Molecular perteneciente a la Unidad Académica de Medicina Humana Área y Ciencias de la Salud de la Universidad

Autónoma de Zacatecas. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional -IPN Unidad

Durango

CCOONNSSEENNTTIIMMIIEENNTTOO PPAARRAA PPAARRTTIICCIIPPAARR EENN PPRROOTTOOCCOOLLOOSS DDEE IINNVVEESSTTIIGGAACCIIÓÓNN Por medio del presente autorizo a la QFB. Blanca Patricia Lazalde Ramos para realizar el siguiente procedimiento:

Tomas de muestras sanguíneas. El propósito de la toma de muestras es realizar el estudio denominado:

Método Analítico para la Determinación de Estrés Oxidativo, a través de la Hidroxilación

de Salicilatos en Plasma Humano.

Por medio de este documento manifiesto que:

1. He sido invitado(a) a participar voluntariamente aportando información y accediendo a que se me tome las muestras de sangre necesarias antes y después de la ingesta oral de 1 gramo de aspirina.

2. He sido informado(a) acerca del proyecto, y de la confidencialidad de mis datos personales. 3. Acepto que no recibiré compensación alguna y que libero a los investigadores e institución

participante de toda obligación económica para conmigo. 4. Mi firma en este documento manifiesta mi participación voluntaria a este proyecto de

investigación. Tal participación no libera a los investigadores e institución de su responsabilidad ética para conmigo.

Entiendo que mi participación en esta investigación puede terminar en el momento en que lo decida y lo exprese a los investigadores responsables sin que se perjudique mi futura atención.

Durango, Dgo., a de de

Responsable de la toma de la

muestra Voluntario

Nombre y firma Nombre y firma

Testigo Testigo

Nombre y firma Nombre y firma

40

ANEXO 2. FORMATO DE HISTORIA CLÍNICA. No. de Folio______

Fecha elaboración de historia: __________________

Expediente_____________________________ Consultorio y turno______________________

Nombre del Paciente:__________________________________________________________

Fecha de nacimiento________________________________ Edad_______ Sexo: (F) (M)

Domicilio: ___________________________________________________________________

Tel. particular_______________ Tel. Celular________________ Tel. Trabajo_____________

Hermanos

Padre

Madre

Padres

Paternos

Maternos

Hijos

Abuelos

Cardiopatía Hipertensión Diabetes Antecedentes heredo-familiares (AHF)

Antecedentes personales

Peso corporal: __________Kg. Talla______________m. IMC______________________

TA________mm. Pulso______/minuto.

Frecuencia cardiaca__________________.

Hoja 1/2

41

Tabaquismo (Si) (No) Número de cigarros/día______. Tiempo de consumo__________.

Consumo de alcohol (Si) (No) Cantidad____________________________________

Tipo de bebida___________________________________Tiempo de

consumo___________.

Consumo de drogas de abuso (Si) (No) Cantidad________________________________

Tipo de droga Tiempo de consumo .

Antecedentes Patológicos

Si No

Nefropatía

Retinopatía

Otra

Neuropatía

Cardiopatía isquémica

Amputación miembros inferiores

Articular degenerativa

Obesidad

Dislipidemia

Hipertensión

Diabetes tipo 2

Tiempo de Evolución ¿La padece? Enfermedades

ANEXO 3. MANEJO ESTADÍSTICO DE DATOS

• Glucosa Hoja 2/2

Consumo de medicamentos. Número de medicamentos que toma: _____________

Nombre del medicamento: ____________________________Dosis:____________

Tiempo de consumo: ________________________________

Nombre del medicamento: ____________________________Dosis:____________

Tiempo de consumo: ________________________________

Nombre del medicamento: ____________________________Dosis:____________

Tiempo de consumo: ________________________________

Nombre del medicamento: ____________________________Dosis:____________

Tiempo de consumo: ________________________________

Nombre del medicamento: ____________________________Dosis:____________

Tiempo de consumo: ________________________________

42

Analysis Summary for Glucosa Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 124.0 to 132.0 Sample 2: 2 values ranging from 73.0 to 82.0 The StatAdvisor This procedure is designed to compare two samples of data. It will calculate various statistics and graphs for each sample, and it will run several tests to determine whether there are statistically significant differences between the two samples. Summary Statistics for Glucosa Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness

Grupo=1 3

127.333 17.3333 4.16333 124.0 132.0

8.0 0.914531

Grupo=2 2

77.5 40.5

6.36396 73.0 82.0 9.0

The StatAdvisor This table shows summary statistics for the two samples of data. Other tabular options within this analysis can be used to test whether differences between the statistics from the two samples are statistically significant. Of particular interest here are the standardized skewness and standardized kurtosis, which can be used to determine whether the samples come from normal distributions. Values of these statistics outside the range of -2 to +2 indicate significant departures from normality, which would tend to invalidate the tests which compare the standard deviations. In this case, Grupo=2 has a standardized skewness value outside the normal range. To calculate the standardized kurtosis, press the alternate mouse button and select Comparison of Standard Deviations for Glucosa Standard deviation Variance Df

Grupo=1 4.16333 17.3333

2

Grupo=2 6.36396

40.5 1

Ratio of Variances = 0.427984 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [2.16767,26.1654] Standard deviation of Grupo=2: [2.83933,203.075] Ratio of Variances: [0.000535314,16.4801] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.427984 P-value = 0.531936 The StatAdvisor This option runs an F-test to compare the variances of the two samples. It also constructs confidence intervals or bounds for each standard deviation and for the ratio of the variances. Of particular interest is the confidence interval for the ratio of the variances, which extends from 0.000535314 to 16.4801. Since the interval contains the value 1.0, there is not a statistically significant difference between the standard deviations of the two samples at the 95.0% confidence level. An F-test may also be used to test a specific hypothesis about the standard deviations of the populations from which the two samples come. In this case, the test has been constructed to determine whether the ratio of the standard deviations equals 1.0 versus the alternative hypothesis that the ratio does not equal 1.0. Since the computed P-value is not less than 0.05, we cannot reject the null hypothesis.

43

IMPORTANT NOTE: the F-tests and confidence intervals shown here depend on the samples having come from normal distributions. To test this assumption, select Summary Statistics from the list of Tabular Options and check the standardized skewness and standardized kurtosis values. Comparison of Means for Glucosa 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 127.333 +/- 10.3423 [116.991,137.676] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 77.5 +/- 57.1779 [20.3221,134.678] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 49.8333 +/- 14.542 [35.2914,64.3753] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 10.9058 P-value = 0.00165007 The StatAdvisor This option runs a t-test to compare the means of the two samples. It also constructs confidence intervals or bounds for each mean and for the difference between the means. Of particular interest is the confidence interval for the difference between the means, which extends from 35.2914 to 64.3753. Since the interval does not contain the value 0.0, there is a statistically significant difference between the means of the two samples at the 95.0% confidence level. A t-test may also be used to test a specific hypothesis about the difference between the means of the populations from which the two samples come. In this case, the test has been constructed to determine whether the difference between the two means equals 0.0 versus the alternative hypothesis that the difference does not equal 0.0. Since the computed P-value is less than 0.05, we can reject the null hypothesis in favor of the alternative. NOTE: these results assume that the variances of the two samples are equal. In this case, that assumption appears to be reasonable based on the results of an F-test to compare the standard deviations. You can see the results of that test by selecting Comparison of Standard Deviations from the Tabular Options menu.

• HbA1c Analysis Summary for HbA1c Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 5.6 to 6.4 Sample 2: 2 values ranging from 4.4 to 4.5 Summary Statistics for HbA1c Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

6.13333 0.213333 0.46188

5.6 6.4 0.8

-1.22474

Grupo=2 2

4.45 0.005

0.0707107 4.4 4.5 0.1

Comparison of Standard Deviations for HbA1c Standard deviation Variance Df

Grupo=1 0.46188 0.213333

2

Grupo=2 0.0707107

0.005 1

Ratio of Variances = 42.6667 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [0.240482,2.90279] Standard deviation of Grupo=2: [0.0315481,2.25639]

44

Ratio of Variances: [0.0533667,1642.94] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 42.6667 P-value = 0.212349 Comparison of Means for HbA1c 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 6.13333 +/- 1.14737 [4.98596,7.28071] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 4.45 +/- 0.63531 [3.81469,5.08531] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 1.68333 +/- 1.10201 [0.581326,2.78534] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 4.86124 P-value = 0.0166238

• Triglicéridos Analysis Summary for Triglicéridos Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 142.0 to 331.0 Sample 2: 2 values ranging from 152.0 to 316.0 Summary Statistics for Triglicéridos Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosi

Grupo=1 3

263.0 11037.0 105.057

142.0 331.0 189.0

-1.19672

Grupo=2 2

234.0 13448.0 115.966

152.0 316.0 164.0

Comparison of Standard Deviations for Triglicéridos Standard deviation Variance Df

Grupo=1 105.057 11037.0

2

Grupo=2 115.966 13448.0

1 Ratio of Variances = 0.820717 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [54.6989,660.256] Standard deviation of Grupo=2: [51.739,3700.48] Ratio of Variances: [0.00102654,31.6028] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.820717 P-value = 0.769419 Comparison of Means for Triglicéridos 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 263.0 +/- 260.976 [2.02363,523.976] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 234.0 +/- 1041.91 [-807.909,1275.91] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 29.0 +/- 316.125 [-287.125,345.125] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2

45

Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 0.291945 P-value = 0.789354

• HDL Analysis Summary for HDL Sample 1: Grupo=1 Pacientes con Dm2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 27.0 to 34.0 Sample 2: 2 values ranging from 39.0 to 48.0 Summary Statistics for HDL Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

30.5 12.25

3.5 27.0 34.0 7.0 0.0

Grupo=2 2

43.5 40.5

6.36396 39.0 48.0 9.0

Comparison of Standard Deviations for HDL Standard deviation Variance Df

Grupo=1 3.5

12.25 2

Grupo=2 6.36396

40.5 1

Ratio of Variances = 0.302469 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [1.8223,21.9966] Standard deviation of Grupo=2: [2.83933,203.075] Ratio of Variances: [0.000378323,11.647] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.302469 P-value = 0.421296 Comparison of Means for HDL 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 30.5 +/- 8.69448 [21.8055,39.1945] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 43.5 +/- 57.1779 [-13.6779,100.678] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: -13.0 +/- 13.5228 [-26.5228,0.522808] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = -3.05941 P-value = 0.0550185

• LDL Analysis Summary for LDL Cannot perform analysis. Data values are all equal.

• VLDL Analysis Summary for VLDL Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 66.0 to 67.0

46

Sample 2: 2 values ranging from 13.0 to 32.0 Summary Statistics for VLDL Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

66.5 0.25 0.5 66.0 67.0 1.0 0.0

Grupo=2 2

22.5 180.5 13.435

13.0 32.0 19.0

Comparison of Standard Deviations for VLDL Standard deviation Variance Df

Grupo=1 0.5 0.25

2

Grupo=2 13.435 180.5

1 Ratio of Variances = 0.00138504 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [0.260329,3.14237] Standard deviation of Grupo=2: [5.99415,428.714] Ratio of Variances: [0.00000173238,0.0533329] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.00138504 P-value = 0.00276434 The StatAdvisor This option runs an F-test to compare the variances of the two samples. It also constructs confidence intervals or bounds for each standard deviation and for the ratio of the variances. Of particular interest is the confidence interval for the ratio of the variances, which extends from 0.00000173238 to 0.0533329. Since the interval does not contain the value 1.0, there is a statistically significant difference between the standard deviations of the two samples at the 95.0% confidence level. An F-test may also be used to test a specific hypothesis about the standard deviations of the populations from which the two samples come. In this case, the test has been constructed to determine whether the ratio of the standard deviations equals 1.0 versus the alternative hypothesis that the ratio does not equal 1.0. Since the computed P-value is less than 0.05, we can reject the null hypothesis in favor of the alternative. IMPORTANT NOTE: the F-tests and confidence intervals shown here depend on the samples having come from normal distributions. To test this assumption, select Summary Statistics from the list of Tabular Options and check the standardized skewness and standardized kurtosis values. Comparison of Medians for VLDL Median of sample 1: 66.5 Median of sample 2: 22.5 Mann-Whitney (Wilcoxon) W test to compare medians Null hypothesis: median1 = median2 Alt. hypothesis: median1 NE median2 Average rank of sample 1: 4.0 Average rank of sample 2: 1.5 W = 0.0 P-value = 0.148914 The StatAdvisor

47

This option runs a Mann-Whitney W test to compare the medians of the two samples. This test is constructed by combining the two samples, sorting the data from smallest to largest, and comparing the average ranks of the two samples in the combined data. Since the P-value is greater than or equal to 0.05, there is not a statistically significant difference between the medians at the 95.0% confidence level. Analysis Summary for Presión arterial sistólica Cannot perform analysis. Data values are all equal. Analysis Summary for Presión arterial diastólica Cannot perform analysis. Data values are all equal.

• PAM Analysis Summary for PA media Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 93.15 to 103.2 Sample 2: 2 values ranging from 80.0 to 83.2 Summary Statistics for PA media Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

97.6167 26.1858 5.11721

93.15 103.2 10.05 0.6613

Grupo=2 2

81.6 5.12

2.26274 80.0 83.2 3.2

Comparison of Standard Deviations for PA media Standard deviation Variance Df

Grupo=1 5.11721 26.1858

2

Grupo=2 2.26274

5.12 1

Ratio of Variances = 5.11442 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [2.66432,32.1603] Standard deviation of Grupo=2: [1.00954,72.2044] Ratio of Variances: [0.00639702,196.938] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 5.11442 P-value = 0.588469 Comparison of Means for PA media 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 97.6167 +/- 12.7119 [84.9048,110.329] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 81.6 +/- 20.3299 [61.2701,101.93] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 16.0167 +/- 12.7178 [3.29885,28.7345] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 4.00794 P-value = 0.0278635

• IMC

48

Analysis Summary for IMC Sample 1: Grupo =1Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo =2 control Sample 1: 3 values ranging from 20.19 to 40.29 Sample 2: 2 values ranging from 22.03 to 22.15 Summary Statistics for IMC Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

29.37 103.273 10.1623

20.19 40.29 20.1

0.528848

Grupo=2 2

22.09 0.0072

0.0848528 22.03 22.15 0.12

Comparison of Standard Deviations for IMC Standard deviation Variance Df

Grupo=1 10.1623 103.273

2

Grupo=2 0.0848528

0.0072 1

Ratio of Variances = 14343.5 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [5.29111,63.8676] Standard deviation of Grupo=2: [0.0378578,2.70767] Ratio of Variances: [17.9406,552316.0] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 14343.5 P-value = 0.0116499 Comparison of Medians for IMC Median of sample 1: 27.63 Median of sample 2: 22.09 Mann-Whitney (Wilcoxon) W test to compare medians Null hypothesis: median1 = median2 Alt. hypothesis: median1 NE median2 Average rank of sample 1: 3.33333 Average rank of sample 2: 2.5 W = 2.0 P-value = 0.772826

• 2,3-DHBA

Analysis Summary for 2,3-DHBA Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 63.14 to 88.6 Sample 2: 2 values ranging from 43.85 to 89.16 Summary Statistics for 2,3-DHBA Count Average Variance

Grupo=1 3

71.6267 216.071

Grupo=2 2

66.505 1026.5

49

Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

14.6993 63.14 88.6 25.46

1.22474

32.039 43.85 89.16 45.31

Comparison of Standard Deviations for 2,3-DHBA Standard deviation Variance Df

Grupo=1 4.6993 216.071

2

Grupo=2 32.039 1026.5

1 Ratio of Variances = 0.210493 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [7.65333,92.3814] Standard deviation of Grupo=2: [14.2945,1022.37] Ratio of Variances: [0.000263281,8.10531] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.210493 P-value = 0.32222 Comparison of Means for 2,3- DHBA 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 71.6267 +/- 36.5152 [35.1115,108.142] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 66.505 +/- 287.859 [-221.354,354.364] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 5.12167 +/- 64.0596 [-58.9379,69.1813] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 0.254442 P-value = 0.815598

• 2, 5-DHBA Analysis Summary for 2, 5-DHBA Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 365.2 to 747.7 Sample 2: 2 values ranging from 642.52 to 1593.56 Summary Statistics for 2, 5-DHBA Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

512.653 42331.0 205.745

365.2 747.7 382.5

1.10915

Grupo=2 2

1118.04 452239.0 672.487 642.52

1593.56 951.04

Comparison of Standard Deviations for 2,5-DHBA Standard deviation Variance Df

Grupo=1 205.745 42331.0

2

Grupo=2 672.487

452239.0 1

50

Ratio of Variances = 0.0936033 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [107.123,1293.05] Standard deviation of Grupo=2: [300.036,21459.2] Ratio of Variances: [0.000117077,3.60432] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.0936033 P-value = 0.164447 Comparison of Means for 2,5-DHBA 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 512.653 +/- 511.099 [1.55441,1023.75] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 1118.04 +/- 6042.05 [-4924.01,7160.09] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: -605.387 +/- 1229.01 [-1834.4,623.628] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = -1.56761 P-value = 0.214968

• Glucosa/2,3-DHBA Analysis Summary for glucosa /2,3-DHBA Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 90.82 to 135.66 Sample 2: 2 values ranging from 53.13 to 121.34 Summary Statistics for glucose/ 2,3-DHBA Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

108.177 579.568 24.0742

90.82 135.66 44.84

1.10165

Grupo=2 2

87.235 2326.3

48.2318 53.13 121.34 68.21

Comparison of Standard Deviations for glucosa /2,3-DHBA Standard deviation Variance Df

Grupo=1 24.0742 579.568

2

Grupo=2 48.2318 2326.3

1 Ratio of Variances = 0.249137 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [12.5344,151.3] Standard deviation of Grupo=2: [21.519,1539.08] Ratio of Variances: [0.000311616,9.59336] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.249137 P-value = 0.366067 Comparison of Means for glucose/ 2,3-DHBA 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 108.177 +/- 59.8037 [48.373,167.98] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 87.235 +/- 433.345 [-346.11,520.58]

51

95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 20.9417 +/- 99.0237 [-78.082,119.965] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 0.673029 P-value = 0.549135

• Glucosa/2,5-DHBA Analysis Summary for glucosa /2,5-DHBA Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 18.93 to 35.35 Sample 2: 2 values ranging from 2.97 to 8.28 Summary Statistics for glucose/ 2,5-DHBA Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

25.5633 74.8617 8.65227

18.93 35.35 16.42

1.00564

Grupo=2 2

5.625 14.098 3.75474

2.97 8.28 5.31

Comparison of Standard Deviations for glucose/ 2,5-DHBA Standard deviation Variance Df

Grupo=1 8.65227 74.8617

2

Grupo=2 3.75474 14.098

1

Ratio of Variances = 5.31008 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [4.50487,54.3772] Standard deviation of Grupo=2: [1.67521,119.814] Ratio of Variances: [0.00664175,204.472] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 5.31008 P-value = 0.57849 Comparison of Means for glucose/ 2,5-DHBA 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 25.5633 +/- 21.4934 [4.06991,47.0568] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 5.625 +/- 33.735 [-28.11,39.36] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 19.9383 +/- 21.4682 [-1.52987,41.4065] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 2.95566 P-value = 0.0597519

• Creatinina Analysis Summary for creatinina Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 0.6 to 0.75

52

Sample 2: 2 values ranging from 0.7 to 0.9 Summary Statistics for creatinina Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

Grupo=1 3

0.65 0.0075

0.0866025

0.6 0.75 0.15

1.22474

Grupo=2 2

0.8 0.02

0.141421 0.7 0.9 0.2

Comparison of Standard Deviations for creatinina Standard deviation Variance Df

Grupo=1 0.0866025

0.0075 2

Grupo=2 0.141421

0.02 1

Ratio of Variances = 0.375 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [0.0450903,0.544274] Standard deviation of Grupo=2: [0.0630963,4.51278] Ratio of Variances: [0.000469043,14.4399] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.375 P-value = 0.488142 Comparison of Means for creatinina 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 0.65 +/- 0.215133 [0.434867,0.865133] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 0.8 +/- 1.27062 [-0.47062,2.07062] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: -0.15 +/- 0.313794 [-0.463794,0.163794] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = -1.52128 P-value = 0.225538

• Urea Analysis Summary for Urea Sample 1: Grupo=1 Pacientes con DM2 Sample 2: Grupo=2 Grupo control Sample 1: 3 values ranging from 37.0 to 39.0 Sample 2: 2 values ranging from 17.0 to 20.5 Summary Statistics for Urea Count Average Variance Standard deviation Minimum Maximum Range

Grupo=1 3

38.0 1.0 1.0 37.0 39.0 2.0

Grupo=2 2

18.75 6.125

2.47487

17.0 20.5

53

Stnd. skewness Stnd. kurtosis

0.0

3.5

Comparison of Standard Deviations for Urea Standard deviation Variance Df

Grupo=1 1.0 1.0

2

Grupo=2 2.47487

6.125 1

Ratio of Variances = 0.163265 95.0% Confidence Intervals Standard deviation of Grupo=1: [0.520658,6.28473] Standard deviation of Grupo=2: [1.10419,78.9736] Ratio of Variances: [0.000204209,6.28675] F-test to Compare Standard Deviations Null hypothesis: sigma1 = sigma2 Alt. hypothesis: sigma1 NE sigma2 F = 0.163265 P-value = 0.263514 Comparison of Means for Urea 95.0% confidence interval for mean of Grupo=1: 38.0 +/- 2.48414 [35.5159,40.4841] 95.0% confidence interval for mean of Grupo=2: 18.75 +/- 22.2359 [-3.48586,40.9859] 95.0% confidence interval for the difference between the means assuming equal variances: 19.25 +/- 4.78103 [14.469,24.031] t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 12.8136 P-value = 0.0010257

54