Doktori (Ph.D.) értekezés Fehér Balázsdoktori.bibl.u-szeged.hu/1078/1/Fehér_Balázs_PhD_értekezés.pdf · cdf1 cycling dof-factor 1 cfp cyan fluorescent protein che cca1 hiking

Doktori (Ph.D.) értekezés

Fehér Balázs

Biológia Doktori Iskola

Szeged

2011

Az UV-B fény és a növényi cirkadián óra

kapcsolatának vizsgálata

Doktori (Ph.D.) értekezés

Készítette: Fehér Balázs

Témavezető: Dr. Nagy Ferenc

Magyar Tudományos Akadémia

Szegedi Biológiai Kutatóközpont

Növénybiológiai Intézet

Foto- és Kronobiológiai Csoport

Szegedi Tudományegyetem

Természettudományi és Informatikai Kar

Biológia Doktori Iskola

Szeged

2011

TARTALOMJEGYZÉK II _________________________________________________________________________________________________

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ......................................................................................................................................2

BEVEZETÉS................................................................................................................................................................3

SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................................................................5

Ritmikus folyamatok ......................................................................................................................................................... .5

Cirkadián ritmusok ............................................................................................................................................................ .5

Alapismeretek, alapfogalmak .............................................................................................................................. 5

Mérési módszerek ..................................................................................................................................................... 8

A cirkadián óra................................................................................................................................................................... 10

A központi oszcillátor felépítése .......................................................................................................................11

Az óra kapcsolata a külvilággal (bemenet, input).....................................................................................11

Az óra kimeneti elemei által szabályozott folyamatok (output) .........................................................12

Az Arabidopsis cirkadián órájának modellje ......................................................................................................... 12

A központi óramű felépítése ...............................................................................................................................12

A bemeneti oldal elemei .......................................................................................................................................16

UV-B érzékelés és jelátvitel .......................................................................................................................................... 23

UV-B: stresszfaktor és környezeti jel ...............................................................................................................23

Az UV-B fotomorfogenikus jellemzői...............................................................................................................24

UV-B fotoreceptor? .................................................................................................................................................25

A COP1 új funkciója ................................................................................................................................................27

Az UVR8 jellemzői ...................................................................................................................................................28

UVR8 a lehetséges UV-B fotoreceptor .............................................................................................................30

CÉLKITŰZÉSEK...................................................................................................................................................... 32

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK................................................................................................................................ 33

Kísérleti anyagok és élőlények.................................................................................................................................... 33

Tápoldatok, táptalajok, antibiotikumok, szelekció ...................................................................................33

Baktériumok .............................................................................................................................................................34

Növények ....................................................................................................................................................................34

Molekuláris biológiai módszerek............................................................................................................................... 35

Riportergén konstrukciók készítése, transzgénikus növények előállítása .......................................35

Agrobaktérium konjugáció .................................................................................................................................37

Növényi DNS tisztítása..........................................................................................................................................38

TARTALOMJEGYZÉK II _________________________________________________________________________________________________

Növényi RNS tisztítása..........................................................................................................................................38

mRNS szint meghatározása RT-PCR-rel ........................................................................................................38

Növényi összfehérje tisztítása ............................................................................................................................40

Fehérjeszint meghatározása Western-blot módszerrel ..........................................................................40

Növényeken alkalmazott technikák ......................................................................................................................... 41

Magsterilizálás, növénynevelés .........................................................................................................................41

Fénykezelések ...........................................................................................................................................................41

Alkalmazott UV szűrők .........................................................................................................................................42

Transzgénkus növények előállítása .................................................................................................................43

In vivo lumineszcencia mérés luminométerrel............................................................................................43

Periódus adatok számolása ................................................................................................................................44

A fázis igazíthatóságának mérése (PRC).......................................................................................................44

A kapuzás (gating) vizsgálata ...........................................................................................................................45

UV-B tolerancia vizsgálata .................................................................................................................................45

Klorofilltartalom meghatározása ....................................................................................................................46

EREDMÉNYEK........................................................................................................................................................ 47

A cirkadián óra beállíthatósága UV-B fénnyel...................................................................................................... 47

Az UV-B befolyásolja a cirkadián óra sebességét .......................................................................................47

UV-B pulzusokkal a cirkadián óra késleltetése idézhető elő..................................................................49

UV-B kiváltotta fényindukció cirkadián szabályozása ..................................................................................... 51

Optimális indukciós és mintaszedési körülmények megállapítása .....................................................51

Az UV-B képes indukálni a központi óraelemeket .....................................................................................53

A cirkadián óra a nem ritmikus gének UV-B indukcióját is kapuzza .................................................56

A HY5 és a HYH nem szükségesek sem az óragének UV-B indukciójához, sem az UV-B

indukálta génexpresszió kapuzásához .......................................................................................................... 61

Aritmiás mutánsokban hiányzik az UV-B indukált génkifejeződés kapuzása................................63

Az óra által szabályozott UV-B génindukció fiziológiai hatása ...........................................................67

AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ................................................................................................................... 69

Az UV-B szerepet játszik a növényi cirkadián óra beállításában................................................................. 69

Az UV-B indukció ritmikus szabályozása ............................................................................................................... 71

Az óramodulált UV-B válaszok fiziológiai jelentősége ..................................................................................... 73

KÖVETKEZTETÉSEK............................................................................................................................................ 75

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ........................................................................................................................................ 77

IDÉZETT KÖZLEMÉNYEK................................................................................................................................... 78

ÖSSZEFOGLALÁS................................................................................................................................................... 86

SUMMARY .............................................................................................................................................................. 90

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .................................................................................................................................. 99

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AhR Aril-hidrokarbon receptor AM Arabidopsis Medium (növényi táptalaj) BCIP 5-bróm-4-klór-3-indolil foszfát bHLH Bázikus Helix-Loop-Helix fehérjeelem BiFC Bimolecular Fluorescent Complementation BRASS Biological Rhythms Analysis Software System BSA Bovine serum albumin CBS CCA1 binding site A CCA1 transzkripciós faktor által felismert szekvenciamotívum CCD Charge coupled device Col-0 Arabidopsis thaliana (lúdfű), Columbia természetes ökotípusa CPD Ciklobután pirimidin dimer cps Counts per second (másodpercenként beérkező fotonok száma) CTAB Cetil-trimetil-ammónium bromid EDTA Etilén-diamin-tetraacetát EE Esti kifejeződésű promóterekben feldúsult szekvenciamotívum FFT-NLLS Fast Fourier Transformation Non Linear Least Squares FICZ 6-formilindol[3,2-b]carbazol FMN Flavin-mononukleotid FRC Fluence rate curve (egy jelleg függése a fényerősségtől) FRET Fluorescent Resonance Energy Transfer GEF Guanine nucleotide exchange factor IPTG Izopropil-β-D-galakto-piranozid LB Luria-Bertani baktérium táptalaj LOV (light/oxigen/voltage) fehérjeelem MS Murashige-Skoog növényi táptalaj NBT Nitroblue tetrazólium NES Nuclear export signal NLS Nuclear localization signal PAS (Per/Arnt/Sim) fehérjeelem Pfr A fitokróm távoli vörös fényt elnyelő alakja pPCV Plant Cloning Vector (növényi kétgazdás plazmid) Pr A fitokróm vörös fényt elnyelő alakja PRC Phase response curve (az óra beállítható-ságát az idő függvényében leíró görbe) SCF SKP-Cullin-F-box SDS Nátrium-dodecil-szulfát SEM Standard error of the means (a középértékek standard hibája) TBS TCP transzkripciós faktorok által felismert szekvenciamotívum TBST Tris-Buffered Saline Tween-20 TCP (TB1, CYC, PCFs) fehérjeelem Tris·HCl Trisz-(hidroximetil)-amino-metán hidroklorid sója UV-A/B Ibolyántúli-A/B sugárzás Ws Arabidopsis thaliana (lúdfű), Wassilewskija természetes változata X-gal 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-galakto-piranozid YEB Yeast Beef (Agrobacterium táptalaj)

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2 __________________________________________________________________________________________

Gén szimbólumok

ARR ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR

ASK ARABIDOPSIS SKP

β-TUB β-TUBULIN

BRI1 BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1

CAB2 CHLOROPHYLL A/B-BINDING 2

CCA1 CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1

CCR2 COLD CIRCADIAN CLOCK REGULATED 2

CDF1 CYCLING DOF-FACTOR 1

CFP CYAN FLUORESCENT PROTEIN

CHE CCA1 HIKING EXPEDITION

CHS CHALCONE SYNTHASE

CO CONSTANS

COP1 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1

CRY CRYPTOCHROME = kriptokróm

CUL1 CULLIN 1

DET1 DE-ETIOLATED 1

ELF EARLY FLOWERING

ELIP EARLY LIGHT INDUCIBLE PROTEIN

ETR1 ETHYLENE RESPONSE 1

FAH1 FERULIC ACID 5-HYDROXILASE 1

FHL FH1-LIKE

FHY FAR RED ELONGATED HYPOCOTYL

FKF1 FLAVIN-BINDING, KELCH-REPEAT, F-BOX 1

FLC FLOWERING LOCUS C

FT FLORAL TRANSITION

GFP GREEN FLUORESCENT PROTEIN

GI GIGANTEA

GPX7 GLUTATION PEROXIDASE 7

HFR1 LONG HYPOCOTYL IN FAR-RED

HPT HYGROMYCIN PHOSPHOTRANSFERASE

HY5 LONG HYPOCOTYL 5

HYH HY5 HOMOLOGUE

JAR1 JASMONATE RESISTANT1

LAF1 LONG AFTER FAR-RED LIGHT 1 LHY LATE ELONGATED HYPOCOTYL

LKP2 LOV KELCH PROTEIN 2

LUC Photinus pyralis (szentjánosbogár) luciferáz LUX LUX ARRHYTHMO

PHOT PHOTOTROPIN = fototropin

PHY PHYTOCHROME = fitokróm

PIF PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR

PRR PSEUDO RESPONSE REGULATOR

RAN RAS RELATED NUCLEAR PROTEIN

RCC1 REGULATOR OF CHROMOSOME CONDENSATION 1

SRR1 SENSITIVITY TO RED LIGHT REDUCED 1

TIC TIME FOR COFFEE

TOC1 TIMING OF CAB 1

TT TRANSPARENT TESTA

UVH1 ULTRAVIOLET HYPERSENSITIVE 1

UVR UV RESISTANCE LOCUS

UVS ULTRAVIOLET SENSITIVE

WC WHITE COLLAR

YFP YELLOW FLUORESCENT PROTEIN

ZTL ZEITLUPE

BEVEZETÉS

A cirkadián órák az élővilág egészében elterjedt biokémiai időmérők. Működésükkel

nagymértékben segítik az élőlényeket a Föld tengely körüli forgása következtében

kialakult, ritmikusan változó környezethez való alkalmazkodásban. Különösen fontos ez

az alkalmazkodás a növények számára, hiszen egyfelől, mint helyhez kötött élőlények

különösen kiszolgáltatottak a kedvezőtlen tényezőknek; másfelől, a fotoszintézishez

szükséges energia minél hatákonyabb felhasználásához szükséges, hogy az

életfolyamataikat a fény napi eloszlásának megfelelően időzítsék. A cirkadián óra

segítségével képesek ezeket a folyamatokat a megfelelő időpontokra időzíteni, illetve a

kedvezőtlenekben gátolni. Ennek az „órarendnek” segítségével energiát takarítanak meg

és hatákonyabbá válnak (Dodd és mtsai, 2005).

A cirkadián óra hatékonysága függ attól, hogy mennyire van szinkronban az óra által

mért belső idő a külső környezet valós idejével. A szubjektív idő pontosításának

érdekében a cirkadián órát a külső környezet periodikus változásai – melyek közül

növényekben a fény a legfontosabb - képesek beállítani. A fény így kettős szerepet

játszik a növények életében, egyrészt a fotoszintézisen keresztül a fő energiaforrás,

másrészt a környezet állapotáról információt hordozó jel. A növények a fényt speciális

fehérjék, úgynevezett fotoreceptorok segítségével fogják fel. Az impulzus a jelátviteli

láncon keresztül eléri a cirkadián órát, ahol megváltoztatja a szintjét és/vagy aktivitását

egy vagy több órakomponensnek, ezáltal másik fázisba állítva azt (Kozma-Bognár és

Káldi, 2008). A vörös/távoli vörös fényelnyelésű fitokrómok, illetve a kék fényelnyelésű

kriptokrómok szerepe a cirkadián óra fotoreceptoraként már bizonyított Arabidopsisban

(Somers és mtsai, 1998a; Devlin és Kay, 2000).

Az ultraibolya-B (UV-B, 280-315 nm) sugárzás természetes része a Föld felszínét

elérő napfénynek. A felszínt elérő UV-B sugárzás igen változatos fiziológiai folyamatokat

vált ki a növényekből. A legismertebbek azok, amiket összefoglalóan stresszhatásoknak

nevezünk (DNS-, és fehérjekárosodás, reaktív oxigéngyökök felhalmozódása, lipid

BEVEZETÉS 4 __________________________________________________________________________________________

peroxidáció) (Jansen és mtsai, 1998). Azonban van egy másik, kevésbé ismert hatása is,

az alacsony intenzitású UV-B fotomorfogenikus hatással is rendelkezik (gátolja a

hipokotil megnyúlását, serkenti a sziklevél növekedését, illetve a flavonoid

felhalmozódást (Ulm és mtsai, 2004; Brown és mtsai, 2005; Oravecz és mtsai, 2006;

Stracke és mtsai, 2010). Vagyis a növények ugyanúgy környezeti jelként érzékelik ezt a

sugárzást, mint a fényspektrum látható részét.

Munkánk során az alacsony intenzitású UV-B kapcsolatát vizsgáltuk a cirkadián

órával. Eddig semilyen adat nem volt arról, hogy a fénynek ez a természetes

komponense befolyásolja-e a cirkadián óra működését, illetve, hogy a cirkadián óra

szabályozza-e az UV-B által kiváltott élettani folyamatokat.

SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS

Ritmikus folyamatok

Az élővilágban általánosan megfigyelhetőek olyan folyamatok, melyek időben

ismétlődnek, ritmikusak. Ezeket az élő rendszerekben megjelenő periodikus

folyamatokat csoportosíthatjuk az ismétlődésük gyakorisága szerint. Ultradián

ritmusoknak nevezzük a latin ultra diem (egy napon túli) kifejezés alapján azokat,

melyek naponta többször ismétlődnek, Ilyenek például az agyhullámok

(tizedmásodperc), a szívverés (~ egy másodperc), a légzés, a madárdal, a tücsökciripelés

(néhány másodperc), az ember alvásszakaszainak ismétlődése (90 perc), vagy a

csíranövények hipokotiljának köröző mozgásában egy kör megtétele (néhány óra). Más

folyamatok sokkal ritkábban, csak több nap alatt ismétlődnek. Ilyenek például a

gerincesek menstruációs ciklusai (rágcsálók: 3-5 nap, ember: 25-35 nap), vagy azok a

leghosszabb biológiai ritmusok, melyek évente csak egyszer ismétlődnek, mint a

vándormadarak költözése, vagy a téli álmot alvó állatok nyugalmi időszaka. Ezeket

infradián ritmusoknak nevezzük (latin infra diem, egy nap alatti). A kettő között

találhatóak azok a folyamatok, melyek megközelítőleg naponta ismétlődnek, amelyeket

ezért cirkadián ritmusoknak hívunk (latin circa diem egy nap körüli). A cirkadián

ritmusok nagyon elterjedtek, szinte minden a fény érzékelésére képes élőlényben

megfigyelhetők.

Cirkadián ritmusok

Alapismeretek, alapfogalmak

Összefoglalóan napszakos ritmusról beszélünk, ha egy jelleg természetes viszonyok

között 24 órás gyakorisággal ismétlődik. A cirkadián ritmusoknak azonban van néhány

SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS _____________________________________________________________________________________________________

6

olyan jellemvonása, ami megkülönbözteti őket az egyszerű, a környezeti jelek által

vezérelt napszakos ritmusoktól.

A cirkadián ritmusok nemcsak ciklusosan változó körülmények (pl. fény/sötét vagy

hőmérséklet ciklusok) hanem állandó körülmények között is több cikluson keresztül

fennmaradnak. Ilyenkor kialakul a cirkadián ritmusokra jellemző saját periódus, mely

közelítőleg, bár soha nem pontosan 24 óra. Az ilyen ritmust szabadon futó ritmusnak

nevezzük.

A cirkadián ritmusok ugyan külső környezeti jelek nélkül is fennmaradnak, de

azokkal beállíthatóak. A beállítás során a ritmus belső időzítése (szubjektív idő) a külső

környezet idejéhez (objektív idő) igazodik. A cirkadián órát beállító két legfontosabb

tényező a fény/sötét átmenet, illetve a meleg/hideg szakaszok periodikus váltakozása.

Az óra érzékenysége a beállító jelekre azonban nem egyforma a nap folyamán, hanem

hullámzó mintázatot mutat. A belső óra ugyanis a bemeneti elemek cirkadián

szabályzásával bizonyos napszakokra korlátozza a saját beállíthatóságát. Ezt a jelenséget

hívjuk kapuzásnak (gating).

A cirkadián ritmusok hőmérséklet-kompenzáltak, azaz képesek ellensúlyozni a

hőmérséklet kémiai reakciókat befolyásoló hatását. A biokémiai folyamatok

sebességének hőmérsékletfüggését az ún. Q10 érték mutatja. Ez azt fejezi ki, hogy egy

adott folyamat sebessége hányszorosára növekszik, ha a hőmérsékletet 10 ⁰C-al emeljük.

Az átlagos biokémiai folyamatok Q10 értéke 2-4 közötti, a cirkadián periódusoké

azonban csak 0,8-1,2. Ennek köszönhetően a szabadon futó ritmusuk tág hőmérsékleti

határok között is csak kis mértékben változik.

A természetben ugyan soha nincsenek állandó fény- vagy hőmérsékleti viszonyok,

mégis a kutatásban sokszor alkalmazzuk ezt a kísérleti elrendezést. Ilyen körülmények

között ugyanis a környezet hatása elhanyagolható, a ritmus jellegét kizárólag a cirkadián

rendszer belső törvényszerűségei alakítják. Ebben az egyszerűsített vizsgálati

rendszerben a szabadon futó ritmusok tanulmányozásával könnyebben megérthetjük a

cirkadián szabályozásban résztvevő mechanizmusokat.

A cirkadián ritmusokat az alábbi fogalmakkal tudjuk leírni, amelyeket

legegyszerűbben egy vázlatos ábrán lehet szemléltetni (1. ábra).


7

1. ábra. Egy cirkadián ritmus jellemző paraméterei

Az ábrán egy cirkadián óra által szabályozott folyamat mérhető tulajdonságait tüntettem fel az idő

függvényében. A beállító fényviszonyokat fekete ill. fehér sávok jelölik. Folyamatos fényviszonyok között a

névleges (szubjektív) éjszaka vagy nappal fogalmával azt fejezzük ki, hogy ekkor következne a beállító

fény/sötét váltásoknak megfelelő napszak. Kísérleteink során az utolsó beállító nappal kezdetétől

számítjuk az eltelt időt. Periódusnak nevezzük két egymást követő összehasonlítási pont, pl. csúcs időbeli

távolságát. A cirkadián ritmus maximuma és minimuma közötti különbség fele az amplitúdó, vagy kitérés.

A ritmus átlagos szintje a kitérések alapvonalának távolsága a függőleges tengely 0 pontjától. A ritmus

fázisa azt mutatja meg, hogy a cirkadián körön belül hol tartózkodik a rendszer. Ezt rendszerint a hullám

csúcsidejének és egy viszonyítási időpontnak a különbségeként adjuk meg.

A periódus egy jelleg ismétlődési gyakoriságát jelenti. Ha a jelleg kifejeződését az idő

függvényében ábrázoljuk, akkor a periódust a hullámmintázat két azonos pontjának (pl.

az egymást követő csúcsoknak) időbeli távolsága adja meg. A szabadon futó cirkadián

ritmusok periódusa általában 15-38 óra (cirkadián tartomány). A periódus egy-egy

körben különbözhet, a gyakorlatban ezért több csúcs távolságából számolunk egy

átlagot. A ritmus fázisa azt mutatja meg, hogy a cirkadián körön belül hol tartózkodik a

rendszer. Ezt rendszerint a hullám csúcsidejének és egy viszonyítási időpontnak (az

utolsó beállító fény kezdetének) a különbségeként adjuk meg. A hullám amplitúdója a

maximum és a minimum közötti különbség fele. Az amlitúdó egy-egy kör során eltérő is

lehet, miközben a periódus változatlan marad. A ritmus átlagos szintje a kitérések

alapvonalának távolsága a függőleges tengely 0 pontjától. Névleges éjszakaként vagy


8

nappalként tüntetjük fel folyamatos körülmények alatt a beállító fény/sötét váltásoknak

megfelelő időszakokat. Ezzel azt fejezzük ki, hogy ekkor következne a megfelelő

napszak. Kísérleteink során az utolsó beállító nappal kezdetétől számítjuk az eltelt időt.

Mérési módszerek

A szabadon futó körülmények között mérhető periódus a legtöbb élőlényben függ az

alkalmazott fény erősségétől (Aschoff, 1979). Növényekben ez a viszony fordított: minél

erősebb a fény, annál rövidebb a periódus. A periódus fényerősségtől való függését úgy

vizsgáljuk, hogy az azonos módon beállított növényeket eltérő erősségű állandó fénybe

helyezzük néhány napra, majd a kialakuló periódust az alkalmazott fényerősség

függvényében ábrázoljuk. Az így kialakuló fényerősség-függés görbe (FRC, Fluence Rate

Curve) segítségével szerezhetünk ismereteket a különböző hullámhosszú és erősségű

fényben működő fényérzékelő rendszerek érintettségéről.

A cirkadián órát be lehet állítani egyetlen fényvillanással is. Ez lényegében azt jelenti,

hogy a központi óra valamely kulcselemének működését a fény közvetlenül vagy

közvetve befolyásolja, például ideiglenesen megemeli annak szintjét. Az óra fázisától

függően ez késést vagy sietést okozhat. Ez a kettős válasz az alapja a beállíthatóságnak

(2. ábra, A mező), amelynek során a túl gyorsan vagy túl lassan futó belső óra a külső

környezet idejéhez igazodik.

Korábban már említettem, hogy az óra saját beállíthatóságát cirkadián szabályozás

alatt tartja. Ennek köszönhetően az óra a nap nagy részében szinte teljesen érzéketlen a

beállító fényjelekre, míg a legnagyobb fáziscsúszásokat a névleges éjszaka alatt lehet

kiváltani. A természetben ilyenkor nincs fény, ezért valójában az óra a napfelkelte

és/vagy a naplemente idején a legérzékenyebb a beállításra. A természetben e két

időpontban változik legnagyobb mértékben a fény erőssége (és színösszetétele), ezért ez

a két legbiztosabb pont a nap folyamán, amelyekhez igazodni lehet. Az egyéb

időpontokban fellépő ideiglenes, nem kiszámíthatóan bekövetkező környezeti

változások (pl. egy felhő eltakarja a napot) cirkadián szempontból nem hasznosak, így

érthető, hogy az óra a nappal során érzéketlen a beállító jelekre.

Ha a szabadon futó óra fázisát különböző időpontokban adott, azonos erősségű és

időtartamú fénypulzussal állítjuk be, és a tapasztalt fáziscsúszást az adott fényvillanás

idejének függvényében ábrázoljuk, megkapjuk az ún. fázisválasz görbét (PRC, Phase


9

Response Curve; Johnson, 1992). A különböző hullámhosszú és erősségű

fénypulzusokkal előállított fázisválasz görbék alakja eltérő. Általában erősebb

fényvillanásokkal nagyobb fáziscsúszásokat lehet kiváltani, mint gyengébbekkel (2. ábra,

B mező).

2. ábra. A fény hatása a cirkadián órára

(A) Az óra beállításának alapja, hogy egy órakomponens működését, pl. szintjét egy fényvillanás

ideiglenesen meg tudja változtatni (itt növelni). Attól függően, hogy a pulzus melyik fázisban éri az órát,

sietést vagy késést vált ki (B). A sietéseknek és késéseknek a fénypulzus idejének függvényében való

ábrázolásával kapjuk a fázisválasz görbét (PRC, Phase Response Curve). Erős villanásokkal nagyobb

fáziscsúszásokat lehet kiváltani, mint gyengébbekkel (C). Egy adott gén kifejeződésének vizsgálatából

készíthetjük el a kapuzási görbét. Szabadon futó ritmus: fekete görbe, egy-egy fényimpulzust követő

kifejeződési változások: narancssárga vonalak, az indukciók egy azonos pontját (például maximumát)

összekötő vonal a kapuzási görbe: piros vonal.

Az óra kapuzó szabályozási mechanizmusa nemcsak az óra beállíthatóságának

érzékenységében nyilvánul meg. Régóta ismert, hogy a cirkadián óra által szabályozott

gének egy része egyben közvetlen fényszabályozott is, tehát a fény a fényérzékelőkön

keresztül, az órát kikerülve közvetlenül képes ezeknek a géneknek a kifejeződését


10

szabályozni. A fénynek ezt a gyors, közvetlen hatását akut válasznak nevezzük. A

cirkadián óra a kapuzási mechanizmus révén képes a fázisának megfelelően gátolni a

fényre adott akut válasz erősségét, ami az óra fázisának megfelelően csökkenti, vagy

növeli az adott folyamat fényérzékenységét. A gátló hatás tehát maga is cirkadián

ritmust mutat. A szabadon futó periódusú növényt különböző időpontokban azonos

erősségű és időtartamú fényfelpulzusokkal kezelve, és a kezelés után egy-egy ilyen

kettős szabályzású gén megemelkedett szintjeit az idő függvényében ábrázolva kapjuk

az adott gén kapuzási görbéjét (2. ábra, C panel).

A cirkadián óra

Cirkadián órának nevezzük azt a belső időmérő mechanizmust, amely a külső

környezettől függetlenül is képes a cirkadián ritmusok létrehozására, fenntartására és

irányítására. A cirkadián óra három fő részből épül fel: főrezgőkör, vagy központi

oszcillátor, bemenet (input) és kimenet (output). Vázlatos felépítését a 3. ábra

szemlélteti.

3. ábra. A cirkadián óra vázlatos felépítése

Működés szempontjából a cirkadián órát három egységre bonthatjuk. A főrezgőkör, amely a környezettől

függetlenül képes ismétlődő mintázat létrehozására, legalább egy serkentő és egy gátló folyamatból álló

negatív visszacsatoláson alapul. A hullámmintázat létrejöttének feltétele a visszacsatolás késleltetése. A

főrezgőkör ugyan képes a környezettől függetlenül is működni, de az alkalmazkodás szempontjából az is

fontos, hogy a belső ritmus a külső, természetes ritmusra hangolódjék. A naponkénti órabeállítást a

környezeti jeleket érzékelő molekulák, és a hozzájuk kapcsolódó jelátviteli elemek főrezgőkörhöz való

csatolása teszi lehetővé (bemenet). Az órát sokféle környezeti jellel be lehet állítani, de a két

legjelentősebb a fény és a hőmérséklet. A létrehozott ismétlődő mintázat a kimeneti jelátviteli utakon

keresztül nyilvánul meg a különféle élettani folyamatokban, amelyek a génkifejeződéstől kezdve a

szervmozgásokig minden szinten megfigyelhetők.


11

A központi oszcillátor felépítése

A központi oszcillátor egy olyan mechanizmus, amely a külső környezettől

függetlenül képes a ritmus létrehozására és fenntartására. Az oszcillátor elemei (az ún.

óragének ill. órafehérjék) negatív visszacsatolás útján szabályozzák önmaguk és egymás

kifejeződését, működését. A negatív visszacsatolás lényege, hogy egy elem több lépcsőn

keresztül végül a saját működésének gátlását idézi elő. A cirkadián órák működésének és

a 24 órás periódus kialakításának alapvető feltétele a késleltetés, amelynek révén az

egyes órafehérjék mennyisége csak a megfelelő óragén indukciója után több órával éri el

a maximumát. Ennek hiányában a szabályozó ciklus jóval rövidebb idő alatt futna körbe,

mint egy nap.

Hagyományosan azokat az elemeket tekintjük a főrezgőkör részeinek, amelyek

törlése vagy folyamatos működése minden megfigyelhető ritmus megszűnéséhez vezet,

szintjük vagy működésük cirkadián módon hullámzik, továbbá amelyek szintje vagy

működése a fény és egyéb beállítójelek által pillanatszerűen megváltoztatható, és ez

egyben minden megfigyelhető ritmus fázisának átállítódásához is vezet.

Az óra kapcsolata a külvilággal (bemenet, input)

A cirkadián óra létezésére a napszakos változások előrejelzése miatt van szükség. A

belső ritmus külsőhöz való igazítását a környezeti jeleket érzékelő jelátviteli rendszerek,

és a központi oszcillátor kapcsolata teszi lehetővé. Ezt az összeköttetést biztosító

jelátviteli rendszert hívjuk a cirkadián óra bemenetének. A legfontosabb beállító jel a

fény és a hőmérséklet, amelyek meghatározott pontoknál befolyásolják az óraelemek

működését.

Számos esetben kimutatták, hogy saját bemeneti elemeinek működését a cirkadián

óra szabályozza. Modellek tanúsága szerint ez a fajta szabályozás erőteljesebbé teszi a

rezgést (Roenneberg és Merrow, 1998), ezen kívül pedig biztosítja az óra

beállíthatóságának bizonyos napszakra való korlátozását (kapuzás).

Azokat a komponenseket tekintjük a cirkadián óra bemeneti elemeinek, amelyek

elrontása csak az óra működésének környezettől (pl. fénytől) való függését változtatja

meg, de nem szünteti meg a ritmust. Így például megváltozhat a periódus, a hullám

tartóssága (lecsengés), de a ritmus nem szűnik meg.


12

Az óra kimeneti elemei által szabályozott folyamatok (output)

Azokat a jelátviteli utakat, amelyeken keresztül az óra a különféle életfolyamatokat

vezérli az óra kimeneteinek nevezzük. Cirkadián szabályozás a génkifejeződéstől a

viselkedésig minden szinten megfigyelhető. Cianobaktériumokban az összes promóter

működése cirkadián szabályozás alatt áll (Liu és mtsai, 1995), és növényekben is a gének

89%-ának kifejeződése változik valamilyen napszakos mintázat szerint (Michael és

mtsai, 2008). A különböző gének kifejeződési csúcsai (fázisai) ugyan lefedik az egész

napot, mégis a hasonló szerepet betöltő gének időzítése ugyanazon napszakra,

legtöbbjük vagy a napfelkelte vagy a naplemente környékére esik (Harmer és mtsai,

2000; Michael és mtsai, 2008). A génkifejeződéshez hasonlóan az összes többi cirkadián-

szabályozott folyamat is a számára legmegfelelőbb napszakra időzítődik. A központi

oszcillátor értelemszerűen csak egyféle fázissal rezeg, az ettől eltérő fázisokat módosító

kimeneti elemek közbeiktatásával lehet létrehozni (fázisátalakítók). Az eltérő

hullámformák kialakulásáért is módosító kimeneti elemek felelősek.

Azokat az elemeket tekintjük az óra kimenetének, amelyek elrontása nem szünteti

meg a ritmusképzést, és nem változtatja meg a periódust sem, hanem csak egyes

ritmusok kifejeződésére van hatással.

Az Arabidopsis cirkadián órájának modellje

A központi óramű felépítése

A közelmúltban végzett kísérletek és a matematikai modellek szerint az Arabidopsis

központi oszcillátora három – óragének és termékeik által alkotott – összekapcsolt,

negatív visszacsatoláson alapuló szabályozóhurokból épül fel (4. ábra). Az elsőként

azonosított hurok három összetevőből áll. A TIMING OF CAB 1 (TOC1), vagy más néven

PSEUDO RESPONSE REGULATOR 1 (PRR1) egy esti kifejeződésű, cirkadián-szabályozott

gén (Somers és mtsai, 1998b). A sejtmagban elhelyezkedő TOC1 fehérje közvetett

módon serkenti a két reggeli MYB-szerű transzkripciós faktor, a CIRCADIAN CLOCK

ASSOCIATED 1 (CCA1) és a LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) génjének kifejeződését

(Alabadi és mtsai, 2001). A CCA1 és LHY olyan szokatlan felépítésű, MYB-elem tartalmú

DNS-kötő fehérjék, amelyek a DNS-en aszimmetrikus nukleotidsorrendet, az ún. esti

elemet (EE), (AAATATCT) ismerik fel (Harmer és mtsai, 2000). Az mRNS-ek és fehérjék


13

cirkadián módon hullámzanak, reggeli csúcsokkal. Kifejeződésük fénnyel serkenhető.

Szerepük részben átfed: a két gén bármelyikének túltermelése minden vizsgált ritmus

megszűnését (Schaffer és mtsai, 1998; Wang és Tobin, 1998), hiánya a ritmusok

periódusrövidülését okozza (Green és Tobin, 1999; Mizoguchi és mtsai, 2002); együttes

hiányuk csaknem teljes ritmustalansággal jár (Ding és mtsai, 2007a). Közvetlenül

kötődnek a TOC1 promóteréhez és gátolják annak működését (Alabadi és mtsai, 2001).

Ennek a kölcsönös szabályozásnak köszönhetően a TOC1 és a CCA1/LHY gének cirkadián

kifejeződése ellentétes fázisú. A matematikai modell egy ismeretlen X elem jelenlétét is

feltételezi, amely a TOC1 fehérje és a CCA1/LHY gének között helyezkedik el, feladata az

utóbbi gének serkentése. Ez a lépés magyarázná a jelentős időbeni eltérést a TOC1

fehérje maximális mennyisége, és a CCA1/LHY gének maximális átíródása között (Locke

és mtsai, 2005). Elképzelhető, hogy ezt a szerepkört az EARLY FLOWERING 3 (ELF3)

és/vagy az ELF4 molekulák töltik be (Locke és mtsai, 2005), mivel hiányukban a

CCA1/LHY kifejeződése drámaian lecsökken (Doyle és mtsai, 2002; Kikis és mtsai, 2005).

Az ELF3 és ELF4 gének kifejeződése cirkadián mintázatú, az ELF4-é ráadásul

fényérzékeny is. A fehérjék sejtmagiak, és nem tartalmaznak egyetlen ismert

fehérjeelemet sem.

Az újabb kutatások szerint a CCA1 HIKING EXPEDITION (CHE) fehérje lehet egy

összekötő elem a CCA1 és a TOC1 között. A CHE egy TCP transzkripciós faktor ami in

vivo képes kötődni a CCA1 promóterében lévő TBS (TCP binding site) szekvenciához

(GGNCCCAC). A CHE fehérje gátolja a CCA1 átíródását, míg a CCA1/LHY fehérjék a CHE

promóterében lévő CBS (CCA1 binding site) elemhez (AAAAATCT) kötődve gátolják a

CHE átíródását, ezzel egy kis szabályzókört alkotva. A CHE in vivo képes kölcsönhatásba

lépni a TOC1 fehérjével, így azt a CCA1 promóter egy adott területére irányítani

(Pruneda-Paz és mtsai, 2009).

Az eredeti egyhurkos modell azonban olyan fontos kísérleti eredményekre nem

tudott magyarázatot adni mint az, hogy a cca1 lhy dupla mutáns nem veszti el teljesen a

ritmikusságát. A továbbfejlesztett modellben már egy esti időzítésű hurok is szerepel.

Ennek lényeges összetevője egy ismeretlen Y elem, amelynek szerepe a TOC1 gén

kifejeződésének serkentése. Az Y gént a modell alapján mind a TOC1, mind pedig a

CCA1/LHY gátolja (Locke és mtsai, 2005). Egyes adatok szerint az Y tényező egy részéért

a GIGANTEA (GI) lehet a felelős (Locke és mtsai, 2006; Locke és mtsai, 2005), mások


14

azonban csak áttételes szerepet tulajdonítanak a GI fehérjének ebben a tekintetben (Kim

és mtsai, 2007; Martin-Tryon és mtsai, 2007; Sawa és mtsai, 2007). A GI (Fowler és

mtsai, 1999; Park és mtsai, 1999) egy nagy méretű sejtmagi fehérje (Huq és mtsai,

2000), amely nem tartalmaz ismert fehérjeelemet. A GI mRNS és fehérje mennyisége

cirkadián módon hullámzik, kora esti csúcsokkal (David és mtsai, 2006). A gi növényben

az LHY és CCA1 gének kifejeződése erősen csökkent, ami arra utal, hogy a GI a megfelelő

LHY és CCA1 szint kialakításában játszik szerepet.

4. ábra. A növényi cirkadián óra modellje

A jelenlegi elképzelés szerint a központi rezgőkör három egymáshoz kapcsolt, negatív visszacsatoláson

alapuló szabályozó hurokból épül fel. A „reggeli” hurkot a CIRCADIAN CLOCK REGULATED 1 (CCA1) és a

LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), valamint a PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7 és 9 (PRR7,9)

fehérjék és génjeik alkotják. A CCA1/LHY fehérjék közvetlenül serkentik a PRR7/9 gének átíródását, míg a

PRR-ek közvetett módon gátolják a CCA1/LHY géneket. Az „esti” hurok tagjai a PRR-családba tartozó

TIMING OF CAB 1 (TOC1) és a GIGANTEA (GI). Az GI ismeretlen módon serkenti a TOC1 gén kifejeződését,

míg a TOC1 fehérje szintén ismeretlen módon gátolja a GI gént. A két hurok több ponton is egymáshoz

kapcsolódik: a TOC1 egy feltételezett X elemen keresztül serkenti a CCA1/LHY géneket, míg a CCA1/LHY

fehérjék közvetlenül a TOC1 promóteréhez kapcsolódva gátolják annak működését. A CCA1/LHY nem csak

a TOC1, hanem a GI, valamint saját génjeik kifejeződésére is gátlólag hat. A sárga villámok jelölik az adott

gének fényindukált átíródását. Az ábra eredeti verziója a Harmer által 2009-ben közölt összefoglaló

cikkből származik (Harmer, 2009).


15

Az Arabidopsis génállománya négy TOC1-hez hasonló gént tartalmaz, cirkadián

mintázatú kifejeződésük csúcsa különböző napszakokra esik (Matsushika és mtsai,

2000). Legkorábbi a PRR9, majd sorban következik a PRR7, PRR5, PRR3, végül az esti

TOC1/PRR1. A TOC1 és PRR5 hiánya rövid, a PRR7 és 9-é hosszú periódust okoz

(Eriksson és mtsai, 2003; Somers és mtsai, 1998b; Yamamoto és mtsai, 2003). A PRR3, 5,

7, 9 fehérjék, valamint a TOC1 az amino-végükön a baktériumok kételemű jeltovábbító

rendszerének jelfogó tagjára jellemző fehérjeelemet tartalmaznak. Az ilyen molekulák

nem közvetlenül szabályozzák az átírást, hanem feltételezhetően egyéb segédfehérjéken

keresztül (Ben-Naim és mtsai, 2006). A TOC1-re hasonlító gének mindegyikéről

kimutatták, hogy közük van a cirkadián órához, noha az egyszeres mutánsaik cirkadián

fenotípusa nem túl feltűnő (Eriksson és mtsai, 2003; Farré és mtsai, 2005; Kaczorowski

és Quail, 2003; Nakamichi és mtsai, 2005a). A többszörös mutánsok azonban már

súlyosabban sérültek (Farré és mtsai, 2005; Nakamichi és mtsai, 2005a). A

legszélsőségesebb a prr5/prr7/prr9 mutáns, amelyben megszűnik mindenféle ritmus

(Nakamichi és mtsai, 2005b).

A toc1 null mutáns növényekben viszont határozott cirkadián ritmus mérhető, és

mivel a TOC1 közös komponense mindkét korábban leírt szabályozó körnek, ezért

mutációja esetén aritmia várható. Ezek az eredmények ismét arra utaltak, hogy egy

további szabályozó hiányzik. Ennek leírása 2006-ban következett be, mikor többszörös

mutánsok, ill. túltermelő vonalak vizsgálatával kimutatták, hogy a harmadik szabályozó

kört a CCA1/LHY valamint a PRR7 és PRR9 gének/fehérjék alkotják. A CCA1/LHY

fehérje serkenti a két reggeli kifejeződésű gén, a PRR7 és 9 kifejeződését, a PRR7 és 9

fehérje viszont (a TOC1-hez hasonlóan közvetetten) gátolja a CCA1/LHY géneket. Ez a

negatív visszacsatolás egy reggeli szabályozó hurkot alkot (Locke és mtsai, 2006;

Zeilinger és mtsai, 2006).

Mutánsok vizsgálatával igazolták, hogy a reggeli és esti szabályozó körök

önmagukban is képesek oszcilláció létrehozására, de ezen ritmusok periódusa

jelentősen rövidebb a vad típusú óráénál. Ez azt jelenti, hogy a vad típusú növényekben

mérhető kb. 24 órás periódus azáltal alakul ki, hogy a két rövid periódusú hurok

összekapcsolódik egymással a központi szabályozó körön keresztül. Mivel a CCA1/LHY,

PRR9 és GI gének átíródása fényérzékeny, gyakorlatilag mindhárom szabályozó hurok


16

rendelkezik fénybemenettel, amelyen keresztül a különböző fotoreceptorok által

továbbított fényjelek hatással lehetnek az egyes szabályozó körök működésére.

Több olyan óraelem is ismert, amelynek hatása az órára jelentős, mégsincs benne a

modellben. Ilyenek például a LUX ARRHYTHMO (LUX), amelynek hiányában teljes

ritmustalanság tapasztalható (Hazen és mtsai, 2005; Onai és Ishiura, 2005). A LUX egy

háromtagú géncsalád egyik eleme, egy MYB-szerű DNS-kötő elemmel rendelkező

transzkripciós faktor, amely szükséges a CCA1/LHY megfelelő szintjének kialakításához

és a TOC1 ritmusának kialakulásához. A LUX a TOC1-hez hasonlóan szabályozódik, mivel

a CCA1/LHY a promóterében levő esti elemhez kötődve gátolja a kifejeződést. A

BROTHER OF LUX ARHHYTMO (BOA) a géncsalád egy másik tagja, túltermelése

jelentősen megnyújtja a periódust. In vivo képes serkenteni a CCA1 átíródását, míg a

CCA1/LHY fehérjék a LUX-hoz hasonlóan gátolják a BOA kifejeződését, így egy alhurkot

kialakítva (Dai és mtsai, 2011).

A bemeneti oldal elemei

Ahogy azt már korábban kifejtettem, a cirkadián óra nyújtotta előnyök

érvényesüléséhez a belső időnek azonos fázisban kell lennie a valós idővel. Mivel a

szabadon futó cirkadián ritmusok periódusa nem pontosan 24 óra, ezért a szétcsúszás

elkerülése érdekében az órát naponta hozzá kell igazítani a külső időhöz. A beállítást

különböző környezeti tényezők (leginkább a fény és a hőmérséklet) változása váltja ki,

amelyet az erre érzékeny receptormolekulák fordítanak le biokémiai jelekre. Az

érzékelők a jelet ezután a hozzájuk kapcsolt jelátviteli hálózaton keresztül juttatják el a

központi oszcillátorhoz. A jel az órafehérjék szintjét vagy működését oly módon

változtatja meg, hogy az a cirkadián kör egy másik fázisára lesz jellemző. Az óra ezután

ettől a ponttól folytatja tovább működését. Ez a beállítás molekulaszintű magyarázata.

A főrezgőkör egyes elemei fényérzékenyek. Ezek azok a belépési pontok, amelyeken

keresztül a beállító fényjelek elérik az órát. Így például a fény serkenti a CCA1/LHY (Kim

és mtsai, 2003a; Wang és Tobin, 1998) és a PRR9 (Makino és mtsai, 2001), valamint az

ELF4 (Kikis és mtsai, 2005) és a GI (Locke és mtsai, 2005) gén kifejeződését, ugyanakkor

a CCA1 mRNS lebomlását (Yakir és mtsai, 2007) és az LHY mRNS lefordítását is (Kim és

mtsai, 2003a). A fény az átírás utáni szinteken is befolyásolja az óra működését. A GI és a


17

ZTL fehérje például csak sötétben bomlik, a kék fény meggátolja ezt a folyamatot (Kim és

mtsai, 2007; Kim és mtsai, 2003b; Yu és mtsai, 2008).

Fényérzékelők

A cirkadián órát a fény nem a fotoszintézis fényelnyelő és energia-átalakító

rendszerén, hanem speciális fényérzékelő-fehérjéken keresztül szabályozza. Ezek a

fehérjék a fényt a hozzájuk kötött jellegzetes (kromofor) molekulák segítségével nyelik

el. A kromofor molekulák fényelnyelés által kiváltott szerkezetváltozása torzulásra

kényszeríti az őket megkötő fehérjéket is, ami elindítja a jelátvitelt. A fényérzékelőket az

általuk elnyelt fény hullámhossza alapján három nagy csoportba oszthatjuk (Chen és

mtsai, 2004).

1. vörös/távoli vörös fényt érzékelő fitokrómok (Bae és Choi, 2008; Kevei és mtsai,

2007)

2. UV-A és kék tartományban elnyelő kriptokrómok, fototropinok és a ZTL-család

tagjai (Briggs, 2007; Briggs és Christie, 2002; Briggs és Huala, 1999; Cashmore

és mtsai, 1999; Christie, 2007; Kim és mtsai, 2007; Lin és Shalitin, 2003)

3. UV-B fényérzékelő molekulák (Jenkins, 2009; Rizzini et al, 2011)

Jelenlegi tudásunk szerint a fototropinok nem vesznek részt a cirkadián óra

szabályozásában. Az UV-B érzékeléssel pedig a - dolgozat témája miatt - külön fejezetben

foglalkozom.

A fitokrómok olyan, ~125 kDa molekulatömegű hisztidin kináz-szerű fehérjék,

amelyek amino-végi fehérjeeleméhez kovalensen kötődik egy nyílt láncú tetrapirrol

természetű fitokromobilin molekula. Ezen kromofor fényelnyelési tulajdonságainak

köszönhetően a fitokrómoknak két alakjuk van: a vörös fényt elnyelő, élettanilag

hatástalan Pr (λmax=660 nm), valamint a távoli vöröst elnyelő, hatásos Pfr (λmax=730 nm).

A fitokrómok a sejtben Pr alakban képződnek, majd vörös fény elnyelésekor átalakulnak

Pfr alakba. Ez az alak távoli vörös fény hatására képes visszakerülni az eredeti Pr

állapotba, amelybe egyébként idővel sötétben magától is visszaalakul. A fitokrómok

dimer alakban működnek, a párbaállásért felelős elem a molekula közepén helyezkedik

el. A fitokrómok sötétben a sejtplazmában helyezkednek el, fény hatására pedig a

sejtmagba vándorolnak, ahol közvetlenül transzkripciós faktorokhoz kapcsolódva


18

fényfüggő gének kifejeződését szabályozzák (Kevei és mtsai, 2007). A fitokrómokat

Arabidopsisban öt gén kódolja, a PHYA, -B, -C, -D és -E. Az egyes gének által kódolt

fehérjék szekvenciája ugyan nagymértékben hasonlít egymásra, a köztük lévő kis

különbségek azonban eltérő működéssel ruházzák fel őket. A fitokrómok működésük

alapján két csoportba sorolhatók: az I-es csoport tagjai (Arabidopsisban csak egy van, a

PHYA) fényben gyorsan lebomlanak, így legnagyobb mennyiségben a sötétben csírázó

(föld alatti) és sötétben nőtt növényekben találhatók meg (Furuya, 1989; Furuya és

Schäfer, 1996). E tulajdonságok egyértelműen meghatározzák a PHYA szerepét:

elsősorban a csírázás megindításában és nagyon gyenge fényben a zöldülés

szabályozásában vesz részt. A II-es csoportot a többi (PHYB–E) gén terméke alkotja.

Ezek a fehérjék fényben nehezebben bomlanak, ezért a zöld növények uralkodó

fitokrómjai. Többek között a zöldülés folyamatát, a szár megnyúlását, az

árnyékelkerülést és a virágzást szabályozzák. A II-csoport tagjai képesek egymással

heterodimereket képezni. (Sharrock és Clack, 2004).

A kriptokrómokat elsőként növényekben azonosították, majd állatokban is leírták

szerepüket a cirkadián óra működésében (Cashmore és mtsai, 1999). Növényekben

elsősorban a kék/UV-A-függő élettani folyamatok (pl. zöldülés, virágzás, fényfüggő

génkifejeződés) szabályozásában játszanak szerepet. Amino-végükön egy FAD és MTHF

kromofort kötő fotoliáz-szerű, karboxi-végükön pedig egy szerin/treonin kináz

fehérjeelemet tartalmaznak (Lin és Shalitin, 2003). Sötétben a molekula csukott

állapotban van, a karboxi-végi elem elfedi az amino-végen található jelátvivő elemet. Kék

fény hatására a kromoforkötő elem szerkezetváltozása következtében a molekula saját

magát foszforilálja. Ennek hatására az amino-végi elem szabaddá válik, lehetővé téve a

jelátviteli molekulákkal való kölcsönhatást (Shalitin és mtsai, 2003; Yu és mtsai, 2007b).

A kriptokrómok sejtmagi elhelyezkedésűek. Arabidopsisban két eltérően viselkedő

kriptokrómot azonosítottak, amelyeket a CRY1 és a CRY2 gének kódolnak. A két fehérje

fényérzékenysége különbözik: kék fény hatására a CRY2 (foszforilálódás után)

ubikvitinálódik és lebomlik, míg a CRY1 fehérje szintje nem változik (Yu és mtsai,

2007a). Ennek megfelelően a CRY2 szerepe gyenge, míg a CRY1-é inkább erősebb

fényben fontosabb.

Az egyedi fitokróm- és kriptokrómhiányos (phyA, phyB, cry1, cry2), illetve ezek kettős,

hármas és négyes mutánsainak vizsgálata során sikerült meghatározni, hogy az egyes


19

fényérzékelők milyen mértékben vesznek részt az óra fénybemenetének

szabályozásában (Yanovsky és mtsai, 2001). A kísérletek során a beállított növényeket

folyamatos gyenge fénybe helyezésük után különböző színű fénypulzusokkal kezelték és

a levélmozgás ritmusában bekövetkező fáziscsúszást mérték. A kísérletek kimutatták,

hogy a PHYA a távoli vörös- és kék, a CRY1 és CRY2 a kék, a PHYB pedig a vörös fény

érzékelésében vesz részt. A phyA/phyB kétszeres mutánsban csökkent, de nem szűnt

meg a vörös fényre adott fázisválasz, ami további fényérzékelők (PHYC–E) szerepére

utal.

Növényekben a szabadon futó cirkadián ritmus periódusa a fény erősségének

növelésével csökken (Aschoff-szabály) (Aschoff, 1979). A fényérzékelők hiánya a

fényerősség csökkenéséhez hasonlóan a folyamatos fényben megfigyelhető periódus

megnyúlásával jár. Az egyes érzékelők hiánya csak az általuk elnyelt hullámhossz-

tartományban és jellegzetes fényerősségnél mutatkozik meg. Az egyes fotoreceptorok

periódusra gyakorolt hatását Somers és munkatársai a különböző mutánsokban olyan

jelzőgén segítségével vizsgálták, amelyben a cirkadián óra által vezérelt CAB2 gén

promótere a szentjánosbogár luciferáz génjének kifejeződését szabályozta (Somers és

mtsai, 1998a). A kutatók kimutatták, hogy a phyA növényekben a CAB2:LUC jelzőgén

kifejeződésének periódusa gyenge vörös és kék fényben a vad típushoz képest hosszabb.

A phyB növényekben viszont erős vörös fényben figyelhető meg ugyanez a jelenség. A

PHYB mellett minden bizonnyal további fitokrómok is részt vesznek a vörös fény

érzékelésében, mivel a phyB növényekben továbbra is észlelhető a fény periódusrövidítő

hatása. Hasonló kísérletben igazolták a CRY1 és CRY2 fehérjék szerepét a kék fény

periódus hangolásában. Érdekes, hogy a phyA/phyB/cry1/cry2 mutáns továbbra is képes

a fényjelek továbbítására a cirkadián óra felé, miközben fotomorfogenikus képessége

gyakorlatilag nincs (Yanovsky és mtsai, 2000a). Eszerint az említett fényérzékelőkön

kívül mások (PHYC–E, ZTL-család) is szabályozzák az óra fénybemenetét.

A ZEITLUPE (ZTL), a LOV KELCH PROTEIN 2 (LKP2) és FLAVIN-BINDING, KELCH

REPEAT, F-BOX 1 (FKF1) egy újabb fényérzékelő fehérjecsalád tagjai. E fehérjék három

jellegzetes fehérjedomént tartalmaznak: LOV (Light, Oxigen, Voltage), F-box és Kelch.

Ezek együttes előfordulása egy molekulán belül sejteti a fehérjék működésének

mikéntjét. A LOV elemet eredetileg olyan baktériumfehérjékben azonosították, amelyek

különféle környezeti tényezők, pl. fény, redox állapot ill. feszültség érzékelésében


20

vesznek részt. Ilyen elemet tartalmaznak a fototropinok, valamint a fonalasgomba

cirkadián órafehérjéi, a WHITE COLLAR (WC) 1 és 2 is. A LOV-elem FMN redoxfestéket

(kromofort) köt, amelynek külső hatásra bekövetkező elektronszerkezeti változása teszi

lehetővé a fent említett környezeti jelek érzékelését (Crosson és Moffat, 2001). A

fototropinok, a WC fehérjék és az FKF1 LOV-elemeinek vizsgálatával sikerült kimutatni,

hogy ez a fehérjeelem általános (kék) fényérzékelőként működik (Cheng és mtsai, 2003;

Imaizumi és mtsai, 2003; Zikihara és mtsai, 2006). Az F-box elem olyan fehérjékre

jellemző, amelyek az ún. SCF (Skp1-Cul1-F-box) ubikvitin-ligáz együttes részeként más

fehérjék irányított lebomlásában működnek közre (Cardozo és Pagano, 2004; Ho és

mtsai, 2008; Kipreos és Pagano, 2000). Az F-box fehérjék felismerik a lebontandó

célfehérjéket és az ubikvitin-ligázhoz kapcsolják őket, ezzel biztosítva az ubikvitinnel

történő jelölés célzottságát. Arabidopsisban igen sok, mintegy 700 F-box tartalmú fehérje

található, amelyhez változatos fehérjefelismerő elemek társulnak (Xiao és Jang, 2000). A

Kelch viszont egy általánosan elterjedt, β-propeller szerkezetű fehérjefelismerő elem,

amelynek változékonysága lehetővé teszi a célfehérjék egyedi felismerését (Adams és

mtsai, 2000). Ez felépítés azt sugallja, hogy a ZTL család tagjai célfehérjék

fényszabályozott lebomlásában vesznek részt.

A ZTL gén elrontása a cirkadián ritmusok periódusának hosszabbodását okozza

(Somers és mtsai, 2000). A periódus a fényerősség függvényében erőteljesebben

változik, mint a vad hátterű növényben. Ez arra utal, hogy a ZTL a fénybemenet

gátlóeleme. A hosszú periódus sötétben is megfigyelhető. Az FKF1 a virágzás

nappalhosszúságtól függő szabályozásában kulcsszerepet játszó fehérje. A GIGANTEA

(GI) fehérjével együtt a CONSTANS (CO) gén kifejeződését gátló transzkripciós faktor, a

CYCLING DOF FACTOR1 (CDF1) lebomlását irányítja (Imaizumi és mtsai, 2005; Sawa és

mtsai, 2007). Az fkf1 mutánsban emellett a cirkadián ritmusok hullámalakja is

megváltozik, tehát ez a fehérje is hozzájárul a megfelelő óraműködéshez (Nelson és

mtsai, 2000). Az LKP2 túltermelése a ritmusok megszűnését okozza, míg mutációjának

nincs cirkadián fenotípusa. (Schultz és mtsai, 2001). Az LKP2 fehérjéről kimutatták, hogy

élesztő kéthibrid rendszerben (a ZTL-hez hasonlóan) összekapcsolódik a TOC1 és PRR5

fehérjével is, bár ezen kölcsönhatások élettani jelentőségéről még nem sokat tudunk

(Yasuhara és mtsai, 2004). A ZTL-család egyes fehérjéi önmagukkal illetve egymással

dimert képezve működnek (Yasuhara és mtsai, 2004). A fénybemenet és a főrezgőkör

közti kölcsönhatást szemlélteti az a tény, hogy a fitokróm és kriptokróm gének (PHYA, B,


21

D, E; CRY1, 2) kifejeződése cirkadián mintázatú (Tóth és mtsai, 2001). Ez lehet az alapja

annak a korábban már említett jelenségnek, hogy az óra a saját fényérzékenységét csak

bizonyos időszakokban kapuzza (lásd: fázisválasz görbe).

Az eddig leírt kísérleti eredményeket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a növényi

cirkadián óra fénybemenetében az egyes fényérzékelők a következő módon jutnak

szerephez: a PHYA, CRY1, CRY2, ZTL egyaránt részt vesznek a kék fénybemenetben, míg

a távoli vörös fény érzékelésére egyedül a PHYA képes. A PHYA, PHYB, PHYD és PHYE

egymást kiegészítve juttatja el a vörös fény hatásait az órához (Devlin és Kay, 2000). A

fényérzékelők egymás működését is befolyásolják. Leírták például, hogy a PHYA

megfelelő működéséhez vörös és kék fényben a CRY1 (Devlin és Kay, 2000), a CRY2

fehér fényben való működéséhez pedig a PHYB jelenléte szükséges (Más és mtsai, 2000).

Jelátviteli utak

Génkölcsönhatásokat feltérképező kísérletekből sikerült néhány olyan elemet

azonosítani, amelyek a fényérzékelők és a központi óraelemek közé helyezhetők. A

fotomorfogenezisben sérült constitutive photomorphogenic 1 (cop1) és de-etiolated 1

(det1) mutánsokban a vizsgált ritmusok periódusa állandó sötétben rövidebb (Millar és

mtsai, 1995b). Hatásuk a fényfejlődésre és a génkifejeződés genomszintű mintázatára

nagyon hasonló, ezért feltételezhetően ugyanabban a szabályozási egységben (E3

ubikvitin-ligáz együttes) működnek. Nemrég mutatták ki, hogy a COP1 az ELF3

fehérjével együtt felelős a GI fehérje ubikvitinálásáért és lebomlásáért, és ezt a

folyamatot a kék fény a CRY2-n keresztül gátolja (Yu és mtsai, 2008). A DET1 pontos

szerepét az órában nem ismerjük, csak annyit figyeltek meg, hogy hiányában az LHY

fehérje lebomlása felgyorsul (Song és Carré, 2005). Ez a hatás fényfüggetlen, így a DET1

nem is a fénybemenet, sokkal inkább a központi óramű része lehet. A FAR RED

ELONGATED HYPOCOTYL 1 és 3 (FHY1 és FHY3) hiányában távoli vörös fénnyel nem

állítható át megfelelően a fázis (Yanovsky és mtsai, 2001; Yanovsky és mtsai, 2000b), így

ezen fehérjék is nélkülözhetetlenek az óra megfelelő működéséhez. Az FHY3 ezen túl

részt vesz a beállító fényjelek kapuzásában is (Allen és mtsai, 2006).

A kriptokrómok eredendően a sejtmagban találhatók, a fitokrómok pedig fényfüggő

módon vándorolnak a sejtmagba. Ez arra enged következtetni, hogy a fénybemeneti

folyamatok korai lépései a sejtmagban játszódnak le, ahol a fényérzékelők közvetlenül,

vagy jelátvivő molekulákon keresztül szabályozzák a génkifejeződést. A fitokrómok


22

esetében a közvetlen kapcsolat különféle transzkripciós faktorokkal régóta ismert. Az

elsőként azonosított PHYB-vel kölcsönható fehérje a PHYTOCHROME INTERACTING

FACTOR 3 (PIF3) volt (Ni és mtsai, 1998). Később számos rokon fehérjét azonosítottak,

amelyek mindegyike kölcsönhat a fitokrómokkal, élettani szerepük azonban sokféle

(Castillon és mtsai, 2007; Josse és mtsai, 2008; Khanna és mtsai, 2004). A PIF3 egy bHLH

transzkripciós faktor, amely a bekapcsolt fitokrómhoz tapadva kötődik számos

fényszabályozott gén promóterében található ún. G-box mintázathoz (Martínez-García

és mtsai, 2000). Ilyen G-box mintázat található a CCA1 és LHY óragének promóterében is,

amelyekhez a PIF3 szintén képes kapcsolódni. PIF3-hiányos növényekben az LHY és

CCA1 gének fényválasza erősen csökken, ami arra utal, hogy a PIF3 fehérje szerepet

játszik a két óragén kifejeződésének fényszabályozásában. Ez a megfigyelés azt sugallta,

hogy az óra fázisának beállítása ezen az úton, a PIF3 közreműködésével történik.

Kiderült azonban, hogy a PIF3 egyáltalán nem vesz részt a cirkadián óra beállításában,

szerepe a fotomorfogenikus folyamatok szabályozására korlátozódik (Viczián és mtsai,

2005).

A TIME FOR COFFEE (TIC) szerepe elsősorban a cirkadián ritmusok erőteljességének

és periódusának fenntartásában van (Hall és mtsai, 2003). A TIC elrontása nem

egyformán hat minden kimenetre: egyeseknél periódus hosszabbodást, másoknál

rövidülést okoz. A TIC fényben és sötétben is szükséges a cirkadián óra megfelelő

működéséhez, valamint részt vesz a kapuzásban is. A TIC egy igen nagy méretű

növényjellegzetes sejtmagi molekula, ismert fehérjeelem (egy P-hurkon kívül) nem

található benne (Ding és mtsai, 2007b).

A SENSITIVITY TO RED LIGHT REDUCED 1 (SRR1) fehérjét egy olyan munka során

azonosították, amelynek célja fényszabályozott fejlődési folyamatokban résztvevő

elemek azonosítása volt (Staiger és mtsai, 2003). Az srr1 mutáns kevésbé érzékeny a

vörös fényre, és számos egyéb, PHYB-függő fényválasza is sérült. Igen valószínű, hogy az

SRR1 a fényszabályozásban a PHYB jelátviteli lánc részeként működik. Állandó

körülmények között az srr1 szabadon futó ritmusainak periódusa a vad típuséhoz képest

rövidebb. Az SRR1 kifejeződése vörös fény hatására megemelkedik, ami arra utal, hogy

az SRR1 az óra fényérzékenységének beállításában vesz részt. A fehérjében nem

található semmilyen ismert fehérjeelem, és a molekula működési módját sem ismerjük.

SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS ______________________________________________________________________________________________________

23

UV-B érzékelés és jelátvitel

UV-B: stresszfaktor és környezeti jel

Az ultraibolya-B (UV-B, 280-315 nm) sugárzás természetes összetevője a napfénynek.

Ugyan az ózonpajzs szűrő hatásaként számottevő mennyiségben csak a 295 nm–es

hullámhossz feletti része éri el a felszínt, azonban még ez a tartomány is képes

károsítani a DNS-t, a fehérjéket, és a lipideket; elősegíti a reaktív oxigén származékok

(ROS) keletkeződését (Brosché és Strid, 2003; Frohnmeyer és Staiger, 2003). Az

élőlényeknek ezért ki kellett fejleszteniük a védelmüket a káros UV-B sugárzással

szemben, és a javító mechanizmusaikat az általa okozott károk enyhítésére. A

magasabbrendű növények UV-B elnyelő fenolszármazékokat, és a ROS-ok

közömbösítésére antioxidánsokat halmoznak fel az epidermisz sejtjeikben (Bornmann

és mtsai, 1997), a DNS károk kijavításában pedig a többi élőlényhez hasonló,

fénystimulált DNS fotoliázaik játszanak szerepet (Britt, 2004).

Az UV-B által kiváltott válaszok nagyban függenek az intenzitástól, az időtartamtól és

a hullámhossztól (Brosché és Strid, 2003; Jenkins és Brown, 2007). Általánosságban, a

nagy intenzitású és rövid hullámhosszú UV-B stresszválaszokat indukál, míg az alacsony

intenzitású UV-B képes szabályzó folyamatokat kiváltani. Ilyenek például a

hipokotilmegnyúlás gátlása, a sziklevelek kiterülésének serkentése, illetve a

génkifejeződés szabályzásán keresztül többek között a flavonoid felhalmozódás

beindítása (Boccalandro és mtsai, 2001; Brown és mtsai, 2005; Frohnmeyer és Staiger,

2003; Kim és mtsai, 1998). Az alacsony intenzitású UV-B hatására stimulálódnak az UV

védelemben és az UV okozta hibák kijavításában közreműködő gének, ami így

akklimációt, adaptációt biztosít elsősorban az UV-B, de a stresszjelátviteli utak

kapcsoltsága miatt a kártevők, patogének ellen is (Brosché és Strid, 2003; Jenkins és

mtsai, 2001; Jenkins és Brown, 2007; Jansen és mtsai, 1998; Stratmann, 2003). Ezek a

szabályzó folyamatok nyilvánvalóan nem stresszválaszok, inkább hasonlóak az általános

fotoreceptorok (fitokrómok, kriptokrómok, fototropinok) által szabályozott

fotomorfogenikus folyamatokhoz.


24

Az UV-B fotomorfogenikus jellemzői

A két legjobban jellemzett, alacsony intenzitású UV-B által kiváltott fotomorfogenikus

folyamat a hipokotilmegyúlás gátlása (Ballaré és mtsai, 1995; Ballaré és mtsai, 1996;

Boccalandro és mtsai, 2001; Kim és mtsai, 1998) és a flavonoid bioszintézisben szerepet

játszó gének (elsősorban a kalkon–szintáz, CHS) indukciójának vizsgálata (Frohnmeyer

és mtsai, 1999; Jenkins és mtsai, 1997; Jenkins és mtsai, 2001). A kísérletek eredményei

azt mutatják, hogy ezek az UV-B által kiváltott folyamatok nem stresszválaszok és

nincsenek egyik, már korábban leírt fotoreceptor közvetlen szabályozása alatt sem:

Ezek a fotomorfogenikus folyamatok már egészen alacsony UV-B intenzitással

(kevesebb mint 0,1 μmol/m-2 s-1, kb. a napsugárzás UV-B tartalmának 1/40-ed része), és

igen rövid pulzussal (kevesebb, mint öt másodperc) kiválthatóak. Ez az intenzitás nem

váltja ki a stresszválaszokért felelős gének mérhető indukcióját.

A UV-B által kiváltott fotomorfogenikus génindukció mértéke nem arányos az UV-B

fény által képzett ciklobután pirimidin dimérek (CPD) mennyiségével (Frohnmeyer és

mtsai, 1999; Kalbin és mtsai, 2001).

A DNS hibajavításban mutáns növények, melyeket az UV-B hatására megemelkedett

stresszválaszok jellemeznek nem térnek el a vad típustól a hipokotilmegnyúlás

gátlásában, vagy a szíklevél kiterülés serkentésében (Boccalandro és mtsai, 2001; Kim és

mtsai, 1998). UV-B-vel együtt alkalmazott látható fényű megvilágítás a fotoliáz

aktiválásán keresztül csökkenti a DNS károsodást azonban a CHS gén UV-B indukcióját

megnöveli (Jenkins, 2009).

A nagy intenzitású UV-B által kiváltott stressz jelátvitelében a jázmonsav, az etilén és

a ROS-ok játszanak döntő szerepet (A-H-Mackerness és mtsai, 1999). Míg azonban a

JASMONATE RESISTANT 1, és az ETHYLENE RESPONSE 1 hiányos jelátviteli

mutánsokban UV-B besugárzás hatására a védelemben fontos gének indukciója valóban

alacsonyabb, a CHS-é nem változik (Jenkins, 2009).

Hasonlóan, míg az UV-B hatására bekövetkező védelmi gén indukció gátolható

antioxidáns adásával (Green és Fluhr, 1995; Surplus és mtsai, 1998), a CHS gén

indukciója nem (Jenkins és mtsai, 2001).


25

A CHS kifejeződés nem stimulálható reaktív oxigéngyökökkel sem Arabidopsis

sejtkultúrában (Jenkins és mtsai, 2001), sem növényekben (Desikan és mtsai, 2001);

(Gadjev és mtsai, 2006).

A már ismert fotoreceptorok mindegyike képes ugyan elnyelni UV-B-t és ezért

lehetséges receptorai annak, azonban a fotoreceptor mutánsok nem mutatnak csökkent

CHS indukciót alacsony intenzitású UV-B megvilágításra és a hipokotilmegnyúlás gátlása

is megmarad fitokróm, és kriptokróm mutánsokban (Ballaré és mtsai, 1991;

Boccalandro és mtsai, 2001; Suesslin és Frohnmeyer, 2003).

Mindazonáltal a fotomorfogenikus UV-B jelátvitel nem teljesen független a fény

jelátviteli utaktól. Az UV-B és a fitokróm B jelátvitel átfedően szabályozza a sziklevelek

kinyílását (Boccalandro és mtsai, 2001). Az UV-B által kiváltott CHS indukciót a PHYB

gátolja, míg az UV-A és a kék fény ismeretlen fotoreceptoron keresztül serkenti azt

(Wade és mtsai, 2001).

UV-B fotoreceptor?

A fenti kísérletek már jóideje felvetették annak lehetőségét, hogy a növényekben

megtalálható egy specifikus UV-B fotoreceptor. Az azonosítását megnehezíti, hogy

nagyon sok sejtben található anyag (pl. a nukleinsavak, a fehérjék, a fenolszármaszékok)

képes elnyelni UV-B-t. Tovább nehezíti a keresést, hogy az UV-B által kiváltott

folyamatoknak nincs olyan karakterisztikus jellemzője, mint például a fotoreverzió a

fitokrómoknál. A különböző UV-B által kiváltott folyamatok akciós spektruma is sok

esetben eltér egymástól, így ma sem tudni biztosan, hogy egyetlen érzékelő felelős az

UV-B válaszokért, vagy különböző rendszerek váltják ki őket. Az utóbbi mellett szól,

hogy Arabidopsisban egyes gének másként reagálnak a 280-290, illetve a 300-310 nm-es

hullámhossz-tartományra (Ulm és mtsai, 2004; Kalbina és mtsai, 2008).

Az ismert fotoreceptorok mind tartalmaznak egy nem fehérje jellegű kromofórt, ami

kulcsfontosságú a fényérzékelésben. Egyes festékmolekulák, mint például a redukált

pterinek, flavinok, vagy a p-kumarinsav képesek elnyelni UV-B-t, ezáltal lehetséges UV-B

érzékelő kromofórok (Galland, 1988a; Galland, 1988b; Imamoto és Kataoka, 2007).

Kísérletekkel sikerült azt is bebizonyítani, hogy hiányukban alacsonyabb az UV-B által

kiváltott antocianin termelés kukoricában (Khare és Guruprasad, 1993), csakúgy, mint a

hipokotilmegnyúlás gátlása paradicsomban (Ballaré és mtsai, 1995). Külsőleg bevitt


26

riboflavin hatására pedig több CHS fehérje, és nagyobb flavonoid felhalmozódás

tapasztalható petrezselyem szövetkultúrában UV-B fény hatására, míg a kék fény hatása

azonos marad. Azonban olyan Arabidopsis mutáns is mutat HY5 génindukciót melyben a

teljes fenilpropanoid-bioszintézis sérült, és az előbbi festékmolekulák hiányoznak

(Jenkins, 2009). Ezért továbbra sincs bizonyíték egy, az ismert fotoreceptorokhoz

hasonló, festékanyagot tartalmazó UV-B receptor létére.

Emlős sejtekben bebizonyosodott, hogy UV-B sugárzás következtében termelődött

ROS-ok képesek ligand független módon aktiválni a membránkötött tirozin kináz

receptorokat (Bender és mtsai, 1997; Herrlich és Bohmer, 2000). Ugyan a növényekben

nincsenek tirozin kináz receptorok, de vannak más receptor kinázaik (Johnson és

Ingram, 2005). Az elvi lehetőség tehát fennáll, azonban alacsony UV-B intenzitásnál

aligha termelődik elegendő ROS a fotomorfogenikus reakciókat kiváltó receptor

aktivációhoz, és a folyamat nem is lenne UV-B secifikus. A brasszinoszteroid receptor a

BRASSINOSTEROID INSENSETIVE 1 (BRI1) egy receptor-szerű kináz. Érdekesen a bri1

mutánsban néhány gén UV-B indukciója lecsökkent (Savenstrand és mtsai, 2004). Az

azonban vitatott, hogy ez mennyire UV-B specifikus; továbbá amennyiben a BRI1 lenne a

felelős az UV-B érzékeléséért azt várhatnánk, hogy az indukciók nemcsak lecsökkennek,

hanem teljesen el is tűnnek. Természetesen elképzelhető, hogy több receptor kináz

egymást kiegészítve játszik szerepet az UV-B érzékelésben.

Egy másik, szintén az emlős sejtekben vizsgált lehetőség az aril-hidrokarbon receptor

(AhR) lehetséges részvétele az UV-B jelátvitelben. Az aril-hidrokarbon receptor egy

bHLH/PAS transzkripciós faktor, inaktív formában a citoplazmában helyezkedik el,

szubsztrátkötés hatására a sejtmagba helyeződik, ahol a DNS-hez kötődve elősegíti

bizonyos gének kifejeződését. Az AhR egyik lehetséges szubsztrátja a FICZ

(6-formilindol[3,2-b]carbazol), ami triptofánból keletkezik UV-B sugárzás hatására

(Fritsche és mtsai, 2007). A sejten belüli triptofánszint csökkenése valóban az UV-B

indukálta génkifejeződés csökkenését eredményezi, azonban jelenleg nincs bizonyíték

az AhR meglétére növényekben.

Az aromás aminósavak –elsősorban a triptofán– azon tulajdonsága, hogy képesek

elnyelni UV-B-t, vetette fel a lehetőségét annak, hogy egy fehérje közvetlen UV-B

elnyelése válthatja ki az UV-B választ (Ballaré és mtsai, 1995; Ensminger, 1993;

Gerhardt és mtsai, 2005). Minden fehérje képes elnyelni UV-B-t, tehát potenciálisan


27

bármelyik lehet UV-B receptor, amennyiben az elnyelés elindít benne egy egyedi fizikai

vagy kémiai változást, ami az UV-B érzékelés kiindulása.

A triptofán UV-B elnyelési maximuma 280 nm, vagyis vagy egy különleges

fehérjekörnyezet szükséges az akár 300 nm feletti elnyeléshez, vagy egy UV-B elnyelő

kromofor lehet az, ami képes a gerjesztett állapotát átadni neki (Fluorescent Resonance

Energy Transfer, FRET).

A COP1 új funkciója

A fitokróm és kriptokróm fotoreceptorok kutatásához hasonlóan az áttörést az UV-B

fotoreceptor megtalálásához a molekuláris biológiai kísérletek, a mutáns izolálások,

genetikai szűrővizsgálatok hozták. Segítségükkel sikerült azonosítani több UV-B

érzékenységet okozó mutációt. Ezek legtöbbjében vagy a DNS hibajavítás sérült: UV

resistance 1 (uvr1) (Britt és mtsai, 1993), UV resistance 2 (uvr2) (Jiang és mtsai, 1997;

Landry és mtsai, 1997), UV resistance3 (uvr3) (Jiang és mtsai, 1997; Nakajima és mtsai,

1998), ultraviolet hypersensitive 1 (uvh1) (Harlow és mtsai, 1994), vagy az UV-B

védelemben fontos színanyagok forrása, a fenilpropanoid bioszintézis: transparent testa

4 és 5 (tt4, tt5) (Li és mtsai, 1993), ultraviolet sensitive (uvs) (Lois és Buchanan, 1994),

ferulic acid hidroxilase (fah1) (Landry és mtsai, 1995), UV tolerant 1 (uvt1) (Bieza és

Lois, 2001). Kliebenstein és munkatársai 2002-ben egy olyan mutánst izoláltak, (uv

resistance locus8, uvr8) mely érzékenyebb volt UV-B vel szemben, mint a flavonoid

bioszintézis mutánsok, és UV-B hatására nem mutatott CHS génindukciót (Kliebenstein

és mtsai, 2002). A további mutáns izolálási szűrővizsgálatok, melyeket CHS, illetve HY5

promóter-szentjánosbogár luciferáz jelzőgént hordozó növényeken végeztek további

uvr8 allélokat, illetve egy CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC1 (COP1) hiányos

mutánst eredményeztek.

A COP1 az egyik fő negatív szabályzója a fotomorfogenezisnek (Chen és mtsai, 2004;

Yi és Deng, 2005). A COP1 gátolja a fotomorfogenikus gének kifejeződését sötétben,

ezért a cop1 mutáns sok tekintetben a fényen nőtt növények jellemzőit mutatja. A COP1

fehérje három szerkezeti egységből, egy RING finger motívumból, egy coiled-coil

doménből és WD40 ismétlődésekből felépülő E3 ubikvitin ligáz. A COP9

szignaloszómával kölcsönhatva irányítja olyan pozitív faktorok mint a LONG

HYPOCOTYL 5 (HY5), HY5 HOMOLOGUE (HYH), LONG HYPOCOTYL IN FAR-RED (HFR1),

LONG AFTER FAR RED LIGHT 1 (LAF1) lebomlását a 35S proteoszómán keresztül (Chen


28

és mtsai, 2004; Yi és Deng, 2005). Megvilágítást követően a COP1 inaktiválódik, lassan

elhagyja a sejtmagot hagyva, hogy a HY5 és a többi transzkripciós faktor felhalmozódjon,

és elősegítse a fotomorfogenezist.

A fotomorfogenezisben betöltött negatív szabályzó funkciójával szöges ellentétben a

COP1 az UV-B válaszok pozitív szabályzója. Génchip kisérletekből kiderült, hogy sok, az

alacsony intenzitású UV-B által indukált gén kifejeződése jelentősen alacsonyabb cop1-4

mutánsban, és az egyik közülük éppen a HY5. A COP1 által szabályzott funkciók

majdnem felét a HY5 is szabályozza, vagyis a HY5 a COP1 jelátvitel kulcsszabályozója.

Tehát a COP1 és a HY5 a sejtmagban együttműködnek az UV-B válaszok kialakításában,

míg sötétben a COP1 hatására lebomlik a HY5. A cop1-4 mutáns UV-B stresszre

érzékenyebb a vad típusú növénynél, összhangban a védelemben szerepet játszó gének

csökkent UV-B indukciójával. Viszont kevésbé érzékeny mint a hy5, jóllehet ezt

magyarázhatja a az UV-B védelemben szerepet játszó gének magasabb alapaktivitása.

Fehér fény hatásával szemben UV-B (fény) elősegíti a COP1 sejtmagi akkumulációját

(Oravecz és mtsai, 2006).

Az UVR8 jellemzői

A kutatások szerint az Arabidopsis UVR8 kifejezetten UV-B válasz specifikus. Az uvr8

mutánsban hiányzik a HY5 és CHS gén UV-B indukciója, azonban megmarad az indukció

látható fényre, alacsony hőmérsékletre, és szaharózra is (Brown és mtsai, 2005).

Transzkriptóma analízis szerint alacsony intenzitású UV-B hatására vad típusú

növényben egy órán belül 377 gén kifejeződése növekedett, illetve 102 géné csökkent

legalább kétszeres mértékben. Az indukálódó gének 99.5%-a volt COP1 és 98.6%-a UVR8

függő, míg a csökkenést mutatók kivétel nélkül mind a két gén szabályozása alatt álltak

(Favory és mtsai, 2009). A növekedést mutató gének közül soknak szerepe van az UV

védelemben, mint például a flavonoid bioszintézis egyes enzimeinek, DNS fotoliázoknak,

oxidatív stresszt enyhítő, és fotooxidatív károsodást javító fehérjéknek. Ez jól

magyarázza, hogy miért mutat az uvr8 mutáns komoly nekrózist napfényen, noha UV-B

hiányában megkülönböztethetetlen a vad típustól. Az UVR8 az alacsony, (akár

0.1 μmol m-2 s-1) intenzitású UV-B közvetítője, egyetlen más komponens sem ismert, ami

UV-B specifikus lenne a fotomorfogenezisben.


29

Az UVR8 35%-os azonosságot mutat fehérje szinten az emberi REGULATOR OF

CHROMATIN CONDENSATION 1 (RCC1) fehérjével. Az RCC1 egy nukleotidcserélő

segédfehérjéje (guanin nucleotide exchange factor, GEF) a RAN kis GTP-kötő

fehérjéknek, amik például a sejtmagi transzportban, a sejtciklus szabályzásában, vagy a

mitózisban játszanak szerepet (Moore, 2001). Az RCC1-nek egy speciális hétlapátú

hajócsavart mintázó alakja van és ezt fehérje struktúrát kialakító aminósavak

konzerváltak UVR8-ban (Renault és mtsai, 1998). Ennek fontossága azonban vitatott,

mert a formai hasonlóság ellenére úgy tűnik, az RCC1 és az UVR8 különbözik funkcióban

és aktivitásban. Az UVR8-nak igen kicsi a nukleotidcserélő aktivitása, és míg az élesző

vagy emlős sejtek életképtelenek RCC1 hiányában (Moore, 2001), az Arabidopsis uvr8

mutáns UV-B hiányában megkülönböztethetetlen a vad típustól.

Az egyetlen funkcionális hasonlóság az RCC1, és az UVR8 között az, hogy mind a kettő

képes a kromatinnal (elsősorban a H2B hisztonnal) kölcsönhatni (Cloix és Jenkins,

2008). A kromatin immunoprecipitációs (ChIP) kísérletek alapján, úgy tűnik, az UVR8

kötődik egyes UV-B által indukált gének (HY5, MYB12) kromatinjához, míg másokéhoz

(HYH, CHS) nem. A kötődés a HY5 esetében nem csak a promóterrégióban (Brown és

mtsai, 2005), hanem a kódoló, illetve az 5’ és 3’ nem kódoló szakaszokon is megvalósul

(Cloix és Jenkins, 2008). A kölcsönhatáshoz UV-B nem szükséges.

A zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) jelölt UVR8 fehérje UV-B nélküli, fehér fényen

nőtt növényekben mind a citoplazmában, mind a sejtmagban megtalálható (Brown és

mtsai, 2005). öt perc alacsony intenzitású UV-B megvilágítás hatására jelentős sejtmagi

felhalmozódás indul meg (Kaiserli és Jenkins, 2007), melyhez elegendő az N-terminális

23 aminósav. Ez a szakasz nem tartalmaz nukleáris lokalizációs szignált (NLS), így

valószínűleg az UVR8 sejtmagi transzportjában szerepet játszó, NLS tartalmú fehérjével

való kapcsolódásért felelős, hasonlóan a PHYA és FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL

(FHY1), illetve FHY1 LIKE (FHL) által közvetített áthelyeződéséhez. A nukleáris export

szignált (NES) hordozó GFP-UVR8 konstrukció a citoplazmában helyezkedik el, azonban

rövid UV-B megvilágítás hatására ez is a sejtmagba vándorol (Kaiserli és Jenkins, 2007).

Az NLS-t hordozó pedig ugyan folyamatosan a sejtmagban található, azonban

funkcióképessége ellenére UV-B hiányában nem vált ki HY5 átíródást. Vagyis az UV-B

fény két lépcsőben hat az UVR8-ra, egyrészt a sejtmagi felhalmozódásán, másrészt az

aktivációján keresztül (Jenkins, 2009).


30

UVR8, a lehetséges UV-B fotoreceptor

Favory és munkatársai (Favory és mtsai, 2009) fluoreszcens fehérjék alkalmazásával

vizsgálták a COP1 és az UVR8 sejten belüli elhelyezkedését. Megállapították, hogy a

sárga fluoreszcens fehérjével (YFP) jelölt COP1 molekulák az UV-B megvilágítástól

függetlenül a sejtmagon belül, egyenlőtlenül helyezkednek el, csoportokban, sejtmagi

foltokat (nuclear body, specle) alkotva. A kék fluoreszcens fehérjével (CFP) jelölt UVR8

molekulák UV-B hiányában egyenletes sejtmagi elhelyezkedést mutattak, míg UV-B

megvilágítás hatására szintén foltokat alkottak, melyek helyzete jórészt egybeesett a

jelölt COP1 fehérjék pozíciójával. A közvetlen kölcsönhatás bizonyítására a kutatók egy

olyan módszert választottak, melyben a “kettévágott” fluoreszcens jelzőfehérje N-,

illetve C-terminális részeit illesztették külön-külön a vizsgálandó fehérjékhez. Ebben az

esetben csak akkor jön létre fluoreszcencia, ha a vizsgálandó fehérjék kölcsönhatásának

következtében a fluoreszcens fehérje két része kellő közelségbe kerül egymáshoz

(bimolecular fluorescent complementation, BiFC) (Kerppola, 2006). A kölcsönhatás ez

esetben szintén UV-B függő volt, megvilágítás hiányában alig volt észlelhető

fluoreszcencia. Mutáns alléleket használva kiderült, hogy a vizsgált UVR8 mutációk

mindegyike, és a legtöbb COP1 mutáció is megakadályozza a kölcsönhatást. A cop1eid6

mutánsban továbbra is létrehozható volt a kölcsönhatás, ami nem meglepő annak

fényében, hogy ebben a mutánsban nem sérült az UV-B kiváltotta flavonoid

felhalmozódás (Oravecz és mtsai, 2006). Ez arra utal, hogy a kölcsönhatás

szempontjából a COP1 WD40 ismétlődéseinek van nagyobb jelentősége, és nem a RING

finger doménnek. Tovább vizsgálva a kölcsönhatást sikerült immunoprecipitálni az

UVR8 fehérjét az YFP-vel jelölt COP1 molekula segítségével, pár percig UV-B-vel

megvilágított növényekből. A kísérletek során kiderült az is, hogy az UVR8 képes saját

magával is kölcsönhatásba lépni UV-B megvilágítástól függetlenül (Favory és mtsai,

2009).

A COP1-UVR8 kölcsönhatás létrejött in vitro úgy is, ha a jelölt fehérjéket hordozó

növényekből fehérjekivonatot készítettek, és azt világították meg UV-B-vel. Pontosabban

csak akkor, ha azt a kivonatot világították meg, amelyik az UVR8-at tartalmazta. Ez

bizonyította, hogy az UVR8 fehérjét tartalmazó kivonat UV-B megvilágítása szükséges és

elégséges feltétel az UVR8-COP1 kölcsönhatáshoz, jelezve, hogy ez az UVR8 elsődleges

válasza UV-B jelátvitelben.


31

A kölcsönhatás UV-B megvilágítás hatására élesztőben is létrejön. A különböző uvr8

és cop1 mutánsok a cop1eid6 kivételével szintén nem hatnak kölcsön, illetve a COP1

C-terminális 340 aminósavát (a WD40 ismétlődést) tartalmazó csonka fehérje UV-B

függő módon kölcsönhat az UVR8-al. Az UVR8 homodimereket nem denaturált tisztítás

után vizsgálva kiderült, hogy az UVR8 UV-B megvilágítás nélkül dimer formában

található, és UV-B megvilágítás hatására monomerizálódik. A monomerizáció igen gyors,

már öt másodperc megvilágítás után észlelhető és intenzitásfüggő, valamint nem

szükséges hozzá a COP1 fehérje. A dimer-monomer átalakulás élesztőben is megvalósul.

A mutáns, COP1-el nem kölcsönható UVR8 fehérjék nem formálnak dimereket sem.

Az UVR8 fehérje az RCC1-el összehasonlítva feltünően sok triptofánt tartalmaz, 14-et

a 4-el szemben. Ezek a triptofánok ráadásul valamennyien a feltételezett β-propeller

struktúra felszinén helyezkednek el. A fehérjestruktúra közepén a 233., 285. és 337.

pozícióban lévő triptofánok különösen érdekes fehérjekörnyezetben vannak.

Bármelyikük kicserélése funkcióvesztést okoz, a 285. triptofán fenilalaninra cserélése

pedig folyamatos dimer állapotot. Ez különösen érdekes, hiszen a dimerizációra való

képesség azt mutatja, hogy a molekula szerkezetét alig érinti az aminósavcsere, UV-B

érzékelésre mégis képtelen (Rizzini és mtsai, 2011).

Ezek a legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy az UVR8 a specifikus UV-B

fotoreceptor. Alighanem a molekulában található triptofánok, elsősorban a 285.

triptofán UV-B elnyelésének következtében jön létre az a molekulán belüli változás,

aminek eredményeként az UVR8 monomerizálódik, aktiválódik, majd kölcsönhatásba

lép a COP1 fehérjével, elindítva a jelátvitelt.

CÉLKITŰZÉSEK

A növényi cirkadián óra legfontosabb beállító tényezője a fény. A szabadon futó

ritmus periódusa fordított arányban áll fény erősségével, a fényimpulzusok pedig

képesek az óra fázisát átállítani. Intenzíven kutatott terület azon jelátviteli utak

vizsgálata amelyeken keresztül a fény kifejti a hatását a cirkadián órára. Ennek

köszönhetően igen sok információnk van arról, hogy a látható fény egyes komponensei

milyen fotoreceptorokon és jelátviteli elemeken keresztül befolyásolják az órát. Azonban

mostanáig nem volt adat arról, hogy a fiziológiai mennyiségben jelenlévő UV-B milyen

hatással van a növényi cirkadián órára.

Mostanáig még nem sikerült minden kétséget kizáróan egyetlen molekulához, vagy

molekulacsaládhoz kötni az UV-B érzékelést. Azt azonban már sikerült igazolni, hogy az

alacsony fényintenzitású UV-B által kiváltott fotomorfogenikus folyamatok

fotoreceptora az UVR8 fehérje. Annak vizsgálatára, hogy az UV-B fénynek az UVR8 által

szabályozott alacsony intenzitású része hogyan befolyásolja a cirkadián órát. Illetve

fordítva, a cirkadián óra hogyan szabályozza az UV-B által kiváltott folyamatokat az

alábbi célokat tűztük ki:

1. A cirkadián óra UV-B fénnyel való beállíthatóságának a vizsgálata

2. A cirkadián óra hatásának jellemzése az UV-B által kiváltott fényindukciókra

3. Az UV-B jelátvitel hatásának vizsgálata a kapuzásra

4. Cirkadián óra hiányában történő UV-B indukciók jellemzése

5. A Cirkadián óra szerepé nek vizsgálata az UV-B védelemben

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Kísérleti anyagok és élőlények

Tápoldatok, táptalajok, antibiotikumok, szelekció

Bakteriális táptalajok

LB (Luria-Bertani Medium) (pH=7.0): 1% tripton (Reanal), 0.5% élesztő kivonat

(Reanal), 1% NaCl (Reanal); táptalajhoz: 1.5% agar (Reanal)

YEB (pH=7.0): 0.5% marhahús kivonat (Difco) 0.1% élesztő kivonat, 0.5% Bacto® -

pepton (Difco), 0.5% szaharóz (Reanal), 2 mM MgCl2 (sterilre szűrve, autoklávozás után

hozzáadva; Reanal); táptalajhoz:1.5% Bacto® -agar (Difco).

Növényi táptalajok

MS3 (Murashige-Skoog Medium) (pH=5.6): 4.3 g/l MS (Murashige-Skoog sókeverék;

Sigma), 3% szaharóz, 1% agar (Reanal)

MS1 (Murashige-Skoog Medium) (pH=5.6): 4.3 g/l MS (Murashige-Skoog sókeverék;

Sigma), 1% szaharóz, 0,8% agar (Reanal)

MS0 (Murashige-Skoog Medium) (pH=5.6): 4.3 g/l MS (Murashige-Skoog sókeverék,

Sigma), 0,8% agar (Reanal)

AM (Arabidopsis Medium) (pH=5.6): 2.16 g/l MS (Murashige-Skoog sókeverék, Sigma)

1% szaharóz, 0.2% phytagel (Sigma)

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ______________________________________________________________________________________________________

34

A munkánk során használt, antibiotikumokat autoklávozás (120°C, 25 perc) és

60°C-ra hűtés után kevertük a tápoldatba, ill. táptalajba (1. táblázat).

Élőlény Antibiotikum Végkoncentráció (µg/ml)

Escherichia

coli

Ampicillin (Amp)

Kanamicin (Km)

Tetraciklin (Tet)

Kloramfenikol (Cm)

100

50

100

170

Agrobacterium

tumefaciens

Karbenicillin (Cb)

Kanamicin (Km)

Rifampicin (Rif)

100

50

25

Arabidopsis

thaliana

Higromicin (Hyg)

Klaforán (Cf)*

15

200

1. táblázat. Az alkalmazott antibiotikumok listája

* A klaforánt nem szelekciós célra használtuk az AM és MS táptalajokban hanem azért, hogy

csökkentsük a bakteriális eredetű fertőződés esélyét.

Baktériumok

A molekuláris klónozás során az Escherichia coli XL-1 Blue törzsét (Stratagene)

használtuk. A növénybe juttatandó plazmidokat először Escherichia coli S17-1 törzsbe

transzformáltuk be. Ez a törzs képes konjugációra a növényi transzformáció során

használt Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pPM90RK) (RifR) törzsével. Az utóbbi két

törzs Koncz Csaba laboratóriumából származik (Max-Planck Intézet, Köln).

Növények

Kísérleteinkben Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) és Wassilewskija (Ws) vad

ökotípusait; valamint a CCA1 túltermelő, CCA1-OX Col-0 ökotípusú növényvonalat

(Wang és Tobin, 1998) és az alábbi mutáns növényvonalakat vizsgáltuk (2. táblázat):


35

Vonal neve

Hivatkozás Mutáció típusa

Mutáció helye

Fnkcióvesztés foka

Háttér

uvr8-6 Favory és

mtsai, 2009 T-DNS inszerció 9. intron nullmutáns Col-0

cop1-4 McNellis és mtsai, 1994

pontmutáció Gln283STOP részleges mutáns Col-0

hy5-ks50 hyh Brown és

Jenkins, 2008 T-DNS

inszerció/deléció

HY5: promóter, első exon

HYH: első exon

kétszres nullmutáns

Ws

elf3-4 Hicks és mtsai,

1996 T-DNS

inszerció/deléció első exon nullmutáns Ws

2. táblázat. A használt mutáns növényvonalak jellemzői

Molekuláris biológiai módszerek

Riportergén konstrukciók készítése, transzgenikus növények

előállítása

A növények vizsgálatakor alkalmazott riportergén konstrukciókat (CCR2:LUC+,

HY5:LUC+ és UVR8:LUC+) Agrobacterium-közvetített géntranszfer (Clough és Bent,

1998) segítségével juttattuk be a mutáns és a megfelelő vad típusú növényekbe. A

riportergének expresszióját mindegyik háttér esetében (mutáns és vad típus) legalább

öt független transzformáns növényi vonalban vizsgáltuk meg. A vizsgált riportergén

kifejeződése minden azonos genotípusba tartozó transzgenikus növényi vonalban

hasonló mintázatot mutatott.

A vizsgált gének (CCR2, HY5, UVR8) promótereit Arabidopsis Col-0 változatának

genomi DNS-éből (a növényi genomi DNS tisztítását lásd: 39. oldal) sokszorosítottuk

PCR-rel, a kívánt restrikciós enzim hasítóhelyeket tartalmazó oligonukleotidok

segítségével. A PCR-ben hibajavító enzimkeveréket (Stratagene PfuUltra™ II Fusion HS)

használtunk a gyártó útmutatása szerint.

A restrikciós endonukleáz emésztéseket és egyéb DNS módosító kezeléseket a gyártó

(Fermentas) által megadott körülmények között végeztük, majd a termékeket agaróz


36

gélen (SeaKem® LE, Cambrex), elektroforézissel választottuk el. A megfelelő DNS

darabokat a gélből kivágás után fenolozással tisztítottuk. A darabok ligálását a T4 DNS

ligáz gyártójának (Fermentas) útmutatásai alapján végeztük. Az összeillesztett DNS-eket

Inoue módszere (Inoue és mtsai, 1990) szerint előkészített XL-1 Blue sejtekbe egy gyors

és hatékony módszerrel (Pope és Kent, 1996) juttattuk be. A plazmidot hordozó

baktériumsejtek kiválogatását a megfelelő antibiotikumot tartalmazó LB lemezeken

37 °C-on 16 órán át végeztük. A plazmidokat Escherichia coli sejtekből a hagyományos

lúgos feltárás módosított változatával tisztítottuk (Ahn és mtsai, 2000), amelyeket

azután restrikciós enzimekkel, majd szekvenálással ellenőriztünk.

A riportergén-konstrukciókban használt szentjánosbogár LUCIFERÁZ (LUC)

módosított (erősebb fénykibocsátású) változatának (LUC+) cDNS-ét a Promega cégtől

vásároltuk.

A CCR2:LUC+, a HY5:LUC+ és az UVR8:LUC+ jelzőgének létrehozásához a CCR2 kódoló

része előtti 2233 bp-nyi DNS darabot, a HY5 kódoló része előtti 565 bp-nyi DNS darabot,

illetve az UVR8 kódoló része előtti 2568 bp-nyi szakaszt sokszorosítottuk Arabidopsis

Col-0 változatából a következő primerek felhasználásával:

CCR2 pro F: 5’-CGCAAGCTTAAATCTTCTCCTTCATCACCGCATA-3’

CCR2 pro R: 5’-CGCGGATCCTGAAATTTGAAAAGAAGATCTAAGGGA-3’

HY5 pro F: 5’-AAAGAATTCTCTAATGTTAACGTTGAGATGGCAATG-3’

HY5 pro R: 5’-TTTGTCGACTTTTCTTACTCTTTGAAGATCGATCAGG-3’

UVR8 pro F: 5’-ATAGTCGAC TAGTTCTTAGTTTCTTGGTTCC-3’

UVR8 pro R: 5’-ATAGGATCC GATCACAGTTGCAGTTTTC-3’

A termékeket közvetlenül a növényi kétgazdás pPCVH LUC+ plazmidba klónoztuk

HindIII–BamHI (CCR2), EcoRI-SalI (HY5), illetve SalI–BamHI (UVR8) helyekre.

Az Arabidopsis transzformálására használt pPCV (Plant Cloning Vector) bináris

plazmidot Koncz Csaba csoportja fejlesztette ki (Koncz és mtsai, 1994). A pPCV bináris

vektor vázlata az 5. ábrán látható.


37

5. ábra. A pPCV növényi klónozó vektor szerkezete

A 7.5 kb méretű, Agrobacterium Ti-plazmid alapú vektor tartalmazza a jobb- és baloldali integrációs

határszekvenciákat (LB ill. RB), ezek közé építve a bakteriális replikációs origót (ORIColE1) és az

ampicillin/karbenicillin rezisztenciát okozó β-laktamáz kazettát (ApR), valamint a növényi szelekciót

lehetővé tevő – a higromicin rezisztenciáért felelős – higromicin-foszfotranszferáz (HPT) fehérjét

konstitutívan kifejező kazettát is. A plazmidba építettek egy, a molekuláris klónozást megkönnyítő, egyedi

DNS endonukleáz hasítóhelyeket hordozó régiót, amelyet 3’ irányban a nopalin szintáz gén

3’ poliadenilációs szignálja (Tnos) követ. A NOS szekvencia az expresszált mRNS megfelelő processzálását

irányítja növényben.

Agrobacterium konjugáció

Az elkészült bináris plazmid vektort Escherichia coli S17-1 törzsbe transzformáltuk,

majd 2 ml-es, ampicillinnel kiegészített LB folyadékkultúrában 16 órán át növesztettük.

Agrobacterium tumefaciens GV3101 törzséből YEB tápoldatban, 24 óra alatt szintén friss

folyadékkultúrát neveltünk. A két baktériumszuszpenzióból 1-1 ml-t összekevertünk és

YEB táplemezen együtt növesztettünk. 24 óra után a növekedésnek indult

baktériumtenyészetből kis mennyiséget rifampicin és karbenicillin tartalmú YEB

lemezre szélesztettünk, majd a felnövekvő rezisztens Agrobacterium-telepeket legalább


38

három alkalommal passzáltuk. Az E. colitól ilyen módon megtisztított Agrobacteriumot

használtuk Arabidopsis virág-infiltrációs transzformálásra (lásd:43. oldal).

Növényi DNS tisztítás

Körülbelül egy cm2 felületű levelet/levéldarabot folyékony nitrogénben

lefagyasztottunk, majd 1.5 ml-es Eppendorf csőben elporítottunk. A mintára 500 μl

60°C-ra előmelegített 2×CTAB puffert (2% CTAB, 100 mM Tris·HCl pH=8.0, 20 mM EDTA

pH=8.0, 1.4 M NaCl, 1% PVP 40, 0.5% β-merkaptoetanol) mértünk rá, majd többször

összerázva a csövet, 30 percig 65°C-on tartottuk. öt percnyi ülepítés után a

törmelékmentes felülúszót új csőbe pipettáztuk át és azonos térfogatú kloroformmal

ráztuk össze. A vizes és a szerves fázist 10 perc centrifugálással választottuk szét. A felső

vizes fázisból a nukleinsavakat 0.75 térfogatnyi 2-propanollal szobahőmérsékleten

10 perc alatt csaptuk ki, majd 10 perces centrifugálással ülepítettük. A csapadékot

70%-os etanollal mostuk, légszivattyúval megszárítottuk és 100 μl csíramentes TE

pufferben (10 mM Tris·HCl pH=7.5, 1 mM EDTA) feloldottuk. A mintát 10 μg RNáz-A

enzimmel kezeltük 37°C-on egy órán át, majd fenol-kloroform (1:1) elegyével ráztuk

össze. Centrifugálás után a vizes fázist kloroformmal is tisztítottuk, majd a vizes fázisból

a DNS-t 0.2 térfogatnyi 3 M nátrium-acetát pH=5.2 és 0.75 térfogatnyi 2-propanol

hozzáadásával szobahőmérsékleten 10 perc alatt csaptuk ki. Centrifugálásos ülepítés és

70%-os etanollal történő mosás után a csapadékot megszárítottuk és 100 μl csíramentes

TE-ben oldottuk fel. A mintából 1–2 μl-t használtunk egy PCR-hez.

Növényi RNS tisztítása

Össz-RNS-t ~100 mg, folyékony nitrogénben porított növényi anyagból a Qiagen

RNeasy® Plant Mini Kit-jével tisztítottuk (oszlopon történő RNáz-mentes DNáz

kezeléssel kiegészítve) a gyártó leírása alapján. A kapott RNS mennyiségét és minőségét

a minta 260 és 280 nm-en mért fényelnyeléséből határoztuk meg.

mRNS szint meghatározása RT-PCR-rel

Mérési pontonként ~20 db csíranövényből tisztítottunk össz-RNS-t. 0.5–1 µg RNS-ből

cDNS-t a Fermentas által gyártott RevertAid™ First-Strand cDNA Synthesis Kit

felhasználásával készítettünk a gyártó útmutatásainak megfelelően. A termékeket RNáz-


39

mentes vízzel ötszörösére hígítottuk. Az mRNS-ek szintjét valós idejű PCR-rel

ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) gépen, ABI SYBR® Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems) alkalmazásával 10 µl térfogatban határoztuk meg.

Minden kísérletnél készítettünk egy cDNS hígítási sort: UV-B-fénnyel kezelt vad

típusú növények a fénykezelés után 90 perccel gyűjtött mintáiból cDNS keveréket

készítettünk, amelyet 1-, 10-, 100-, 1000-szeresre hígítottunk. Ezekben megmértük a

kérdéses mRNS-ek szintjét. Az egyes primerpárokkal kapott értékekre egyenest

illesztettünk, amelynek meghatároztuk az egyenletét. Az ismeretlen mintákban az mRNS

szinteket ennek a hitelesítő egyenesnek a segítségével számítottuk ki. A kapott értékeket

a minták TUB2 és TUB3 össz mRNS-szintjére vonatkoztattuk. Minden mintát háromszor

mértünk meg. A sokszorozáshoz használt primerek az alábbiak voltak, amelyeket 0.3 µM

töménységben alkalmaztunk (3. táblázat).

Gén neve Forward primer (5’→3’) Reverse primer (5’→3’)

CCA1 (At2g46830) CTGTGTCTGACGAGGGTCGAA ATATGTAAAACTTTGCGGCAATACCT

PRR9 (At2g46790) GCCTTCTCAAGATTTGAGGAAAGC TTTGGCTCACCTGAAGTACTCTC

GI (At1g22770) AATTCAGCACGCGCCTATTG GTTGCTTCTGCTGCAGGAACTT

ELF4 (At2g40080) CGACAATCACCAATCGAGAATG AATGTTTCCGTTGAGTTCTTGAATC

CHS (At5g13930) TGAGAACCATGTGCTTCAGGCGGAG TGTCGACTTGTCGCACATGCGCT

GPX7 (At4g31870) GACAAGGTTGATGTGAATGGA GATGATATCACCAAGGAAACCA

ELIP2 (At4g14690) CTCCTATGAAACCTAAGGTGAG GCTAAACGTCCGTTAATCCT

HY5 (At5g11260) CAGGCGACTGTCGGAGAAAGTCAAAGG TCAACAACCTCTTCAGCCGCTTGTTCTC

HYH (At3g17609) GCCTCAAGAGATTATTGAGGA CTCTTGATTCCAAATCACTCAC

At3g16350 ATTCGACATACTAGTTCAAGCC CGATGAATCGGTTACCATCTC

At3g57830 TTACTATGCTGAGGACGAGAG GTGAAGGCAGAGTATTCGAG

TUB2/TUB3

(At5g62690/At5g62700) CCAGCTTTGGTGATTTGAAC CAAGCTTTCGGAGGTCAGAG

3. Táblázat Az RT-PCR reakciókban használt oligonukleotidok listája

A PCR körülményei az alábbiak voltak: 94°C 2.5 perc, 40×(95°C 15 mp, 60°C 1 perc),

95°C 15 mp, 60°C 1 perc, 95°C 15 mp, 60°C 15 mp.


40

Növényi összfehérje tisztítása

50–100 mg növényi anyagot folyékony nitrogénben lefagyasztottunk és 1.5 ml-es

csőben porrá őröltük. Az elporított mintára 300 μl/100 mg 60°C-ra előmelegített

feltárópuffert mértünk (4 M urea, 5% SDS, 5% β-merkaptoetanol, 16.66% glicerin). A

mintákat tovább őröltük addig, amíg nagyobb darabokat már nem láttunk az oldatban,

majd 60°C-os vízfürdőbe helyeztük őket 10 percre. Időnként erőteljesen összeráztuk a

csöveket. A törmeléket ezután centrifugálással ülepítettük 30 percig. A tiszta felülúszót

új csövekbe mértük át. Az így elkészített minták azonnal felvihetők poliakrilamid gélre.

Fehérjeszint meghatározása Western blot módszerrel

Mintánként 10μl fehérjekivonatot futtattunk 10%-os SDS-poliakrilamid gélen

Tris/glicin/SDS futattópufferben. Futtatás után a gélből 2×15 percen keresztül

átvivőpufferrel (12mM Tris·HCl pH=8.3, 96mM glicin, 20% metanol) mostuk ki az SDS és

urea maradványokat. A gélből az elválasztott fehérjéket elektroblot készülékkel (Bio-

Rad; 25V, 1h) átvittük Immobilon®-P PVDF (polivinilidén-difluorid) membránra

(Millipore). Az átvitel után a membránról levágtuk a belső kontrollt (aktin) tartalmazó

részt, majd a membránokat TBST pufferrel (20mM Tris·HCl pH=7.5, 150mM NaCl, 0.05%

Tween® 20) öblítettük át. A szabadon maradt kötőhelyeket kioltópufferrel (5% sovány

tejpor, 1% szérum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) TBST pufferben)

semlegesítettük 4°C-on egy éjszakán át. Ezután a membránokat műanyag zacskóba

helyeztük, amelyet (Dr Roman Ulm csoportja által készített) UVR8-, illetve az aktin elleni

elsődleges ellenanyag hozzáadása után lehegesztettünk. Az ellenanyagokat

kioltópufferben egy órán keresztül hagytuk a membránon, majd a membránt kivéve

3×5 perc TBST pufferben történő mosással távolítottuk el róla a felesleges ellenanyag

maradványokat. Ezután kioltópufferben 10000-szeresre hígított, alkalikus-foszfatázhoz

kapcsolt nyúl-IgG elleni másodlagos ellenanyagot (BioRad, 170-6518) adtunk hozzá, és

így tartottuk szobahőmérsékleten egy óráig. Ezt követően 3×10 percig TBST pufferben

mostuk. A felesleges folyadék leitatása után előhívó oldatban (100mM Tris·HCl pH=9.5,

100mM NaCl, 5mM MgCl2, 0.02% 5-Bróm-4-klór-3-indolil foszfát (BCIP),

0.03% Nitroblue-tetrazólium (NBT) tartottuk szobahőmérsékleten, míg a fehérjesávok

láthatóvá nem váltak. A reakciót vizes öblítéssel leállítottuk, majd a lapot megszárítottuk

és képet készítettünk róla.


41

Növényeken alkalmazott technikák

Magsterilizálás, növénynevelés

A sterilizálandó magokat vízbe áztatás után két napig 4°C-on tároltuk, majd 10 percig

30%-os Domestos oldatban áztattuk. Ezután steril desztillált vízzel ötször átmostuk,

majd a steril magokat táptalajra szélesztettük. Ezt követően a növényeket 12 h fehér

fény (50 μmol m-2 s-1)/12 h sötétben, 22°C-on neveltük steril körülmények között,

növénynevelő kamrában (MLR-350, Sanyo) hét napig.

Fénykezelések

A méréseket 22°C-on végeztük. A kísérletekben használt fehér fényt fluoreszcens

fénycsövek (PHILIPS TL-D 18W/33-640 biztosították, a megvilágítás intenzitása

10 μmol m-2 s-1 volt. A monokromatikus vörös (λmax=667nm), és kék (λmax=470nm)

fénypulzusokhoz Quantum Devices Inc (USA) Snaplite™ LED-eket alkalmaztunk. Az

alkalmazott fényintenzitások 40 μmol m-2 s-1 (vörös), és 25 μmol m-2 s-1 (kék) volt. Az

kísérleteinkbhez használt alacsony intenzitású (1.5 μmol m-2 s-1) UV-B-t PHILIPS

ULTRAVIOLET-B TL 20W/01 RS; a tolerancia teszthez alkalmazott nagy intenzitású

(14 μmol m-2 s-1) UV-B-t pedig PHILIPS ULTRAVIOLET-B TL 40w/12 RS fénycsövek

segítségével állítottuk elő ezen fénycsövek fénykibocsátását a 6. ábrán ábrázoltuk.

Kísérleteinkben az UV-B megvilágítást minden esetben fehér fénnyel együtt alkalmaztuk,

ezzel közelítve modellrendszerünket a külső környezetben tapasztalható

körülményekhez, hiszen a természetben sincsen UV-B látható fény nélkül.

A fényintenzitás méréséhez látható tartományban a Gigahertz-Optik cég X11

fénymérőjét használtuk XD-9504 mérőfejjel, míg az UV-B fényt a Cole-Palmer cég

fénymérőjével (katalógus szám: 97503-00), 312 nm-es szenzorral mértük.


42

Alkalmazott UV szűrők

A kísérletekben „alulvágó” (cut-off) filtereket alkalmaztunk. UV-B kezelésnek

alávetett mintáknál alkalmazott LP305 filter nem engedi át a fényforrásból származó

UV-C fényt, viszont átengedi az UV-B jelentős részét. A kontroll növények esetében

használt LP385 filter pedig kiszűri a teljes UV-B tartományt. A szűrőket a Rapp

Optoelectronic GmbH (Hamburg, Németország)-tól vásároltuk, jellemzőik a 7. ábrán

láthatóak.

6. Ábra. Az alkalmazott UV-B

fényforrások fénykibocsátási

spektruma

(A) A cirkadián és génindukciós

kísérletekhez alkalmazott PHILIPS

ULTRAVIOLET-B TL 20W/01 RS, illetve

(B) az UV-B stressztolerancia tesztben

használt PHILIPS ULTRAVIOLET-B TL

40w/12 RS fénycsövek hullámhossz

tartománya.

7. Ábra. A használt UV-B szűrők jellemzői

Fekete vonal:LP305, piros vonal: LP385.


43

Transzgenikus növények előállítása

A megfelelő pPCV alapú vektorkonstrukciót hordozó Agrobacterium törzset 300 ml,

100 µg/ml karbenicillint tartalmazó YEB tápoldatban növesztettük 25°C-on két napig

(OD600= 2.5-3.0), majd az Agrobacteriumot centrifugálással (4000 g, 20 perc, 25°C)

összegyűjtöttük és 3 ml YEB oldatban felszuszpendáltuk. Ezután folyamatos kevergetés

mellett 300 ml 3%-os (w/v) szaharózoldatot, végül 40 µl Silwet L-77-et (Lehle Seeds)

adtunk a szuszpenzióhoz. A transzformálandó, üvegházban nevelt Arabidopsis növények

teljes virágzatát 15 másodpercre a szuszpenzióba merítettük, majd a növényeket egy

napig letakarva, magas páratartalmat biztosítva, tartottuk. A felnevelt növényekről

magot gyűjtöttünk és a megfelelő szelekciós ágenssel és klaforánnal kiegészített AM

táptalajon steril körülmények között szelektáltuk a transzformánsokat (T1 nemzedék),

amelyeket, miután megfelelő erősségű gyökérzetet fejlesztettek (10-12 nap), földbe

ültettünk és üvegházban felneveltünk. Minden konstrukció esetében 20-30 független T1

transzformáns vonalat állítottunk elő. Vizsgálatainkat a T3 nemzedék transzgénre nézve

homozigóta, a transzgént egy kópiában hordozó egyedein végeztük.

In vivo lumineszcencia mérés luminométerrel

A luciferáz jelzőgéneket kifejező csíranövényeket 12 óra fény (50 µmol m-2 s-1) /12

óra sötét fénycikluson, 22°C-on neveltük MS3 táptalajon, hét napig. A mérés kezdete

előtt min. hat órával a csíranövényeket steril körülmények között egyenként egy 96

zsebes mikrotiter lemezbe helyeztük, amelynek minden zsebe 0.25 ml MS3 táptalajt

tartalmazott. Minden növényre 20 µl 2 mM-os luciferin oldatot cseppentettünk. A

méréseket TopCount® NXT™ automatizált luminométerrel (Perkin-Elmer) végeztük,

amely minden egyes - a mikrotiter lemez zsebeiben elhelyezett - csíranövény által

kibocsátott lumineszcenciát 1-2 óránként rögzítette, a mérési idő végéig (2-7 nap). A

mérés a csírázást követő 7. napon indult, a nevelés során alkalmazott fényciklusoknak

megfelelően a fény-sötét átmenet pillanatában. A mérés módjától függetlenül a

növények lumineszcenciáját az első 12 óra során (a nevelési körülményeknek megfelelő

éjszakai fázisban) sötétben mértük. Ezt követően a mintákat a mérés módjától függően

sötétben, illetve folyamatos fehér fényben tartottuk. A fényben mért minták csupán a

mérések alkalmával (egy-két óránként öt percre) kerültek a mérőtér sötétjébe, ami nem

befolyásolja a cirkadián óra működését (Millar és mtsai, 1995a). A mérési eredmények


44

feldolgozása a TopTempII nevű Microsoft Excel makro programmal (Dr. Andrew Millar,

University of Edinburgh, UK ajándéka) történt. A luminométer által mért lumineszcencia

értékek az egy másodperc alatt beérkezett fotonok számát (cps = count per seconds)

mutatják. Egy csíranövény által adott időpontban kibocsátott lumineszcencia értékét az

adott növény által a teljes mérés során kibocsátott lumineszcencia átlagával osztottuk el,

így kaptuk meg az adott időponthoz tartozó normalizált lumineszcencia értéket. Az

ábrákon –ha másképpen nem tüntettük fel– legalább 16 csíranövény (normalizált)

lumineszcencia értékéből számolt átlagértéket ábrázoltunk. az idő függvényében. Az

időtengely 0 pontja az utolsó sötét/fehér fény átmenet időpontja.

Periódus adatok számolása

A periódusok becslését a Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)

(Locke és mtsai, 2005; Southern és Millar, 2005) segítségével végeztük el. A Microsoft

Excel alapú makró képes a TopCount®NXT™ luminométer használata során nyert adatok

kiértékelésére. A program a „Fast Fourier Transform-Non-Linear Least Squares (FFT-

NLLS)” módszerrel (Plautz és mtsai, 1997) minden egyes növény adatsorára illesztett

görbe alapján ad becslést az egyedek periódusára. Minden kísérletben legalább 80,

legfeljebb 120 órás mérési időtartamból származó adatokat használtunk fel.

Csoportonként legalább 20 növény periódusának statisztikai elemzését BRASS

programmal végeztük el. A periódus középértékének becslése során csak azokat az

értékeket vettük figyelembe, amelyek 15 és 38 óra közé estek (cirkadián tartomány).

A fázis igazíthatóságának mérése (PRC)

A CCR2:LUC+ jelzőgént hordozó növényeket 12 óra sötét/12 óra fehér fény

(50 µmol m-2 s-1) váltásokkal állítottuk be hét napig, majd folyamatos sötétbe helyeztük

őket. Ezután háromóránként egyórás, ugyanolyan erősségű fénypulzusokat kaptak. A

pulzusok által kiváltott fáziscsúszást a pulzus időpontjának függvényében ábrázoltuk. A

különböző periódusú növények fázisainak összehasonlíthatósága érdekében a

fáziscsúszásokat a következő módon számítottuk ki: a kezelt növények új fázisát (a

folyamatos sötétbe helyezés után jelentkező harmadik cirkadián csúcs idejét) a

kezeletlen, folyamatosan sötétben mérődő növények fázisából kivontuk. A negatív

értékek jelzik ezért az óra késését, mert a csúcs későbbi időpontban van, mint a

kezeletlenben. A pozitív értékek a hamarabb érkező, siető csúcsot jelölik. Megmértük


45

továbbá az adott növényvonal folyamatos sötétben mérhető periódusát is. Ezt az értéket

elosztottuk 24-gyel, majd a kapott arányszámmal szoroztuk be az összes

fáziskülönbséget, valamint a pulzusok időpontjait is. Így minden értéket egy névleges

24 órás napon belül tudtunk feltüntetni (cirkadián idő). A fáziscsúszás hibáját a kezelt és

a kezeletlen növényekben mért fázisok középértékhibáiból (SEM) számoltuk ki az alábbi

képlet szerint:

A kapuzás (gating) vizsgálata

A csíranövényeket 12 óra fény (50 µmol m-2 s-1) /12 óra sötét fénycikluson, 22°C-on

neveltük MS3 táptalajon, hét napig, majd az utolsó sötét fázis után alacsony intenzitású

(10 μmol m-2 s-1) folymatos fehér fénybe helyeztük őket (ZT0 időpont). Harminchat

órával később másfélnapos időszakon (ZT36-ZT72) keresztül háromóránként

növényanyagot szedtünk az indukció nélküli mRNS szintek megállapításához. Minden

mintaszedés alkalmával egy-egy elkülönített növénycsoportot 30 perc, 1.5 μmol m-2 s-1

UV-B kezelésnek vetettünk alá. A kezelések után a növényeket visszahelyeztük a fehér

fénybe és a kezelés kezdetétől számított 90. percben leszedett mintáikból határoztuk

meg az indukált mRNS szinteket. A vörös fénnyel végzett kísérletnél a növények

folyamatos sötétbe kerültek, és oda lettek visszahelyezve a fényindukció

(60 perc, 40 μmol m-2 s-1) után.

UV-B tolerancia vizsgálata

A csíranövényeket 12 óra fény (50 µmol m-2 s-1) /12 óra sötét fénycikluson, 22°C-on

neveltük MS3 táptalajon hét napig, majd 12 óra alacsony intenzitású (10 μmol m-2 s-1)

fehér fénnyel kiegészített 1.5 μmol m-2 s-1 UV-B fény / 12 óra sötét fényciklusra

helyeztük át két napra. Az áthelyezés utáni harmadik napon, háromóránként egy-egy

elkülönített növénycsoportot nagy intenzitású (14 μmol m-2 s-1) UV-B besugárzásnak

vetettünk alá, míg a kontroll növényeket LP385-ös filterrel megszűrt fénnyel kezeltük. A

kezelések után a növényeket visszahelyeztük a kísérlet elején is alkalmazott

körülmények közé, majd hét nap után készítettük el a fotókat és szedtünk növényi

mintákat a klorofilltartalom meghatározásához.


46

Klorofilltartalom meghatározása

A klorofill méréshez mintánként 10-10 csíranövényt Eppendorf csőbe helyeztünk.

Lemértük a nedvestömegüket, majd 1-1 ml N,N-dimetilformamidot mértünk rájuk. A

mintákat időnkénti összerázással 24 órán keresztül sötétben, szobahőmérsékleten

tartottuk, majd lecentrifugáltuk. A növényi anyagtól mentes felülúszó abszorbanciáját

Shimadzu spektrofotométerrel 664 nm-en lemértük, és a klorofill mennyiséget ebből

számítottuk ki (Inskeep és Bloom, 1985) A klorofill mennyiségeket a nedves tömegek

mennyiségeivel arányosítottuk, és a kontrollhoz viszonyítva ábrázoltuk.

EREDMÉNYEK

Cirkadián óra beállíthatósága UV-B fénnyel

Az UV-B befolyásolja a cirkadián óra sebességét

Ismert biológiai tény, hogy a cirkadián rendszerek beállításában a (látható) fény

elsőrendű szerepű. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy a növények képesek-e

életfolyamataik időzítéséhez felhasználni a fotoszintézisben nem hasznosuló UV-B fényt.

Folyamatos fényben a mért periódus és az alkalmazott fény erőssége között fordított

összefüggés van (parametrikus beállítás; Devlin és Kay, 2000), emiatt a fényválasz görbe

(FRC, a periódus ábrázolása az alkalmazott fény erősségének függvényében)

meredeksége növényekben negatív.

A fényválasz görbe előállításához CCR2:LUC+ jelzőgént kifejező vad hátterű és uvr8-6

csíranövényeket állítottunk be 12 óra fény/12 óra sötét váltásokkal egy héten keresztül,

majd olyan azonos fényintenzitású fehér fénybe helyeztük őket, melyet két különböző

UV-B intenzitással egészítettünk ki. A csíranövények által kibocsátott fényt

luminométerrel rögzítettük, a kialakuló periódusokat a BRASS alkalmazással

számszerűsítettük, majd a fényerősség függvényében ábrázoltuk (8. ábra, A mező). A

kapott eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy vad típusban a periódus UV-B fény

intenzitásának emelkedésével csökken akárcsak látható fényben, míg uvr8-6

növényekben nem tapasztalható periódus változás.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

48

Annak eldöntésére, hogy az uvr8-6 növények fényválasza eltérést mutat-e a vad

típushoz képest a kísérletet elvégeztük különböző intenzitású fehér fénnyel is UV-B

hiányában (8. ábra, B mező). Megfigyelhető, hogy az uvr8-6 periódusa UV-B hiányában

nem tér el a vad típusétól sem sötétben, sem állandó fényben.

Hasonló kísérleti elrendezésben megvizsgáltuk az UV-B jelátvitel más elemei

hiányának a hatását is. Amint az a 4. táblázatban látható, a hy5 hyh dupla mutáns

periódusa nem tér el a vad típusétól fehér fényben és ahhoz hasonlóan körülbelül egy

órával rövidül a periódus az UV-B hatására. A cop1-4 periódusa a szakirodalomban

(Yu és mtsai, 2008) leírtaknak megfelelően nagyjából két órával rövidebb mint a vad

típusé és az UV-B periódus csökkentő hatására ugyanúgy érzéketlen, mint az uvr8-6. A

HY5:LUC+ jelzőgén periódusának UV-B hatására történő csökkenése pedig azt mutatja,

8. ábra. A CCR2:LUC+ jelzőgén

periódusának fényerősségtől való

függése

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet) és uvr8-6 mutáns (piros háromszög) háttérben CCR2:LUC+ jelzőgént kifejező hét napos csíranövényeket azonos fényerősségű fehér (10µmol m-2 s-1), de eltérő intenzitású UV-B fénybe (A), illetve különbözű intenzitású folyamatos fehér fénybe (B) helyeztük. A jelzőgén működését luminométerrel 5 napig követtük nyomon, az egyedi növények periódusait BRASS alkalmazással becsültük meg.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

49

hogy az UV-B a hatását a központi órán fejti ki, nem csak a CCR2 kimeneti elemet

befolyásolja.

4. táblázat. CCR2:LUC+ és HY5:LUC+ periódusa UV-B jelátviteli mutáns és vad hátterű

növényekben

A jelzőgének vizsgálatakor a csíranövények cirkadián óráját 12 óra fény/12 óra sötét váltásokkal

állítottuk be hét napon keresztül, majd folyamatos fehér (10 μmol m-2 s-1), illetve UV-B-vel

(1.5 μmol m-2 s-1) kiegészített fehér fénybe helyeztük őket. A luciferáz működését a szubsztrát

hozzáadása után luminométerben mértük öt napon keresztül. (A periódusbecslést a BRASS

alkalmazással végeztük.)

UV-B pulzusokkal a cirkadián óra késleltetése idézhető elő

A fény szükséges a periódus finomhangolása mellett a naponkénti órabeállításhoz is.

A cirkadián óra a nap egy bizonyos szakára korlátozza a saját beállíthatóságát,

legfőképpen a napfelkelte vagy a naplemente környékére. Ekkor legnagyobb ugyanis a

fényerősség változása, ami egy jó tájékozódási pont a beállításhoz. Érzékenységének

időzítését az óra saját bemeneti elemeinek cirkadián szabályozásával oldja meg (Lakin-

Thomas, 2000; Roenneberg és Merrow, 1998; Tóth és mtsai, 2001). A beállíthatóság

vizsgálatánál az állandó körülmények között, szabadon futó cirkadián órát érő

fénypulzusok által kiváltott perióduscsúszást mérjük. Vad típusú növényekben kék vagy

vörös pulzusok hatására jelentős fáziscsúszások történnek, leginkább a szubjektív

éjszaka során, amikor az egyre nagyobb mértékű késések sietésbe csapnak át, igen

jellegzetes fázisválasz görbét mutatva (Covington és mtsai, 2001).

Annak vizsgálatára, hogy a jelenség kiváltható-e UV-B fénnyel is, a CCR2:LUC+

jelzőgént hordozó vad típusú és uvr8-6 növényeket egy hétig 12 óra fény/12 óra sötét

cikluson tartottuk, majd alacsony intenzitású folyamatos fehér fénybe helyeztük át. Az

áthelyezés után 36 órával háromóránként 30 perces 1.5 μmol m-2 s-1 intenzitású UV-B

pulzussal kezeltük őket. Az egyes pulzusok által kiváltott CCR2:LUC+ fáziscsúszások

Periódus (óra) ±SEM

CCR2:LUC+ HY5:LUC+

Megvilágítás

Col-0 uvr8-6 cop1-4 Ws hy5 hyh Ws

fehér 25.36±0.18 25.21±0.13 22.07±0.14 25.97±0.13 25.83±0.17 27.25±0.26

fehér és UV-B 24.45±0.22 25.35±0.25 22.0±0.13 24.82±0.08 24.61±0.2 24.95±0.46

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

50

irányát és erősségét nem kezelt kontroll növényekhez viszonyítva kaptuk meg az

aktuális sietés/késés értékét, amit a fénypulzusok idejének cirkadián időbe történt

átszámításának a függvényében ábrázoltunk (9.ábra, A mező). UV-B pulzussal készült

PRC-ből kiderült, hogy vad típusú növényben UV-B fénypulzusok gyenge késést okoznak

a szubjektív éjszaka során felében, viszont nem okoznak periódusváltozást a szubjektív

nappal alatt. uvr8-6 és cop1-4 növényekben pedig nem volt tapasztalható egyáltalán

fázisváltozás.

9. ábra. A cirkadián óra beállíthatóságának vizsgálata fénypulzusokkal

A CCR2:LUC+ jelzőgént hordozó vad típusú Col-0 (fekete négyzet) uvr8-6 (piros háromszög), és cop1-4

mutáns (kék kör) hét napos csíranövényeket folyamatos, alacsony intenzitású (10 μmol m-2 s-1) fehér

fénybe (A) vagy sötétbe (B, C, D) helyeztük. Ezután háromóránként 30 perces (A), illetve egyórás (B, C, D),

ugyanolyan erősségű fénypulzusokat kaptak. A pulusok által kiváltott fáziscsúszást a pulzus időpontjának

függvényében ábrázoltuk. Az értékek számolásának és feltüntetésének módját lásd a 44-45. oldalon. A

növényeket a következő színű és erősségű fénypulzusokkal kezeltük: (A) UV-B (1,5 μmol m-2 s-1); (B)

vörös (40 μmol m-2 s-1); (C) kék (25 μmol m-2 s-1); (D) fehér (10 μmol m-2 s-1). A fáziscsúszásokat és a

fénypulzusok idejét az összehasonlíthatóság miatt 24 órára viszonyítva adtuk meg.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

51

A kísérletet megismételtük látható fényt alkalmazva. A növényeket egyhetes beállítás

után folyamatos sötétbe helyeztük, majd 36 órával később 1-1 órás vörös

(40 µmol m-2 s-1) kék (25 µmol m-2 s-1), illetve fehér (10 µmol m-2 s-1) fénypulzusokat

alkalmaztunk (9. ábra, B, C, D mező)). Ezen körülmények között az uvr8-6 növények

fázisválasza megkülönböztethetetlen volt a vad típusétól. Megállapíthatjuk, hogy UV-B

fény képes beállítani a cirkadián órát és ebben a folyamatban az UVR8 és a COP1

kulcsfontosságú.

UV-B általi fényindukció cirkadián szabályozása

Optimális indukciós és mintaszedési körülmények megállapítása

Mielőtt megvizsgáltuk, hogy a cirkadián óra szempontjából fontos gének a látható

fényhez hasonlóan indukálódnak-e UV-B hatására, szükséges volt elvégeznünk még két

kísérletet. Az előzményekből az feltételezhető volt, hogy az UV-B indukálja legalább az

egyik óragént, viszont nem tudhattuk mekkora az optimális UV-B dózis, illetve, hogy az

indukció hatására milyen a célgének mRNS-einek átíródási kinetikája, vagyis az

indukciót után mennyi idővel érdemes mintát szedni ahhoz, hogy maximális, vagy

legalábbis jelentős mértékű legyen a szintnövekedés.

Az mRNS szint felfutásának a vizsgálatához alacsony intenzitású, állandó fehér fénybe

helyezett vad típusú csíranövényeket 51 órával az áthelyezés után 10 perces

1,5 µmol m-2 s-1 erősségű UV-B pulzussal kezeltük. A kezelés előtt közvetlenül, illetve

utána 20 perccel, majd ezt követően 10 percenként mintát szedtünk, amiből össz RNS-t

tisztítottunk. Az mRNS szinteket valós idejű PCR segítségével határoztuk meg. Az

értékeket a TUBULIN mRNS szintjéhez viszonyítottuk, majd a kezdeti indukálatlan minta

növekményeként ábrázoltuk (10. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

52

10. ábra. Néhány UV-B indukált gén mRNS szintje az indukciót követően

A vad típusú (Col-0) hét napos csíranövényeket alacsony intenzitású (10 µmol m-2 s-1) fehér fénybe helyeztük. 51 órával később 10 perces 1,5 µmol m-2 s-1 erősségű UV-B pulzussal kezeltük őket. A kezelést közvetlenül megelőzően (0 időpont) illetve utána 10 percenként mintát vettünk, amelyekből össz-RNS-t tisztítottunk. Az mRNS-szinteket valós idejű PCR segítségével határoztuk meg, az értékeket a TUBULIN mRNS szintjéhez viszonyítottuk és a kezeletlen minta növekményeként ábrázoltuk. (A) Óragének: PRR9 (fekete), GI,

(piros), CCA1 (narancs) (B) UV-B indukálódó nem óragének:

HY5 (zöld), glutation peroxidáz (kék). A glutation peroxidáz mRNS mennyiségeket a bal- a HY5 mRNS mennyiségeket pedig a jobboldali skála mutatja.

A kísérletből megállapíthattuk, hogy mindhárom fényindukciót mutató óragén

indukálható UV-B-vel is. A három gén közül az egyébként legnagyobb növekedést

produkáló PRR9 mRNS-e érte el legelőször a maximumát, az indukció kezdete után

90 perccel. Ezt az időpontot választottuk indukció utáni mintavételi pontnak, amit az is

alátámasztott, hogy más UV-B indukciót mutató gének mRNS-ei (10. ábra, B panel) még

később érik el a csúcsértéküket.

A következő kísérletben az előbbiekkel azonos módon nevelt vad típusú növényeket

különböző idejű és erőségű UV-B pulzusokkal kezeltük. A kezelés megkezdése előtt majd

a kezelések kezdetétől számított 90. percben gyűjtött mintákból tisztítottunk össz RNS-t.

Ezekből a PRR9 mRNS szinteket valós idejű PCR-segítségével határoztuk meg, az

értékeket az előző kísérlethez hasonlóan ábrázoltuk (11. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

53

11. ábra. A PRR9 mRNS szint növekedése

különböző erősségű UV-B sugárzás

hatására

A vad típusú (Col-0) hét napos csíranövényeket alacsony intenzitású (10 µmol m-2 s-1) fehér fénybe helyeztük. 51 órával később különböző idejű (10-40 perc) és erősségű (1.5-4 µmol m-2 s-1) UV-B pulzussal kezeltük őket. A kezelést megelőzően illetve utána 90 perccel mintát vettünk. A mintákat az előző kísérlethez hasonlóan kezeltük illetve az mRNS értékeket ugyanúgy ábrázoltuk. Az alkalmazott fényintenzitásokat különböző

szinekkel jelöltük. LP 385 mutatja a kezeletlen kontroll növekményét a vizsgált időszakban.

Megállapítható volt, hogy a 1,5 µmol m-2 s-1 UV-B intenzitás 30 percen keresztül elég a

maximális válasz kiváltásához, valamint a 385 nm-es filterrel megszűrt fényforrás nem

okoz mRNS szint emelkedést. (A tapasztalható gyenge növekedés a kontroll mintában a

PRR9 mRNS napi ciklusa miatt van.)

Az UV-B képes indukálni a központi óraelemeket

Jelenleg még nem teljesen ismert az a pontos jelátviteli mechanizmus, amelyen

keresztül a fény képes beállítani a cirkadián órát. Az aktuális óramodell szerint a

növényi cirkadián óra lelke az óragének átírásán és mRNS-ének lefordításán alapuló

visszacsatolási kör. Az elmélet szerint az óragének mRNS szintjének változása szükséges

a hullámmintázat létrehozásához és a fázisbeállításhoz egyaránt. Egyes óragének (CCA1,

LHY, PRR9, GI), illetve a központi órával kölcsönható ELF4 átírása közvetlen

fényindukciót mutat (Wang és mtsai, 1997; Tepperman és mtsai, 2001; Locke és mtsai,

2005; Ito és mtsai, 2003; Kikis és mtsai, 2005). Jelenlegi ismereteink szerint ez az mRNS

szint növekedés a kiváltója a fázisátállításoknak.

Ezek a gének nem csak fényindukálhatóak, hanem a cirkadián óra szigorú kontrollja

alatt is állnak, azaz a kifejeződésük állandó körülmények között (akár fény hiányában) is

ritmikus, a fényindukciójuk pedig kapuzott Ez úgy értendő, hogy egy azonos erősségű

fénypulzus más és más mértékű indukciót vált ki a cirkadián nap során. Maximálisat a

gén saját (indukció nélküli) cirkadián csúcsa körül, és egészen kicsit a cirkadián

minimum környékén.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

54

Annak megállapítására, hogy mindez igaz-e UV-B indukcióra is, megvizsgáltuk a

fényindukált óragének (CCA1, PRR9, GI, ELF4) akut indukcióját valós idejű PCR

segítségével vad típusú, illetve uvr8-6 és cop1-4 mutáns hátterekben. A növényeket az

előzőekhez hasonlóan állítottuk be, fény-sötét ciklusokkal, majd folyamatos, alacsony

intenzitású (10 µmol m-2 s-1) fehér fénybe helyeztük őket. Az egyes növénycsoportokat

1,5 µmol m-2 s-1 intenzitású 30 perces UV-B pulzusokkal kezeltük háromóránként az

áthelyezés utáni 36. órától kezdődően. A kezelés után a növényeket visszahelyeztük

folyamatos fehér fénybe, majd egy órával később gyűjtöttünk róluk mintát és ebből

határoztuk meg az indukált génkifejeződés szintjét. Közvetlenül a kezelés előtt vett

mintákból pedig a vizsgált gének alapaktivitásait állapítottuk meg (12. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

55

12.ábra. Központi óragének UV-B indukciója uvr8-6 és cop1-4 háttérben

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet), uvr8-6 (piros háromszög) és cop1-4 mutáns (kék kör) hét napos csíranövényeket alacsony intenzitású (10 µmol m-2 s-1) folyamatos fehér fénybe helyeztük és háromóránként 30 perces 1.5 µmol m-2 s-1 erősségű UV-B pulzussal kezeltük őket. Közvetlenül a kezelést megelőzően szedett mintákból készítettük az alapaktivitások görbéit (telt szimbólumok) és a 90 perccel későbbiekből az indukált görbéket (üres szimbólumok). A mintákból össz RNS-t tisztítottunk. A központi óragének mRNS-szintjét valós idejű PCR segítségével határoztuk meg, az értékeket a TUBULIN mRNS szintjéhez viszonyítva ábrázoltuk. A grafikonok három független kísérlet átlageredményét mutatják. A szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát jelölik. A vizsgált gének: CCA1 (A, B), PRR9 (C, D), GI (E, F), ELF4 (G, H).

Megfigyelhettük, hogy mind a négy gén indukálható UV-B fénnyel és az indukció

kapuzott. Az indukció a cirkadián maximum értékénél a CCA1 esetében majdnem

kétszeres, míg a másik három gén esetében 2-4 szeres mRNS szint adódott az indukció

után. Az uvr8-6 mutáció nem érintette az alap kifejeződési szintet, az indukciót viszont

teljes mértékben eltörölte. Csakúgy, mint a cop1-4 mutáció. Ennek az utóbbinak már

korábban leírt korai fázisú és rövid periódusú fenotípusa van, ami itt is látható volt

minden vizsgált génen. A cop1-4 mutáció sem volt hatással a PRR9, GI, ELF4

alapkifejeződésre, azonban a CCA1 mRNS amplitúdója jelentősen megemelkedett ebben

a mutánsban.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

56

13. ábra. TOC1 gén indukciója

A vad típusú (Col-0) növények beállítása, kísérleti körülményeik, mintafeldolgozásuk, illetve a kapott adatok ábrázolása megegyezett az előző kísérletben alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az indukált görbéket üres szimbólumokkal ábrázoltuk. A szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát jelölik.

A TOC1 óragén mRNS-ének kifejeződésére nincs hatással a (látható) fény (Makino és

mtsai, 2001). Megvizsgálva úgy találtuk, az UV-B szintén nem változtat a szintjén

(13. ábra).

Az adatok alapján úgy tűnik, az UV-B hatása az

óragének indukciójára nagyon hasonló a látható fényhez. Az uvr8-6 és a cop1-4 mutáció

pedig teljes mértékben eltörli ezt a indukciót. Azonban látható fényben az uvr8-6

mutációnak nincs semmilyen hatása az órára nézve.

A cirkadián óra a nem ritmikus gének UV-B indukcióját is kapuzza

A cirkadián óra központi génjein kivül is sok olyan gén van, mely kettős szabályozás

alatt áll. A fény képes közvetlenlül indukálni őket, de ez az indukció nem mindig azonos

mértékű a cirkadián óra kapuzási szabályozása miatt. Annak vizsgálatára, hogy ez az

UV-B-re is igaz-e megnéztük néhány olyan gén kifejeződését és indukcióját, melyek nem

részei a központi órának. A szakirodalomban közölt, cirkadián kifejeződést vizsgáló

(Covington és mtsai, 2008), illetve az alacsony intenzitású UV-B génindukciókat

feltérképező (Favory és mtsai, 2009) génchip adatbázisok összevetésével az alábbi

géneket választottuk ki: CHALCONE SYNTHASE (CHS, At5g13930, UV-B védelemben

fontos flavonoidok termelődésének kulcsenzimét kódolja), GLUTATHIONE PEROXIDASE7

(GPX7, At4g31870, antioxidáns enzim génje, a GPX7 a hidrogén peroxidot redukálja

glutation segítségével), EARLY LIGHT INDUCED PROTEIN 2 (ELIP2, At4g14690,

fotoprotektív gén), ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5, At5g11260 Bzip transzkripciós

faktor génje a fotomorfogenezis fontos pozitív faktora) valamint a HY5-HOMOLOG (HYH,

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

57

At3g17609) melyek mind UV-B indukciót, mind cirkadián mintázatot mutattak. Az

indukciós tesztet az óragénekével teljesen megegyezően vizsgáltuk vad típusú uvr8-6 és

cop1-4 mutáns növényeken (14. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

58

14. ábra. UV-B indukált és cirkadián mintázatot mutató gének UV-B indukciója

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet), uvr8-6 (piros háromszög) és cop1-4 mutáns (kék kör) növények

beállítása, kísérleti körülményeik, mintafeldolgozásuk, illetve a kapott adatok ábrázolása megegyezett a

központi óraelemek vizsgálatában alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az indukált

görbéket üres szimbólumokkal ábrázoltuk. A szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát jelölik.

A megvizsgált gének: CHS (A, B), GPX7 (C, D), ELIP2 (E, F), HY5 (G, H), HYH (I, J). Második (jobboldali) Y

tengelyen ábrázoltuk a következő mRNS adatokat: CHS cop1-4 háttérben (B), indukált GPX7 vad típusban

(C, D), GPX7 cop1-4 háttérben (D), indukált ELIP2 vad típusban (E, F), ELIP2 cop1-4 háttérben (F), és

indukált HY5 vad típusban (G, H).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

59

A CHS, az ELIP2 a GPX7 és a HYH mRNS-ek kifejeződése cirkadián szabályzást követ,

az alapszintjük az óragénekkel összevethető kitéréseket mutatott és a legnagyobb

indukció időben egybeesett a cirkadián csúcsokkal. Azonban a cirkadián alapvonal és a

nagymértékű indukciók ellenére a HY5 mRNS-en nem látható kapuzottság. Annak

eldöntésére, hogy ez általános hiány-e minden fénykörülmény esetén, elvégeztük a

„klasszikus” kapuzási kísérletet vörös fénnyel. A növényeket hét napos beállítás után

folyamatos sötétbe helyeztük, ahol háromóránként egyórás 40 µmol m-2 s-1 erősségű

vörös pulzust kaptak. A pulzus előtt, illetve után 90 perccel gyűjtött mintákból össz RNS-

t tisztítottunk, amiből valós idejű PCR segítségével határoztuk meg a HY5, és HYH mRNS

szinteket, melyeket a TUBULIN mRNS szintjéhez viszonyítva ábrázoltunk (15. ábra).

15. ábra. A HY5 és a HYH gének vörös indukciója

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet) és uvr8-6 mutáns (piros háromszög) hét napos csíranövényeket

folyamatos sötétbe helyeztük és háromóránként egyórás 40 µmol m-2 s-1 intenzitású vörös pulzussalokkal

kezeltük őket. Mintafeldolgozásuk, illetve a kapott adatok ábrázolása megegyezett a korábbi UV-B

kapuzást vizsgáló kísérletekben alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az indukált

görbéket üres szimbólumokkal ábrázoltuk. A szürke sávok az időtengelyen a névleges nappalt jelölik.

HY5 (A), HYH (B).

Amint látható, nem általános jelenségről van szó, mert a HY5 és a HYH vörös

indukcióját az óra kapuzza. Az uvr8-6 -csakúgy, mint korábban- UV-B hiányában

megkülönböztethetetlen a vad típustól.

Vizsgáltuk továbbá az At3g16350, At3g57830 géneket, melyek nem cirkadián

kifejeződésűek, de jelentős UV-B indukciót mutatnak. Az előbbi egy ismeretlen szerepű

Myb transzkripciós faktort (Ikeda és Ohme-Takagi, 2009), míg az utóbbi egy

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

60

leucingazdag ismétlődéseket tartalmazó receptor kinázt kódol (Dievart és Clark, 2003).

Érdekes módon ezen nem cirkadián kifejeződésű gének UV-B indukciója jól kivehető

cirkadián szabályozottságot mutatott (16. ábra). Az indukció maximális értéke a

szubjektív nappal közepére esett.

16. ábra. UV-B indukált, de nem cirkadián kifejeződésű gének indukciója

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet), uvr8-6 (piros háromszög) és cop1-4 mutáns (kék kör) hét napos

csíranövények beállítása, kísérleti körülményeik, mintafeldolgozásuk, illetve a kapott adatok ábrázolása

megegyezett a központi óraelemek vizsgálatában alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az

indukált görbéket üres szimbólumokkal ábrázoltuk. A szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát

jelölik. At3G16350 (A,B), At3g57830 (C,D).

Annak eldöntésére, hogy az UV-B hiányában megfigyelhető rendkívül alacsony

kifejeződés okozza-e azt, hogy nincs cirkadián mintázat; a növényeket egyhetes beállítás

után UV-B fénnyel (1.5 µmol m-2 s-1) kiegészített alacsony intenzitású (10 µmol m-2 s-1)

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

61

folyamatos fehér fénybe helyeztük (17.ábra). Ahogy az ábrák mutatják, a magasabb

mRNS szint ellenére a gének nem cirkadián kifejeződésűek.

17. ábra. Az At3g16350, és At3g57830 gének kifelyeződése UV-B vel kiegészített fehér fényben

A vad típusú (Col-0) hét napos csíranövényeket UV-B fénnyel (1.5 µmol m-2 s-1) kiegészített alacsony

intenzitású (10 µmol m-2 s-1) folyamatos fehér fénybe helyeztük. háromóránként mintát vettünk belőlük,

amiből össz RNS-t risztítottunk. A gének mRNS-szintjét valós idejű PCR segítségével határoztuk meg, az

értékeket a TUBULIN mRNS szintjéhez viszonyítva ábrázoltuk. A grafikonok három független kísérlet

átlageredményét mutatják, a szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát jelölik.

Az uvr8-6 és a cop1-4 mutáció az általunk vizsgált összes gén UV-B indukcióját

eltüntette. Az uvr8-6 mutánsnak nincsen semmilyen hatása az alap kifejeződési

mintázatra, viszont a cop1-4 a már leírt korai fázis és rövid periódus mellett megemelte

az alapszintjét a CHS, ELIP2 és HY5 mRNS-eknek. Mindent egybevéve, ezek az adatok azt

sugallják, hogy legalábbis a génindukció szinjén másként kontrollált a kapuzás az UV-B,

mint a látható fény esetében.

A HY5 és a HYH nem szükségesek sem az óragének UV-B

indukciójához, sem az UV-B indukálta génexpresszió kapuzásához

Korábbi, génchipekkel megerősített kutatások azt mutatták, hogy a HY5 és a HYH a

legtöbb UV-B indukálta gént kontrolállják (Brown és Jenkins, 2008). Hogy megvizsgáljuk

ezeknek a transzkripciós faktoroknak a hatását a mi kísérleti körülményeink között;

megnéztük a hy5 hyh kettős mutáció hatásait a fentebb már leírt kapuzást vizsgáló

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

62

kísérleti rendszerben. A növesztési és kísérleti körülmények azonosak voltak az

előzőekkel (18.ábra).

18. ábra. Néhány gén UV-B indukciója hy5 hyh dupla mutáns háttérben

A vad típusú Col-0 (fekete négyzet) és hy5-ks50 hyh mutáns (narancs rombusz) hét napos csíranövények


korábbi, UV-B kapuzást vizsgáló kísérletekben alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az


jelölik. A vizsgált gének: CCA1 (A), PRR9, (B), CHS (C), At3g16350 (D). Az indukált CHS mRNS szinteket, vad

típusú háttérben másodlagos Y tengelyen ábrázoltuk (C)

A kétszeres mutáns háttérben a CCA1 és a PRR9 mRNS-ek alapszintje csak egészen

kicsit csökkent le, míg indukciójuk gyakorlatilag nem változott. Ezzel szemben a CHS

alapszintje drasztikusan lecsökkent, indukciója teljesen eltűnt a mutánsban, ahogy már

korábban leírták (Brown és Jenkins, 2008; Stracke és mtsai, 2010). Az At3g16350

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

63

indukciója erőteljesen lecsökkent, de nem tűnt el teljesen és a megmaradt indukció

cirkadián kapuzást mutatott.

Mindezek az adatok azt mutatják, hogy az óragének UV-B indukciója nem függ a HY5,

HYH transzkripciós faktoroktól és az UV-B indukált génkifejeződés cirkadián

szabályzása sem rajtuk keresztül történik.

Aritmiás mutánsokban hiányzik az UV-B indukált génkifejeződés

kapuzása

Az UV-B kiváltotta génkifejeződési mintázat napi különbségeit a cirkadián óra

szabályzása biztosítja. Vagyis az elmélet szerint, ha az óra szabályzása kimarad, a

kapuzás megszűnik, viszont az UV-B indukálhatóság meg kell maradjon egy többé-

kevésbé állandó szinten. Ezért megvizsgáltuk az UV-B indukált génkifejeződést olyan

növényekben, melyek nem rendelkeznek működő cirkadián órával (19. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

64

19. ábra. Néhány gén UV-B indukciója elf3-4 mutáns háttérben

A vad típusú Ws (fekete négyzet) és elf3-4 mutáns (magenta háromszög) hét napos csíranövények


korábbi, UV-B kapuzást vizsgáló kísérletekben alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az


jelölik. A vizsgált gének: CCA1 (A), PRR9, (B), CHS (C), At3g16350 (D). Az indukált At3g16350 mRNS

szinteket, elf3-4 háttérben másodlagos Y tengelyen ábrázoltuk (D)

Az elf3-4 növényben a CCA1 mRNS indukció nélküli szintje folyamatosan alacsony

értékű volt, míg a PRR9 mRNS magas szinten mutatta a folyamatos kifejeződést. Ezek az

adatok egybecsengtek a korábbi megfigyelésekkel (Alabadi és mtsai, 2001; Kim és mtsai,

2005; Thines és Harmon, 2010). Az óravezérelt CHS és a nem ritmikus At3g16350 a

PRR9-hez hasonlóan, magas alapszintet mutatott.

Minden általunk tesztelt gén UV-B indukciója azonos szintű, nem kapuzott jelleget

mutatott az elf3-4 mutánsban. A CCA1 kifejeződés minden időpontban kétszeres mRNS

szintbeli különbséget mutatott az elf3-4 mutánsban, ami egyezik a maximális CCA1

mRNS indukcióval a vad típusban. Azonban az alacsony alapszint miatt, az UV-B indukált

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

65

CCA1 mRNS felhalmozódása alacsonyabb az elf3-4 mutánsban, mint a vad típusban.

Szemben a CCA1-gyel a többi gén indukált mRNS szintje azonos vagy magasabb szintű

volt, mint a vad típus maximális értéke.

A kísérleteket elvégeztük egy másik ritmus nélküli növényvonalon is, a CCA1-et

folyamatosan magas szinten kifejező CCA1-OX 38-as vonalon (Wang és Tobin, 1998).

A kísérletek az elf3-4 mutánshoz hasonló eredményt adtak. UV-B megvilágítás magas

szintű génindukciót okozott függetlenül a kezelés időpontjától. Érdekes módon

kétszeres CCA1 mRNS szint növekedést láttunk ebben a CCA1-et folyamatosan

túltermelő vonalban, ami tekintve hogy a 35S promóter nem indukálódik UV-B sugárzás

hatására (Boyko és mtsai, 2010) azt sugallaja, hogy az UV-B stabilizálja a CCA1 mRNS-t

(20. ábra).

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

66

20. ábra. Néhány gén UV-B indukciója CCA1 túltermelő háttérben

A vad típusú Ws (fekete négyzet) és CCA1-OX 38 (zöld kör) hét napos csíranövények beállítása, kísérleti

körülményeik, mintafeldolgozásuk, illetve a kapott adatok ábrázolása megegyezett a korábbi, UV-B

kapuzást vizsgáló kísérletekben alkalmazottakkal. Az alapaktivitások görbéit telt-, míg az indukált

görbéket üres szimbólumokkal ábrázoltuk. A szürke sávok az időtengelyen a névleges éjszakát jelölik.

A vizsgált gének: CCA1 (A), PRR9, (B), CHS (C), At3g16350 (D).

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a ritmikus kapuzás elvész, de az UV-B indukált

génkifejeződés növekedés megmarad ezekben a ritmustalan vonalakban. Az indukciós

szintek arra utalnak, hogy az óra megreked egy olyan sajátos állapotban, amikor az UV-B

válaszok nincsenek gátolva.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

67

Az óra által szabályozott UV-B génindukció fiziológiai hatása

Az a megfigyelés, hogy az elf3-4 mutánsban a vad típushoz képest a legtöbb UV-B

indukálta gén erősebb választ ad; felvetette annak a lehetőségét, hogy az elf3-4 növény

ellenállóbb lehet UV-B okozta stresszel szemben. Ennek a feltételezésnek a

kipróbálására a növényeket a szokásos egyhetes beállítás után UV-B vel

(1.5 µmol m-2 s-1) kiegészített alacsony intenzitású (10 µmol m-2 s-1) fehér fénybe

helyeztük. 24 illetve 35 órával később (szubjektív reggel és este), 20 perces

(14 µmol m-2 s-1) UV-B pulzust adtunk nekik. A növényeket további egy hétre

visszahelyeztük a nevelés körülményei közé (12 h fehér fény (50 μmol m-2 s-1)/12 h

sötét, 22°C), majd analizáltuk.

Ahogyan a 21. ábra mutatja, a mutáns és a vad típusú növények között nem volt

különbség, jelezve, hogy ez a részleges mRNS szintemelkedés nem biztosított nagyobb

ellenállást a nagy intenzitású UV-val szemben az elf3-4 növényeknek. Az UV-B dózis nem

volt halálos, de lelassult a fejlődés és az elsődleges levelek növekedése, valamint

csökkent a klorofilltartalom. Az elf3-4 növények eleve kevesebb klorofillt tartalmaztak,

de a csökkenés (körülbelül 40% a kezeletlen növényekhez képest) egyforma volt a két

genotípusnál. Továbbá, az UV-B stressz mértéke független volt attól, hogy mely

napszakban kapták azt a növények.

EREDMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

68

21. ábra UV-B ellenállóképesség

vizsgálata

A vad típusú és elf3-4 mutáns hét

napos csíranövényeket alacsony

intenzitású (1.5µmol m-2 s-1) UV-B-

vel kiegészített fehér fényben

(10µmol m-2 s-1) helyeztük

(aklimáltuk). 24, illetve 35 órával

később (szubjektív reggel és este)

20 perces 14 µmol m-2 s-1 UV-B

pulzussal kezeltük őket. A

növényeket ezután további egy

hétre visszahelyeztük fény-sötét

ciklusokra. A növényeket lefotóztuk

(A), majd mintát szedtünk. A

mintákból kivontuk a klorofillt,

aminek mennyiségét fotométerrel

határoztuk meg és a nedves

tömegre (NT) vonatkoztatva (B),

illetve a kontrollhoz viszonyítva (C)

adtuk meg.

AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE

Az UV-B fény szerepet játszik a növényi cirkadián óra beállításában

A fényimpulzusok az időtartalmuktól függően különböző paramétereit módosíthatják

a szabadon futó cirkadián órának. Növényekben a folyamatos megvilágítás az

intenzitásával arányosan rövidíti a szabadon futó óra periódusát, míg a fénypulzusok

fáziscsúszást okoznak.

Kísérleteink elsődleges célja az volt, hogy megvizsgáljuk az UV-B egy olyan

részletének a hatását a cirkadián órára, melynek szerepe már bizonyított a

fotomorfogenezisben és melynek az UVR8 a receptora. Ennek érdekében olyan alacsony

intenzitású (1.5 μmol m-2 s-1) UV-B fényt használtunk beállító fénynek, amelynek nincsen

káros hatása a növényekre.

Adataink megmutatták, hogy az UV-B képes a cirkadián óra beállítására. A 8. ábra,

illetve a 4. táblázat bemutatja, hogy vad típusú növényekben mindkét általunk használt

kimenet jelzőgén (CCR2:LUC+, HY5:LUC+) szabadon futó ritmusa szignifikánsan, 1-2

órával rövidebb periódusú volt, amennyiben a folyamatos fehér fényt (10 μmol m-2 s-1)

kiegészítetük UV-B-vel.

A 9/A ábra mutatja, hogy UV-B pulzus a folyamatos fehér fényben tartott

növényeknél fáziskéséseket okozott a szubjektív éjszaka során, azonban azonos mértékű

pulzus nem okozott eltérést a szubjektív nappal alatt. Érdekes, hogy egy korábbi

kísérletben leírt, DNS károsodást okozó, erős UV-B pulzusok újraindították az órát és

csakis fázissietéseket okoztak fibroblaszt kultúrában. (Oklejewicz és mtsai, 2008) Ugyan

kísérleteinknek nem képezte célját megvizsgálni, hogy UV-B-stressz hogyan hat a

növényi circadian órára, egy kísérletünk azonban azt mutatta, hogy az erős UV-B pulzus

drámaian csökkenti a cirkadián ritmusok kitérését, ami lehetetlenné teszi a beállítás

vizsgálatát (22. ábra).

AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ______________________________________________________________________________________________________

70

UV-B által kiváltott órabeállítás lehetséges molekuláris működésének vizsgálatához

több mint egy cirkadián cikluson keresztül követtük a központi óragének (CCA1,PRR9,

GI) illetve az óraközeli ELF4 indukálhatóságát. A 10. ábra mutatja, hogy minden gén

ritmikusan kapuzott UV-B indukciót mutatott vad típusú növényekben, míg az indukciók

megszűntek uvr8-6 illetve cop1-4 mutáns hátterekben. Érdekes módon a HY5 illetve

HYH transzkripciós faktorok hiánya nem érintette az óra periódusát (4. táblázat), illetve

az óragének UV-B indukálhatóságát sem fehér fényben, sem UV-B-ben (18. ábra). Ezek a

megfigyelések meglehetősen váratlanok voltak, hiszen a HY5:

• In vivo kötődik több óragén (CCA1, LHY, ELF4, TOC1) promóteréhez fehér

fényben (Lee és mtsai, 2007).

• A hy5 és a hy5 hyh mutáns, hasonlóan az uvr8-hoz, sérült az UV-B függő

fotomorfogenezisben (Ulm és mtsai, 2004; Oravecz és mtsai, 2006; Brown és

Jenkins, 2008; Stracke és mtsai, 2010)

• A HY5 befolyásolja a legtöbb UVR8, illetve COP1 szabályozott gén UV-B

indukcióját (Brown és mtsai, 2005; Oravecz és mtsai, 2006).

Adataink alapján az összefüggések a fiziológiai (a periódus módosítása) és a

molekuláris (óragén indukciók) adatok között a vad típusú és a mutáns növényekben azt

mutatják, hogy az UV-B órabeállító hatása az óragének átírási szabályozásán alapul. Az

általunk tesztelt óragének közül a PRR9 mutatta a legjelentősebb indukciót UV-B-re.

A megemelkedett PRR9 szint a folyamatos UV-B kezelés alatt egy lehetséges magyarázat

22. ábra Az erős UV-B hatása a

cirkadián órára

CCR2:LUC+ jelzőgént hordozó vad

típusú Col-0 (kék rombusz) és

cop1-4 mutáns (magenta négyzet)

hét napos csíranövényeket

folyamatos sötétbe helyeztük és a

fénykibocsátást luminométerrel

mértük. ZT47 időpontban (fekete

nyilak) 60 μmol m-2 s-1 UV-B

pulzussal kezeltük őket.


71

az UV-B periódus módosítására, mivel a PRR9 túltermelése hasonló mértékű periódus

rövidülést eredményez (Matsushika és mtsai, 2002).

Az UV-B indukció ritmikus szabályozása

A cirkadián kapuzás az a folyamat, amelyben az óra ritmikusan gátolja az akut hatását

egy külső környezeti, vagy akár egy belső jelnek a megfelelő célfolyamaton. A

növényekben a cirkadián kapuzás első leírása a CHLOROPHYLL A/B-BINDING PROTEIN 2

(CAB2) gén napi ritmusú fényindukciója volt (Millar és Kay, 1996). A 12-14. ábrák

bemutatják, hogy az összes általunk vizsgált gén UV-B indukciója -egy kivétellel- az óra

által kapuzott volt; hasonló módon, ahogy a látható fény által kiváltott indukciók. Az

egyetlen, ám annál fontosabb kivétel a HY5 volt. Ez a gén az általunk vizsgált

időtartományban a vörös fényre kapuzott indukciót mutatott, UV-B-re viszont nem. Ezek

az adatok pedig arra utalnak, hogy a HY5 UV-B indukcióját irányító jelátviteli lánc nincs

az óra hatásköre alatt és különbözik a látható fényszignál által bejárt útvonaltól.

Szintén váratlanul az At3g16350, és At3g57830 nem ritmikus gének

(http://diurnal.cgrb.oregonstate.edu) UV-B indukciója szép cirkadián kapuzást

mutatott, maximális indukcióval a szubjektív nap közepén (16. ábra).

A kapuzás jelensége nem korlátozódik a nap egy adott pontjára, illetve az érintett

gének sincsenek egy fázisban. Ezért a működése olyan UV-B jelátviteli elemekkel

magyarázható, amik párhuzamos szignál utakon hatnak és az óra különböző fázisban

szabályozza őket.

23. ábra. Az UVR8:LUC jelzőgén

kifejeződésének mintázata

folyamatos fényben

A jelzőgént hordozó vad típusú Col-

0 hét napos csíranövényeke

fénykibocsátását folyamatos fehér

fényben (10µmol m-2 s-1) mértük

luminométerrel.


72

Az UVR8 átírása ritmikus, naplemente körüli maximummal (23. ábra). Azonban az

UVR8 fehérje nem mutat napi oszcillációt (24. ábra), vagyis valószínűtlen, hogy

közvetíthetné az UV-B kapuzás mechanizmusát. Nem zárható ki azonban az UVR8

fehérje óravezérelt átfordítás utáni módosításának és ezáltali aktiválásának a

lehetősége.

24. ábra. UVR8 fehérje szintjének

változása fény-sötét cikluson

A vad típusú Col-0 hét napos

csíranövényeket folyamatos fehér fénybe

(10µmol m-2 s-1) helyeztük. háromóránként

mintát szedtünk, amelyekből fehérjét tisztítottunk. Az UVR8, és a belső kontrollként használt aktin

fehérjeszinteket Western-blot módszerrel vizsgáltuk.

A HY5 és a HYH alacsony amplitúdójú ritmust mutatnak fehér fényben, viszont a két

transzkripciós faktor közül csak a HYH UV-B indukciója kapuzott. Elméletileg

elképzelhető, hogy aktív HY5/HYH heterodimert alkotva a felhalmozódásuk közvetíteni

képes az UV-B válasz kapuzását a reggel kifejeződő géneknek. Azonban adataink azt

mutatják, hogy az óragének UV-B indukciója érintetlen a hy5 hyh kétszeres mutánsban

reggel (CCA1) illetve a nap folyamán is (PRR9) (18. ábra). A CHS indukciója hy5 hyh

háttérben teljesen hiányzik, míg némi kapuzott indukciója fennmarad az At3g16350

génnek. (18. ábra) Ez azt jelzi, hogy a HY5/HYH fehérjék fontosak egy sor gén akut UV-B

indukciójában, de nélkülözhetőek a válasz időbeni módosításában.

Korábbi adatok bizonyították, hogy a cirkadián órának befolyása van a hormon

jelátvitelben, és több stresszválasz szabályzásában. A folyamatok ezen összehangolása

emeli a fitnesszt (Covington és mtsai, 2008). Kísérleteink megmutatták, hogy a gének

UV-B indukciója szintén jelentősen szabályozott az óra által. Ezért az UVR8-függő

génszabályozás egy újabb jelátvitel, ami az órához köthető. Kísérleteink alapján az alábbi

modellt vázoltuk fel, ami bemutatja az UV-B és a cirkadián óra által szabályozott

folyamatok közötti kölcsönhatásokat (25. ábra).


73

25. ábra. UV-B jelátvitel és a cirkadián óra közötti kapcsolatokat leíró modell

Kísérleteink alapján az UV-B fény az UVR8 és a COP1 fehérjéken keresztül, a HY5 és HYH transzkripciós

faktroktól függetlenül szabályozza a cirkadián órát. A cirkadián óra kapuzza mind a saját UV-B

beállíthatóságát mind a HYH fehérje transzkripcióját; valamint befolyással van a HY5, HYH transzkripciós

faktorok által szabályozott gének napszakos kifejeződésére is. Azonban a HY5 fehérje UV indukciójára

nincsen hatással.

Az óramodulált UV-B válaszok fiziológiai jelentősége

Az alacsony intenzitású UV-B sugárzásra válaszul kialakuló génindukciónak igen

fontos szerepe van a fotoprotektív pigmentek (flavonoidok, antocianinok)

termelődésének serkentésében, melyek védelmet nyújtanak a nagy intenzitású, káros

UV-B-vel szemben (aklimáció) (Favory és mtsai, 2009). Eredményeink azt mutatják,

hogy az összes általunk vizsgált nem óragén indukciója a reggeli, illetve délelőtti

időszakban volt a legnagyobb. Ez arra utal, hogy az alacsony intenzitású UV-B jel

érzékelése és feldolgozása a nap korai részében fontosabb, azért hogy a növény felépítse

a flavonoid védelmet és túlélje a nap további részében várható UV-B terhelést.

Az alacsony intenzitású UV-B sugárzás hatására kialakuló, óra által szabályozott

génindukció fiziológiai fontosságának a felderítésére megvizsgáltuk az aritmikus elf3-4

mutáns molekuláris és fiziológiai válaszait. Adataink azt mutatták, hogy majdnem

minden általunk vizsgált gén erős indukciót mutatott az alacsony intenzitású UV-B–re az

egész nap során ebben a mutánsban.


74

Az indukált mRNS szintek a CCA1 kivételével többnyire magasabbak, mint a

maximális szintek a vad típusban, ami arra utalt, hogy az elf3-4 növény nagyobb UV-B-

stressz toleranciával rendelkezik, mint a vad típus. Azonban ahogyan 21. ábra mutatja,

az aklimált elf3-4 mutánsok nem voltak ellenállóbbak a nap különböző részein adott

pulzusokkal szemben, mint vad típusú növények. Egy másik aritmiás növényvonal, a

CCA1 óragént túltermelő CCA1-OX azonos eredményeket adott. A génkifejeződésekben

megfigyelhető UV-B okozta indukció magasabb volt mint a vad típusban, azonban

UV-B-stressz tűrőképessége nem haladta meg a vad típusét. Mindez arra utal, hogy egy

rövid idejű, alacsony intenzitású UV-B-függő génexpresszió és az azt követő flavonoid

felhalmozás a nap egy rövid szakaszán elégséges a normális védelemhez a nagy

intenzitású UV-B káros hatásaival szemben. Azt az erőforrás-igényt, ami egy

folyamatosan aktív UV-B jelátvithez szükséges, jól illusztrálja az UVR8 gént túltermelő

növények törpe fenotípusa alacsony intenziású UV-B fényben (Favory és mtsai, 2009).

Eredményeink arra utalnak, hogy a növény számára előnyösebb az UV-B válaszokat a

cirkadián óra segítségével a megfelelő napszakra időzíteni, mint folyamatosan nagyobb

toleranciát biztosítani. Így minimalizálható a ráfordított energia, azonban az

ellenállóképesség sem lesz kisebb.

KÖVETKEZTETÉSEK

A dolgozatomban ismertetett kísérletek eredményét és a belőlük levonható

következtetéseket az alábbiakban foglalhatjuk össze:

1. Vad típusú növényekben a cirkadián óra periódusa alacsony intenzitású UV-B

hatására fényintenzitás függő módon rövidül. Míg az uvr8 és cop1 mutáns

növényekben a periódus nem rövidül alacsony intenzitású UV-B hatására.

2. A hy5 hyh mutáns növények periódusa nem tér el a vad típusétól, sem fehér, sem

UV-B-vel kiegészített fehér fényben. Mivel a HY5-ről korábban leírták, hogy in vivo

kötődik több óragén (CCA1, LHY, TOC1, ELF4) promóteréhez, felvetődik, hogy ennek

ellenére sem vesz részt a cirkadián szabályozásban.

3. Alacsony intenzitású UV-B pulzusok hatására vad típusú növényekben fáziskésés

figyelhető meg a szubjektív éjszaka során és nem tapasztalható fázisváltozás a

szubjektív nappal alatt. Az uvr8 és a cop1 mutáns növények nem mutatnak

fázisváltozást alacsony intenzitású UV-B pulzusok hatására, vagyis az egyes ponttal

összegezve: a cirkadián óra beállítható UV-B fénnyel, az UVR8 és a COP1 pedig

kulcsfontosságú ebben a beállításában.

4. Minden általunk vizsgált fényérzékeny óragén (CCA1, PRR9, GI, ELF4) indukálható

volt alacsony intenzitású UV-B vel is. Az indukciójuk kapuzott mintázatot mutatott.

A legnagyobb mértékű indukciót a PRR9 mutatta, a megemelkedett PRR9 szint

magában magyarázhatja a periódus rövidülését

5. Az uvr8 mutánsban a központi óra általunk vizsgált minden eleme a vad típusénak

megfelelő szinten volt UV-B hiányában és egyik sem volt indukálható UV-B

pulzusokkal. A cop1 mutáció az uvr8 hoz hasonlóan eltörölte az óragének UV-B

indukálhatóságát.

6. Az általunk vizsgált kettős (cirkadián és közvetlen fény) szabályozású gének nagy

része kapuzott indukciót mutatott alacsony intenzitású UV-B fénypulzusok hatására.

KÖVETKEZTETÉSEK ______________________________________________________________________________________________________

76

7. A HY5 UV-B indukcióját nem szabályozza a cirkadián óra. A HYH átíródását viszont

igen. Elképzelhető, hogy a két fehérje heterodimerként összekapcsolódva működik

és ez esetben a HYH cirkadián átíródási szabályzása kihat a komplex működésére.

8. Az általunk vizsgált nem cirkadián kifejeződésű, de UV-B indukálható gének szintén

kapuzott indukciót mutattak alacsony intenzitású UV-B pulzusok hatására. A

maximális indukciók –akár a többi vizsgált nem óragén esetében- a reggeli/délelőtti

órákban voltak, ami feltételezi azt, hogy a növény számára ekkor a legfontosabb az

alacsony intenzitású UV-B jel érzékelése. Ennek hatására építi fel UV-B elleni

védelmét a később érkező nagyobb intenzitású sugárzással szemben.

9. A megvizsgált aritmiás növényekben (elf3, CCA1-OX) nem volt tapasztalható

kapuzás, azonban majdnem minden megvizsgált gén magasabb indukciót mutatott,

mint a vad típusban. A minden időpontban magasabb indukció azonban nem tette

védettebbé ezeket a növényeket a nagy intenzitású UV-B sugárzással szemben. Ez

arra utal, hogy egy rövid idejű, alacsony intenzitású UV-B függő génexpresszió és az

azt követő flavonoid felhalmozás a nap egy rövid szakaszán elégséges a normális

védelemhez a nagy intenzitású UV-B káros hatásaival szemben.

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

Kiss I., Kesserű P., Feher B., Bihari Z. és Polyák B.: Co-immobilization of symbiotic green algae and Saccharomyces unispora. Symbiosis 2002, 32(3): 247-256.

Kevei, E., Gyula, P., Hall, A., Kozma-Bognar, L., Kim, W.-Y., Erikson, M.E., Toth, R.,

Hanano, S., Feher, B., Southern, M.M., Bastow, R.M., Viczian, A., Hibberd, V., Davis, S.J., Somers., D.E., Nagy,F. and Millar, A.J: Forward genetic analysis of the circadian clock

separates the multiple functions of ZEITLUPE. Plant Physiology 2006, 140(3): 933-945.

James C.W. Locke, Laszlo Kozma-Bognar, Peter Gould, Balazs Feher, Eva Kevei, Ferenc Nagy, Matthew S. Turner, Anthony Hall, Andrew J. Millar: Experimental validation of a

predicted feedback loop in the multi-oscillator clock of Arabidopsis. Molecular Systems

Biology 2006, 2:59.

Kevei E, Gyula P, Fehér B, Tóth R, Viczián A, Kircher S, Rea D, Dorjgotov D, Schäfer E, Millar AJ, Kozma-Bognár L, Nagy F.: Arabidopsis thaliana circadian clock is Regulated by

the small GTPase LIP1. Current Biology 2007, 17(17):1456-1464.

Safrany J, Haasz V, Mate Z, Ciolfi A, Feher B, Oravecz A, Stec A, Dallmann G, Morelli G, Ulm R, Nagy F.: Identification of a novel cis-regulatory element for UV-B induced

transcription in Arabidopsis. Plant Journal. 2008, 54(3):402-414.

Fehér B*, Kozma-Bognár L

*, Kevei E, Hajdu A, Binkert M, Davis SJ, Schäfer E, Ulm R,

Nagy F.: Functional interaction of the circadian clock and UV RESISTANCE LOCUS 8-

controlled UV-B signaling pathways in Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 2011 (In Press).†

* Megosztott első szerzők † A dolgozat alapjául szolgáló közlemény

IDÉZETT KÖZLEMÉNYEK

Adams J, Kelso R, Cooley L (2000) The kelch repeat superfamily of proteins: propellers of cell function. Trends Cell Biol 10: 17-24

A-H-Mackerness S, Surplus SL, Blake P, John CF, Buchanan-Wollaston V. (1999) Ultraviolet-B-induced stress and changes in gene expression in Arabidopsis thaliana: role of signalling pathways controlled by jasmonic acid, ethylene and reactive oxygen species. Plant Cell Environ. 22: 1413–23

Ahn SC, Baek BS, Oh T, Song CS, Chatterjee B (2000) Rapid mini-scale plasmid isolation for DNA sequencing and restriction mapping. BioTechniques 29: 466-468

Alabadi D, Oyama T, Yanovsky MJ, Harmon FG, Mas P, Kay SA (2001) Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock. Science 293: 880-883

Allen T, Koustenis A, Theodorou G, Somers DE, Kay SA, Whitelam GC, Devlin PF (2006) Arabidopsis FHY3 specifically gates phytochrome signaling to the circadian clock. Plant Cell 18: 2506-2516

Aschoff J (1979) Circadian rhythms: influences of internal and external factors on the period measured in constant conditions. Z Tierpsychol 49: 225-249

Bae G, Choi G (2008) Decoding of light signals by plant phytochromes and their interacting proteins. Annu Rev Plant Biol 59: 281-311

Ballaré CL, Scopel AL, Stapleton AE, Yanovsky MJ (1996) Solar Ultraviolet-B Radiation Affects Seedling Emergence, DNA Integrity, Plant Morphology, Growth Rate, and Attractiveness to Herbivore Insects in Datura ferox. Plant Physiol 112: 161-170

Ballaré CL, Barnes PW, Flint SD. (1995) Inhibition of hypocotyl elongation by UV-B radiation in deetiolating tomato seedlings. 1. The photoreceptor. Physiol. Plant. 93: 584–92

Ballaré CL, Barnes PW, Kendrick RE. (1991) Photomorphogenic effects of UV-B radiation on hypocotyl elongation in wild-type and stable-phytochrome-deficient mutant seedlings of cucumber. Physiol. Plant. 83: 652–58

Ben-Naim O, Eshed R, Parnis A, Teper-Bamnolker P, Shalit A, Coupland G, Samach A, Lifschitz E (2006) The CCAAT binding factor can mediate interactions between CONSTANS-like proteins and DNA. Plant J 46: 462-476

Bender K, Blattner C, Knebel A, Iordanov M, Herrlich P, Rahmsdorf HJ (1997) UV-induced signal transduction. J Photochem Photobiol B 37: 1-17

Bieza K, Lois R (2001) An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol 126: 1105-1115

Boccalandro HE, Mazza CA, Mazzella MA, Casal JJ, Ballare CL (2001) Ultraviolet B radiation enhances a phytochrome-B-mediated photomorphogenic response in Arabidopsis. Plant Physiol 126: 780-788

Bornman JF, Reuber S, Cen Y-P, Weissenböck G. (1997) Ultraviolet radiation as a stress factor and the role of protective pigments. In Plants and UV-B: Responses to Environmental Change, ed. P Lumsden, pp. 157–68. Cambridge: Cambridge Univ. Press

Boyko A, Molinier J, Chatter W, Laroche A, Kovalchuk I (2010) Acute but not chronic exposure to abiotic stress results in transient reduction of expression levels of the transgene driven by the 35S promoter. N Biotechnol 27: 70-77

Briggs WR (2007) The LOV domain: a chromophore module servicing multiple photoreceptors. J Biomed Sci 14: 499-504

Briggs WR, Christie JM (2002) Phototropins 1 and 2: versatile plant blue-light receptors. Trends Plant Sci 7: 204-210

Briggs WR, Huala E (1999) Blue-light photoreceptors in higher plants. Annu Rev Cell Dev Biol 15: 33-62

IDÉZETT KÖZLEMÉNYEK ______________________________________________________________________________________________________

79

Britt AB, Chen JJ, Wykoff D, Mitchell D (1993) A UV-sensitive mutant of Arabidopsis defective in the repair of pyrimidine-pyrimidinone(6-4) dimers. Science 261: 1571-1574

Britt AB. (2004) Repair of DNA damage induced by solar UV. Photosynth. Res. 81:105–12

Brosché N, Strid A. (2003) Molecular events following perception of UV-B radiation by plants. Physiol. Plant. 117: 1–10

Brown BA, Cloix C, Jiang GH, Kaiserli E, Herzyk P, Kliebenstein DJ, Jenkins GI (2005) A UV-B-specific signaling component orchestrates plant UV protection. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 18225-18230

Brown BA, Jenkins GI (2008) UV-B signaling pathways with different fluence-rate response profiles are distinguished in mature Arabidopsis leaf tissue by requirement for UVR8, HY5, and HYH. Plant Physiol 146: 576-588

Cardozo T, Pagano M (2004) The SCF ubiquitin ligase: insights into a molecular machine. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 739-751

Cashmore AR, Jarillo JA, Wu YJ, Liu D (1999) Cryptochromes: blue light receptors for plants and animals. Science 284: 760-765

Castillon A, Shen H, Huq E (2007) Phytochrome Interacting Factors: central players in phytochrome-mediated light signaling networks. Trends Plant Sci 12: 514-521

Chen M, Chory J, Fankhauser C (2004) Light signal transduction in higher plants. Annu Rev Genet 38: 87-117

Cheng P, He Q, Yang Y, Wang L, Liu Y (2003) Functional conservation of light, oxygen, or voltage domains in light sensing. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 5938-5943

Christie JM (2007) Phototropin blue-light receptors. Annu Rev Plant Biol 58: 21-45

Cloix C, Jenkins GI (2008) Interaction of the Arabidopsis UV-B-specific signaling component UVR8 with chromatin. Mol Plant 1: 118-128

Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16: 735-743

Covington MF, Maloof JN, Straume M, Kay SA, Harmer SL (2008) Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol 9: R130

Covington MF, Panda S, Liu XL, Strayer CA, Wagner DR, Kay SA (2001) ELF3 modulates resetting of the circadian clock in Arabidopsis. Plant Cell 13: 1305-1315

Crosson S, Moffat K (2001) Structure of a flavin-binding plant photoreceptor domain: insights into light-mediated signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 2995-3000

Dai S, Wei X, Pei L, Thompson RL, Liu Y, Heard JE, Ruff TG, Beachy RN (2011) BROTHER OF LUX ARRHYTHMO Is a Component of the Arabidopsis Circadian Clock. Plant Cell 23: 961-972

David KM, Armbruster U, Tama N, Putterill J (2006) Arabidopsis GIGANTEA protein is post-transcriptionally regulated by light and dark. FEBS Lett 580: 1193-1197

Desikan R, S AH-M, Hancock JT, Neill SJ (2001) Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiol 127: 159-172

Devlin PF, Kay SA (2000) Cryptochromes are required for phytochrome signaling to the circadian clock but not for rhythmicity. Plant Cell 12: 2499-2510

Dievart A, Clark SE (2003) Using mutant alleles to determine the structure and function of leucine-rich repeat receptor-like kinases. Curr Opin Plant Biol 6: 507-516

Ding Z, Doyle MR, Amasino RM, Davis SJ (2007a) A complex genetic interaction between Arabidopsis thaliana TOC1 and CCA1/LHY in driving the circadian clock and in output regulation. Genetics 176: 1501-1510

Ding Z, Millar AJ, Davis AM, Davis SJ (2007b) TIME FOR COFFEE encodes a nuclear regulator in the Arabidopsis

thaliana circadian clock. Plant Cell 19: 1522-1536

Dodd AN, Salathia N, Hall A, Kevei E, Toth R, Nagy F, Hibberd JM, Millar AJ, Webb AA (2005) Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science 309: 630-633

Doyle MR, Davis SJ, Bastow RM, McWatters HG, Kozma-Bognár L, Nagy F, Millar AJ, Amasino RM (2002) The ELF4 gene controls circadian rhythms and flowering time in Arabidopsis thaliana. Nature 419: 74-77

Ensminger PA. (1993) Control of development in plants and fungi by far-UV radiation. Physiol. Plant. 88: 501–8

Eriksson ME, Hanano S, Southern MM, Hall A, Millar AJ (2003) Response regulator homologues have complementary, light-dependent functions in the Arabidopsis circadian clock. Planta 218: 159-162


80

Farré EM, Harmer SL, Harmon FG, Yanovsky MJ, Kay SA (2005) Overlapping and distinct roles of PRR7 and PRR9 in the Arabidopsis circadian clock. Curr Biol 15: 47-54

Favory JJ, Stec A, Gruber H, Rizzini L, Oravecz A, Funk M, Albert A, Cloix C, Jenkins GI, Oakeley EJ, Seidlitz HK, Nagy F, Ulm R (2009) Interaction of COP1 and UVR8 regulates UV-B-induced photomorphogenesis and stress acclimation in Arabidopsis. Embo J 28: 591-601

Fowler S, Lee K, Onouchi H, Samach A, Richardson K, Morris B, Coupland G, Putterill J (1999) GIGANTEA: a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering in Arabidopsis and encodes a protein with several possible membrane-spanning domains. Embo J 18: 4679-4688

Fritsche E, Schafer C, Calles C, Bernsmann T, Bernshausen T, Wurm M, Hubenthal U, Cline JE, Hajimiragha H, Schroeder P, Klotz LO, Rannug A, Furst P, Hanenberg H, Abel J, Krutmann J (2007) Lightening up the UV response by identification of the arylhydrocarbon receptor as a cytoplasmatic target for ultraviolet B radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 8851-8856

Frohnmeyer H, Loyall L, Blatt MR, Grabov A (1999) Millisecond UV-B irradiation evokes prolonged elevation of cytosolic-free Ca2+ and stimulates gene expression in transgenic parsley cell cultures. Plant J 20: 109-117

Frohnmeyer H, Staiger D (2003) Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant Physiol 133: 1420-1428

Furuya M (1989) Molecular properties and biogenesis of phytochrome I and II. Adv Biophys 25: 133-167

Furuya M, Schäfer E (1996) Photoperception and signalling of induction reactions by different phytochromes. Trends Plant Sci 1: 301-307

Galland P, Senger H. (1988) The role of flavins as photoreceptors. J. Photochem. Photobiol. B Biol. 1: 277–94

Galland P, Senger H. (1988) The role of pterins in the photoreception and metabolism of plants. Photochem. Photobiol. 48: 811–20

Gadjev I, Vanderauwera S, Gechev TS, Laloi C, Minkov IN, Shulaev V, Apel K, Inze D, Mittler R, Van Breusegem F (2006) Transcriptomic footprints disclose specificity of reactive oxygen species signaling in Arabidopsis. Plant Physiol 141: 436-445

Gerhardt KE, Wilson MI, Greenberg BM (2005) Ultraviolet wavelength dependence of photomorphological and photosynthetic responses in Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Photochem Photobiol 81: 1061-1068

Green R, Fluhr R (1995) UV-B-Induced PR-1 Accumulation Is Mediated by Active Oxygen Species. Plant Cell 7: 203-212

Green RM, Tobin EM (1999) Loss of the circadian clock-associated protein 1 in Arabidopsis results in altered clock-regulated gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 4176-4179

Hall A, Bastow RM, Davis SJ, Hanano S, McWatters HG, Hibberd V, Doyle MR, Sung S, Halliday KJ, Amasino RM, Millar AJ (2003) The TIME FOR COFFEE gene maintains the amplitude and timing of Arabidopsis circadian clocks. Plant Cell 15: 2719-2729

Harlow GR, Jenkins ME, Pittalwala TS, Mount DW (1994) Isolation of uvh1, an Arabidopsis mutant hypersensitive to ultraviolet light and ionizing radiation. Plant Cell 6: 227-235

Harmer SL (2009) The circadian system in higher plants. Annu Rev Plant Biol 60: 357-377

Harmer SL, Hogenesch JB, Straume M, Chang HS, Han B, Zhu T, Wang X, Kreps JA, Kay SA (2000) Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsis by the circadian clock. Science 290: 2110-2113

Hazen SP, Schultz TF, Pruneda-Paz JL, Borevitz JO, Ecker JR, Kay SA (2005) LUX ARRHYTHMO encodes a Myb domain protein essential for circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 10387-10392

Herrlich P, Bohmer FD (2000) Redox regulation of signal transduction in mammalian cells. Biochem Pharmacol 59: 35-41

Hicks KA, Millar AJ, Carré IA, Somers DE, Straume M, Meeks-Wagner DR, Kay SA (1996) Conditional circadian dysfunction of the Arabidopsis early-flowering 3 mutant. Science 274: 790-792

Ho MS, Ou C, Chan YR, Chien CT, Pi H (2008) The utility F-box for protein destruction. Cell Mol Life Sci 65: 1977-2000

Huq E, Tepperman JM, Quail PH (2000) GIGANTEA is a nuclear protein involved in phytochrome signaling in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 9789-9794

Ikeda M, Ohme-Takagi M (2009) A novel group of transcriptional repressors in Arabidopsis. Plant Cell Physiol 50: 970-975


81

Imaizumi T, Schultz TF, Harmon FG, Ho LA, Kay SA (2005) FKF1 F-box protein mediates cyclic degradation of a repressor of CONSTANS in Arabidopsis. Science 309: 293-297

Imaizumi T, Tran HG, Swartz TE, Briggs WR, Kay SA (2003) FKF1 is essential for photoperiodic-specific light signalling in Arabidopsis. Nature 426: 302-306

Imamoto Y, Kataoka M (2007) Structure and photoreaction of photoactive yellow protein, a structural prototype of the PAS domain superfamily. Photochem Photobiol 83: 40-49

Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28

Inskeep WP, Bloom PR (1985) Extinction coefficients of chlorophyll a and B in n,n-dimethylformamide and 80% acetone. Plant Physiol 77: 483-485

Ito S, Matsushika A, Yamada H, Sato S, Kato T, Tabata S, Yamashino T, Mizuno T (2003) Characterization of the APRR9 pseudo-response regulator belonging to the APRR1/TOC1 quintet in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 44: 1237-1245

Jansen, M.A.K., Gaba, V., and Greenberg, B.M. (1998). Higher plants and UV-B radiation: balancing damage, repair and acclimation (vol 3, pg 131, 1998) Trends Plant Sci. 3: 243-243.

Jenkins GI (2009) Signal transduction in responses to UV-B radiation. Annu Rev Plant Biol 60: 407-431

Jenkins GI, Brown BA. (2007) UV-B perception and signal transduction. In Light and Plant Development, ed. GC Whitlam, KJ Halliday, pp. 155–182. Oxford: Blackwell

Jenkins GI, Long JC, Wade HK, Shenton MR, Bibikova TN. (2001) UV and blue light signalling: pathways regulating chalcone synthase gene expression in Arabidopsis. New Phytol. 151: 121–31

Jenkins GI, Fuglevand G, Christie JM. (1997) UV-B perception and signal transduction. In Plants and UV-B:

Responses to Environmental Change, ed. P Lumsden, pp. 135–56. Cambridge: Cambridge Univ. Press

Jiang CZ, Yee J, Mitchell DL, Britt AB (1997) Photorepair mutants of Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 7441-7445

Johnson CH (1992) Phase Response Curves: what can they tell us about circadian clocks? In Circadian clocks from

cell to human, Hiroshige T, Honma K (eds), 1 edn, pp 209-249. Sapporo: Hokkaido University Press

Johnson KL, Ingram GC (2005) Sending the right signals: regulating receptor kinase activity. Curr Opin Plant Biol 8: 648-656

Josse EM, Foreman J, Halliday KJ (2008) Paths through the phytochrome network. Plant Cell Environ 31: 667-678

Kaczorowski KA, Quail PH (2003) Arabidopsis PSEUDO-RESPONSE REGULATOR7 is a signaling intermediate in phytochrome-regulated seedling deetiolation and phasing of the circadian clock. Plant Cell 15: 2654-2665

Kaiserli E, Jenkins GI (2007) UV-B promotes rapid nuclear translocation of the Arabidopsis UV-B specific signaling component UVR8 and activates its function in the nucleus. Plant Cell 19: 2662-2673

Kalbin G, Hidema J, Brosché M, Kumagai T, Bornman JF, Strid A. (2001) UV-B-induced DNA damage and expression of defence genes under UV-B stress: tissue-specific molecular marker analysis in leaves. Plant Cell Environ. 24: 983–90

Kalbina I, Li S, Kalbin G, Björn LO, Strid A. (2008) Two separate UV-B radiation wavelength regions control expression of different molecular markers in Arabidopsis thaliana. Funct. Plant Biol. 35: 222–27

Kerppola TK (2006) Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc 1: 1278-1286

Kevei É, Schäfer E, Nagy F (2007) Light-regulated nucleo-cytoplasmic partitioning of phytochromes. J Exp Bot 58: 3113-3124

Khanna R, Huq E, Kikis EA, Al-Sady B, Lanzatella C, Quail PH (2004) A novel molecular recognition motif necessary for targeting photoactivated phytochrome signaling to specific basic helix-loop-helix transcription factors. Plant Cell 16: 3033-3044

Khare M, Guruprasad KN. (1993) UV-B-induced anthocyanin synthesis in maize regulated by FMN and inhibitors of FMN photoreactions. Plant Sci. 91: 1–5

Kikis EA, Khanna R, Quail PH (2005) ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J 44: 300-313

Kim BC, Tennessen DJ, Last RL (1998) UV-B-induced photomorphogenesis in Arabidopsis thaliana. Plant J 15: 667-674

Kim JY, Song HR, Taylor BL, Carré IA (2003a) Light-regulated translation mediates gated induction of the Arabidopsis clock protein LHY. Embo J 22: 935-944


82

Kim WY, Fujiwara S, Suh SS, Kim J, Kim Y, Han L, David K, Putterill J, Nam HG, Somers DE (2007) ZEITLUPE is a circadian photoreceptor stabilized by GIGANTEA in blue light. Nature 449: 356-360

Kim WY, Geng R, Somers DE (2003b) Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 4933-4938

Kim WY, Hicks KA, Somers DE (2005) Independent roles for EARLY FLOWERING 3 and ZEITLUPE in the control of circadian timing, hypocotyl length, and flowering time. Plant Physiol 139: 1557-1569

Kipreos ET, Pagano M (2000) The F-box protein family. Genome Biol 1: REVIEWS3002

Kliebenstein DJ, Lim JE, Landry LG, Last RL (2002) Arabidopsis UVR8 regulates ultraviolet-B signal transduction and tolerance and contains sequence similarity to human regulator of chromatin condensation 1. Plant Physiol 130: 234-243

Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. (1994) Specialized vectors for gene tagging and expression studies. In Plant Molecular Biology Manual, Gelvin, B.S., Schilperoot, R.A. (eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 1-22.

Kozma-Bognár L, Káldi K (2008) Synchronization of the fungal and the plant circadian clock by light. Chembiochem 9: 2565-2573

Lakin-Thomas PL (2000) Circadian rhythms: new functions for old clock genes. Trends Genet 16: 135-142

Landry LG, Chapple CC, Last RL (1995) Arabidopsis mutants lacking phenolic sunscreens exhibit enhanced ultraviolet-B injury and oxidative damage. Plant Physiol 109: 1159-1166

Landry LG, Stapleton AE, Lim J, Hoffman P, Hays JB, Walbot V, Last RL (1997) An Arabidopsis photolyase mutant is hypersensitive to ultraviolet-B radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 328-332

Lee J, He K, Stolc V, Lee H, Figueroa P, Gao Y, Tongprasit W, Zhao H, Lee I, Deng XW (2007) Analysis of transcription factor HY5 genomic binding sites revealed its hierarchical role in light regulation of development. Plant Cell 19: 731-749

Li J, Ou-Lee TM, Raba R, Amundson RG, Last RL (1993) Arabidopsis Flavonoid Mutants Are Hypersensitive to UV-B Irradiation. Plant Cell 5: 171-179

Lin C, Shalitin D (2003) Cryptochrome structure and signal transduction. Annu Rev Plant Biol 54: 469-496

Liu Y, Tsinoremas NF, Johnson CH, Lebedeva NV, Golden SS, Ishiura M, Kondo T (1995) Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria. Genes Dev 9: 1469-1478

Locke JC, Kozma-Bognar L, Gould PD, Feher B, Kevei E, Nagy F, Turner MS, Hall A, Millar AJ (2006) Experimental validation of a predicted feedback loop in the multi-oscillator clock of Arabidopsis thaliana. Mol Syst Biol 2: 59

Locke JC, Southern MM, Kozma-Bognar L, Hibberd V, Brown PE, Turner MS, Millar AJ (2005) Extension of a genetic network model by iterative experimentation and mathematical analysis. Mol Syst Biol 1: 2005 0013

Lois R, Buchanan BB (1994) Severe sensitivity to ultraviolet radiation in an Arabidopsis mutant deficient in flavonoid accumulation. Planta 194: 504–509

Makino S, Matsushika A, Kojima M, Oda Y, Mizuno T (2001) Light response of the circadian waves of the APRR1/TOC1 quintet: when does the quintet start singing rhythmically in Arabidopsis? Plant Cell Physiol 42: 334-339

Martin-Tryon EL, Kreps JA, Harmer SL (2007) GIGANTEA acts in blue light signaling and has biochemically separable roles in circadian clock and flowering time regulation. Plant Physiol 143: 473-486

Martínez-García JF, Huq E, Quail PH (2000) Direct targeting of light signals to a promoter element-bound transcription factor. Science 288: 859-863

Más P, Devlin PF, Panda S, Kay SA (2000) Functional interaction of phytochrome B and cryptochrome 2. Nature 408: 207-211

Matsushika A, Imamura A, Yamashino T, Mizuno T (2002) Aberrant expression of the light-inducible and circadian-regulated APRR9 gene belonging to the circadian-associated APRR1/TOC1 quintet results in the phenotype of early flowering in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 43: 833-843

Matsushika A, Makino S, Kojima M, Mizuno T (2000) Circadian waves of expression of the APRR1/TOC1 family of pseudo-response regulators in Arabidopsis thaliana: insight into the plant circadian clock. Plant Cell Physiol 41: 1002-1012


83

McNellis TW, von Arnim AG, Araki T, Komeda Y, Miséra S, Deng XW (1994) Genetic and molecular analysis of an allelic series of cop1 mutants suggests functional roles for the multiple protein domains. Plant Cell 6: 487-500

Michael TP, Mockler TC, Breton G, McEntee C, Byer A, Trout JD, Hazen SP, Shen R, Priest HD, Sullivan CM, Givan SA, Yanovsky M, Hong F, Kay SA, Chory J (2008) Network discovery pipeline elucidates conserved time-of-day-specific cis-regulatory modules. PLoS genetics 4: e14

Millar AJ, Carre IA, Strayer CA, Chua NH, Kay SA (1995a) Circadian clock mutants in Arabidopsis identified by luciferase imaging. Science 267: 1161-1163

Millar AJ, Kay SA (1996) Integration of circadian and phototransduction pathways in the network controlling CAB gene transcription in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 15491-15496

Millar AJ, Straume M, Chory J, Chua NH, Kay SA (1995b) The regulation of circadian period by phototransduction pathways in Arabidopsis. Science 267: 1163-1166

Mizoguchi T, Wheatley K, Hanzawa Y, Wright L, Mizoguchi M, Song HR, Carré IA, Coupland G (2002) LHY and CCA1 are partially redundant genes required to maintain circadian rhythms in Arabidopsis. Dev Cell 2: 629-641

Moore JD (2001) The Ran-GTPase and cell-cycle control. Bioessays 23: 77-85

Nakajima S, Sugiyama M, Iwai S, Hitomi K, Otoshi E, Kim ST, Jiang CZ, Todo T, Britt AB, Yamamoto K (1998) Cloning and characterization of a gene (UVR3) required for photorepair of 6-4 photoproducts in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res 26: 638-644

Nakamichi N, Kita M, Ito S, Sato E, Yamashino T, Mizuno T (2005a) The Arabidopsis pseudo-response regulators, PRR5 and PRR7, coordinately play essential roles for circadian clock function. Plant Cell Physiol 46: 609-619

Nakamichi N, Kita M, Ito S, Yamashino T, Mizuno T (2005b) PSEUDO-RESPONSE REGULATORS, PRR9, PRR7 and PRR5, together play essential roles close to the circadian clock of Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 46: 686-698

Nelson DC, Lasswell J, Rogg LE, Cohen MA, Bartel B (2000) FKF1, a clock-controlled gene that regulates the transition to flowering in Arabidopsis. Cell 101: 331-340

Ni M, Tepperman JM, Quail PH (1998) PIF3, a phytochrome-interacting factor necessary for normal photoinduced signal transduction, is a novel basic helix-loop-helix protein. Cell 95: 657-667

Oklejewicz M, Destici E, Tamanini F, Hut RA, Janssens R, van der Horst GT (2008) Phase resetting of the mammalian circadian clock by DNA damage. Curr Biol 18: 286-291

Onai K, Ishiura M (2005) PHYTOCLOCK 1 encoding a novel GARP protein essential for the Arabidopsis circadian clock. Genes Cells 10: 963-972

Oravecz A, Baumann A, Mate Z, Brzezinska A, Molinier J, Oakeley EJ, Adam E, Schafer E, Nagy F, Ulm R (2006) CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC1 is required for the UV-B response in Arabidopsis. Plant Cell 18: 1975-1990

Park DH, Somers DE, Kim YS, Choy YH, Lim HK, Soh MS, Kim HJ, Kay SA, Nam HG (1999) Control of circadian rhythms and photoperiodic flowering by the Arabidopsis GIGANTEA gene. Science 285: 1579-1582

Plautz JD, Straume M, Stanewsky R, Jamison CF, Brandes C, Dowse HB, Hall JC, Kay SA (1997) Quantitative analysis of Drosophila period gene transcription in living animals. J Biol Rhythms 12: 204-217

Pope B, Kent HM (1996) High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 24: 536-537

Pruneda-Paz JL, Breton G, Para A, Kay SA (2009) A functional genomics approach reveals CHE as a component of the Arabidopsis circadian clock. Science 323: 1481-1485

Renault L, Nassar N, Vetter I, Becker J, Klebe C, Roth M, Wittinghofer A (1998) The 1.7 A crystal structure of the regulator of chromosome condensation (RCC1) reveals a seven-bladed propeller. Nature 392: 97-101

Rizzini L, Favory JJ, Cloix C, Faggionato D, O'Hara A, Kaiserli E, Baumeister R, Schafer E, Nagy F, Jenkins GI, Ulm R (2011) Perception of UV-B by the Arabidopsis UVR8 protein. Science 332: 103-106

Roenneberg T, Merrow M (1998) Molecular circadian oscillators: an alternative hypothesis. J Biol Rhythms 13: 167-179

Savenstrand H, Brosche M, Strid A (2004) Ultraviolet-B signalling: Arabidopsis brassinosteroid mutants are defective in UV-B regulated defence gene expression. Plant Physiol Biochem 42: 687-694

Sawa M, Nusinow DA, Kay SA, Imaizumi T (2007) FKF1 and GIGANTEA complex formation is required for day-length measurement in Arabidopsis. Science 318: 261-265


84

Schaffer R, Ramsay N, Samach A, Corden S, Putterill J, Carré IA, Coupland G (1998) The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering. Cell 93: 1219-1229

Schultz TF, Kiyosue T, Yanovsky M, Wada M, Kay SA (2001) A role for LKP2 in the circadian clock of Arabidopsis. Plant Cell 13: 2659-2670

Shalitin D, Yu X, Maymon M, Mockler T, Lin C (2003) Blue light-dependent in vivo and in vitro phosphorylation of Arabidopsis cryptochrome 1. Plant Cell 15: 2421-2429

Sharrock RA, Clack T (2004) Heterodimerization of type II phytochromes in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11500-11505

Somers DE, Devlin PF, Kay SA (1998a) Phytochromes and cryptochromes in the entrainment of the Arabidopsis circadian clock. Science 282: 1488-1490

Somers DE, Schultz TF, Milnamow M, Kay SA (2000) ZEITLUPE encodes a novel clock-associated PAS protein from Arabidopsis. Cell 101: 319-329

Somers DE, Webb AA, Pearson M, Kay SA (1998b) The short-period mutant, toc1-1, alters circadian clock regulation of multiple outputs throughout development in Arabidopsis thaliana. Development 125: 485-494

Song HR, Carré IA (2005) DET1 regulates the proteasomal degradation of LHY, a component of the Arabidopsis circadian clock. Plant Mol Biol 57: 761-771

Southern MM, Millar AJ (2005) Circadian genetics in the model higher plant, Arabidopsis thaliana. Methods

Enzymol 393: 23-35

Staiger D, Allenbach L, Salathia N, Fiechter V, Davis SJ, Millar AJ, Chory J, Fankhauser C (2003) The Arabidopsis

SRR1 gene mediates phyB signaling and is required for normal circadian clock function. Genes Dev 17: 256-268

Stracke R, Favory JJ, Gruber H, Bartelniewoehner L, Bartels S, Binkert M, Funk M, Weisshaar B, Ulm R (2010) The Arabidopsis bZIP transcription factor HY5 regulates expression of the PFG1/MYB12 gene in response to light and ultraviolet-B radiation. Plant Cell Environ 33: 88-103

Stratmann J (2003) Ultraviolet-B radiation co-opts defense signaling pathways. Trends Plant Sci 8: 526-533

Suesslin C, Frohnmeyer H (2003) An Arabidopsis mutant defective in UV-B light-mediated responses. Plant J 33: 591-601

Surplus SL, Jordan BR, Murphy AM, Carr JP, Thomas B, A-H-Mackerness S. (1998) Ultraviolet-Binduced responses in Arabidopsis thaliana: role of salicylic acid and reactive oxygen species in the regulation of transcripts encoding photosynthetic and acidic pathogenesis-related proteins. Plant Cell Environ. 21: 685–94

Tepperman JM, Zhu T, Chang HS, Wang X, Quail PH (2001) Multiple transcription-factor genes are early targets of phytochrome A signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9437-9442

Thines B, Harmon FG (2010) Ambient temperature response establishes ELF3 as a required component of the core Arabidopsis circadian clock. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 3257-3262

Tóth R, Kevei É, Hall A, Millar AJ, Nagy F, Kozma-Bognár L (2001) Circadian clock-regulated expression of phytochrome and cryptochrome genes in Arabidopsis. Plant Physiol 127: 1607-1616

Ulm R, Baumann A, Oravecz A, Mate Z, Adam E, Oakeley EJ, Schafer E, Nagy F (2004) Genome-wide analysis of gene expression reveals function of the bZIP transcription factor HY5 in the UV-B response of Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 1397-1402

Viczián A, Kircher S, Fejes E, Millar AJ, Schäfer E, Kozma-Bognár L, Nagy F (2005) Functional characterization of phytochrome interacting factor 3 for the Arabidopsis thaliana circadian clockwork. Plant Cell Physiol 46: 1591-1602

Wade HK, Bibikova TN, Valentine WJ, Jenkins GI (2001) Interactions within a network of phytochrome, cryptochrome and UV-B phototransduction pathways regulate chalcone synthase gene expression in Arabidopsis leaf tissue. Plant J 25: 675-685

Wang ZY, Kenigsbuch D, Sun L, Harel E, Ong MS, Tobin EM (1997) A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of an Arabidopsis Lhcb gene. Plant Cell 9: 491-507

Wang ZY, Tobin EM (1998) Constitutive expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) gene disrupts circadian rhythms and suppresses its own expression. Cell 93: 1207-1217

Xiao W, Jang J (2000) F-box proteins in Arabidopsis. Trends Plant Sci 5: 454-457


85

Yakir E, Hilman D, Hassidim M, Green RM (2007) CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcript stability and the entrainment of the circadian clock in Arabidopsis. Plant Physiol 145: 925-932

Yamamoto Y, Sato E, Shimizu T, Nakamich N, Sato S, Kato T, Tabata S, Nagatani A, Yamashino T, Mizuno T (2003) Comparative genetic studies on the APRR5 and APRR7 genes belonging to the APRR1/TOC1 quintet implicated in circadian rhythm, control of flowering time, and early photomorphogenesis. Plant Cell Physiol 44: 1119-1130

Yanovsky MJ, Mazzella MA, Casal JJ (2000a) A quadruple photoreceptor mutant still keeps track of time. Curr Biol 10: 1013-1015

Yanovsky MJ, Mazzella MA, Whitelam GC, Casal JJ (2001) Resetting of the circadian clock by phytochromes and cryptochromes in Arabidopsis. J Biol Rhythms 16: 523-530

Yanovsky MJ, Whitelam GC, Casal JJ (2000b) fhy3-1 retains inductive responses of phytochrome A. Plant Physiol 123: 235-242

Yasuhara M, Mitsui S, Hirano H, Takanabe R, Tokioka Y, Ihara N, Komatsu A, Seki M, Shinozaki K, Kiyosue T (2004) Identification of ASK and clock-associated proteins as molecular partners of LKP2 (LOV kelch protein 2) in Arabidopsis. J Exp Bot 55: 2015-2027

Yi C, Deng XW (2005) COP1 - from plant photomorphogenesis to mammalian tumorigenesis. Trends Cell Biol 15: 618-625

Yu JW, Rubio V, Lee NY, Bai S, Lee SY, Kim SS, Liu L, Zhang Y, Irigoyen ML, Sullivan JA, Lee I, Xie Q, Paek NC, Deng XW (2008) COP1 and ELF3 control circadian function and photoperiodic flowering by regulating GI stability. Mol Cell 32: 617-630

Yu X, Klejnot J, Zhao X, Shalitin D, Maymon M, Yang H, Lee J, Liu X, Lopez J, Lin C (2007a) Arabidopsis cryptochrome 2 completes its posttranslational life cycle in the nucleus. Plant Cell 19: 3146-3156

Yu X, Shalitin D, Liu X, Maymon M, Klejnot J, Yang H, Lopez J, Zhao X, Bendehakkalu KT, Lin C (2007b) Derepression of the NC80 motif is critical for the photoactivation of Arabidopsis CRY2. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 7289-7294

Zeilinger MN, Farré EM, Taylor SR, Kay SA, Doyle FJ, 3rd (2006) A novel computational model of the circadian clock in Arabidopsis that incorporates PRR7 and PRR9. Mol Syst Biol 2: 58

Zikihara K, Iwata T, Matsuoka D, Kandori H, Todo T, Tokutomi S (2006) Photoreaction cycle of the light, oxygen, and voltage domain in FKF1 determined by low-temperature absorption spectroscopy. Biochemistry 45: 10828-10837

ÖSSZEFOGLALÁS

A Földön nem minden környezeti tényező változása véletlenszerű. Bolygónk tengely

körüli forgása következtében a felszínen a fény erőssége, összetétele és a hőmérséklet

24 óránként ismétlődő mintázat szerint változik. Ehhez a kiszámítható jelenséghez

szinte minden földi élőlény alkalmazkodott. Kifejleszettek egy általánosan elterjedt belső

időmérő mechanizmust, a cirkadián órát, melynek segítségével életfolyamataikat

képesek bizonyos napszakokhoz igazítani, valamint a környezet napszakos változásaira

felkészülni. A fotoszintetizáló élőlények számára a fény az elsőrendű energiaforrás, ezért

számukra különösen fontos, hogy ezt az erőforrást minél hatékonyabban tudják

hasznosítani. Ennek feltétele, hogy már napfelkelte előtt felkészítsék fényelnyelő és

hasznosító, valamint a fénykárosodástól védő apparátusaikat. A cirkadián rendszer

megfelelő működéséhez a belső biológiai óra által mért időnek azonos fázisban kell

lennie az abszolút, környezetben mérhető idővel. A cirkadián óra és a környezetben

mért idő szinkronizációja a biológiai óra újra és újra történő beállításával valósul meg,

amely folyamatban ritmikusan változó környezeti faktorok vesznek részt. A növényi

cirkadián óra legfontosabb beállító tényezője a fény. A vörös/távoli vörös fényelnyelésű

fitokrómok, illetve a kék fényelnyelésű kriptokrómok szerepe a cirkadián óra

fotoreceptoraként már bizonyított Arabidopsisban (Somers és mtsai, 1998a; Devlin és

Kay, 2000).

Munkánk során az alacsony intenzitású UV-B kapcsolatát vizsgáltuk a cirkadián

órával. Eddig semilyen adat nem volt arról, hogy a fénynek ez a természetes

komponense befolyásolja-e a cirkadián óra működését, illetve az alacsony intenzitású

UV-B érzékelésében kulcsfontosságú UVR8, COP1, HY5 illetve HYH fehérjék milyen

szerepet játszanak az UV-B jelek közvetítésében a cirkadián órához. Vizsgáltuk továbbá,

hogy a cirkadián óra szabályozza-e az UV-B által kiváltott élettani folyamatokat, szerepet

játszik-e az UV-B védelemben.

ÖSSZEFOGLALÁS ______________________________________________________________________________________________________

87

A cirkadián óra UV-B fénnyel való beállíthatóságának vizsgálata során kapott

eredmények alapján az alábbi következtetéseket tehetjük:

• Vad típusú növényekben a cirkadián óra periódusa alacsony intenzitású UV-B

hatására fényintenzitás függő módon rövidül.

• Az uvr8 mutáns növényben a periódus nem rövidül alacsony intenzitású UV-B

hatására, viszont a látható fény a vad típushoz hasonlóan rövidíti a periódust. A

kísérlet megerősíti azt a korábbi megfigyelést, miszerint az uvr8 mutáns UV-B

hiányában megkülönböztethetetlen a vad típustól.

• A cop1 mutáns növények periódusa sem rövidül alacsony intenzitású UV-B

hatására.

• A hy5 hyh mutáns növények periódusa nem tér el a vad típusétól, sem fehér, sem

UV-B-vel kiegészített fehér fényben. Mivel a HY5-ről korábban leírták, hogy in

vivo kötődik több óragén (CCA1, LHY, TOC1, ELF4) promóteréhez, felvetődik, hogy

ennek ellenére sem vesz részt a cirkadián szabályozásban.

• Alacsony intenzitású UV-B pulzusok hatására vad típusú növényekben fáziskésés

figyelhető meg a szubjektív éjszaka során és nem tapasztalható fázisváltozás a

szubjektív nappal alatt.

• Sem az uvr8, sem a cop1 mutáns növények nem mutatnak fázisváltozást alacsony

intenzitású UV-B pulzusok hatására.

• Az uvr8 mutáns növények látható fénypulzusokra adott fázisváltozásaikban vad

típusú válaszokat adnak minden általunk vizsgált körülményben. Látható fényben

szintén nem okoz fenotípust a mutáció.

ÖSSZEFOGLALÁS ______________________________________________________________________________________________________

88

A cirkadián óra UV-B által kiváltott fényindukciókra gyakorolt hatásának vizsgálata

alapján az alábbi megállapítások tehetőek:

• Minden általunk vizsgált fényérzékeny óragén (CCA1, PRR9, GI, ELF4) indukálható

volt alacsony intenzitású UV-B vel is. Az indukciójuk kapuzott mintázatot

mutatott. A legnagyobb mértékű indukciót a PRR9 mutatta, a megemelkedett

PRR9 szint magában magyarázhatja a periódus rövidülését

• Az uvr8 mutánsban a központi óra általunk vizsgált minden eleme a vad típusnak

megfelelő szinten volt UV-B hiányában és egyik sem volt indukálható UV-B

pulzusokkal.

• A cop1 mutáció az uvr8 hoz hasonlóan eltörölte az óragének UV-B

indukálhatóságát.

• Az általunk vizsgált kettős (cirkadián és közvetlen fény) szabályozású gének nagy

része kapuzott indukciót mutatott alacsony intenzitású UV-B fénypulzusok

hatására.

• A HY5 UV-B indukcióját nem szabályozza a cirkadián óra. A HYH átíródását

viszont igen. Elképzelhető, hogy a két fehérje heterodimerként összekapcsolódva

működik és ez esetben a HYH cirkadián átíródási szabályzása kihat a komplex

működésére.

• Az általunk vizsgált nem cirkadián kifejeződésű, de UV-B indukálható gének

szintén kapuzott indukciót mutattak alacsony intenzitású UV-B pulzusok

hatására. A maximális indukciók – akár a többi vizsgált nem óragén esetében - a

reggeli/délelőtti órákban voltak, ami feltételezi azt, hogy a növény számára ekkor

a legfontosabb az alacsony intenzitású UV-B jel érzékelése. Ennek hatására építi

fel UV-B elleni védelmét a később érkező nagyobb intenzitású sugárzással

szemben.

ÖSSZEFOGLALÁS ______________________________________________________________________________________________________

89

A megvizsgált aritmiás növényekben (elf3, CCA1-OX) nem volt tapasztalható kapuzás,

azonban majdnem minden megvizsgált gén magasabb indukciót mutatott, mint a vad

típusban. A minden időpontban magasabb indukció azonban nem tette védettebbé

ezeket a növényeket a nagy intenzitású UV-B sugárzással szemben. Ez arra utal, hogy

egy rövid idejű, alacsony intenzitású UV-B függő génexpresszió és az azt követő

flavonoid felhalmozás a nap egy rövid szakaszán elégséges a normális védelemhez a

nagy intenzitású UV-B káros hatásaival szemben.

Összegezve az eredményeket megállapítható, hogy a növényi cirkadián óra

beállítható UV-B fénnyel, és ebben az UVR8 és COP1 fehérjék kulcsfontosságúak. A HY5

és HYH transzkripciós faktorok nem komponensei a cirkadián óra fénybemenetének

sem UV-B-ben sem látható fényben. A központi óra fényindukálható génjei UV-B

indukálhatóak is, a cirkadián óra pedig kapuzza a legtöbb UV-B indukálható gén UV-B

indukcióját, a nem cirkadián kifejeződésű génekét is beleértve. Az egyetlen általunk

talált kivétel a HY5 UV-B indukciója volt, mely nincsen cirkadián szabályozás alatt,

szemben a gén vörös indukciójával, mely kapuzott. Az uvr8 és cop1 mutánsokban nem

figyelhető meg egyáltalán UV-B génindukció, míg a hy5 hyh kétszeres mutánsban a

központi óra génjeinek UV-B indukciója nem változott a vad típushoz képest. A vizsgált

aritmiás mutánsokban nincs kapuzása az UV-B indukcióknak. A vizsgált gének indukciós

szintje általánosan magasabb a mutáns növényekben a vad típushoz képest. A nagyobb

indukció viszont nem ad számukra nagyobb védettséget a nagy intenzitású

UV-B sugárzással szemben.

SUMMARY

Introduction Circadian clocks are ubiquitous biochemical timing mechanisms that rhythmically

regulate a wide range of molecular and physiological processes in most of the living

organisms exposed to the daily succession of days and nights (Harmer, 2009). Due to the

function of the clock, certain processes are timed to the most appropriate time of the day

and are attenuated, when they are not needed. This temporal organization results in

significant saving of chemical energy and contributes to the fitness of the organism

(Dodd et al., 2005).

In Arabidopsis the central oscillator relies on the function of three regulatory circuits

(Locke et al., 2006). The “morning loop” consists of the Myb-related CIRCADIAN CLOCK

ASSOCIATED 1 (CCA1) and the LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) transcription

factors, which facilitate the transcription of the PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7/9

(PRR7/9) genes in the morning. PRR7/9 proteins inhibit transcription of CCA1/LHY

during the day (Farré et al., 2005). The evening loop is formed by TIMING OF CAB

EXPRESSION 1 (TOC1) and the hypothetical component Y. Y positively regulates TOC1

expression in the evening, whereas TOC1 attenuates Y expression during the night.

GIGANTEA (GI) has been proposed to contribute to the function of Y (Locke et al., 2005).

The morning and evening loops are coupled by a third circuit, where TOC1 indirectly

induces transcription of CCA1/LHY during the late night and CCA1/LHY inhibit TOC1

expression in the morning (Alabadi et al., 2001). The coordinated function of these three

circuits is required to generate the basic oscillation in the level of the clock.

The biological impact of the clock depends on the synchrony between the subjective

time provided by the oscillator and the real time of the environment. To achieve this, the

phase of the oscillator is reset to the day/night cycles by periodic environmental signals

among which light is the most significant. Light is perceived by photoreceptors and

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

91

signals are transduced to the oscillator via the light input pathway, where they affect the

level and/or activity the clock components (Kozma-Bognar and Kaldi, 2008).

UV-B light has long been known as a harmful component of the sunlight causing

damage to DNA, protein and other macromolecules capable of direct absorption of these

wavelengths of light (Jansen et al., 1998). However, UV-B at lower fluence rates has been

shown to act as an environmental signal to control development, promote

photomorphogenesis and drive the expression of genes required for the production of

flavonoids (Ulm et al., 2004; Brown et al., 2005). Although the photoreceptor, which is

thought to mediate all of the UV-B effects, is still unknown, several components of the

signaling cascade have been identified recently. UV RESISTANCE LOCUS 8 (UVR8) is a

protein required for virtually all physiological UV-B responses, indicating that it is

located very close to the putative receptor in the signaling cascade (Favory et al., 2009)

or it is the low fluence UV-B photoreceptor itself (Rizzini et al., 2011). UVR8 is highly

specialized for UV-B signal transduction since uvr8 mutants show UV-B-dependent

phenotypes only (Brown et al., 2005; Favory et al., 2009). The E3 ubiquitin ligase

CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) physically interacts with UVR8 in a

UV-B dependent manner and this interaction is suggested to be required for signaling

(Favory et al., 2009). Under supplementary UV-B, COP1 promotes transcription of the

ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5) gene (Favory et al., 2009). HY5 and HY5 HOMOLOG

(HYH) act as transcription factors and play crucial roles in mediating molecular and

physiological processes in response to photomorphogenic UV-B light (Ulm et al., 2004;

Brown and Jenkins, 2008; Stracke et al., 2010). Low intensity UV-B light induces the

expression of genes implicated in flavonoid biosynthesis. In turn, accumulation of UV-B

absorbing flavonoids confers protection to plants against the damaging effects of

highintensity UVB, which is apparent under natural conditions (Stracke et al., 2010).

Research objectives

Entrainment is required to set and maintain the correct and stable phase-relationship

between the endogenous circadian clock and environmental light/dark cycle. Since UV-B

is an important component of sunlight, we ought to test if low intensity, non-damaging

UV-B contributes to the light-mediated entrainment of the circadian clock in Arabidopsis.

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

92

Most biochemical processes are organized by the circadian clock. This timing results

in saving of resources and improves fitness. Therefore we want to know, how does the

circadian clock regulate the UV-B responsive processes.

Results

UV-B light mediates entrainment of the plant circadian clock

The function of the light input pathway affects the pace or the phase of the oscillator,

depending on the light conditions. In plants, continuous irradiation shortens the

reerunning period length in a fluence rate dependent manner. To test the effect of UV-B

in this process, WT, uvr8-6, cop1-4, and hy5 hyh mutant plants expressing the CCR2:LUC+

reporter were grown in 12/12 LD cycles for a week and transferred to continuous white

light (WLL) or WLL supplemented by UVB of different fluence rates. Rhythmic

CCR2:LUC+ expression was monitored and freerunning periods were calculated. UV-B

shortens the period in WT and in hy5 hyh mutant a fluence rate dependent manner, but

not in uvr8-6 and in cop1-4 mutants. The effect of the uvr8-6 mutation is specific for UV-

B light, since it does not affect period length in plants free-running in WLL or in

darkness.

In contrast to the effect of continuous irradiation, discrete light pulses elicit

characteristic phase shifts of the free-running oscillator. Phase response curves (PRCs)

are constructed by plotting the magnitude of the phase change against the circadian time

when the light pulse was administered. It has been demonstrated that red or blue light

pulses given during the early or late subjective night trigger phase delays (negative

phase changes) or phase advances (positive phase changes), respectively (Covington et

al., 2001). To test the effect of UV-B in phase re-setting, plants described above were

grown in 12/12 LD cycles for a week and transferred to WLL. Short UV-B pulses

(1.5 μmol m-2 s-1 for 30 min) were given to parallel sets of plants in every 3 hr starting at

36 hr after the transfer to WLL. The magnitude and direction of phase shifts of

CCR2:LUC+ expression were determined relative to the non-pulsed control plants. UV-B

pulses cause phase delays during the subjective night, but apparently have no effect

during the subjective day in WT plants. In contrast, no significant phase shifts were

detected in uvr8-6 or in cop1-4 mutant plants at any time of the circadian cycle. On the

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

93

other hand, when red, blue or white light pulses were used to induce phase shifts in

plants free-running in DD, WT and uvr8-6 plants displayed identical PRCs with the shape

consistent with published data (Covington et al., 2001). Collectively, these data

demonstrate that UV-B light does entrain the plant circadian clock, and UVR8 and COP1

play essential roles in this process.

UV-B acutely induces transcription of core clock genes

The precise molecular mechanism by which light signals entrain the plant circadian

oscillator is not fully understood yet, but light-modulated transcription of core oscillator

genes is thought to contribute to this process. In Arabidopsis, transcription of clock

genes CCA1, LHY, PRR9 and GI and the clock-associated gene ELF4 is acutely induced by

visible light (Wang et al., 1997; Tepperman et al., 2001; Locke et al., 2005; Ito et al.,

2003; Kikis et al., 2005). Induction of these rhythmically expressed genes is gated by the

clock, which means that the same light treatment causes maximal induction at the time

around the circadian peak of a given gene, but only a small increase is detected at the

time of the circadian trough.

To see if UV-B affects the transcription of clock genes in Arabidopsis, the acute

induction of CCA1, PRR9, GI and ELF4 genes was tested by quantitative RT-PCR. WT,

uvr8-6 and cop1-4 plants were grown in 12/12 LD cycles for a week and transferred to

WLL. Plants were irradiated by UV-B (1.5 μmol m-2 s-1 for 30 min) at 3 hr intervals

starting from 36 hr after the transfer, returned to WLL and harvested 1 hr later. The

control, non-pulsed samples were harvested at 3 hr intervals and provided data on the

basal expression of the corresponding genes. CCA1, PRR9, GI and ELF4 showed acute and

gated induction in response to UV-B pulses. The uvr8-6 mutation had no effect on the

basal circadian expression of these genes, but eliminated the response to UV-B pulses. In

contrast, the early phase and short period phenotype of the cop1-4 mutation was clearly

seen in the case of all clock genes tested and UV-B induction of all tested was

diminished. Expression of the clock gene TOC1 is not affected by visible light, and TOC1

is not affected by UV-B light either. These data suggest that UV-B induces the expression

of a very similar set of clock genes as visible light and demonstrate that UVR8 regulates

clock gene expression in response to UV-B, but not visible light.

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

94

Circadian gated induction of rhythmic and non-rhythmic genes

The circadian clock rhythmically attenuates visible light responses (Hotta et al.,

2007). To see if UV-B responses are influenced similarly, UV-B induced circadian genes

CHALCONE SYNTHASE (CHS, At5g13930), GLUTATHIONE PEROXIDASE 7 (GPX7,

At4g31870), EARLY LIGHT INDUCED PROTEIN 2 (ELIP2, At4g14690), ELONGATED

HYPOCOTYL 5 (HY5, At5g11260) and HY5-HOMOLOG (HYH, At3g17609) and non-

circadian genes (At3g16350 and At3g57830) were selected and their UV-B inducibility

was tested in WT, uvr8-6 and cop1-4 plants. Induction of CHS, GPX7, ELIP2 and HYH

showed clear circadian control with amplitude comparable to that of the clock genes. In

contrast, inducibility of HY5 did not display any circadian patterns. To see if the lack of

gating is general for any light responses of HY5, the effect of red light pulses was tested

in a “classical” gating experiment. Plants were grown in 12/12 LD cycles for a week and

transferred to DD. Red light pulses (40 μmol m-2 s-1 for 60 min) were given at 3 hr

intervals and HY5 and HYH mRNA levels were determined in pulsed and nonpulsed

samples. It seems, red light induction of HY5 and HYH is gated by the clock.

Interestingly, UV-B induction of the non-rhythmic At3g16350 and At3g57830 genes

showed clear circadian modulation, and the maximal induction was detected around

mid-day. To see if the low expression level of these two genes in the absence of UV-B

masks circadian rhythmicity, we measured transcript levels in plants transferred to WLL

supplemented with low intensity UV-B. We conclude, despite the elevated expression

levels under these conditions, these genes are expressed non-rhythmically.

UV-B induction of all genes tested was completely eliminated in uvr8-6 or cop1-4

plants. The uvr8-6 mutation had no effects on basal expression levels/patterns, but

cop1-4 caused an early phase/short period phenotype as expected. Moreover, the basal

expression level of CHS, ELIP2 and HY5 was elevated in cop1-4 plants. Taken together,

these data suggest that -at least regarding gene expression- gating of UV-B and visible

light induction is differently regulated.

HY5 and HYH are not essential for UV-B induction or for gating

The HY5 and HYH transcription factors were suggested to control the UV-B induction

of most responsive genes in Arabidopsis (Brown and Jenkins, 2008). To test their

function in our conditions and for the particular target genes used in this study, a UV-B

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

95

gating experiment was performed using hy5 hyh double mutant plants. The growth and

induction conditions were essentially the same as described in the previous sections. In

double mutant plants the basal expression level and UV-B induction of CCA1 and PRR9

was only slightly affected, whereas gating was clearly retained. In contrast, expression of

CHS was severely reduced and UV-B induction was completely lost in hy5 hyh, as

described before (Brown and Jenkins, 2008; Stracke et al., 2010). In the case of

At3g16350 UV-B induction was diminished, but not completely lost. Importantly, the

retained inducibility showed clear circadian gating. Collectively, these results

demonstrate that UV-B induction of clock genes does not rely on HY5/HYH and

circadian modulation of UV-B induced gene expression is not mediated by these

transcription factors.

Circadian gating of UV-B induced gene expression is lost in the

arrhythmic elf3-4 mutant and CCA1-OX plants

Circadian modulation of UV-B induction is provided by the circadian clock. In

principle, if clock regulation is eliminated, gating is lost, but UV-B inducibility should be

retained at a certain constant level. To test this, UV-B induced gene expression was

investigated in plants with non-functional circadian clocks. CCA1 showed low and

constitutive basal expression level, whereas PRR9 was expressed at high and

constitutive level in non-induced elf3-4 plants, in agreement with published data

(Alabadi et al., 2001; Kim et al., 2005; Thines and Harmon, 2010). The clock-controlled

CHS and the non-rhythmic At3g16350 showed increased basal expression levels in

elf3-4, similarly to PRR9. UV-B induction of all tested genes displayed constitutive, non-

gated pattern in elf3-4. The induced mRNA levels of PRR9, GI, CHS and At3g16350 in

elf3-4 were similar to or higher than the maximal induced levels in WT.

Analysis of the arrhythmic line constitutively over-expressing CCA1 (CCA1-OX, line 38

(Wang and Tobin, 1998) yielded similar results. UV-B irradiation resulted in high levels

of gene induction independent of the time of the treatment. Interestingly, two-fold

induction of CCA1 was observed in the CCA1-OX line. Since the 35S promoter is not up-

regulated by UV-B (Boyko et al., 2010), this result suggests an effect of UV-B on the

stability of CCA1 mRNA. These data indicate that rhythmic gating is lost, but UV-B

induction of gene expression is retained in these arrhythmic lines.

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

96

Physiological impact of clock-modulated UV-B induction

The observed hypersensitivity of UV-B dependent gene expression has suggested that

elf3-4 mutant plants could be more tolerant to UV-B stress compared to WT. To test this

hypothesis, plants were grown in 12/12 LD cycles for a week, transferred to continuous

white light supplemented with UV-B (1.5 μmol m-2 s-1) and were given high-intensity

(14 μmol m-2 s-1) UV-B pulse for 20 min in the subjective morning (24h after the

transfer) and in the subjective evening (35h after the transfer). Plants were returned to

normal growth conditions and analyzed one week later. WT and elf3-4 plants were

similarly affected by the UV-B pulse, indicating that the particular high induced levels of

genes dependent on low intensity UV-B do not confer resistance to elf3-4 plants against

high intensity UV-B. The elf3-4 mutant accumulates less chlorophyll than WT, but the

UV-B induced decrease is the same in both genotypes. Moreover, the effect of stressing

UV-B pulses was independent of the time of the day in both genotypes.

Discussion

UV-B light mediates the entrainment of the plant circadian clock

Entraining light signals affect different parameters of the free-running clock,

depending on the duration of irradiation. In plants, continuous irradiation shortens the

free-running period length in a fluence rate dependent manner, whereas light pulses

elicit discrete phase shifts of the oscillator. Our data demonstrate that UV-B acts as a

signal for both modes of entrainment. In WT seedlings the clock output markers

exhibited significantly (1-2 h) shorter free-running periods if continuous white light was

supplemented by low fluences of UV-B. UV-B pulses applied to plants free-running in

WLL were effective in causing phase delays during the night, but no phase shifts were

elicited during the day.

To provide a possible molecular mechanism for UV-B mediated entrainment, the

inducibility of the core clock genes CCA1, PRR9, GI and the clock-associated gene ELF4

was tested over one circadian cycle. All genes showed rhythmically gated UV-B

induction in WT seedlings and that their induction was eliminated in uvr8-6 and cop1-4

plants. Surprisingly, the loss of HY5/HYH did not affect the period length of the clock in

WL or in UV-B and the UV-B inducibility of clock genes. These findings are somewhat

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

97

unexpected as HY5 was shown (i) to bind in vivo to the promoters of several clock genes,

including CCA1, LHY, ELF4 and TOC1 in seedlings grown in WL (Lee et al., 2007), (ii) the

hy5 and hy5 hyh double mutant, similarly to uvr8, is impaired in UV-B dependent

photomorphogenesis, (Ulm et al., 2004; Oravecz et al., 2006) and (iii) hy5 was thought to

mediate UV-B inducibility of the majority of genes regulated by UVR8 and COP1 (Brown

et al., 2005; Oravecz et al., 2006).

Taken together, the correlation of physiological (modulation of period length) and

molecular (clock gene induction) data from UV-B signaling mutants suggests that this

effect of UV-B is mediated through the transcriptional regulation of clock genes. Among

the clock genes tested, PRR9 showed the most significant induction to UV-B. The

elevated level of PRR9 in continuous UV-B light could explain the effect of UV-B on

period length, since over-expression of PRR9 resulted in a similar degree of period

shortening (Matsushika et al., 2002).

The circadian clock rhythmically modulates UV-B induction of

responsive genes

Circadian gating is the process by which the clock rhythmically inhibits the acute

effect of environmental or endogenous signals on the corresponding target processes.

UV-B induction of all but one tested clock and clock-controlled genes, including HYH,

was gated by the clock in a manner similar to gating visible light responses. The only, but

significant exception was HY5, which showed a flat, non-gated induction by UV-B but a

gated induction by red light over the time course tested. These results demonstrate that

the signaling pathway mediating the UV-B induction of HY5 is not targeted by the clock

and it is different from the cascades transducing visible light signals to HY5.

Unexpectedly, UV-B induction of the non-rhythmic At3g16350 and At3g57830 showed

clear circadian gating with peak levels of induction at the middle of the subjective day.

Gating is not restricted to a single time of day, but works for a range of genes with

markedly different phases of expression. Therefore the mechanism underlying gating

could be explained by UV-B signaling components acting in parallel routes and

controlled by the clock in different phases. UVR8 is transcribed rhythmically and shows

the peak of expression close to dusk. However, UVR8 protein levels show no daily

oscillations, so it is unlikely that this mechanism mediates gating of UV-B induction,

SUMMARY ______________________________________________________________________________________________________

98

although the possibility of clock-regulated post-translational modification of UVR8

cannot be excluded. HY5 and HYH show a low amplitude rhythm in WL but UV-B

induction of HY5 lacks clock control whereas the UV-B induction of HYH is gated;

therefore, accumulation of HY5/HYH heterodimers in the morning could mediate gating

of UV-B responses of morning expressed genes. However, our data demonstrate that

clock gene induction by UV-B is unaffected in the hy5 hyh double mutant in the morning

(CCA1) or during the day (PRR9). UV-B induction of CHS was completely absent, but a

residual and gated induction of At3g16350 was retained in hy5 hyh, indicating that

HY5/HYH are important for the acute UV-B induction of a set of genes, but they are

dispensable for the temporal modulation of the response.

Physiological significance of clock-modulated UV-B responses

Induction of gene expression in response to low fluences of UV-B light (acclimation)

has an important function in triggering the production of pigments (flavonoids,

anthocyanin) that are protective against high intensity, damaging UV-B (Favory et al.,

2009). Our results showed that induction of all tested non-clock genes was gated to the

subjective morning or the first part of the subjective day. This indicated that perception

and processing of low intensity UV-B signals in the early part of the day is important to

set up the flavonoid “shield” and survive UV-B stress expected during the subsequent

hours of the day. In order to test the physiological relevance of clock modulated

induction of gene expression in response to low intensity UV-B, we characterised

molecular and physiological UV-B responses in the arrhythmic elf3-4 mutant. Our data

demonstrated that almost all of the genes tested here showed a high induction level to

low fluences of UV-B in elf3-4 at all times of the day. The induced mRNA levels, except

for CCA1, were usually higher than the maximal induction level achieved in WT which in

turn suggested that elf3-4 plants may display increased stress tolerance to UV-B

compared to WT plants. However, acclimated elf3-4 mutants were as resistant to UV-B

stress pulses applied at different times of the day as were the acclimated WT controls.

Analysis of another arrhythmic mutant, CCA1-OX, has provided similar results.. This

indicates that limiting low intensity UV-B dependent gene expression and the

subsequent accumulation of flavonoids to a relatively short interval of the day is

sufficient to reach normal protection against the damaging effect of high intensityUVB.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A dolgozatban szereplő kísérleteket a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi

Biológiai Központjának Növénybiológiai Intézetében, a Foto- és Kronobiológiai Csoport

tagjaként végezhettem el. Köszönettel tartozom téma- és csoportvezetőmnek, Dr. Nagy

Ferencnek jelentős anyagi és szellemi támogatásáért, amellyel mindvégig segítette

munkámat és akinek nem kis szerepe volt abban, hogy eredményeinket megfelelő

színvonalon tudtuk közzétenni. Köszönöm Dr. Dudits Dénes volt-, Dr Ormos Pál jelenlegi

főigazgató és Dr. Vass Imre igazgató uraknak, hogy munkámat lehetővé tették.

Köszönettel tartozom a Foto- és Kronobiológiai csoport minden egyes tagjának a

munkám során nyújtott segítségükért és a közvetlen munkahelyi légkör

megteremtéséért. Köszönöm Dr. Kozma-Bognár Lászlónak a laboratóriumban eltöltött

éveim alatt köztünk lezajlott rendkívül értékes és izgalmas tudományos eszmecseréket,

valamint tekintélyes mértékű hozzájárulását a dolgozatom alapját képező közlemény

megírásához. Köszönöm Dr. Gyula Péternek az önzetlen szakmai segítségét a munkám

kezdeti időszakában. Köszönöm Dr. Kevei Évának az UV-B fénnyel végzett munka első

lépéseiben nyújtott szakmai tanácsait.

Külön köszönöm Dr. Szekeres Miklósnak az értekezésem tudományos bírálatát,

értékes észrevételeit, javaslatait.

Köszönöm Jószai Katalin, Majzik Hedvig és Veres Gabriella asszisztenseknek a

kísérletek előkészítésében és a növények gondozásában nyújtott pótolhatatlan

segítségét és özv. Hajó Róbertnének az Arabidopsis magok tisztításában végzett

munkáját.

Köszönöm Terecskei Katának a figyelmét és türelmét a munkám során, valamint a

dolgozat javításában tett felbecsülhetetlen segítségét.

Végül köszönöm családomnak a kitartó érdeklődést és támogatást, amelyet munkám

és tudományos előmenetelem iránt mindvégig tanúsítottak.

Documents

Doktori (Ph.D.) értekezés Fehér Balázsdoktori.bibl.u-szeged.hu/1078/1/Fehér_Balázs_PhD_értekezés.pdf · cdf1 cycling dof-factor 1 cfp cyan fluorescent protein che cca1 hiking