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DOPPIA COLORAZIONE DOPPIA COLORAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA IMMUNOCITOCHIMICA AUTOMATIZZATA AUTOMATIZZATA M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, e G.Zamboni L.Furlani, e G.Zamboni Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale S.Cuore – Don Calabria di Negrar (VR)

DOPPIA COLORAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA AUTOMATIZZATA

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DOPPIA COLORAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA AUTOMATIZZATA. M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, e G.Zamboni. Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale S.Cuore – Don Calabria di Negrar (VR). SOLUZIONE: - divisione del preparato in più aree - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

DOPPIA COLORAZIONE DOPPIA COLORAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA IMMUNOCITOCHIMICA

AUTOMATIZZATAAUTOMATIZZATA

M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, M.Marconi, G.Bogina, M.Fontana, S.Lonardi, L.Furlani, e G.Zambonie G.Zamboni

Servizio di Anatomia Patologica, Ospedale S.Cuore – Don Calabria di Negrar (VR)

Page 2: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

INTRODUZIONEL’ESAME CITOLOGICO è una metodica di ampio utilizzo.

Il suo potenziale diagnostico è affinato dall’ applicazione di procedure immunocitochimiche (ICC).

PROBLEMA: limitato numero di preparati disponibili.

SOLUZIONE: - divisione del preparato in più aree

- doppia colorazione ICC

Page 3: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

INTRODUZIONE

RISULTATO: visualizzazione di due anticorpi diversi sulle medesime cellule.

La DOPPIA COLORAZIONE ICC utilizza due anticorpi sulle stesse cellule contemporaneamente.

La STANDARDIZZAZIONE della metodica con l’utilizzo di un IMMUNOCOLORATORE la rende eseguibile in 3.5 ore.

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MATERIALE

LA DOPPIA COLORAZIONE ICC É APPLICABILE A:

• materiale citologico in fase liquida

• citocentrifugato di liquido endocavitario o endocistico

• materiale citologico strisciato ottenuto per agoaspirazione

Fissazione immediata del materiale dopo l’allestimento in alcool etilico 95° per almeno 15 minuti.

Page 5: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

METODI

VARIABILI nella STANDARDIZZAZIONE AUTOMATIZZATA della metodica:

• materiale e fissazione

• recupero antigenico combinato per i due anticorpi

• denaturazione di eventuali legami aspecifici

• scelta degli anticorpi da abbinare

Page 6: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

2. Incubazione del primo anticorpo

METODIPROTOCOLLO DI ESECUZIONE

3. Rivelazione con multimero coniugato con perossidasi

7. Rivelazione con multimero coniugato con fosfatasi

1. Eventuale recupero antigenico

5. Denaturazione a 90°C per 4 minuti

6. Incubazione del secondo anticorpo

8. Sviluppo con cromogeno FAST RED.

4. Sviluppo con cromogeno DAB.

Page 7: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

METODI

- Anticorpi diretti contro antigeni presenti sulla stessa cellula ma con localizzazione differente (nucleare, citoplasmatica, di membrana).

- Anticorpi diretti contro antigeni presenti su cellule di diversa origine e mutuamente esclusivi.

ANTICORPI UTILIZZABILI CONTEMPORANEAMENTE:

Page 8: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;antiEpatocitario-CK7; TTF1-CK20; CDX2-ER.

CD45 PAN CK

Metastasi linfonodale di carcinoma a piccole cellule

Page 9: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Metastasi (linfonodale, epatica, polmonare) di origine sconosciuta combinando: CD45-Pan Citocheratina;antiEpatocitario-CK7; TTF1-CK20; CDX2-ER.

Metastasi epatica di adenocarcinoma del polmone

antiEpatocyte CK7

Page 10: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Tipizzazione di carcinomi primitivi del polmone con:TTF1-CK7; P63-Sinaptofisina.

Adenocarcinoma primitivo del polmone

TTF-1 CK7

Page 11: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.

B-CLL (evidente infiltrato linfoide B)

CD3 CD20

Page 12: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Diagnosi di processi linfoproliferativi con: CD3-CD20;Ciclina D1-CD5 e BCL6-CD23.

B-CLL (evidente infiltrato linfoide B CD5+)

CD5 CD5+CD3

Page 13: DOPPIA COLORAZIONE  IMMUNOCITOCHIMICA  AUTOMATIZZATA

APPLICAZIONI- Discriminazione tra cellule epiteliali e mesoteliali in liquidi pleurici/peritoneali con: BerEP4(ESA)- Calretinina.

Liquido pleurico da metastasi di carcinoma mammario

BerEp4 Calretinina

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CONCLUSIONE

La STANDARIZZAZIONE AUTOMATIZZATA della

DOPPIA COLORAZIONE ICC ha reso la metodica ancora

più facile e meno dispendiosa in termini di:

- tempo

- personale

- materiale cellulare impiegato