Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
dr hab. Joanna Cieśla, prof. PW
Wydział Chemiczny PW
Katedra Biotechnologii Środków Leczniczych
i Kosmetyków
Gmach Technologii Chemicznej, pok. 305 (klatka B, III p.)
tel.: 222345576
e-mail: [email protected]
Sposób oceny nabytej wiedzy
Kolokwium na ostatnich zajęciach (prawdopodobnie 23.01).
5 otwartych pytań ocenianych w zakresie 0-4 punktów:
Liczba punktów Ocena
11-12 3,0
12.1-14 3,5
14.1-16 4,0
17.1-18 4,5
18.1-20 5,0
Podstawowe źródła wiedzy biochemicznej
1. Wykłady:
http://test.ztibsl.ch.pw.edu.pl/materialy-dydaktyczne/swiat-
makroczasteczek-biologicznych/
1. Publikacje podawane na slajdach
2. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemia, wydanie VI.
Przekład pod redakcją Zofii Szweykowskiej-Kulińskiej i Artura
Jarmołowskiego. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009
3. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff,
Keith Roberts, and Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, 4th
edition. New York: Garland Science; 2002.
Joanna Cieśla
ŚWIAT
MAKROCZĄSTECZEK
BIOLOGICZNYCH
Wykład 1. Odkrycie, struktura i właściwości DNA
Makrocząsteczki biologiczne
1. Kwasy nukleinowe
kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)
kwas rybonukleinowy (RNA)
2. Białka
3. Węglowodany (polisacharydy)
4. Lipidy
Systematyka organizmów żywych
Trzy domeny: Jądrowce - Eukarya (Eukaryota, eukarioty, eukarionty) – organizmy mające jądro
komórkowe
Bakterie - Bacteria (dawniej Eubacteria) - organizmy jednokomórkowe,
pozbawione jądra
Archeony - Archea (dawniej Archaebacteria) – organizmy jednokomórkowe,
pozbawione jądra komórkowego, żyjące w nietypowych środowiskach
Organizmy pozbawione jądra komórkowego – Prokaryota (prokarioty, prokarionty)
Komórka W każdej komórce eukariotycznej jest:
cytozol
jądro komórkowe
siateczka śródplazmatyczna gładka i szorstka
mitochondria
aparat Golgiego
peroksysomy
centrosom
błona komórkowa
lizosomy
Charakterystyczne dla komórki roślinnej:
chloroplasty
wakuola
ściana komórkowa
komórka
zwierzęca
komórka
roślinna
Charakterystyczne dla komórki bakteryjnej:
brak jądra, kolisty chromosom
plazmidy (nie u wszystkich)
ściana komórkowa (inna niż u roślin i różna u bakterii
gram+ i gram-) komórka
bakteryjna
Makrocząsteczki mają taką samą budowę w całym świecie ożywionym
20 aminokwasów
białkowych
Białko
Jacques Monod: “What
is true of E. coli is true
of the elephant.”
DNA RNA
Glikogen
Skrobia
KWASY NUKLEINOWE
Odkrycie kwasu deoksyrybonukleinowego
(DNA)
Friedrich Miescher
(1844-1895)
1869 r. – odkrycie nowej substancji -
nukleiny.
Zamek w Tybindze
• Uniwersytet w Tybindze: chemia w
laboratorium Adolpha Streckera, histochemia
pod kierunkiem Felixa Hoppego-Seylera
• Uniwersytet w Bazylei: profesura w wieku 28 lat
• Uniwersytet w Bazylei: medycyna
Miescher zasugerował, że nukleina
może być kwasem, występującym
także w innych tkankach.
Gabryelska MM, Szymański M, Barciszewski J. (2009) NAUKA 2:111-134
Analiza składu atomowego nukleiny wykazała:
Obecność C, H, O, N
Obecność S (zanieczyszczenie białkami)
Obecność P (w niezwykłej proporcji do innych pierwiastków,
niespotykanej w żadnych innych znanych cząsteczkach organicznych)
Spalenie nukleiny i zawieszenie popiołu w wodzie:
Nie było reakcji charakterystycznej dla kwasu fosforowego → fosfor jest
związany organicznie i wyparował podczas spalania.
“We rather have here entities sui generis [= of their own kind] not
comparable to any hitherto known group.”
Miescher F. (1871) Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen. Medicinisch-chemische
Untersuchungen 4:441–460.
Jaką funkcję w komórce może pełnić nukleina?
Magazyn fosforu?
Rezerwuar innych cząsteczek?
Substancja, z której powstaje lecytyna?
Udział w zapłodnieniu?
(Miescher, 1874: „If one [...] wants to assume that a single substance [...] is the specific
cause of fertilization, then one should undoubtely first and foremost consider nuclein”)
lecytyna (fosfatydylocholina)
Miescher zaobserwował:
…“increase in nuclear substances [as] a preliminary phase to cell division in
proliferating tissues, such as tumours”
Miescher F. (1869) Letter V; to Wilhelm His; Leipzig, December 20th 1869. In: His W et al (eds) Die
Histochemischen und Physiologischen Arbeiten von Friedrich Miescher - Aus dem wissenschaftlichen
Briefwechsel von F. Miescher, vol 1. F. C. W. Vogel, Leipzig, pp 39–41.
„Knowledge of the relationship between nuclear substances, proteins and
their closest conversion products will gradually help to lift the veil which still
utterly conceals the inner processes of cell growth.”
Miescher F (1871) Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen. Medicinisch-chemische
Untersuchungen 4:441–460.
Miescher zasugerował również, że wyłączna obecność nukleiny w jądrze
komórkowym jest znacząca i że jądro nie powinno być dalej definiowane
poprzez jego morfologiczne właściwości, ale przez obecność nukleiny, jako
że ten fakt ściślej określa funkcję fizjologiczną tego organellum.
Miescher F (1870) Nachträgliche Bemerkungen. In: His W et al (eds) Die Histochemischen und
Physiologischen Arbeiten von Friedrich Miescher - A. Arbeiten von F. Miescher, vol 2. F. C. W. Vogel,
Leipzig, pp 32–34.
Dalsze ustalenia dotyczące nukleiny
(praca Mieschera na Uniwersytecie w Bazylei)
1. Siarka, znajdowana uprzednio, jest wynikiem zanieczyszczenia
2. Cały fosfor, obecny w nukleinie, występuje w postaci kwasu
fosforowego
3. Nukleina jest kwasem przynajmniej czterozasadowym
4. Nukleina ma dużą masę cząsteczkową
5. Propozycje składu atomowego nukleiny (błędne) : C22H32N6P2O16,
C29H49N9P3O22
6. Obecność nukleiny w próbkach spermy pochodzących z różnych
gatunków (łosoś, karp, żaba, kogut, byk)
Dalsze prace nad DNA
Albrecht Kossel – 1879 r. identyfikacja podstawowych elementów budujących
nukleinę: zasady azotowe (purynowe i pirymidynowe),
cukier i kwas fosforowy. Potwierdzenie, że nukleina
występuje wyłącznie w jądrze komórkowym. Razem z
białkami histonowymi nukleina jest kluczowym
składnikiem chromatyny. Nukleina nie służy ani jako
materiał zapasowy ani źródło energii, lecz jest związana
z syntezą nowej protoplazmy podczas wzrostu.
Nagroda Nobla 1910 r. za badania nad właściwościami
chemicznymi białek i kwasów nukleinowych.
Richard Altmann – 1889 r. Wydzielenie substancji nazwanej kwasem
nukleinowym (Nucleïnsäure). Nie zdawał sobie sprawy
z tego, że jest to nukleina Mieschera.
H
OH
H
O
H H
H
OH
HOCH2
2'-deoksyryboza
N
1 2
3 4
5
6
N
Pirymidyna
N
N 1
2 3 4
5
6
N
N 7
8 9
Puryna
H3PO4
Prace nad dziedziczeniem
Gregor Mendel – 1866 r. dziedziczenie cech grochu jest zgodne z pewnymi
prawami (I – czystości gamet i II – niezależnej segregacji)
Wacław Mayzel – 1873 r. Odkrył mitozę w komórkach zwierzęcych, mitozę w
komórkach roślinnych odkrył Edward Strasburger w 1876. Badania nad mitozą
prowadzili następnie Otto Bütschli (od 1876) i Oscar Hertwig (od 1892). Twórcą
terminu był Walther Flemming.
Oscar Hertwig – 1875 r. Odkrył i opisał mejozę.
Prace m. in. Augusta Weismana, Eduarda Strasburgera, Walthera Flemminga,
Heinricha von Waldeyera i Edouarda Van Benedena
– dziedziczna informacja jest przekazywana tylko przez komórki rozrodcze –
jaja i plemniki. Komórki ciała (somatyczne) nie mogą przekazać informacji
genetycznej do następnego pokolenia.
Terminy: jądro komórkowe, cytoplazma (Strasburger), mitoza (Flemming)
chromatyna (Van Beneden), chromosom (Waldeyer)
1944 r. Przełomowa publikacja:
Oswald T. Avery, Colin MacLeod,
Maclyn McCarty
pokazali, że substancją zdolną do
transformacji niegroźnego szczepu
bakterii w szczep zakaźny jest
kwas deoksyrybonukleinowy
DNA jest nośnikiem informacji genetycznej
Eksperyment Griffitha, 1928 r.
(„substancja transformująca”):
Avery OT, MacLeod CM, McCarty M (1944). J Exp Med 79:137–158.
Dalsze prace nad DNA i dziedziczeniem
Erwin Chargaff – lata 40./50. XX w.
Prawa Chargaffa:
1.W DNA jest tyle samo zasad purynowych (A + G) co
pirymidynowych (C + T), stosunek molowy A/T i G/C wynosi
zawsze ok. 1, ale stosunki A/C, A/G, T/C i T/G mogą się znacznie różnić.
2.Kompozycja zasad DNA różni się pomiędzy gatunkami, czyli (A+T)/(G+C) jest
różny u różnych gatunków.
Kompozycja zasad azotowych oznaczona eksperymentalnie:
Gatunek
Człowiek
Łosoś
Pszenica
Drożdże
Escherichia coli
Pałeczka krwawa
W jaki sposób informacja genetyczna jest
przechowywana w DNA i wiernie replikowana
przed każdym podziałem komórki?
Badania krystalograficzne
Budowa modeli cząsteczki DNA
Podwójna helisa DNA
Cechy wzorów dyfrakcji
promieni rentgenowskich
wskazywały, że DNA
tworzy dwa łańcuchy
zwinięte w regularną
strukturę helikalną.
Rosalind Franklin i Maurice Wilkins –
badania struktury trójwymiarowej DNA
Obraz dyfrakcji promieni X
na uwodnionym włóknie DNA
(Photo-51)
Raymond Gosling
doktorant
Model cząsteczki DNA
James Watson i Francis Crick na
podstawie obrazu dyfrakcyjnego i
innych danych wydedukowali
przestrzenną strukturę DNA (1953 r).
1962 r. – Nagroda Nobla wraz z
M. Wilkinsem
Watson JD, Crick FHC (1953) A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:737–738. 25 April
Wilkins, M., Stokes, A. & Wilson, H. (1953) Molecular Structure of Nucleic Acids: Molecular Structure of
Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171, 738–740. 25 April
Franklin, R., Gosling, R. (1953) Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature 171, 740–741. 25 April
Watson J, Crick, F. (1953) Genetical Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature 171, 964–967.
30 May
Franklin, R., Gosling, R. (1953) Evidence for 2-Chain Helix in Crystalline Structure of Sodium Deoxyribonucleate.
Nature 172, 156–157. 25 July
Najistotniejsze cechy modelu Watsona i Cricka
G C
A T
Komplementarne nici są
antyrównoległe:
5’....…CATTGCCAGT…...3’
3’…....GTAACGGTCA…...5’
Dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe oplatają
wspólną oś. Biegną w przeciwnych kierunkach.
Rdzeń cukrowo-fosforanowy biegnie na zewnątrz.
Zasady purynowe i pirymidynowe są wewnątrz helisy.
Płaszczyzny zasad są niemal prostopadłe do osi
helisy, odległość między sąsiednimi zasadami wynosi
0.34 nm. Całkowity skręt helisy powtarza się co 3.4
nm, czyli co 10 nukleotydów. Zasady są skręcone
względem siebie pod kątem 36˚.
Średnica podwójnej helisy wynosi 2 nm.
DNA jest liniowym polimerem złożonym z czterech rodzajów
monomerów. Ma stały szkielet, z którego wystają podstawniki.
Szkielet: deoksyryboza i fosforan. Podstawniki: 4 rodzaje zasad azotowych
Monomer: deoksynukleotyd złożony z jednostki cukrowo-fosforanowej
i jednej z czterech zasad azotowych
Nukleotydy
OH
OH
H
O
H H
H
OH
HOCH2
H
OH
H
O
H H
H
OH
HOCH2
ryboza
(w RNA)
2'-deoksyryboza
(w DNA)
N
1 2
3 4
5
6
N
PIRYMIDYNA
cytozyna
tymina
uracyl
N
N 1
2 3 4
5
6
N
N 7
8 9
PURYNA
adenina
guanina O
N
zasada
cukier 1’
2’ 3’
4’
5’ CH2 P
O
O-
O-
reszta kwasu
ortofosforowego
DNA: dAMP, dGMP, dCMP, TMP
RNA: AMP, GMP, CMP, UMP
N
Zasady azotowe
(A) (G)
(C) (U) (T)
tylko w RNA tylko w DNA
(Deoksy)nukleozyd – jednostka składająca się
z zasady azotowej połączonej z cukrem
wiązaniem β-glikozydowym.
DNA: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna,
deoksycytydyna, tymidyna
RNA: adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna
(Deoksy)nukleotyd – (deoksy)nukleozyd połączony wiązaniem estrowym z
przynajmniej jedną grupą fosforanową
Miejsce estryfikacji: C-5' cukru
Produkt estryfikacji: (deoksy)nukleozydo-5'-fosforan (lub 5'-fosforan
(deoksy)nukleozydu)
Jednostki nukleotydowe w kwasach nukleinowych:
(deoksy)adenylan, (deoksy)guanozylan,
(deoksy)cytydylan, tymidylan (w DNA), urydylan (w RNA)
Nazewnictwo
9
1’
(d)NMP – (deoksy)nukleozydo-5'-monofosforan
(d)NDP – (deoksy)nukleozydo- 5'-difosforan
(d)NTP – (deoksy)nukleozydo-5'-trifosforan deoksyadenozyno-5’-fosforan (dATP)
W komórce są:
Fragment łańcucha kwasu nukleinowego
Przyjęto, że kolejność zasad
zapisuje się w kierunku 5' → 3'
wiązanie β-
glikozydowe
5’
3’
wiązanie
fosfodiestrowe
Donory i akceptory wiązań wodorowych
w zasadach azotowych
Pary A-T i G-C mają podobną geometrię
i wymiary
Tautomeryczne formy
zasad azotowych
Jedna z przyczyn
mutacji w DNA
https://www.golifescience.com/dna-damage/
Duży i mały rowek
(bruzda) w helisie typu B
Wiązania glikozydowe nie leżą dokładnie
naprzeciwko siebie – każda para zasad ma stronę
która wyznacza duży rowek helisy i drugą,
wyznaczającą mały rowek.
Każdy z rowków jest pokryty atomami, które
będąc potencjalnymi donorami lub akceptorami
podczas tworzenia wiązań wodorowych stwarzają
możliwości oddziaływania z białkami.
Siły utrzymujące DNA w postaci
dwuniciowej helisy
1. Oddziaływania między zasocjowanymi
warstwowo parami zasad (hydrofobowe)
2. Oddziaływania elektrostatyczne (grupy
fosforanowe).
3. Wiązania wodorowe
Oddziaływania
elektrostatyczne
w DNA
Gdy nici łączą się, wiązania wodorowe z cząsteczkami
wody ulegają zerwaniu i tworzą się między zasadami.
Wiązania wodorowe między nićmi DNA
4. Oddziaływania van der Waalsa.
Asocjacja warstwowa zasad
w dwuniciowej helisie DNA
Topnienie dwuniciowej helisy
Dwie nici rozdzielają się, gdy zostaną zerwane wiązania
wodorowe między zasadami azotowymi – topnienie DNA
W warunkach
laboratoryjnych:
• temperatura
• alkalizacja
W komórce:
• helikazy
Efekt hipochromowy:
ssDNA absorbuje wydajniej
przy 260 nm niż dsDNA.
Absorbancja roztworu DNA przy
260 nm wzrasta, gdy dwuniciowa
helisa topi się do dwóch
pojedynczych łańcuchów.
Po obniżeniu temperatury poniżej Tm rozdzielone
komplementarne łańcuchy DNA spontanicznie reasocjują
odtwarzając strukturę podwójnej helisy.
Temperatura topnienia
(Tm) – temperatura, w
której dochodzi do
utraty połowy helikalnej
struktury.
Denaturacja DNA przez dodanie zasady
pKa > 9
Do roztworu zawierającego dwuniciową
helisę dodajemy stężoną zasadę:
wzrasta pH, ale nie zmienia się
znacząco stężenie podwójnej helisy
przy pH ~ 9 helisa zaczyna
dysocjować na pojedyncze nici
składowe
przy pH 10 nici ulegają całkowitej
dysocjacji.
Dlaczego?
Reakcje typu kwas-zasada mogą
rozerwać dwuniciową helisę
OH- OH- OH-
OH-
OH-
OH-
1
Odebranie protonu biorącego udział w wiązaniu wodorowym
między zasadami destabilizuje podwójną helisę
Drugorzędowa struktura dwuniciowej helisy DNA
B-DNA A-DNA
W komórce DNA przyjmuje głównie
strukturę B-DNA.
Strukturę przypominającą A-DNA
przyjmują dwuniciowe fragmenty RNA
oraz niektóre hybrydy RNA-DNA
Antyrównoległe nici tworzące
prawoskrętną helisę
Dwuniciowa helisa DNA może przyjmować różne formy strukturalne
Z-DNA
Strukturę typu Z przyjmują krótkie fragmenty oligonukleotydowe
zbudowane z następujących po sobie na przemian reszt purynowych
i pirymidynowych (np. dCGCGCG).
Nici są antyrównoległe, ale helisa jest lewoskrętna.
Trzeciorzędowa struktura dwuniciowej helisy DNA
Na jeden skręt helisy przypada 10.4 par zasad, a więc odcinek o długości 260 par
zasad utworzy 260 : 10.4 = 25 skrętów
Lk (linking number, liczba opleceń )– ile razy w
kolistym DNA nić DNA owija się prawoskrętnie
wokół osi helisy sprowadzonej do prostej leżącej
na płaszczyźnie
Tw (twisting number, liczba skrętów)
odzwierciedla helikalne wzajemne skręcenie
pojedynczych nici względem siebie.
Wr (writhing number, liczba zwojów) – miara
zwinięcia osi dwuniciowej helisy -
superhelikalność. Prawoskrętne zwinięcia –
ujemna wartość Wr, lewoskrętne – dodatnia.
Dwuniciowe helisy DNA mogą tworzyć struktury trzeciorzędowe
dzięki superhelikalności
Większość komórkowego DNA ma negatywne superhelikalne skręty.
Co się stanie jeśli przed połączeniem DNA w strukturę kolistą odwiniemy 2
skręty helisy?
Struktury topologicznie identyczne mogą różnić się
liczbą skrętów (Tw) oraz liczbą zwojów (Wr).
Lk = Tw + Wr
Topoizomery DNA
różnią się wyłącznie
liczbą opleceń Lk
Struktury topologicznie identyczne, lecz różne geometrycznie:
Topologia – gałąź matematyki zajmująca się właściwościami strukturalnymi,
które nie ulegają zmianom podczas zginania czy rozciągania.
Eukariotyczny DNA jest
związany z histonami
Histony – małe, silnie
zasadowe białka (1/4 reszt
aminokwasowych to Arg lub Lys) Histony: H2A, H2B, H3, H4 (i histon H1)
Chromatyna zbudowana jest z powtarzających się jednostek
(nukleosomów) , z których każda zawiera 200 pz DNA i po dwie kopie
histonów H2A, H2B, H3 i H4. Białka te tworzą wspólnie oktamer histonowy.
Mikrografia elektronowa chromatyny z
uwidocznionymi nukleosomami (koraliki
nanizane na sznurek). Każdy koralik
(nukleosom) ma średnicę ok. 10 nm.
Budowa chromatyny
Stuktura nukleosomu: 8 białek histonowych oplecionych DNA
widok z boku
widok z góry
schemat
Cząsteczka DNA tworzy oplatającą rdzeń
lewoskrętną superhelisę.
Ogony aminowych końców histonów zawierają
znaczną liczbę reszt Lys i Arg, które podlegają
modyfikacjom kowalencyjnym – funkcje
regulacyjne.
Struktura chromatyny
wyższego rzędu (solenoidu)
Histon H1 ma inną budowę niż pozostałe histony.
Oddziałuje z DNA łącznikowym, znajdującym się
pomiędzy nukleosomami (spaja nukleosom).
Solenoid: helisa utworzona z łańcucha nukleosomów.
Umożliwia wielokrotne skrócenie długości DNA
(kondensację). W metafazie długość DNA zostaje
skrócona 10 000 razy.
Długość DNA w pojedynczym jądrze komórki: ok. 2 metrów.
Całkowita dł. DNA w organizmie człowieka: kilka mln km.
Upakowanie DNA
Oplatanie DNA wokół rdzenia
histonowego umożliwia
przechowywanie ujemnych
skrętów.
Rozprostowanie DNA
nukleosomu rozplata
podwójną helisę
Przekazywanie informacji genetycznej
Replikacja semikonserwatywna:
jedna nić pochodzi z cząsteczki
rodzicielskiej, a druga jest dobudowana
na zasadzie komplementarności zasad
Rodzicielska cząsteczka DNA
Pierwsze pokolenie cząsteczek potomnych
Drugie pokolenie cząsteczek potomnych
Watson JD, Crick FH (1953) Genetical implications of the
structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171:964–967
Kolejność nukleotydów jednej nici
precyzyjnie określa kolejność
nukleotydów w drugiej nici.
Mathew Meselson i Franklin Stahl, 1958 r. – "the most beautiful experiment in biology"
Doświadczalny dowód na semikonserwatywną replikację DNA
Hodowla wielu pokoleń E. coli na pożywce z 15NH4Cl jako jedynym
źródłem azotu, a następnie szybkie przeniesienie bakterii do
środowiska ze zwykłym izotopem azotu 14N.
Zbadanie rozdzielenia się 14N-DNA i 15N-DNA metodą wirowania
równowagowego w gradiencie gęstości chlorku cezu.
Izolacja i wirowanie DNA z
bakterii w różnym czasie od
przeniesienia do pożywki 14N
Rozpuszczalność kwasów nukleinowych
Dobrze w roztworach zasadowych (charakter polianionowy DNA i RNA), słabo w
rozcieńczonych kwasach i wodzie
W roztworach wodnych tworzą koloidy, które łatwo wytrącić czynnikami
odwadniającymi (etanol, izopropanol)
Chemiczna hydroliza kwasów nukleinowych
DNA: oporny na działanie mocnych zasad – brak produktów hydrolizy w 1M NaOH,
40 h w temp 37°C
RNA: całkowity rozpad do mieszaniny 2’ i 3’-monofosfonukleozydów w powyższych
warunkach (obecność grupy OH przy C2’ rybozy umożliwia powstawanie nietrwałych
cyklicznych nukleozydo-2’,3’-fosforanów)
Działanie mocnych kwasów mineralnych (72% HClO4, 100°C, 1 h) na DNA i RNA:
uwolnienie zasad purynowych, pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego
Krótkotrwałe działanie rozcieńczonych kwasów (1M HCl, 100°C, krótko) na DNA i
RNA: początkowo powstają kwasy apurynowe (w nukleotydach purynowych wiązania
glikozydowe są bardziej labilne niż w pirymidynowych), po 1 h uwalniają się
mononukleotydy pirymidynowe, pentozy i kwas fosforowy.
Własności kwasów nukleinowych
Chemiczna denaturacja DNA i RNA
W obojętnym pH – kilkumolowe stężenia mocznika lub formamidu – rozerwanie
wiązań wodorowych i usuwanie cząsteczek wody spomiędzy zasocjowanych zasad
Lepkość i sztywność cząsteczki
Szerokość: 2 nm, długość: w µm, mm, a nawet w cm → DNA jest cząsteczką
sztywną, przez co roztwory DNA są lepkie. Sonikacja powoduje fragmentację DNA
Gęstość
1.7 g/ml – podobna do gęstości 8 M CsCl
Możliwość oczyszczania DNA za pomocą
wirowania równowagowego
Odróżnienie DNA od RNA
Opiera się na wykrywaniu różnych pentoz – rybozy lub deoksyrybozy)
Wykrywanie DNA metodą Dischego:
w środowisku kwaśnym deoksyryboza
tworzy z difenyloaminą niebieski produkt
kondensacji
Wykrywanie RNA metodą
orcynową (reakcja Biala):
pentozy i fosfopentozy wolne oraz
związane w nukleotydach
purynowych przechodzą podczas
ogrzewania ze stężonym HCl w
furfural, który tworzy z orcyną zielony
kompleks. W tych warunkach
deoksyryboza reaguje 10x słabiej niż
ryboza furfural orcyna
Barwny
kompleks
Wykazanie obecności puryn w hydrolizacie
Zasady azotowe reagują z jonami Ag+ (lub Cu+), tworząc nierozpuszczalne sole
kompleksowe. Reakcję prowadzi się w obecności amoniaku w lekko alkalicznym
pH. Wytrąca się osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amoniaku
Wykazanie obecności kwasu fosforowego
Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO3 – powstaje
żółty osad fosfomolibdenianu amonu
Spektrofotometria nukleotydów i kwasów nukleinowych
Kwasy nukleinowe, nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe pochłaniają światło
UV z max = 260 nm. Reszty monocukrowe i grupy fosforanowe nie mają wpływu
na tę absorbancję.
Efekt hipochromowy – absorbancja DNA nie jest addytywną sumą absorbancji
jego pochłaniających światło składników. Rzeczywista molowa absorpcja jest ok.
40% niższa niż wyliczona na podstawie składu.
A260/A280 ~ 1.8 → wolny od zanieczyszczeń białkiem DNA
A260/A280 ~ 2 → wolny od zanieczyszczeń białkiem RNA
A260/A230 ~ 2 - 2.2 → brak zanieczyszczeń substancjami absorbującymi przy
230 nm lub mniej (np. fenolem)
Preparat DNA o wartości A260/A280 > 1.8 może być zanieczyszczony RNA, a
A260/A280 < 1.8 wskazuje na zanieczyszczenie białkami lub fenolem
A260 = 1 → 50 µg/ml dsDNA;
40 µg/ml ssDNA lub RNA
20 µg/ml oligonukleotyd
Podsumowanie
Wszystkie żywe organizmy, pomimo różnorodności form i różnic
fizjologicznych, są jednorodne pod względem biochemicznym.
Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) został odkryty przez szwajcarskiego
badacza Friedricha Mieschera w 1869 r.
Strukturę DNA ostatecznie rozwiązali Amerykanin James Watson i Anglik
Francis Crick w 1953 r.
DNA jest biopolimerem złożonym z deoksyrybonukleotydów.
Większość DNA w komórce występuje w postaci podwójnej helisy.
W podwójnej helisie nici biegną antyrównolegle, na zewnątrz jest szkielet
cukrowo-fosforanowy, a wewnątrz 4 rodzaje zasad azotowych łączących się
wiązaniami wodorowymi A=T i G≡C.
Komplementarność łączenia się zasad umożliwia wierną, semikonserwatywną
replikację materiału genetycznego.
W komórkach eukariotycznych DNA związany jest z zasadowymi białkami –
histonami i upakowany w chromosomach podczas podziału komórki.