UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

Facultatea de Fizică

Școala Doctorală de Fizică

Specializarea Biofizică

Drd. Bogdan ZORILĂ

_____________________________________________________________________ _

STUDIUL INTERACȚIEI PROTEINELOR CU MEMBRANELE

LIPIDICE MODEL ȘI CU MEMBRANELE BIOLOGICE __________________________________________________________________ ____

Rezumatul Tezei de Doctorat

Conducător științific

Prof. Univ. Dr. Aurel POPESCU

București, 2018

1

Scopul lucrării

Primul capitol al Tezei de Doctorat este reprezentat de o motivație redată integral în

paragrafele următoare.

Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014), referitor la rezistența

antimicrobiană, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme rezistente la

tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). Una dintre direcțiile recomandate este aceea de

a crea noi metode de tratament a infecțiilor cu agenți patogeni, bazate pe proprietățile

bacteriostatice și bactericide ale peptidelor antimicrobiene (AMP).

În cadrul unui grant de cercetare, intitulat “Generarea și investigarea unor noi peptide

antimicrobiene, cu dimensiune redusă. Corelarea structurii peptidelor cu funcția lor”,

http://www.science.research.uaic.ro/biopep/index.html, au fost generate și sintetizate 8 noi

structuri peptidice, numite în mod generic, P1 – P8, bogate în reziduuri de Triptofan și Arginină,

fiind cunoscut efectul sinergic al acestor reziduuri, împotriva liniilor celulare bacteriene.

În paralel cu experimentele in vitro, utilizând aceste 8 peptide, a fost nevoie și de un studiu

aprofundat al mecanismelor biofizice prin care acestea interacționează cu membranele lipidice,

pentru determinarea afinității acestora față de două tipuri de membrane lipidice acceptate în

literatură ca modele simple pentru membranele celulelor de mamifere și bacteriene. În urma

acestui studiu, s-a pus în evidență diferențele care apar între cele 8 peptide, comparând rezultatele

obținute, dar și făcând o paralelă cu rezultatele obținute, în aceleași condiții, pentru trei peptide

“model”, foarte bine caracterizate în literatură: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, fiecare

dintre acestea având mecanisme diferite de interacție cu bistratul lipidic.

S-a dorit, în urma experimentelor, să se obțină, pe de-o parte, gradul de accesibilitate al

reziduurilor de Triptofan la moleculele unui stingător colizional al fluorescenței (acrilamida) și, pe

de altă parte, variațiile energiilor libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în

mediul hidrofob. Valorile obținute în aceste experimente au fost comparate cu cele obținute pentru

peptidele “model”.

Deoarece membrana (celulară, bistrat lipidic) este primul compartiment afectat de interacția

cu peptidele antimicrobiene, a fost necesară evaluarea modului în care starea bistratului lipidic este

afectată de prezența AMP. Una dintre metodele de investigare este analiza fluidității membranare

utilizând fluorofori, în particular Laurdanul, care se inseră în bistratul lipidic. Analiza detaliată a

2

spectrelor de emisie ale Laurdanului a necesitat dezvoltarea și validarea unei noi metode de

evaluare a fluidității membranare, mai sensibilă decât metodele utilizate, până în acest moment.

Această metodă folosește o procedură de deconvoluție a spectrelor de fluorescență statică,

utilizând funcții asimetrice de tip log-normal (LN). După validarea metodei, s-a pus în evidență

diferențele care apar la nivelul fluidității bistratului lipidic, în funcție de mecanismul de interacție

dintre peptidă și membrana celulară sau lipidică model.

Metoda de analiză a spectrelor complexe de fluorescență statică, utilizând deconvoluția

acestora, cu funcții asimetrice de tip LN, a fost utilizată și pentru spectrele de emisie fluorescentă

ale Triptofanului, dar utilizând o adaptare originală a metodei din literatură. Astfel, noua abordare,

furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la bistratului lipidic și peptida

liberă în soluție.

Pentru evaluarea accesibilității reziduurilor de Triptofan la moleculele de stingător și a

variației energiei libere Gibbs, s-a dezvoltat, pornind de la zero, un echipament experimental

pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. După realizarea, verificarea și calibrarea

acestuia, s-au efectuat măsurători pentru evaluarea interacțiilor dintre peptidele precizate anterior

și membranele lipidice model. Realizarea practică a echipamentului pentru măsurarea timpilor de

viață ai fluorescenței a deschis noi direcții de analiză a interacțiilor moleculare, rezultatele obținute

putând fi aplicate la o gamă largă de molecule (polipeptide, proteine etc).

Studiul bibliografic

În capitolul 2 sunt prezentate aspecte actuale legate de peptidele antimicrobiene, rezistența

microorganismelor la tratamentele clasice, avantajele și dezavantajele utilizării AMP în

tratamentele antiinfecțioase, rolul anumitor aminoacizi din structura primară a peptidelor și

mecanismele de interacție a AMP cu membranele celulare.

Toate organismele prezintă mecanisme de apărare înnăscute, mecanisme ce fac parte din

sistemul lor imunitar. Peptidele antimicrobiene, AMP, sunt implicate în aceste mecanisme de

apărare înnăscute. AMP-urile sunt compuși cu masă moleculară mică, având în structura lor

aminoacizi, prezentând un spectru larg de activități antimicrobiene împotriva bacteriilor Gram-

negative și Gram-pozitive, a virusurilor, protozoarelor și ciupercilor. Majoritatea AMP-urilor sunt

3

caracterizate de proprietăți fizico-chimice generale, ca sarcina electrică netă (încărcare pozitivă, în

general) ridicată și separarea spațială a regiunilor hidrofobe de cele hidrofile, ceea ce duce la

interacția lor diferită cu miezul hidrofob al bistratului lipidic și cu mediul hidrofil extracelular.

O comparație a secvențelor AMP relevă că două tipuri de catene laterale sunt esențiale pentru

activitatea antimicrobiană. Catenele laterale cationice, cum ar fi cele alcătuite din reziduurile

Arginină și Lizină, mediază interacțiunile AMP cu membranele încărcate negativ și/sau cu peretele

celular al bacteriilor Gram-negative. Catenele laterale hidrofobe, cum ar fi cele care au în structura

lor reziduurile Izoleucină, Leucină, Fenilalanină sau Triptofan, reziduuri ce apar frecvent în

structura primară a AMP-urilor, se comportă ca niște ancore lipofile care destabilizează bistratul

lipidic și, în cele din urmă, produc dezorganizarea acestuia. S-a observat că activitatea

antimicrobiană a AMP este guvernată de încărcarea net pozitivă și de hidrofobicitatea reziduurilor

din structura acestora, trebuind să existe un echilibru adecvat între aceste două tipuri de reziduuri

pentru a evita toxicitatea față de celulele de mamifere.

Mecanismul de acțiune al AMP implică interacția electrostatică a moleculelor peptidice

încărcate pozitiv cu suprafața membranelor agenților patogeni, încărcată negativ, urmată de

penetrarea membranei, ceea ce duce la scurgerea conținutului intracelular în mediul extracelular.

Majoritatea studiilor referitoare la mecanismul de acțiune al AMP-urilor cationice au fost efectuate

utilizând membrane lipidice model, cu diferite compoziții de lipide. Atunci când interacția AMP

cu membranele lipidice duce la apariția unor reorganizări la nivelul bistratului, în urma cărora apar

efecte de distrugere ale acestuia, sunt implicate trei tipuri de mecanisme, în urma cărora apar

structuri de tipul: “carpet like”, “barrel-stave” și pori toroidali.

În continuarea acestui capitol, se prezintă informații referitoare la structura membranelor

celulare (de mamifere și bacteriene) fiind evidențiate diferențele dintre acestea, la proprietățile

membranelor lipidice și sunt descrise structurile biomimetice (lipozomii) utilizate.

Tehnicile utilizate în Teză, spectroscopia statică de fluorescență și spectroscopia rezolvată

în timp și principiile fizice care stau la baza acestora sunt descrise în capitolul 3. În acest capitol

sunt prezentate și informații despre compușii chimici utilizați în aceste tipuri de măsurători, cu

evidențierea proprietăților celor doi fluorofori, Laurdanul și Triptofanul.

În capitolul 4, sunt prezentate informații despre AMP utilizate în secțiunea experimentală.

Astfel, sunt selectate din literatura de specialitate informațiile cele mai relevante referitoare la

4

cele trei peptide utilizate ca “modele”: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1 dar, sunt prezentate

și unele caracteristici fizico-chimice ale peptidelor nou sintetizate, P1 – P8, pentru care s-a dorit

obținerea de informații relevante referitoare la modul de interacție al acestora cu membranele

lipidice model.

Cercetarea experimentală

Secțiunea de cercetare experimentală proprie începe de la capitolul 5, în care sunt prezentate

materialele și metodele utilizate pentru realizarea experimentelor descrise în Teză.

În capitolul 6, este prezentată realizarea și optimizarea funcționării echipamentului

experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. Schema practică a

echipamentului experimental are la bază planul original al fluorimetrului FluoTime 100, produs

de firma germană PicoQuant, care a fost adaptat pentru cerințele experimentale locale.

Optimizarea funcționării s-a realizat pe baza verificării performanțelor prin măsurarea

timpilor de viață ai fluorescenței pentru o serie de fluorofori, utilizați în practică drept standarde

pentru timpul de viață: NATA și L-Triptofan dizolvate în PBS, Indol dizolvat în apă, PPO și p-

Terfenil dizolvate în alcool etilic. Rezultatele obținute în urma măsurătorilor sunt similare cu cele

din literatura de specialitate.

O altă serie de experimente au vizat stabilirea “sensibilității” instrumentului de măsură,

prin varierea concentrațiilor fluoroforilor în soluție, într-o gamă largă de valori. Pentru

verificarea ”sensibilității” aranjamentului experimental, s-a realizat un al doilea set de

experimente, în care concentrația probelor a fost variată între 1 µM și 500 µM (în pași de 1-2-3-5

µM), temperatura probelor fiind menținută constantă, la 25 °C. În urma analizării datelor

experimentale s-a ajuns la concluzia că spectrofluorimetrul poate măsura timpi de viață ai

fluorescenței într-o gamă largă a concentrațiilor (1 µM – 500 µM) fluoroforilor: Indol-ul și

derivații acestuia, NATA și L-Triptofan.

O aplicație directă a aranjamentului experimental este descrisă în capitolul 7, unde s-a studiat

interacția AMP cu membranele lipidice model care imită, într-un mod simplificat, membranele

celulelor de mamifere.

5

În cadrul acestui studiu, s-a urmărit realizarea unei analize comparative, din punct de vedere

al variației timpilor de viață ai fluorescenței, între Melitină, pe de-o parte și trei dintre peptidele

nou sintetizate: P1 – din clasa celor cu trei reziduuri de Triptofan, P5 – considerată peptida de

referință pentru grupul de 8 peptide și P8 – din clasa celor cu patru reziduuri de Triptofan.

Ca referință, pentru timpii de viață analizați, s-au folosit rezultatele obținute pentru timpul

de viață al fluorescenței pentru L-Triptofan, prezentat în capitolul anterior.

Rezultatele obținute pentru cele trei peptide, P1, P5 și P8, atunci când acestea se găsesc în

prezența lipozomilor alcătuiți din DOPC, pun în evidență faptul că reziduurile de Triptofan din

structura acestora sunt localizate la nivelul suprafeței bistratului lipidic. Acest lucru rezultă din

comportamentul timpilor de viață, atunci când temperatura probei variază, timpii de viață

corespunzători celor trei peptide urmând aceeași tendință cu aceea a L-Triptofanului, pentru

ambele situații în care regăsim peptida liberă sau în prezența lipozomilor alcătuiți din DOPC.

Deoarece, în cazul măsurătorilor în prezența lipozomilor, timpii de viață ai fluorescenței sunt mai

mari, avem o indicație directă a interacției care apare între peptidele studiate și bistratul lipidic,

Triptofanul interacționând într-o măsură mai mică cu moleculele solventului.

În capitolul 8, este descrisă o nouă metodă de analiză a fluidității membranelor lipidice.

Metoda dezvoltată are la bază o procedură de deconvoluție a spectrelor complexe de fluorescență

ale Laurdanului și s-a dovedit a fi mai sensibilă la modificările de fluiditate ale membranei, în

comparație cu metodele clasice.

În cadrul experimentelor descrise în acest capitol, s-a pus la punct o nouă metodă de analiză

a spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului inserat în bistraturi lipidice. Această metodă are

la bază un model de deconvoluție cu funcții de tip log-normal (LN).

Pentru punerea la punct a metodei este necesar ca parametrii funcției de deconvoluție să fie

calibrați în prealabil. Această calibrare se face utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului

dizolvat într-o gama largă de solvenți (cu diferite valori ale momentului de dipol electric). În urma

calibrării parametrilor, s-a pus la punct modelul de deconvoluție cu funcții LN.

Modelul matematic de deconvoluție, cu funcții LN, utilizează intensitatea fluorescenței

reprezentată în scala numerelor de undă și a fost propus anterior pentru descrierea spectrelor de

emisie a fluoroforilor organici.

6

Validarea modelului s-a făcut utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului inserat în

lipozomi preparați din trei tipuri distincte de lipide: C13, DPPC și DSPC. În urma deconvoluției

au fost obținute câte două peak-uri distincte, corespunzătoare celor două stări ale bistratului lipidic.

Dependența de temperatură a ariilor relative ale celor două peak-uri obținute în urma

deconvoluției, oferă o imagine mai realistă referitoare la tranziția de fază a bistratului, atunci când

această dependență este comparată cu cea obținută în urma analizei cu funcții Gauss.

Pentru toate rezultatele experimentale s-a făcut o comparație între deconvoluția cu funcții

LN și Gauss. În Fig. 1 se pot observa comparațiile între aceste două tipuri de deconvoluție, pentru

spectrele de emisie a Laurdanului, inserat în lipozomii preparați din DPPC, la trei temperaturi

distincte. Pentru spectrele din A, B și C s-au folosit funcții de tip LN, iar pentru cele din D, E și F

funcții de tip Gauss.

7

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

5

6I F

LU

OR

ES

C. [x

10

10]

[cm-1]

Spectrul de fluorescenta

LN fit

LN peak albastru

LN peak verdeA

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

5

6

Spectrul de fluorescenta

Gauss fit

Gauss peak albastru

Gauss peak verde

I FL

UO

RE

SC

. [x10

10]

[cm-1]

D

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

Spectrul de fluorescenta

LN fit

LN peak albastru

LN peak verde

I FL

UO

RE

SC

. [x10

10]

[cm-1]

B

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

Spectrul de fluorescenta

Gauss fit

Gauss peak albastru

Gauss peak verde

I FL

UO

RE

SC

. [x10

10]

[cm-1]

E

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

5

Spectrul de fluorescenta

LN fit

LN peak albastru

LN peak verde

I FL

UO

RE

SC

. [x10

10]

[cm-1]

C

16000 18000 20000 22000 24000 26000

0

1

2

3

4

5

Spectrul de fluorescenta

Gauss fit

Gauss peak albastru

Gauss peak verde

I FL

OR

ES

C. [

x10

10]

[cm-1]

F

Figura 1. Comparație între deconvoluția cu funcții LN (A, B și C) și funcții

Gauss (D, E și F).

LUV preparate din DPPC la 20 °C (A și D), 41 °C (B și E) și 60 °C (C și F).

Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR, este

mult mai sensibil cu privire la nivelul de hidratare al bistratului, așa cum este indicat de către

Laurdan. Aria peak-ului corespunzător fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care

are loc tranziția de fază sunt dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.

8

0 10 20 30 40 50 60

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 s

R GP

S

r, G

P

T [oC]

A20 30 40 50 60

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B

S

r, G

P

T [oC]

30 40 50 60 70

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

S

r, G

P

T [oC]

Figura 2. Dependența mărimilor ΔSR și GP de temperatură.

Lipozomi preparați din: A – C13, B – DPPC, C – DSPC.

În capitolul 9, sunt prezentate efectele peptidelor “model” asupra membranelor lipidice

model și asupra membranelor biologice, utilizând metoda de analiză descrisă în capitolul anterior.

Rezultatele obținute în cadrul acestui capitol fac obiectul unui articol de specialitate, aflat în curs

de redactare.

Pentru tratamentul aplicat LUV preparate din DOPC (model simplificat de membrană

celulară de mamifer), cu cele trei peptide, Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, s-a observat că,

cea mai mică influență asupra fluidității bistratului a avut-o Cecropina P1. Acest comportament

era de așteptat, având în vedere modul de acțiune al acestei peptide, de tip “carpet-like”,

concentrația la care s-a lucrat fiind insuficientă pentru afectarea împachetării laterale a lipidelor.

Efectul Melitinei s-a manifestat pe toată gama de temperaturi de lucru, în urma interacției cu

bistratul lipidic aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR fiind mai mari decât în cazul

lipozomilor fără tratament aplicat. Efectul Melitinei s-a manifestat pe toată gama de temperaturi

de lucru, în urma interacției cu bistratul lipidic aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR

fiind mai mari decât în cazul lipozomilor fără tratament aplicat.

Același comportament de modificare al fluidității membranare, la interacția cu Melitina și

Indolicidina, s-a obținut și pentru situația în care LUV au fost preparate din DOPC:DPPG (model

simplificat de membrana bacteriana). Gradul de afectare a fluidității bistratului este, pentru cele

două peptide, mai mare decât în cazul interacției acestora cu LUV formate din lipide neutre

datorită, probabil, manifestării interacțiilor de natură electrostatică, în plus față de interacțiile

hidrofobe. Acest comportament era de așteptat, deoarece ambele peptide au afinitate mai mare

pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona capetelor polare. În schimb, Cecropina P1

9

prezintă același comportament față de membranele formate din DOPC:DPPG, ca și în cazul

DOPC, fluiditatea bistratului lipidic fiind identică cu cea din situația în care lipozomii s-au aflat

singuri în soluție.

Pentru testarea efectelor AMP asupra membranei externe a bacteriilor E. coli, s-au ales

Melitina și Indolicidina. Valorile ΔSR indică un grad de împachetare mult mai ridicat al lipidelor,

datorat complexității pe care o au membranele biologice, față de cele din bistratul lipidic al

lipozomilor. Efectele peptidelor asupra membranelor de E. coli se manifestă pe tot intervalul

temperaturilor studiate, fiind mai pronunțat la temperaturi < 25 °C.

Rezultatele obținute au indicat că împachetarea lipidelor, atât din membranele artificiale, cât

și din cele biologice, este afectată de interacția cu AMP. Gradul de afectare al împachetării

lipidelor, raportat în cadrul acestor experimente de parametrul ΔSR, este dependent de proporția

peptidă-lipide, dar și de tipul de peptide și lipide utilizate.

Complexitatea membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un

nivel de împachetare mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste membrane

sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP.

Considerând că bistratul lipidic este prima componentă afectată de tratamentul cu AMP,

această metodă de analiză poate fi utilizată, împreună cu alte tehnici de fluorescență, pentru

evaluarea efectelor peptidelor antimicrobiene asupra membranelor biologice sau artificiale.

În capitolele 10 și 11 s-a studiat interacția AMP, nou sintetizate (P1 – P8), cu două tipuri

de membrane lipidice model. Studiul a avut două abordări: din punctul de vedere al gradului de

accesibilitate a reziduurilor de Triptofan la moleculele solventului și din punctul de vedere al

dependenței variației energiei libere Gibbs de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob.

În ambele capitole, s-a făcut o corelație între rezultatele obținute și structura primară a peptidelor,

dar și a diferențelor care apar în funcție de tipul de membrana lipidică model utilizată. Rezultatele

obținute fac obiectul unui articol de specialitate, aflat în curs de redactare.

Fenomenul de stingere a fluorescenței se referă la orice proces fizico-chimic ce duce la

scăderea intensității fluorescenței unei probe. Există o mare varietate de interacții moleculare care

duc la apariția fenomenului de stingere a fluorescenței. Aceste interacții includ reacțiile care apar

în timpul stării excitate a fluoroforului, rearanjări ale structurii moleculare, transferul rezonant de

10

energie între molecule, formarea de complexe moleculare în starea fundamentală și stingerea

colizională a fluorescenței.

Stingerea colizională a fluorescenței este descrisă de ecuația Stern-Volmer:

𝐹0𝐹=𝜏0𝜏= 1 + 𝑘𝑏𝜏0[𝑄] = 1 + 𝐾𝑆𝑉[𝑄]

unde 𝐹0 și 𝐹 sunt intensitătile fluorescenței, 𝜏0 și 𝜏 sunt timpii de viață a fluorescenței în absența,

respectiv în prezența stingătorului, 𝑘𝑏 reprezintă constanta bimoleculară, 𝜏0 este timpul de viață al

fluoroforului în absența stingătorului și 𝑄 reprezintă concentrația stingătorului. Din ecuație se

observă că 𝐾𝑆𝑉 = 𝑘𝑏𝜏0 reprezintă constanta de stingere Stern-Volmer. Pentru fluoroforii care

prezintă mai mulți timpi de viață, așa cum este și în cazul de față pentru reziduurile de Triptofan

din structura peptidelor, în ecuație se vor folosi valorile timpului de viață mediu.

Datele obținute în urma experimentelor de stingere a fluorescenței sunt, în general,

reprezentate ca F0 F⁄ în funcție de [𝑄]. Din panta acestui grafic se obține, în urma unei fitări liniare,

constanta de stingere 𝐾𝑆𝑉.

Utilizând valorile obținute pentru 𝐾𝑆𝑉 și timpii de viață ai fluorescenței, măsurați în absența

stingătorului, se poate determina valoarea constantei bimoleculare, 𝑘𝑏, valoare care este un

indicator al eficienței stingerii sau al gradului de accesibilitate al stingătorului la moleculele de

fluorofor.

Măsurătorile de stingere a fluorescenței Triptofanului, utilizând ca stingător o soluție

concentrată de acrilamidă, s-au efectuat utilizând peptidele la o concentrație finală de 1 µM.

Lipozomii au fost preparați din DOPC și DOPC:DPPG, iar lipidele din care aceștia au fost

preparați au avut o concentrație finală de 50 µM. Din aceste spectre s-au obținut valorile

corespunzătoare maximului intensității fluorescenței (F0) și timpului de viață mediu (𝜏0), valori

care s-au utilizat ulterior la prelucrarea datelor. Pentru stingerea fluorescenței s-a titrat o soluție

concentrată de acrilamidă, având concentrația inițială de 10 M, în pași de 7.5 µL. Astfel,

concentrația acrilamidei a fost incrementată în pași de 25 mM. După echilibrarea soluției timp de

15 min., au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Din spectrele de

fluorescență statică, în urma prelucrării datelor se obțin reprezentări Stern-Volmer de tipul celei

din Fig. 3.

11

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

1

2

3

4

5

F0/F

Cacy

[M]

PBS DOPC DOPC:DPPG

Figura 3. Reprezentare Stern-Volmer pentru Indolicidină.

Rezultatele obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru toate peptidele

utilizate în acest studiu, sunt reprezentate grafic în Figura 4.

Mel Ind CP1 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

4

8

12

16

20

KS

V [

M-1]

PBS DOPC DOPC:DPPGA

Figura 4. Valorile KSV, τ0 și kb pentru peptidele utilizate în acest studiu, aflate în

PBS, în amestec cu LUV preparate din DOPC sau din DOPC:DPPG.

12

Pe baza rezultatelor obținute pentru cele trei peptide “model”, pentru situația în care acestea

s-au aflat în PBS, am pus în evidență relația care există între structura secundară pe care acestea o

adoptă în soluție și constanta bimoleculară care a rezultat în urma prelucrării datelor

experimentale. Astfel, pentru cea mai complexă structură, α-helix-ul alungit al Cecropinei P1, s-a

obținut cea mai mică valoare a constantei bimoleculare, iar cea mai mare valoare a acestei

constante a fost obținută pentru Indolicidină, care are o structură dezordonată. În prezența LUV

preparate din DOPC, interacția dintre reziduurile hidrofobe din structura primară a peptidelor, duce

la o scădere substanțială a constantei bimoleculare pentru toate cele trei peptide. Interacțiile dintre

reziduurile cationice, din structura peptidelor, și lipidele anionice, în situația în care peptidele s-au

aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, a dus la o creștere a constantelor bimoleculare,

corespunzătoare celor trei peptide, datorită reorientării acestora față de planul membranei

lipozomilor.

Comportamentul peptidelor P1 – P8, în prezența moleculelor de stingător (acrilamidă) este

asemănător, dacă se ține cont de numărul reziduurilor de Triptofan din structura acestora și de

timpul de viață al fluorescenței în absența acrilamidei, excepție făcând P4 și P6. Astfel, se poate

spune despre aceste două peptide că, atunci când se află în PBS, prezintă o structură distinctă de

celelalte șase, în sensul că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă,

ca rezultat al valorilor obținute pentru constantele bimoleculare.

Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu

ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide.

Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din

structura peptidelor. Astfel, s-a obținut un prim grup de valori pentru peptidele cu 3 reziduuri, P1

– P3, un grup de valori pentru P5 – P8 și, separat, valoarea cea mai mică a constantei bimoleculare,

pentru P4. O valoare aparte o are timpul de viață corespunzător peptidei P3, mai mică în comparație

cu al celorlalte peptide, ceea ce duce la concluzia că aceasta adoptă, în interacția cu bistratul format

din DOPC, o conformație în care reziduurile de Triptofan sunt mai expuse mediului hidrofil.

În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile cationice, în cazul

de față Arginina, și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în plus față de interacțiile

hidrofobe datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate

peptidele, scădere care este un indicator că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile

moleculelor de acrilamidă.

13

Utilizarea tehnicilor de spectroscopie de fluorescență pentru studierea interacțiilor care apar

între AMP și membranele lipidice au avantajul că în structura primară a acestor peptide se

regăsește reziduul Triptofan. Mai multe proprietăți ale acestui fluorofor intrinsec, proprietăți

dependente de mediul în care acest fluorofor se găsește, pot fi utilizate pentru determinarea

variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob:

deplasarea maximului de fluorescență care apare la interacția peptidă-bistrat, modificări ale

eficienței cuantice și a timpului mediu de viață al fluorescenței Triptofanului.

Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din

mediul hidrofil în mediul hidrofob a fost folosit un protocol de lucru în care soluția de peptidă a

fost titrată cu o soluție concentrată de LUV.

Soluția de peptidă dizolvată în PBS, având concentrația finală de 1 µM, a fost ținută în

întuneric, cu agitare continuă, timp de 30 min., pentru atingerea echilibrului. După scurgerea

acestui interval, au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în

timp. Titrarea soluțiilor de peptidă s-a făcut utilizând soluții concentrate de LUV, 12.5 mM,

preparate din DOPC și DOPC:DPPG. La fiecare pas al titrării, amestecul de peptide cu lipozomi a

fost ținut în întuneric, timp de 15 min. și agitat continuu, pentru atingerea echilibrului. În final

s-au înregistrat spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în timp ale amestecului

de peptide și LUV. Concentrațiile finale ale lipidelor, în soluția de peptide, rezultate în urma

titrării, au fost: 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, …, 180 µM și 200 µM. Din prelucrarea acestor

spectre au rezultat valorile folosite pentru determinarea ΔG utilizând ecuațiile din modelele

descrise pe larg în Teză. O familie de spectre, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din

DOPC, utilizate pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din

mediul hidrofil în mediul hidrofob, este prezentată în figura următoare.

14

300 350 400 450 500

0

1

2

3

4

5

200 M

I FL

UO

RE

SC

. [x10

5 c

ps]

[nm]

0 M

Concentratia lipidelor

in solutie

Figura 5. Familie de spectre din care se obțin valorile parametrilor

utilizați în modelele de calcul a ΔG utilizând fluorescența statică.

Pentru obținerea ΔG, datele experimentale au fost fitate, în Origin, cu ecuațiile

corespunzătoare fiecărui model de analiză. Este de precizat faptul că pentru concentrația lipidelor

s-au folosit valori reduse la jumătate, deoarece se consideră că peptidele interacționează numai cu

peretele exterior al LUV. Un exemplu de fitări, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din

DOPC, este ilustrat în Figura 6.

15

0 2 4 6 8 10

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Model fit

[

nm

]

CL/2 [x10

-5 M]

Model RectHyperbola

Equation y = a*b*x/(1+b*x)

Plot \g(Dl)

a 13.95282

b363074.71028

Reduced Chi-Sqr 0.68117

R-Square(COD) 0.96285

Adj. R-Square 0.95947

A

0 2 4 6 8 10

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

IFLUORESC.

@ 335 nm

Model fit

I FL

UO

RE

SC

. [x

10

5 c

ps]

CL/2 [x10

-5 M]

Model deltaG_comp (User)

Equation112735.80439+((A-112735.80

439)*B*x)/(55.3+B*x)

Plot 335

A 438301.29416

B 4.25478E6

Reduced Chi-Sqr 1.29099E8

R-Square(COD) 0.98702

Adj. R-Square 0.98584

B

0 2 4 6 8 10

1.50

1.65

1.80

1.95

2.10

2.25

2.40

0

Model fit

[

ns]

CL/2 [x10

-5 M]

Model deltaG_tau (User)

Equation(1.5701+A*0.782*x*B)/(1+A*0.7

82*x)

Plot \g(t\-(0_))\-(AMP)

A 270545.39786

B 2.26207

Reduced Chi-Sqr 0.0012

R-Square(COD) 0.97509

Adj. R-Square 0.97282

C

Figura 6. Fitarea datelor experimentale cu modelele teoretice, pentru

Indolicidină titrată cu LUV preparate din DOPC.

A – fitarea variației Δλ ([L]/2), cu ecuația (11.4) descrisă în Teză; B – fitarea variației 𝐹𝑃𝐿

([L]/2), cu ecuația (11.7) descrisă în Teză; C – fitarea variației �̃� ([L]/2), cu ecuația (11.8)

descrisă în Teză.

Trebuie precizat că, în cazul peptidelor P3 și P4, în urma titrării cu soluția concentrată de

lipozomi, nu s-au obținut deplasări ale maximului de emisie fluorescentă. Totuși, în urma titrării,

au apărut creșteri ale intensității spectrelor de emisie fluorescentă, poziția maximului de emisie

rămânând neschimbată, relativ la situația în care peptidele au fost doar în PBS, acest lucru sugerând

că la nivelul reziduurilor de Triptofan se manifestă interacții care afectează eficiența cuantică a

fluorescenței acestuia.

Rezultatele obținute pentru celelalte peptide, care au prezentat deplasări ale maximului de

emisie fluorescentă sunt detaliate Fig. 7. În situația interacției acestor peptide cu LUV, preparate

16

din DOPC, cea mai mare valoare a variației energiei a avut-o P2, de -8.27 ± 0.34 kcal/mol, iar cea

mai mică a fost pentru P6, de -9.34 ± 0.33 kcal/mol. Valorile mai mici obținute pentru peptidele

cu 4 reziduuri de Triptofan în structura lor, P5 – P8, față de cele cu 3 reziduuri, P1 – P2, sunt

explicabile datorită faptului că, având un reziduu de Triptofan în plus în structură, acesta duce la

adoptarea unei configurații mai stabile a peptidei relativ la planul membranei.

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

1 2 3 4 5 6 7 8

-10

-8

-6

-4

-2

0

DOPC DOPC:DPPG

G

[kcal/M

]

A

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

1 2 3 4 5 6 7 8

0

5

10

15

20

[

nm

]

DOPC DOPC:DPPGB

Figura 7. Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de

ecuația (11.4) prezentată în Teză.

A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în

bistratul lipidic; B – Deplasarea maximului de emisie fluorescentă.

Din valorile deplasărilor maximului emisiei fluorescente, se observă că reziduurile de

Triptofan, care intră în componența peptidei P2, sunt cele mai expuse mediului hidrofil de la

interfața bistratului, în situația în care acesta este obținut din DOPC. Pentru aceeași compoziție

lipidică a bistratului, cel mai puțin expuse reziduuri sunt ale peptidei P7. O creștere semnificativă

(dublare) a deplasării maximului o are P2 în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG. Cea mai

mare valoare a deplasării maximului a fost obținută, în această situație, pentru peptida P1.

17

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

1 2 3 4 5 6 7 8

-10

-8

-6

-4

-2

0

DOPC DOPC:DPPG

G

[k

ca

l/M

]

A

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

1 2 3 4 5 6 7 8

0

1

2

3

4 DOPC DOPC:DPPG

lim

. [n

s]

B

Figura 8. Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de

ecuația (11.8) prezentată în Teză.

A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în

bistratul lipidic; B – Timpul de viață al fluorescenței.

Valorile obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele P1 – P8,

analizate cu cu modelul descris în Teză, sunt reprezentate sub formă grafică în Fig. 8. La fel ca la

modelul utilizat anterior, cea mai mică energie a fost obținută tot pentru peptida P6, în ambele

cazuri, pentru DOPC.

Surprinzător a fost comportamentul peptidei P3 pentru care, utilizând această metodă de

analiză, s-a obținut o variație mare a timpului de viață pentru cele două situații, în cazul DOPC,

având valoarea de 1.51 ± 0.08 ns, iar în cazul DOPC:DPPG, având valoarea de 3.70 ± 0.20 ns,

valori care nu se corelează cu cele ale energiilor de partiție pentru cele două situații, în cazul

DOPC:DPPG energia de partiție fiind de -7.35 ± 0.16 kcal/mol, mai mică decât în cazul DOPC,

când a avut valoarea de -8.15 ± 0.19 kcal/mol.

Rezultatele obținute pentru peptidele P1-P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs,

indică faptul că peptida P6 are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide

anionice. Aceste rezultate se corelează cu testele in vitro efectuate pentru aceste peptide.

Ținând cont de proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă, număr mare de

reziduuri de Triptofan (4 pentru jumătate dintre ele, P5 – P8) și sarcina netă a acestora, se poate

trage concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei.

18

În capitolul 12, s-a propus o nouă abordare în analiza spectrelor de fluorescență ale

Triptofanului, care furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la nivelul

bistratului lipidic și peptida liberă în soluție.

În literatura de specialitate, există studii care utilizează deconvoluția cu funcții de tip LN a

spectrelor complexe de fluorescență ale Triptofanului, din structura peptidelor și proteinelor, dar

doar câteva din acestea tratează interacția dintre peptide/proteine cu membranele lipidice. Toate

aceste studii tratează problema deconvoluției spectrelor pe baza principiilor amintite în Teză, din

punctul de vedere al stingerii fluorescenței reziduurilor de Triptofan.

Ținând cont de ipotezele de lucru ale metodei de analiză a spectrelor de emisie fluorescentă

a reziduurilor de Triptofan și de existența celor cinci clase de spectre de emisie, descrise în Teză,

s-a dezvoltat unui pachet asemănător de coduri de analiză a spectrelor de fluorescență, precum cel

descris în capitolul 8. Scopul a fost determinarea fracției dintre peptidă aflată în faza apoasă și cea

adsorbită la nivelul bistratului lipidic.

La prelucrarea și analiza datelor s-au luat în considerare următoarele:

1. Cele două peptide analizate, Indolicidina și P6, în soluții apoase, prezintă o structură

secundară dezordonată, astfel că reziduurile de Triptofan sunt total expuse moleculelor

solventului; datorită acestui lucru, era de așteptat să se regăsească în spectrul de emisie

fluorescentă (corespunzător fiecărei peptide aflate doar în PBS sau în faza apoasă atunci

când interacționează cu bistratul) o singură specie de molecule fluorescente, cu

caracteristicile de emisie foarte apropiate de emisia fluorescentă a moleculelor de L-

Triptofan dizolvate în soluție apoasă (clasa III din lista anterioară).

2. În situația în care peptida se află adsorbită la nivelul bistratului lipidic, toate reziduurile

de Triptofan din structura acesteia interacționează, prin interacții hidrofobe, cu suprafața

exterioară a bistratului.

3. Datorită lungimii reduse a peptidelor, acestea nu pot penetra bistratul lipidic în urma unei

reorientări la nivelul acestuia (cazul Melitinei) în urma căreia unele reziduuri ar fi mai

puțin accesibile mediului hidrofil, rezultând astfel două categorii de reziduuri cu grade

diferite de accesibilitate pentru moleculele solventului și, implicit, asociat acestora, două

peak-uri elementare care să rezulte în urma deconvoluției.

19

4. Ținând cont de ipoteza anterioară, s-a considerat că, pentru peptidele adsorbite la nivelul

bistratului, fluorescența reziduurilor de Triptofan va genera în spectrul complex de

fluorescență un singur peak elementar, corespunzător uneia dintre clasele A, S, I sau II.

5. În prezența LUV, peptidele care nu sunt adsorbite la nivelul bistratului vor genera un

peak elementar cu caracteristici care se încadrează în clasa III.

Pentru analiza spectrelor de fluorescență, s-a dezvoltat un pachet de coduri, scrise în limbajul

de programare MatLab, care respectă algoritmul de calcul descris în capitolul 8. În Fig. 9, sunt

reprezentate valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două fracții de peptidă, aflate fie în faza

apoasă, fie adsorbite la nivelul bistratului, obținute în urma deconvoluției, pentru Indolicidină și

pentru P6.

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DOPC - fractia de peptida adsorbita

DOPC - fractia de peptida libera

DOPC:DPPG - fractia de peptida adsorbita

DOP:-DPPG - fractia de peptida libera

FP

EP

T.

C [x10-5 M]

1

23 4

A

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DOPC - fractia de peptida adsorbita

DOPC - fractia de peptida libera

DOPC:DPPG - fractia de peptida adsorbita

DOPC:-DPPG - fractia de peptida libera

FP

EP

T.

C [x10-5 M]

B

Figura 9. Variația ariei relative a peak-urilor obținute în urma

deconvoluției.

A – Indolicidina; B – peptida P6.

Se remarcă faptul că, la concentrați mari ale lipidelor, unde ariile relative ale peak-urilor

rămân aproximativ constante, pentru DOPC:DPPG, fracția de peptidă adsorbită reprezintă

aproximativ 75 % din cantitatea totală de peptidă din soluție, spre deosebire de DOPC, unde

această fracție reprezintă aproximativ 60 % din cantitatea totală de peptidă.

Pentru P6 am obținut aproximativ același tip de variație a ariilor relative ale peak-urilor

elementare obținute în urma deconvoluției. Spre deosebire de cazul Indolicidinei, atunci când în

suspensia de P6 a fost titrată soluția de LUV, preparate din DOPC, fracția de peptidă adsorbită la

bistrat a fost mai mică decât fracția de peptidă din faza apoasă, pentru toate valorile raportului

20

peptidă-lipide, așa cum se observă din Fig. 9 – B. În cazul LUV, preparate din DOPC:DPPG,

fracția de peptidă adsorbită la nivelul bistratului pentru concentrațiile mari ale lipidelor a fost de

aproximativ 65 %, iar pentru LUV, preparate din DOPC, de aproximativ 45 %.

Utilizând această metodă se obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipidic,

respectiv aflată în faza apoasă. Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile

dintre diferite AMP și membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.

Concluzii generale

Toate rezultatele experimentale, obținute cu aranjamentul experimental realizat și calibrat în

Teză, referitoare la timpii de viață ai fluorescenței, sunt comparabile cu cele din literatură. Timpul

de viață al fluorescenței, în cazul moleculelor care includ în structura lor un inel indolic, este afectat

de variațiile de temperatură într-o măsură mai mare decât timpul de viață obținut pentru ceilalți

compuși. De aceea, în experimente, trebuie să se aibă în vedere influența factorilor fizico-chimici

asupra grupărilor cromofore ale moleculelor studiate.

În urma analizării datelor în cazul Melitinei, a rezultat că, la creșterea fluidității bistratului,

obținut din DOPC, aceasta se reorientează față de bistrat, pătrunzând în profunzimea lui, către zona

hidrofobă a acestuia. Spre deosebire de Melitină, cele trei peptide analizate, și anume: P1, P5 și

P8, având reziduurile de Triptofan localizate la nivelul interfeței membrană lipidică-solvent,

paralele cu planul membranei, sunt mult mai expuse mediului hidrofil, în comparație cu reziduul

de Triptofan din structura Melitinei. Datele experimentale din Teză demonstrează că mecanismul

de acțiune al peptidelor nou sintetizate (P1, P5 și P8) asupra bistratului lipidic diferă față de cel al

Melitinei.

Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR,

obținut în urma deconvoluției spectrelor de emisie fluorescentă ale Laurdanului inserat în

membrane lipidice, utilizând funcții asimetrice de tip LN, este mult mai sensibil la gradul de

hidratare a bistratului, așa după cum este indicat de către Laurdan. Aria peak-ului corespunzător

fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază sunt

dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.

21

Împachetarea lipidelor, obținută din spectrele de fluorescență ale Laurdanului din

membranele artificiale și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP. Complexitatea

membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un nivel de împachetare a

lipidelor constituenete mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste

membrane sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP. Gradul de destabilizare a bistratului, în

cazul membranelor artificiale, depinde de componentele constituente ale acestuia. Pentru interacția

dintre Melitină și lipozomi, preparați din DOPC și DOPC:Chol, există o concentrație limită, peste

care efectul destabilizator nu se mai manifestă.

Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV, preparate din DOPC, sunt puse în evidență cu

ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide.

Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din

structura peptidelor. În prezența LUV, formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile

cationice și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în afară de interacțiile hidrofobe

datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate peptidele,

indicând că grupările lor cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de stingător (i.e.,

acrilamidă).

Valorile variației energiei libere Gibbs, pentru peptidele P1-P8, indică faptul că peptida P6

are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide anionice. Ținând cont de

proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă și sarcina netă pozitivă a acestora, se

poate trage concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei, față de

membranele lipidice.

Utilizând deconvoluția spectrelor de fluorescență ale Triptofanului cu funcții de tip LN se

obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipidic, respectiv aflată în faza apoasă.

Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile dintre diferite AMP și

membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.

Protocoalele dezvoltate pe parcursul acestei Teze, permit studierea efectelor diferiților agenți

de stres: radiații ionizante, tratamente termice, chimice etc., asupra membranelor celulare de

mamifere și bacteriene.

22

23

Articole legate de Teză publicate in extenso în reviste științifice indexate ISI, cu

factor de impact

Chilom, C. G., Zorilă, B. și Popescu, A. I. (2017) Characterization of Some Physico-Chemical

Properties and Interactions of Human and Bovine Serum Albumins with Mitomycin C, Romanian

Journal of Physics, 62. (IF = 1.433, AIS = 0.259)

Zorila, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zorilă, B. (2017) Atomic force microscopy study of

morphological modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli,

Ultramicroscopy, 182, 226-232. (IF = 2.929, AIS = 1)

Zorilă, B., Bacalum, M., Popescu, A. I. și Radu, M. (2016) Log-Normal Deconvolution of Laurdan

Fluorescence Spectra - a Tool to Assess Lipid Membrane Fluidity, Romanian Reports in Physics,

68, 702-712. (IF = 1.467, AIS = 0.18)

Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2016) Investigating the Anticancer Activity of Some Cationic

Antimicrobial Peptides in Epithelial Tumor Cells, Romanian Reports in Physics, 68, 1159-1169.

(IF = 1.467, AIS = 0.18)

Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric

functions: Laurdan spectrum revisited, Analytical Biochemistry, 440, 123-129. (IF = 2.275,

AIS = 0.8)

Bacalum, M., Zorilă, B., Radu, M. și Popescu, A. (2013) Laurdan solvatochromism: influence of

solvent polarity and hydrogen bonds, Optoelectronics and Advanced Materials-Rapid

Communications, 7, 456-460. (FI =0.386, AIS = 0.07)

Articole legate de Teză aflate în stadiul de manuscris

Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă, Maria Bălăşoiu, R. N. Yaroslavtsev, S. V. Stolyar, Anna S.

Artemyeva, D. Soloviov, A. I. Kuklin, Mihaela Bacalum, Structural and spectrophotometric

characterization of ferrihydrite nanoparticles in interaction with liposomes and the effect against

normal and tumour cells.

B. Zorilă, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, Spectral characterization of folic acid effects of

lipid membranes: from model membranes to cells membranes.

F. L. Zorilă, M. M. Manea, B. Zorilă, Spectroscopic study of membrane modifications induced by

different decontamination treatments on Escherichia coli.

24